CN105807067A - 一种检测阿尔兹海默综合症ncam2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法。本试剂盒包括PVC底板、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫；所述样品垫、硝酸纤维素膜、荧光结合垫、吸水垫按水平方向固定于PVC底板上。所述荧光结合垫上有包被的鼠抗人NCAM2单克隆抗体1‑纳米荧光微球复合物、鸡IgY‑纳米荧光微球复合物；所述的硝酸纤维素膜上有鼠抗人NCAM2单克隆抗体2构成的检测线和兔抗鸡IgY抗体构成的质控线。本发明利用纳米荧光微球检测NCAM2，其背景值低、检测时间短、特异性和灵敏度高、检测结果准确，为临床诊断和阿尔兹海默综合征的普查提供了更加可靠的依据。

Description

一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，本发明属于医疗产品领域。

背景技术

阿尔茨海默综合症（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。AD是老年期最常见疾病之一，世界卫生组织（WHO）估计全球65岁以上老年人群AD的患病率为4%~7%。AD患病率与年龄密切相关，年龄平均每增加6.1岁，患病率升高1倍；在85岁以上老年人群中，AD患病率可高达20%~30%。2001年全球AD患者超过2000万，估计到2040年，全球AD患者将超过8000万。自1999年，中国开始进入老龄化社会，与之相对应的，目前中国老年人群AD患病人口已经超过600万，预计到2050年患病人口将超过2000万，是世界上AD患病人口最多、增长速度最快的国家。AD是造成老年人失去日常生活能力的最常见疾病，也是导致老年人死亡的第5位病因。AD不仅给患者带来巨大的痛苦，还给家庭和社会带来了沉重的精神压力和医疗、照料负担。因此，AD已成为影响全球公共健康和社会可持续发展的重大问题。尽管世界各国对AD治疗药物的研发投入了大量人力物力，仍未能研发出延缓或阻止AD进展的药物。因此早期诊断治疗是防治AD的关键时期。

目前阿尔兹海默综合症临床常用的诊断方法有：1、神经影像学检查、脑电图：如计算海马区神经原纤维缠结和老年斑数，与临床诊断的符合率可达81%～88%。由于正常老年人也有一定数量的神经原纤维缠结和老年斑，且有同样的分布，准确率较低，且耗时费用高；2、神经心理学测验：神经心理学测验是在现代心理测验基础上发展起来的用于脑功能评估的一类心理测验方法。因个体差异较大，准确率较差。对于早期患者，检出率并不理想；3、基因检测：通过检测阿尔兹海默综合标志性因子，如淀粉样蛋白前体蛋白基因（APP）、早老素1、2基因（PS1、PS2）等，有简便、敏感、特异等优点，但需要相应的检测设备，技术要求高，费用高，难以推广。4、血液学检查、脑脊液检测：主要用于检测阿尔兹海默综合症特异性蛋白，发现存在的伴随疾病或并发症、发现潜在的危险因素。目前常用ELISA免疫诊断技术检测血清中或脑脊液特异性蛋白，具有常规程序冗长费时、不易于推广、灵敏度低等。因此寻找一种快速、方便携带、操作简单、灵敏度高，对阿尔兹海默综合症的诊断和方法学建立具有十分重要的意义。

神经细胞粘附分子（neuralcelladhesionmole2cules，NCAMs）是细胞表面糖蛋白大家族的成员之一，这些糖蛋白均在神经系统发育过程中表达并对轴突的生长起着重要的调节作用，在学习记忆过程中，神经元也经历了突触的可塑性变化过程，有关实验表明NCAMs对长时记忆的保持有着重要的影响。NCAMs由一个含有26个外显子的单拷贝基因进行选择性拼接，产生出至少20～30个同位体。NCAMs含有与免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）和纤连蛋白Ⅲ（fibronectinⅢ，FNⅢ）决定簇相关的结构，NCAMs可以按其所含有的每一种决定簇的数目进行分类，比如NCAM有五个免疫球蛋白和两个FNⅢ决定族，而L1糖蛋白含有六个免疫球蛋白和五个FNⅢ决定簇。在不同种系的动物中，NCAMs之间有较高的同源性，在果蝇中已鉴定出NCAM和L1的结构同源分子。除了由选择性拼接而导致的结构上的变化外，NCAMs还可经历了翻译后修饰过程，比如糖基化。神经细胞之间存在大量被称为突触的接触点，这是连接大脑神经细胞的重要结构。在学习和记忆的过程中，大脑的神经连接需要不断重组。突触损失是阿尔茨海默症最早的标志性事件之一，大脑的所有功能都需要突触，尤其是学习和记忆形成。阿尔茨海默症中的突触损失发生得非常早（在患者出现轻度认知功能障碍的时候），比神经细胞的死亡要早得多。

