CN106802334A

CN106802334A - 一组监测癌症疾病进展和或耐药性产生的个体化标志物

Info

Publication number: CN106802334A
Application number: CN201510827734.1A
Authority: CN
Inventors: 李智立; 任俊玲
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-06-06

Abstract

本发明提供了一组监测癌症疾病进展的个体化标志物和检测这些个体化标志物的方法。该组个体化标志物包含7个磷脂酰胆碱化合物，利用这些化合物相对强度比值随治疗时间的变化可以预警癌症疾病的复发和或耐药性的产生。

Description

一组监测癌症疾病进展和或耐药性产生的个体化标志物

所属技术领域

本发明涉及用于监测医学病症如肺癌临床进展和或耐药性产生的个体化标志物和检测方法。通过检测血液中磷脂酰胆碱相对强度，计算疾病相关磷脂酰胆碱之间相对强度比值随治疗时间的变化，可以早期发现肿瘤疾病的病情进展，为肿瘤耐药性和或疾病进展和治疗提供一组新型的个体化标志物。

背景技术

肺癌具有极高的患病率以及致死率。从组织学结构分类，约有85％的肺癌可以归属为非小细胞肺癌，其5年生存率仅为10％-15％。通常大部分非小细胞肺癌患者确诊时已经处于晚期，此时，对于这些患者的治疗通常是化学治疗与放射治疗相结合。尽管表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的成功研制为广大非小细胞肺癌患者带来了曙光。但由于获得性耐药性和或癌症复发，使得这些抑制剂通常只对一部分患者有效。因此，监测肺癌患者的疾病进展变得尤为重要。

目前，临床上主要采用计算机断层扫描和核磁共振成像技术监测疾病进展。由于这些技术通常是根据患者肿瘤的大小来评估患者的疾病状态，不能在肿瘤复发和或耐药性产生的早期提供信息，对于肿瘤耐药性和或复发难以起到预警作用。因此，评估肿瘤患者预后状况需要一组简单、经济和微创伤的标志物及其检测方法。

磷脂酰胆碱(PCs)作为有机体中含量最多的磷脂，其在维持细胞膜结构及其生物学功能方面发挥重要作用。研究表明，多种癌症与体内PCs含量的变化密切相关。然而，关于肿瘤随访患者血清中PCs的变化关系目前还未见报道。申请者利用质谱技术(MS)检测并鉴定了血清中的疾病相关的PCs相对强度，发现肺癌随访患者血清中PCs相对强度比值的变化与疾病复发和或耐药性产生密切相关。

发明内容

本发明的目的是提供一组具有简单、经济和微创特点的个体化预警肿瘤复发和或耐药性产生标志物及其检测方法。

本发明利用常规的液-液萃取法提取血清中的PCs，并采用质谱技术检测并鉴定提取的PCs，然后分析血清中PCs的相对强度，将不同的PCs相对强度进行比值运算，得到疾病相关的PCs相对强度比值，依据其比值随治疗时间的变化预警肿瘤的复发和或耐药性的产生。

在进一步详细描述本发明之前，首先要定义下列术语。

定义：将疾病相关的PCs相对强度比值与其起始点相比，变化为2倍或0.5倍时的时间点标记为T1；治疗起始点至T1点的时长命名为药物反应时间；将临床上监测的疾病进展时间标记为T2(PD)；T1至T2的时长命名为疾病进展时间。

本发明所提供的血清中PCs的提取、检测及鉴定及其在监测非小细胞肺癌的进展中的应用是通过以下步骤实现的：

1)采用液-液萃取方法提取血清中的PCs；

2)将步骤1)中提取的PCs进行质谱检测；

3)将步骤2)中检测到的PCs进行质谱鉴定；

4)在步骤1)中加入的定量内标作为参照，在分析PCs的相对强度时，可将各PCs的相对强度相对内标峰值进行定量，即得到各PCs的相对强度。本发明中每个样本中都可以检测到PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(34∶3)、PC(36∶1)、PC(36∶2)、PC(36∶3)、PC(36∶4)，并得到其相对强度；

5)利用步骤4)中得到的PCs相对强度，计算PC(36∶2)/PC(36∶1)、PC(34∶3)/PC(34∶2)、PC(34∶2)/PC(34∶1)、PC(36∶2)/PC(34∶2)和PC(36∶4)/PC(36∶3)相对强度比值。

