CN205333645U - 一种人血清中Lp-PLA2快速定量检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种人血清中Lp-PLA2快速定量检测试纸条，包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有标记物标记的Lp-PLA2抗体，所述标记物为胶体金、有色微球、荧光乳胶微球、时间分辨荧光乳胶纳米微球、量子点中的一种；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的Lp-PLA2抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG。本实用新型具有反应迅速、灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点，可广泛应用于Lp-PLA2的临床免疫检验和科学研究中；且试纸条制作方便，可批量生产；体积小，便于携带。
Description
技术领域
本实用新型属于免疫层析检测技术领域，具体涉及一种人血清中Lp-PLA2快速定量检测试纸条。
背景技术
流行病学研究和临床前瞻性研究发现，发生心血管事件者脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)浓度或活性显著高于对照组。血浆Lp-PLA2浓度或活性升高是心血管事件的独立危险因子，Lp-PLA2浓度、活性与心血管疾病风险正相关。
WOCOPS是一项评估普伐他汀在预防冠脉事件中的价值的试验，在中年男性苏格兰人中观察Lp-PLA2、hs-CRP、纤维蛋白原、白细胞计数等炎性反应标志物是否与冠脉事件有关。纳入了580例曾发生过冠状动脉事件(非致死性心肌梗死、心源性死亡或冠状动脉血运重建事件)的患者，并从相同人群中纳入了未发生过冠状动脉事件者共1160例，再根据年龄与吸烟史分2组作为对照组。研究结果显示，Lp-PLA2、C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)、纤维蛋白原和白细胞计数的水平可以作为冠状动脉事件强有力的预测因子，每个变量组中最高五分位数者与最低五分位数者相比，冠脉事件危险约增加一倍。但在包括年龄、收缩压、脂蛋白水平和炎性反应标志物在内的多变量模型分析中，CRP、纤维蛋白原和白细胞计数增高与冠脉事件无明显相关性，而Lp-PLA2的最高五分位数者与最低五分位数者相比，心血管事件危险增加约2倍(RR＝1.49，95％CI：0.95-2.33)。研究认为Lp-PLA2是一个强有力的、肯定的冠脉事件预测因子，且独立于其他炎性反应因子。
ARIC研究的结果显示，在为期6年的前瞻性队列研究中纳入12819名美国不同社区的健康中年人(包括男性和女性，白人和黑人)，结果发生冠心病事件的608例患者中Lp-PLA2、hs-CRP水平高于未发生冠心病事件的患者。在调整了年龄、性别与种族后，Lp-PLA2、hs-CRP最高三分位数者与最低三分位数者相比冠心病事件风险显著增加(HR＝1.78，95％CI：1.33-2.38)。尤其是当LDL-C<130mg/dl时，位于Lp-PLA2最高三分位数者与最低三分位数者相比冠心病事件风险显著增加(HR＝1.99，95％CI：1.17-3.38)，在调整了包括hs-CRP的模型后相比，冠心病事件风险仍有显著增加(HR＝2.08，95％CI：1.20-3.62)。研究表明Lp-PLA2与CRP在鉴别低密度脂蛋白胆固醇不高的高危冠心病患者中可能具有互补性。
Garza等的调查结果表明，LP-PLA2与心血管疾病显著相关，其危险分层在调整传统心血管危险因素后未受明显影响。并认为测量LP-PLA2可用于指导心血管危险分层。此外，为使心血管事件发生的危险程度降低，LP-PLA2可能可作为潜在的治疗靶点。
试验分析Lp-PLA2显示出了在中高危人群作为附加于传统的CV风险评估是有用的。Lp-PLA2增高的人们，这些将从强化降脂治疗上受益的人应适当重新划分为更高的风险，这是基于大量的证据-不论高危患者的低密度脂蛋白胆固醇的基线水平如何，他们都能从低密度脂蛋白胆固醇的降低中受益。
目前认为，将Lp-PLA2作为治疗目标是一种新的、非降脂策略的AS治疗方法。他汀类、烟酸、非诺贝特、ω-3脂肪酸和依替米贝的降脂治疗可以降低Lp-PLA2的水平。Macphee等在家兔的实验中发现，Lp-PLA2抑制剂SB-244323能减少动脉粥样硬化斑的形成。而最近被研究较多的Lp-PLA2抑制剂是darapladib。相关研究认为Lp-PLA2抑制剂darapladib阻止了坏死中心的扩大，是斑块易损性的一个主要决定性因素。WilenskyRL的研究亦显示Lp-PLA2抑制剂darapladib能改善冠状动脉粥样硬化病变程度。因此，Lp-PLA2可作为治疗ACS的新靶点，为临床上治疗ACS提供早期依据。
基于上述原因，对Lp-PLA2的检测显得尤为关键，因此，亟需一种能够快速定量检测人血清中Lp-PLA2含量的检测工具。
实用新型内容
本实用新型的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种人血清中Lp-PLA2快速定量检测试纸条。
本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有标记物标记的Lp-PLA2抗体，所述标记物为胶体金、有色微球、荧光乳胶微球、时间分辨荧光乳胶纳米微球、量子点中的一种；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的Lp-PLA2抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG。