神经细胞粘附分子2（NCAM2）是一种连接突触的蛋白，可以在神经细胞之间稳定长期突触连接。研究人员在阿尔茨海默症与正常大脑组织中对这种蛋白进行了研究。研究显示，在阿尔茨海默症患者的海马体中，突触的NCAM2水平比较低。研究人员还通过小鼠和体外实验展示，β-淀粉样蛋白能够破坏NCAM2，从而造成突触损失。NCAM2蛋白的水平可以揭示个体患阿尔兹海默氏症的风险，可阐明个体轻度认知损伤的发展情况，对于开发有效的干预措施也至关重要。

荧光微球纳米颗粒在标志物检测领域具有巨大潜能。它具有以下特点：1、灵敏度高：不受外界的背景干扰；2、稳定性高：避免了样本腐蚀或自身衰变引发的淬灭现象；3、灵活性高：可以组合多样化光谱；4、安全性高：对于检测者、检测样品和环境都没有危害；5、方便简易：可对样品直接进行检测，无需特殊处理；6、以上特点决定其在生物标记物方面应用前景较广阔，尤其是在床旁检测领域。通过荧光微球纳米颗粒标记鼠抗人NCAM2单克隆抗体，建立一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法在临床检测领域具有重要的应用价值。

发明内容

针对以上存在的问题，本发明提供了一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法。本发明的特点是：结合干式免疫荧光法检测人NCAM2，通过特异性单抗与样本中NCAM2抗原形成双抗体夹心结构，其准确性和特异性更高；利用干式免疫荧光法测定，其背景值低，测量便捷、准确、操作简单。

本发明的目的是提供一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法。

本发明试剂盒包括PVC底板、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫；所述样品垫、硝酸纤维素膜、荧光结合垫、吸水垫按水平方向固定于PVC底板上。所述荧光结合垫上有包被的鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-荧光微球纳米颗粒复合物、鸡IgY-荧光微球纳米颗粒复合物；所述的硝酸纤维素膜上有鼠抗人NCAM2单克隆抗体2构成的检测线和兔抗鸡IgY抗体构成的质控线；所述的纳米颗粒径为100~200nm。

本发明的技术方案为：

1）硝酸纤维素膜（NC膜）-PVC底板的制备：将硝酸纤维素膜切成25mm×300mm，贴在PVC底板上。将鼠抗人NCAM2单抗2在硝酸纤维素膜上划线得到检测线；将兔抗鸡IgY在硝酸纤维素膜上划线得到质控线。然后将硝酸纤维素膜（NC膜）-PVC底板置于干燥箱干燥；

2）利用纳米荧光微球颗粒标记鼠抗人NCAM2单抗1和鸡IgY，保存备用。

3）结合垫的制备：将结合垫切成9mm×300mm细条，将鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-荧光微球纳米颗粒复合物、鸡IgY-荧光微球纳米颗粒复合物按照一定比例混合，均匀铺在结合垫上，放入烘箱烤干。

4）样品垫：将玻璃纤维膜切成17mm×300mm细条。

5）吸收垫：将吸水纸切成17mm×300mm细条。

7）组装：将上述吸水垫、样品垫、荧光结合垫依次贴在PVC底板上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条。

附图说明

图1干式免疫荧光检测系统结构示意图，其中1为样品垫；2为荧光结合垫；3为硝酸纤维素膜；4为吸水垫；5为PVC底板；6为样本中目标抗原；7为荧光微球标记鼠抗人NCAM2单抗1；8为荧光微球标记鸡IgY；9为检测线：鼠抗人NCAM2单抗2；10为质控线：兔抗鸡IgY。

具体实施方式

实施例1制备本发明的阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒

本发明试剂盒包括PVC底板、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫；所述样品垫、硝酸纤维素膜、荧光结合垫、吸水垫按水平方向固定于PVC底板上。

一、硝酸纤维素膜（NC膜）-PVC底板的制备

1、划膜：将硝酸纤维素酶切成25mm×300mm，贴在PVC底板上。将兔抗鸡IgY用PBS稀释到浓度为1mg/ml，作为C线包被液；将鼠抗人NCAM2单抗2用PBS稀释到浓度为1mg/ml，作为T线。通过喷膜仪，将T线包被液和C线包被液在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，37度烤干，即可得到单克隆抗体包被测试条。

