CN101074958A - 一种层粘连蛋白诊断试剂盒 - Google Patents

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冯志荣
沈剑
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Abstract

一种层粘连蛋白诊断试剂盒，采用双抗体夹心－ELISA法，用抗人层粘连蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的层粘连蛋白与单抗结合，加入兔抗人层粘连蛋白多抗，形成免疫复合物连接在板上，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，层粘连蛋白浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中层粘连蛋白浓度。它为临床肝纤维化的诊断和鉴别诊断提供一种灵敏度和特异性较高，所需血清量较少，易于操作，无放射性污染的手段。

Description

一种层粘连蛋白诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及肝纤维化诊断技术领域，特别是一种层粘连蛋白诊断试剂盒。
背景技术
肝纤维化是人体对肝脏损伤后的一种修复瘢痕反应，是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理改变。肝纤维化形成过程受基质降解及基质积聚两方面因素制约，受细胞因子调控。肝纤维化在理论上是可逆的，采用有效抗纤维化治疗，包括消除病因，加速降解过程或诱导星状细胞凋亡，均有可能逆转病程。所以早期诊断肝纤维化并动态监测其变化对慢性肝病的治疗，改善预后有着重要的意义。
血清学诊断是目前研究最广泛的肝纤维化诊断方法。由于该法取材方便，无创伤性，价格低廉，因而较为实用。目前公认具有较高诊断价值的有III型前胶原氨基端前肽(PIIINP)，IV型胶原，层粘连蛋白(LN)，透明质酸(HA)等，报道较多。其中，层粘连蛋白(LN)属结构性糖蛋白，存在于基底膜的透明层中。研究发现其与肝纤维化形成有重要关系，是门脉高压发生的主要基础。血清层粘连蛋白水平常与IV型胶原、透明质酸等相平行，在肝纤维尤其门脉高压诊断方面有重要价值。但是，现有产品的灵敏度和特异性有待提高，特别是能达到所需血清量较少，易于操作，无放射性污染的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种层粘连蛋白诊断试剂盒，为临床肝纤维化的诊断和鉴别诊断提供一种灵敏度和特异性较高，所需血清量较少，易于操作，无放射性污染的手段。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
一种层粘连蛋白诊断试剂盒，其特征在于：采用双抗体夹心-ELISA法，用抗人层粘连蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的层粘连蛋白与单抗结合，加入兔抗人层粘连蛋白多抗，形成免疫复合物连接在板上，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，层粘连蛋白浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中层粘连蛋白浓度。
所述的层粘连蛋白诊断试剂盒，其特征在于：采用已包被抗人层粘连蛋白单抗96孔微孔板。
具体实施方式
本发明提供了一种层粘连蛋白诊断试剂盒，它采用双抗体夹心-ELISA法：用抗人层粘连蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的层粘连蛋白与单抗结合，加入兔抗人层粘连蛋白多抗，形成免疫复合物连接在板上，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，层粘连蛋白浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中层粘连蛋白浓度。
本发明层粘连蛋白诊断试剂盒主要由96孔微孔板(已包被抗人层粘连蛋白单抗)、样品稀释液、第一抗体工作液、酶标抗体工作液、底物稀释液、终止液、洗涤液(20x)、标准品、坐标纸、OPD片、封板纸、使用说明书组成。
使用本发明层粘连蛋白诊断试剂盒，其操作步骤是：
1.实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温(20-25℃)。
2.取出所需数量的板条，倾去孔中液体，用洗涤液洗板1次，滤纸上拍干。剩余板条密封好，4℃保存(孔中保留保护液)。
3.建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中各加入稀释好的标准品100ul。
4.加样：待测品孔中每孔各加入待测样品100ul。
5.将反应板置37℃120分钟。
6.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
7.每孔中加入第一抗体工作液50ul。
8.将反应板充分混匀后置37℃ 60分钟。
9.洗板：同前。
10.每孔加酶标抗体工作液100ul。
11.将反应板置37℃ 60分钟。
12.洗板：同前。
13.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应5-10分钟。
14.每孔加入50ul终止液混匀。
15.在492nm处测吸光值。
结果判断：
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴)，OD值作为Y轴(线性轴)。曲线应为一光滑曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应人层粘连蛋白含量。
与现有产品相比，本发明的特点是：灵敏度高(＜8ng/ml)、特异性好(同III型前胶原肽、IV型胶原、透明质酸等无交叉反应)，所需血清量较少(100微升)，易于操作，便捷快速。对人体无创伤性，结合IV型胶原、透明质酸、III型前胶原肽的联合检测，用于肝纤维化的诊断和鉴别诊断。
用本发明试剂盒经上海瑞金、曙光、龙华等三家医院，共计检测1006例样本，统计结果如下：
  分组   例数   LN平均含量(ng/ml)
  正常对照组   400   177.0±123.2
  可疑异常组   慢性肝炎   402   313.5±199.0
  急性病毒性肝炎患者组   69   214.0±102.9
  肝硬化(B超已诊断)组   135   445.2±220.6
实验结果表明：正常对照组同可疑异常组LN平均含量有较明显差异。认为其可对早期诊断肝纤维化有较高的辅助诊断意义。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (2)

1、一种层粘连蛋白诊断试剂盒，其特征在于：采用双抗体夹心-ELISA法，用抗人层粘连蛋白单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的层粘连蛋白与单抗结合，加入兔抗人层粘连蛋白多抗，形成免疫复合物连接在板上，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体与之结合，加入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在492nm处测OD值，层粘连蛋白浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中层粘连蛋白浓度。
2、根据权利要求1所述的层粘连蛋白诊断试剂盒，其特征在于：采用已包被抗人层粘连蛋白单抗96孔微孔板。
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