一实施例中：所述荧光乳胶微球的荧光物质为直接荧光物质异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
一实施例中：所述时间分辨荧光乳胶纳米微球为镧系元素荧光乳胶纳米微球。
一实施例中：所述镧系元素为铕，铽，钐或镝中的一种。
一实施例中：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
一实施例中：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥而得。
一实施例中：所述Lp-PLA2抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述另一个表位的Lp-PLA2抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
一实施例中：所述试纸条外还包裹有一壳体。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.传统的检测试纸条分别设有样品垫和结合垫，血清/血浆等样品首先与样品垫接触，样品垫对样品进行预处理，去除样品中杂质颗粒，调节样品液pH值或粘度等，减缓样品渗透速度，有利于样品的均匀分布；经样品垫预处理过后的均匀的样品再流动至结合垫上与标记抗体发生结合，才能够保证反应的准确性，如果不经预处理，样品在结合垫上的结合量无法把握，且结合稳定性也差；而本实用新型采用一个样品结合垫代替传统的样品垫和结合垫，该样品结合垫上准确而均匀地分布有标记抗体，既能保证样品得到预处理，又能保证样品结合一定量的标记抗体，保证了反应的准确性，经检测，灵敏度和特异性良好；同时，也使得试纸条结构和制备过程得到简化。
2.本实用新型的人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，包被有标记物标记的Lp-PLA2抗体，所述标记物为胶体金、有色微球、荧光乳胶微球、时间分辨荧光乳胶纳米微球、量子点中的一种；上述标记物为荧光物质标记或有色物质标记，具有反应迅速、灵敏度高、特异性强、易于辨别、稳定性好等特点，可广泛应用于Lp-PLA2的临床免疫检验和科学研究中。
3.本实用新型的试纸条制作方便，可批量生产；体积小，便于携带。
附图说明
下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步说明。
图1为本实用新型的人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条结构示意图。
附图标记：样品结合垫1；标记物标记的Lp-PLA2抗体2；硝酸纤维素膜3；检测线4；质控线5；吸水膜6；背衬底板7。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本实用新型的内容：
请查阅图1，一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，包括背衬底板7，该背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品结合垫1和吸水膜6，该样品结合垫1和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该样品结合垫1上包被有标记物标记的Lp-PLA2抗体2，所述标记物为胶体金、有色微球、荧光乳胶微球、时间分辨荧光乳胶纳米微球或量子点中的一种；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(T线)和质控线5(C线)，检测线4(T线)包被有另一个表位的Lp-PLA2抗体，质控线5(C线)包被有羊抗鼠IgG。
上述试纸条可以通过以下制备方法制备：
1)硝酸纤维素膜(NC膜)处理
将NC膜贴至背衬底板的制定位置，取50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的Lp-PLA2抗体稀释至1mg/ml，用于制备T线；用0.05M的MES缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，通过biodot划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于50℃干燥箱中，干燥过夜。
2)样品结合垫的处理
玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mMPB(pH7.4)，其中含有2％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，50℃干燥过夜；通过Biodot仪器的airjet喷头将标记物标记的Lp-PLA2抗体按照8μl/cm的量超声喷雾至干燥好的玻璃纤维素膜上，50℃干燥过夜，制备得到样品结合垫。
其中，根据需要，Lp-PLA2抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体；另一个表位的Lp-PLA2抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
根据需要，所述标记物可以为胶体金、有色微球、荧光乳胶微球、时间分辨荧光乳胶纳米微球或量子点中的一种；所述荧光乳胶微球的荧光物质可以为直接荧光物质异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种；所述时间分辨荧光乳胶纳米微球为镧系元素的荧光乳胶纳米微球；所述镧系元素为铕，铽，钐或镝中的一种；本实施例之中，所述标记物为时间分辨荧光乳胶纳米微球，具体为含铕乳胶纳米微球。