6)依据步骤5)中的比值，与治疗开始时的比值相比大于2倍或小于0.5倍时的时间点作为个体化预警肿瘤复发和或耐药性产生。

本发明每次所用样本血清体积少(10μL)，操作方法简单、易行，价廉。本发明的检测方法可以实现在相同质谱检测条件下，同时检测PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(34∶3)、PC(36∶1)、PC(36∶2)、PC(36∶3)、PC(36∶4)，依据PC(36∶2)/PC(36∶1)、PC(34∶3)/PC(34∶2)、PC(34∶2)/PC(34∶1)、PC(36∶2)/PC(34∶2)和PC(36∶4)/PC(36∶3)的相对强度比值可以实现个体化肺癌肿瘤预后监测，且可以推广至其他肿瘤疾病的病情进展和或耐药性产生的监测。

附图说明

图1一名晚期非小细胞肺癌患者某一时间点血清中PCs的代表性质谱图

图2三十一名晚期非小细胞肺癌患者在经过盐酸埃克替尼治疗8周后的临床反应情况

图3在盐酸埃克替尼治疗的整个过程中患者血清中PCs相对强度比值的变化趋势图

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。研究对象包括362份盐酸埃克替尼治疗的非小细胞肺癌随访患者的血清样本。

下述实施例中的方法，若无特殊说明，均按常规方法操作。

实施例1、(制备实施例)血清中磷脂酰胆碱的提取、检测及鉴定

1、血清中磷脂酰胆碱的提取方法

所用样本的处理方法：全血在4℃ 3000g离心10min，用移液器吸取上清到新的离心管中；12,000g离心10min，将上清小体积分装于新的离心管中，保存于-80℃冰箱中。血清样本置于4℃解冻后，取10μL与150μL甲醇-乙腈混合溶剂(3∶2，v/v)混合，并加入40μL内标溶液(3.2μMPC(36∶0))，涡旋30s混匀，放置于-20℃过夜。然后将混合物置于离心机中以19,000g离心30min，以去除蛋白。取出10μL上清液分别加入50μL二氯甲烷和20μL水涡旋混匀，1,300g转速下离心5min，吸取二氯甲烷层置于管内，自然挥干后，存放于-80℃待用。

2、磷脂酰胆碱的检测及鉴定

1)用10μL甲醇/水(1∶1，v/v)将上述挥干样本重新溶解，取0.3μL重溶液点于MTP AnchorChip^TM靶，挥干之后在样本痕迹上方覆盖上0.3μL 5mg/mL 2，5-二羟基苯甲酸溶液(甲醇/水，1∶1，v/v)，挥干后进行质谱分析。

检测仪器：傅立叶变换离子回旋共振质谱仪，配有基质辅助激光解吸电离源、ApexControl 3.0.0数据采集软件和Data Analysis 4.0(Bruker Daltonics)数据处理软件；

质谱条件：Nd：YAG激光器，激光波长355nm，正离子模式，仪器分辨率在m/z 400时为530,000；

由于患者血清中的磷脂酰胆碱的类型相同，所以本发明只列出一名患者某个时间点的质谱图结果(见附图1)。

2)质谱数据的获取：质谱图中的数据信息(m/z和绝对强度)利用提峰软件获取，以信噪比≥3、相对强度＞0.1％，绝对强度＞100,000，并具有可靠同位素峰为选取标准。结果导入Microsoft Excel进行分析。去除同位素峰后，设定不同样本中的质谱峰m/z相差在±0.0015Da范围内，即所有样本质谱峰m/z偏移±0.0015Da以内认为是同一个分子，并且在正谱中同一个化合物的[M+H]⁺和[M+Na]⁺两种离子的峰强度加在一起作为一个变量。如果出现缺失值，则用该图谱基线强度的一半值代替。每个峰强度均通过内标PC(36∶0)(m/z 790.6320)校正。

3)磷脂酰胆碱的鉴定：(1)高分辨质谱获得分子的精确质量(观测值)，利用数据库提供的不同脂类信息，推测对应可能的脂类分子并计算其理论分子量，采用质谱检测所得的观测值与理论值误差在±0.0015Da以内，则认为是同一物质；(2)二级谱结合脂类分子测量同位素分布和理论同位素分布(强度相对误差＜5％)进一步确定其分子结构。鉴定结果见图1。

