KR20100008632A - 폐암 진단 마커 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 진단 마커들 중에 신경원 특이성 에놀라제 (Neuron specific enolase)와 수용성 사이토 각질 19 절편 (CYFRA 21-1)을 폐암 진단 마커로 사용하여 사람의 혈청이 당해 진단 마커의 하나 이상에서 양성 반응을 보이는 사람을 폐암으로 진단하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당해 진단 마커의 존재를 측정하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편에 대한 항체를 이용하여 사람의 혈청으로부터 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편을 정성, 정량 분석함을 특징으로 하는 쉽고 간편하게 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

폐암 진단 키트, 폐암 마커, 폐암 진단법, NSE, CYFRA 21-1

Description

폐암 진단 마커 및 키트{Maker and kit for the diagnosis of lung cancer}

암을 진단하는데 사용되는 현재의 기술은 조직검사 (cytology evaluation), 조영법 (mammography) 및 종양 마커 면역검정법 (tumor marker immunoassay)로 대별된다. 특히 폐암의 진단방법은 흉부방사선 촬영, CT 및 MRI, 기관지경, 객담 및 경피적 세포 흡인에 의한 검사 및 종양 마커 검사 등이 있다.

종양 마커 면역검정법으로 폐암을 진단하는 방법은 한 종류 종양 마커를 정성 및 정량 분석하는 것이다. 이렇게 사용하고 있는 암 마커는 신경원 특이성 에놀라제, 암태아성 항원 (Carcinoembryonic antigen; CEA), 편평세포암 항원 (Squamous cell carcinoma antigen; SCC Ag), 수용성 사이토 각질 19절편 등이 있다. 이들 중 신경원 특이성 에놀라제는 소세포암 진단에 사용되고 있고 수용성 사이토 각질 19 절편은 비소세포암 중 특히 편평상피암 진단에 사용되고 있다.

폐암은 크게 소세포암과 비소세포암으로 분류되는데, 폐암의 치료적 접근방법을 결정하는 주된 요인은 종양이 조직학적으로 어느 종류의 암에 포함되는가를 정확하게 진단하는 것이 중요하다.

따라서 본 발명은 소세포암과 비소세포암의 마커들을 이용하여 폐암의 진단률을 높일 수 있는 종양 마커를 선별하고, 이들 마커를 이용하여 편하고, 간단하게 폐암을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

종래 암 진단에는 이들 암 마커들 중 어느 한 종류만을 사용함으로써 암 진단기술에 있어서 낮은 정확도로 인해 암 진단에 어려움이 있었다. 특히, 폐암 진단에 있어서 암 마커인 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편을 모두 사용하고, 이들 하나 이상의 마커에서 양성 반응 또는 일정 농도 이상을 나타내는 혈청에 대해 폐암으로 진단함으로써, 폐암 진단률을 개선시킬 수 있음은 선행 기술 어디에도 기재되어 있지 않았다.

본 발명에 이르러, 페암 특이적 마커로 각각 소세포암과 비소세포암 마커인 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편을 선택하고, 환자의 혈청 중 이들 폐암 마커들에 대한 정량 및 정성 분석 결과를 통해 예상외로 높은 폐암 진단률을 달성할 수 있었다. 따라서 본 발명은 폐암 마커 2개를 선정하고 혈액 중에 어느 한 곳에서 양성반응 혹은 일정 농도 이상 반응을 나타내는 혈청에 대하여 폐암으로 진단할 수 있는 쉽고 간편한 폐암 진단 방법을 제공한다.