3)组装
将步骤2)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
本实用新型的试纸条利用双抗夹心法进行检测：将待测样品量取75μL滴加到样品垫上，样品中的Lp-PLA2与样品垫上时间分辨荧光物质标记的Lp-PLA2抗体结合，形成抗原-标记抗体复合物。经层析原理，依次与硝酸纤维素膜上的另一个表位的Lp-PLA2抗体(T线)和羊抗鼠IgG抗体(C线)形成抗体-抗原-标记抗体复合物。在时间分辨荧光分析仪的激发光激发下，标记元素显现荧光，结合的标记抗体越多，荧光强度越高，从而进行定量检测。
Lp-PLA2水平受性别和种族影响，国外报道成人血清Lp-PLA2参考区间男性为131～376(平均251)μg/L(ng/mL)，女性为120～342(平均为174)μg/L(ELISA)。女性低于男性，可能与雌激素水平有关，正在接受激素替代治疗的女性Lp-PLA2水平较低，但其差别尚不足以影响参考区间。建议Lp-PLA2<200μg/L为正常水平，200～223μg/L为中度升高，≥223μg/L为升高。目前国内尚无大规模Lp-PLA2水平人群研究及适合国人的参考区间报道，建议各实验室建立自己的参考区间。国内小规模研究提示Lp-PLA2水平<175μg/L为正常，如大于175μg/L提示心血管事件风险增加。
实验例：样品的定量检测
1.标准曲线制作
1.1取Lp-PLA2校准品一套，具体值见下表
1.2检测方法
1.2.1取校准品75μl，加入实施例1制备的层析条中样品窗口；
1.2.210分钟之后，用时间分辨荧光定量分析仪定量检测发光值。
1.2.3每个校准品检测2次，取T/C值的平均值。具体结果见下表：
1.3标准曲线制备
根据上述检测结果，以T/C值的对数值为X轴，以浓度的对数值为Y轴进行线性回归，，得到线性方程y＝-0.055x2+1.0871x-3.7975，R2＝0.998。
2精密度测试：
2.1取制备好的9张层析条，配置一个浓度(200ng/mL)的Lp-PLA2工作校准品，
2.2取75μl样品，一次性加入层析条的检测口；
2.3待样品层析10min之后，用时间分辨荧光定量分析仪对结果进行扫描分析，结果如下表，说明本实用新型的Lp-PLA2时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条精密度良好。
3准确性测试：
3.1配置50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，500ng/mL，800ng/mL浓度的工作校准品。
3.2各取75μl样品，一次性加入层析条的检测口；
3.3待样品层析10min之后，用时间分辨荧光定量分析仪对结果进行扫描分析，结果如下表，说明本实用新型的Lp-PLA2时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条准确度良好。
| 配置浓度 | T/C值 | 换算浓度 | CV(％) |
| 30 | 0.492 | 31.2 | 2.77 |
| 80 | 0.941 | 83.9 | 3.37 |
| 200 | 1.568 | 213.1 | 4.48 |
| 400 | 2.071 | 387.5 | 2.24 |
| 800 | 2.693 | 754.2 | 4.17 |
以上所述，仅为本实用新型较佳实施例而已，故不能依此限定本实用新型实施的范围，即依本实用新型专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本实用新型涵盖的范围内。
Claims (8)
1.一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有标记物标记的Lp-PLA2抗体，所述标记物为胶体金、有色微球、荧光乳胶微球、时间分辨荧光乳胶纳米微球、量子点中的一种；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的Lp-PLA2抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述荧光乳胶微球的荧光物质为直接荧光物质异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述时间分辨荧光乳胶纳米微球为镧系元素荧光乳胶纳米微球。
4.根据权利要求3所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述镧系元素为铕，铽，钐或镝中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
6.根据权利要求5所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥而得。
7.根据权利要求1所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述Lp-PLA2抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述另一个表位的Lp-PLA2抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的一种人血清中Lp-PLA2定量检测试纸条，其特征在于：所述试纸条外还包裹有一壳体。
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