实施例2、(应用实施例)不同PCs相对强度比值用于监测非小细胞肺癌患者的疾病进展。

1、所用血清样本的信息如下表1所示。

2、三十一名非小细胞肺癌患者在经过盐酸埃克替尼治疗8周后的临床反应情况，见附图2。

3、将362份盐酸埃克替尼治疗的非小细胞肺癌随访患者的血清样本按照实施例1中的方法进行PCs的提取、检测，每个样本分别取10μL血清。

4、按照实施例1中的方法获得每份样本的质谱数据，输入excel表，建立数据库并计算PCs相对强度的比值，按照每一名患者不同时间点的PCs相对强度比值与时间点做图，附图3所示即为5名患者代表性PCs比值在治疗过程中的变化趋势示意图。尽管这些患者在盐酸埃克替尼治疗开始时具有不同的PCs相对强度比值，但是他们在治疗过程中的变化趋势具有相似性。如附图3-A所示，患者#7的PC(36∶2)/PC(36∶1)比值在治疗初始时基本没有发生变化，随着治疗时间的增长，比值逐渐升高直至峰值，然后逐渐下降至基线。利用PC(36∶2)/PC(36∶1)比值变化可以预警肿瘤进展或耐药性产生的患者共有15例。患者#29的PC(34∶3)/PC(34∶2)比值在治疗初始时基本没有改变(附图3-B)，这一比值在治疗的第10至第50周中发生了一个小的波动，随后升至峰值，然后逐渐下降至基线。利用PC(34∶3)/PC(34∶2)比值变化可以预警肿瘤进展或耐药性产生的患者共有13例。其余三名患者的肿瘤复发或耐药性产生可以分别利用PC(34∶2)/PC(34∶1)、PC(36∶2)/PC(34∶2)和PC(36∶4)/PC(36∶3)的比值变化进行预警，如附图3-C、3-D及3-E所示。统计结果表明药物反应时间的中位数时长为18周(95％CI：15.3-20.7周)，比临床影像学获得无疾病进展期提前19周。这一结果表明疾病相关PCs比值是一组可以个体化预警肿瘤患者病情进展和或耐药性产生的有效方法，这对随访肿瘤患者的用药方案确定具有重要的临床意义。

如此，利用本发明的个体化标志物的PCs比值随治疗时间的变化，可以监测非小细胞肺癌的疾病进展和或耐药性产生。

综上所述，本发明所提供的以血清中不同的疾病相关PCs比值作为确定或辅助监测疾病进展和或耐药性产生的模型具有个体化特征，并且能够在临床影像学之前确定疾病发生进展和或耐药性产生。其消除了现有技术的缺点，即发明了一组可快速实施的、非侵入性、个体化标志物，并且比临床影像学方法可以更灵敏的监测癌症进展和或耐药性的产生。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。毫无疑问，本发明的方法可以推广至其他一些肿瘤进展和或耐药性产生的监测。因此，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样在本发明的保护范围。

表1样本的基本信息

Claims

1.一组确定或辅助监测癌症疾病进展和或耐药性产生的个体化标志物，其特征在于，包括选自如下一组磷脂酰胆碱：(PCs)：PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(34∶3)、PC(36∶1)、PC(36∶2)、PC(36∶3)和PC(36∶4)。

2.根据权利要求1所述的个体化标志物，其特征在于，它们是两种PCs的相对强度比值：PC(34∶2)/PC(34∶1)、PC(34∶3)/PC(34∶2)、PC(36∶2)/PC(36∶1)、PC(36∶2)/PC(34∶2)和PC(36∶4)/PC(36∶3)。

3.根据权利要求2所述的个体化的PCs相对强度比值，其特征在于，它们的比值变化大于2倍或小于0.5倍时可以个体化的预警癌症患者的疾病进展将要发生或正在发生。

4.根据权利要求2所述的个体化的PCs相对强度比值，其特征在于，它们的比值变化大于2倍或小于0.5倍时可以个体化的预警癌症患者的耐药性产生。

5.一种确定或辅助监测癌症疾病进展和或耐药性产生的方法，其特征在于，所述的检测步骤包括：

a、从对象血液中提取PCs；

b、对提取的PCs进行检测；

c、计算PCs相对强度比值，确定其比值随治疗时间的变化倍数。

6.一种确定或辅助监测癌症疾病进展和或耐药性产生的方法，其特征在于，用于检测如权利要求2、3、4中所述的个体化标志物及计算其相对强度比值。