본 발명은 인간 종양 마커 중 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 2 종류를 모두 포함하는, 폐암 진단 마커 조합에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신경원 특이성 에놀라제 및 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질의 존재를 측정하는 항체를 포함하는, 폐암 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질에 대한 정량 및 정성 분석 둘 다를 수행하여 이들 중 하나 이상의 마커에서 정상인 최고농도 이상 농도이거나 양성반응을 보이는 사람을 폐암으로 진단함을 특징으로 하는, 폐암 진단 마커 조합에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 폐암 마커인 신경원 특이성 에놀라제 또는 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질에 대해 혈액 혹은 혈청으로부터 정성 및 정량 분석을 모두 수행함으로써 폐암 진단률이 향상됨을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 폐암 진단률 향상을 위한 정성 분석에는 신경원 특이성 에놀라제 및 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질의 존재를 측정하는 항체를 포함하는 키트를 사용하고, 정량 분석에는 RIA법, ELISA법 또는 이의 변형된 분석법이 이용됨을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 있어서 폐암 진단에 필요한 정보는, 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 중 하나 이상의 마커에서 정상인 최고농도 이상의 농도를 나타내거나 양성반응을 나타냄으로써 제공됨을 특징으로 한다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은 인간 종양 마커 중에 폐암 감도 및 특이성이 높은 폐암 마커 2종인 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 단편 단백질을 정량 분석하여 폐암 진단률을 약 95%까지 올릴 수 있는 폐암 진단 마커 및 선별하는 발명을 이루었고, 또한 본 발명에서 각각의 폐암 마커를 정성 및 정량 분석할 수 있는 분석법을 제공함으로써 사람의 혈청으로부터 정확하고, 쉽고 간편하게 폐암을 스크리닝 및 진단할 수 있는 방법을 제공하고 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 하기 실시 예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 정상인과 폐암으로 확진된 환자 혈청

본 실험에 사용된 시료는 정상인과 폐암으로 확진된 환자의 혈액으로, 원광대 의대병원의 임상시험연구 심의위원회의 심의를 통과하여 내원하는 사람을 대상으로 연구목적을 설명하고 자발적 동의하에 혈액검사에 사용하는 혈액의 일부로부터 혈청을 분리하였다. 자세하게는 채혈된 혈액 2 ml을 실온에서 1시간 정치한 후, 냉각원심분리기로 1,500 G에서 10분간 원심분리하여 상청액인 혈청을 1.5 ml 튜브에 분취하여 -70 ℃에 보관하였다. 추후 RIA법, ELISA법에 의한 폐암 마커 정성분석 등에 사용하였다.

실시예 2: 정상인 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 정성 분석

정상인 35명 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도는 Roche diagnostics사 (Germany)의 RIA 키트를 구입하여 제조회사에서 제공하는 실험방법으로 측정하였다.

정상인 35명 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도는 도 1과 같다. 도 1에서 알 수 있듯이 신경원 특이성 에놀라제 단백질 농도는 최고농도 11.77 ng/ml, 최저농도 3.70 ng/ml로 평균 6.255 ng/ml 이었고 표준편차는 1.735 ng/ml인 결과를 얻었다. 한편 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도는 최고농도 1.96 ng/ml, 최저농도 0.25 ng/ml인 결과를 얻었다. 위 결과는 제조사에서 제시한 정상인의 마커 농도인 최고 13.4 ng/ml (NSE) 이하와 2 ng/ml (CYFRA 21-1) 이하에 부합된 결과를 나타내었다.

실시예 3: 폐암 확진 환자 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 정성 분석

폐암으로 확진된 환자 69명 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도는 Roche diagnostics사 (Germany)의 RIA 키트 를 구입하여 제조회사에서 제공하는 실험방법으로 측정하였다.

폐암 확진 환자 69명 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도는 도 2과 같다. 도 2에서 알 수 있듯이 신경원 특이성 에놀라제 단백질 농도는 최고농도 134.92 ngml, 최저농도 3.53 ng/ml로 평균 44.265 ng/ml 이었고 표준편차는 37.869 ng/ml인 것으로 분석되었다. 제조회사에서 제시하는 정상인 농도 (13.4 ng/ml) 이상인 환자는 49명으로 71%의 진단률을 보였으며, 정상인 대조 실험군 최대값 11.7 ng/ml 이상인 환자는 51명으로 73.9% 진단률을 보였다. 한편 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도는 최고농도 48.73 ng/ml, 최저농도 0.19 ng/ml 이었으며 평균 12.29 ng/ml 이었고 표준편차는 13.42 ng/ml로 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 농도분포가 큰 것으로 나타났으며, 2 ng/ml 이상인 환자는 59명으로 85.5% 진단률을 보였다.

또한 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질이 각각 정상인 최고 11.77 ng/ml과 1.96 ng/ml 이상인 폐암환자는 43명으로 62.3% 진단률을 나타내었으며, 2개 폐암 마커중 어느 한 마커에서 정상인 최고농도보다 높은 환자는 66명으로 약 95.5% 진단률을 나타내었다.