二、结合垫的制备

1、标记抗体：纳米荧光微球颗粒与鼠抗人NCAM2单抗偶联方法是通过纳米荧光微球上的醛基与抗体蛋白上的氨基在弱碱环境下通过希夫氏碱基缩合，形成纳米荧光微球-CH-NH2-NCAM2抗体复合物；同样方式形成纳米荧光微球-CH-NH2-鸡IgY抗体复合物。荧光微球纳米颗粒与鼠抗人NCAM2单抗或鸡IgY按照1:1（ul：ug）混合反应2h，制备得到鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-荧光微球纳米复合物或鸡IgY-荧光微球纳米颗粒复合物。

2、结合垫的制备：将结合垫切成9mm×300mm细条，将鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-荧光微球纳米颗粒复合物或鸡IgY-荧光微球纳米颗粒复合物按照一定比例混合均匀铺在结合垫上，放入烘箱37度下烘烤2h。

三、其他辅材制备

1、将玻璃纤维膜切成17mm×300mm细条。

2、吸收垫：将吸水纸切成17mm×300mm细条。

四、组装

组装试纸条：将硝酸纤维素膜、吸水纸、荧光结合垫、样品垫依次粘贴到PVC底板上，用斩切机切成一定宽度的试剂条。

实施例2本发明试剂盒的使用方法

1、用移液器移取50ul血清、血浆、脑脊液样本加到试纸条的加样垫上；

2、室温静置10min；

3、10min结束，将试纸条放入免疫荧光定量分析仪中读取数据；

4、免疫荧光定量分析仪对光学信号进行测量和分析处理，定量得出被测物质的浓度；

5、依据参考值判定阴阳性。

实施例3本发明试剂盒与ELISA试剂盒比较

本发明的试剂盒与ELISA试剂盒同时检测临床确诊的阿尔兹海默综合症患者血清193例，脑脊液样本33例，正常人对照血清187例，检测结果见下表1：

表1本发明的试剂盒与ELISA试剂盒检测结果

从表1可以看出，本发明的试剂盒对阿尔兹海默综合症患者的阳性检出率明显高于ELISA试剂盒，对正常人血清检测均为阴性，可见本发明的试剂盒比ELISA试剂盒更敏感、特异、准确。说明本发明试剂盒具有更高的临床符合率，可为目前阿尔兹海默综合症的检测提供更准确、可靠的价值。

Claims (8)

1.一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于，本试剂盒包括PVC底板、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫；所述样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按水平方向固定于PVC底板上；所述结荧光合垫上有包被的鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-纳米荧光微球复合物、鸡IgY-纳米荧光微球复合物；所述的硝酸纤维素膜上有鼠抗人NCAM2单克隆抗体2构成的检测线和兔抗鸡IgY抗体构成的质控线。

2.如权利要求1所述的一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于，所述的纳米荧光微球为醛基化红荧光微球，纳米颗粒粒径为100~200nm，激发波长为365nm，发射波长为612±5nm，表面有醛基基团其含量为0.1~0.5mMol/g。

3.如权利要求1所述的一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于，鼠抗人NCAM2单克隆抗体1和鼠抗人NCAM2单克隆抗体2为NCAM2特异性单抗，识别NCAM2蛋白分子上的2种位点。

4.如权利要求1所述的一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于，将硝酸纤维素酶切成25mm×300mm，贴在PVC底板上；将兔抗鸡IgY用PBS稀释到浓度为1mg/ml，作为C线包被液；将鼠抗人NCAM2单抗2用PBS稀释到浓度为1mg/ml，作为T线包被液；通过喷膜仪，将T线包被液和C线包被液在硝酸纤维素膜上划线得到检测线和质控线，37度烤干，即可得到单克隆抗体包被测试条。

5.如权利要求1所述的一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于纳米荧光微球颗粒与鼠抗人NCAM2单抗或鸡IgY按照1:1（ul：ug）混合，37度反应2h，制备得到鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-纳米荧光微球复合物或鸡IgY-纳米荧光微球复合物。

6.如权利要求5所述的纳米荧光微球颗粒与鼠抗人NCAM2单抗偶联方法是通过纳米荧光微球上的醛基与抗体蛋白上的氨基在弱碱环境下通过希夫氏碱基缩合，形成纳米荧光微球-CH-NH2-NCAM2抗体复合物；同样方式形成纳米荧光微球-CH-NH2-鸡IgY抗体复合物。

7.如权利要求1所述的一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于结合垫的制备：将结合垫切成9mm×300mm细条，将鼠抗人NCAM2单克隆抗体1-纳米荧光微球复合物或鸡IgY-纳米荧光微球复合物按照一定比例混合均匀铺在结合垫上，放入烘箱37度下烘烤2h。

8.如权利要求1所述的一种检测阿尔兹海默综合症NCAM2的干式免疫荧光试剂盒和制备方法，其特症在于检测样品为血清、血浆、全血、脑脊液、尿液。