실시예 4: 사람 혈청에 존재하는 종양 마커 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질을 정량 분석하는 ELISA 법

본 실험에 사용된 종양 마커인 인간 신경원 특이성 에놀라제 항원은 UBL 회 사 제품을, 인간 수용성 사이토 각질 19 항원은 Fitzgerald 회사의 제품을 구입하였고 각각의 항원은 정상인 혈청에 희석하여 실시예 2에 기술된 방법에 따라 RIA법으로 농도를 결정하여 ELISA법의 항원으로 사용하였다.

인간 종양 마커인 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질에 대한 capture 단일클론 항체 (Monoclonal antibody)를 1 ug/ml으로 코팅버퍼에 희석하여 96웰에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 12시간 동안 반응하여 코팅하였다. 충분한 양의 PBS-T (Phosphate Buffered Saline with 0.05% Triton-X 100)로 3회 반복 세척하여 코팅되지 않은 단일클론 항체를 제거하였다. 블로킹 완충액을 200㎕/well씩 분주한 후 실온에서 2시간 동안 배양한 후, 충분한 양의 PBS-T로 3회 반복 세척하였다. 항원으로 종양 마커인 신경원 특이성 에놀라제 항원 (150 ng/ml)과 수용성 사이토 각질 19 절편 항원 (62.5 ng/ml)은 동일한 정상인 혈청에 각각 1/3과 1/5로 4단계 희석하여 각각의 표준곡선 시료당 3개 웰과 RIA법으로 분석된 고, 중, 저 농도별 암환자 혈청 3개 시료를 100 ㎕씩 분주하고 상온에서 2시간 동안 반응한 후, 충분한 양의 PBS-T로 3회 반복 세척하였다. 각각의 항원에 대한 detection 단일클론항체를 PBS에 희석하여 웰에 100㎕씩 분주하여 상온에서 2시간 동안 반응하고 충분한 양의 PBS-T로 3회 세척하였다. Detection 단일클론 항체에 대해 양고추냉이 퍼록시다제가 표지된 다클론 항체를 PBS에 1/1000으로 희석하여 웰에 100㎕씩 분주하여 상온에서 30분간 반응하고 충분한 양의 PBS-T로 3회 세척하였다. HRP의 기질인 TMB (3,3´,5,5-tetramethylbenzidine)용액을 100㎕씩 분주하고 실온에서 30분간 발색 반응시킨 후, 1N H2SO4를 50㎕씩 분주하여 발색반응 을 정지시키고 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 각각의 종양 마커에 대한 표준곡선을 작성하였다. 동일한 실험방법으로 확진된 폐암 환자의 시료에 대한 정량분석을 수행하였다.

정량분석을 위해 작성된 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 항원에 대한 표준 곡선은 각각 도 3과 도 4와 같다. ELISA 분석법으로 분석할 수 있는 암 마커 농도는 0.1 ng/ml (NSE)과 1.85 ng/ml (CYFRA 21-1)이상이었다. 또한 환자 혈청을 시료로 ELISA법으로 분석한 암 마커의 농도는 RIA법으로 정량된 농도와 큰 차이가 없는 유의한 결과를 얻을 수 있었으나, 그 오차범위는 저 농도에서 다소 크게 나타났다.

본 실시예의 결과는 폐암 마커를 ELISA법으로 쉽고, 간편하게 정량 분석함으로 폐암을 스크리닝하고 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

실시예 5: 사람 혈청에 존재하는 종양 마커 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질을 정성 분석하는 rapid kit 제조

폐암 마커의 정성분석을 보다 빠르고 간편하게 수행할 수 있는 rapid kit를 개발하기 위하여 확보된 폐암 마커 항체를 희석용 완충액(10 mM 붕산염 완충액) 으로 2 ㎎/㎖로 희석한 후 나이트로 셀룰로즈 멤브레인용 분주기를 이용 1㎕/ cm 비율로 니이트로 셀룰로즈 멤브레인 검사선 위치에 각각의 항체를 1.0±0.2㎍/Device로 분주하였다.

토끼 면역글로블린-지를 희석용 완충액 (10 mM 붕산염 완충액)으로 농도가 4 ㎎/㎖이 되도록 희석하여 만든 용액을 pore size가 0.2 ㎛인 멤브레인 필터를 사용하여 제균 여과하고 멤브레인용 분주기를 이용하여 1 ㎕/cm 비율로 나이트로셀룰로즈 멤브레인에 분주하여 대조선 위치에 각각 항체를 2.0±0.4 ㎍/Device로 제조하였다. 코팅이 완료된 멤브레인을 소 혈청 알부민이 함유된 용액으로 봉쇄하고 37 ℃에서 항온 하여 건조한 후 조립 전까지 밀봉 포장하여 제습 상태로 보관하였다.

Gold chloride 수용액에 Na-citrate를 첨가하여 gold chloride를 환원시켜서 입자크기가 약 33±5 nm인 Colloidal gold를 제조하고, 제조된 colloidal gold에 폐암 마커에 대한 단일클론 항체를 첨가한 후, 실온에서 한 시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응이 종결된 gold particle을 세척하고 520 nm에서 흡광도 값을 측정하여 정량한 후 보존제를 첨가하였다. 동일한 방법으로 토끼 면역그로블린-지에 대한 골드 콘쥬게이트를 제조하였다.

위 과정에서 생성된 골드 콘쥬게이트를 흡광도가 0.4와 0.6이 되도록 희석한 후, 혼합하여 유리섬유에 균질하게 흡수시켜 골드 콘쥬게이트 패드를 제조하였다.

코팅한 멤브레인의 하단에 골드 콘쥬게이트 패드와 검체 패드를 순차적으로 중첩되도록 부착하고 상단에는 흡수 패드를 부착하였다. 이 시험지를 전용 절삭기로 59.0 ×4.0mm 규격으로 절단하여 디바이스 조립 전까지 방습 포장하여 보관하였다. 절단한 스트립을 플라스틱 케이스 하부에 놓은 후　상부 케이스를 덮고 건조된 실리카겔과 함께 은박포에 밀봉 포장하였다.

위 과정으로 제조된 rapid device에 실시 예 2와 3에서 사용한 항원과 검체 시료를 점적하여 폐암 마커들에 대한 정성분석 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터 제조된 rapid kit은 신경원 특이성 에놀라제 항원에 대하여 10 ng/ml 이상을 수용성 사이토 각질 19 절편 항원에 대하여 4 ng/ml 이상을 정성 분석할 수 있는 분석방법을 제공하고 있다. 따라서 제조 rapid kit은 사람 혈청을 대상으로 폐암 마커를 쉽고 간편하게 정성 분석할 수 있는 분석법을 제공함으로써 폐암의 스크리닝과 진단에 새로운 분석 방법을 제공하고 있다.

도 1은 정상인 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편의 농도를 RIA법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 2는 폐암 환자로 확진된 혈청에 존재하는 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편의 농도를 RIA법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 3은 사람 신경원 특이성 에놀라제에 대한 단일클론 항체의 역가를 ELISA법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 4는 사람 수용성 사이토 각질 19 절편에 대한 단일클론 항체의 역가를 ELISA법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 5는 사람 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편에 대한 단일클론 항체를 이용하여 즉석 (rapid) 방식의 키트 개발에 관한 결과를 나타낸 도면이다.

Claims (9)

1. 인간 종양 마커 중 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 2 종류를 모두 포함함을 특징으로 하는, 폐암 진단 마커 조합.
2. 제1항에 따른 신경원 특이성 에놀라제 및 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질의 존재를 측정하는 항체를 포함함을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
3. 제1항에 따른 신경원 특이성 에놀라제 및 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질의 존재를 측정하는 항체를 포함함을 특징으로 하는, 폐암 진단용 키트.
4. 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질에 대한 정량 및 정성 분석 둘 다를 수행하여 이들 중 하나 이상의 마커에서 정상인 최고농도 이상 농도이거나 양성반응을 보이는 사람을 폐암으로 진단함을 특징으로 하는, 폐암 진단 마커 조합.
5. 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 폐암 마커인 신경원 특이성 에놀라제 또는 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질을 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질에 대해 혈액 혹은 혈청으로부터 정성 및 정량 분석을 모두 수행함으로써 폐암 진단률이 향상됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 정성 분석에 제3항에 따른 키트를 사용함을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 정량 분석에 RIA법, ELISA법 또는 이의 변형된 분석법이 이용됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폐암 진단에 필요한 정보가, 신경원 특이성 에놀라제와 수용성 사이토 각질 19 절편 단백질 중 하나 이상의 마커에서 정상인 최고농도 이상의 농도를 나타내거나 양성반응을 나타냄으로써 제공됨을 특징으로 하는, 방법.

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