EA031771B1 - Биологический микрочип для количественного определения иммуноглобулинов классов e и g в биологических жидкостях и способ проведения анализа с его использованием - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу, и касается биологического микрочипа на основе гидрогелей для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов E и G в биологических жидкостях. Биологический микрочип содержит элементы с различными иммобилизованными аллергенами, способными вызывать у человека аллергические реакции с участием иммуноглобулинов классов E и G, а также элементы с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса E в разных концентрациях и элементы с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса G в разных концентрациях для построения внутренних калибровочных кривых. Изобретение также относится к способу проведения одновременного количественного анализа аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов E и G на биологическом микрочипе с использованием внутренних калибровочных кривых. Изобретение может найти применение для диагностики и мониторинга лечения аллергий различного типа, в которых принимают участие иммуноглобулины классов E и G.

Description

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу, и касается биологического микрочипа на основе гидрогелей для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G в биологических жидкостях. Биологический микрочип содержит элементы с различными иммобилизованными аллергенами, способными вызывать у человека аллергические реакции с участием иммуноглобулинов классов Е и G, а также элементы с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса Е в разных концентрациях и элементы с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса G в разных концентрациях для построения внутренних калибровочных кривых. Изобретение также относится к способу проведения одновременного количественного анализа аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G на биологическом микрочипе с использованием внутренних калибровочных кривых. Изобретение может найти применение для диагностики и мониторинга лечения аллергий различного типа, в которых принимают участие иммуноглобулины классов Е и G.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу, и касается биологического микрочипа на основе гидрогелей, содержащего иммобилизованные аллергены и иммобилизованные иммуноглобулины человека, для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G в биологических жидкостях, а также способу проведения одновременного количественного анализа аллергенспецифичных иммуноглобулинов классов Е и G на биологическом микрочипе.

Предлагаемое изобретение может найти применение в аналитической биохимии, иммунологии и медицине, в частности, при диагностике аллергий различного типа, в которых принимают участие иммуноглобулины классов Е и G.

Уровень техники

Аллергия - это реакция повышенной чувствительности, инициируемая определенным иммунным механизмом. Повышенная чувствительность (гиперчувствительность) проявляется в виде объективно воспроизводящихся симптомов или признаков, возникающих при контакте с определенными раздражителями, причем раздражители в такие количествах не вызывают реакцию у людей, не страдающих аллергией (Johansson S.G., Bieber Т., et al. Revised nomenclature for allergy for global use Report of the Nomenclature Review Committee of the World Allergy Organization, October 2003. J. Allergy Clin. Immunol., 2004, v. 113 (5), p. 832-836). Аллергические заболевания являются чрезвычайно важной медицинской и социальной проблемой во всем мире. От различных проявлений аллергии страдают от 20 до 40% населения земли. Аллергия может протекать в таких формах, как аллергическая астма, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, экзема, контактный дерматит, аллергическая крапивница, пищевая или лекарственная аллергия, анафилаксия.

Распространение аллергии и рост заболеваемости связаны с окружающими условиями, ухудшением экологический обстановки и наличием продуктов экономической активности человека: отходов различных производств, гербицидов, пестицидов, химических удобрений, которые попадают в организм человека вместе с пищей и питьевой водой. Заболеваемость аллергическими болезнями неуклонно увеличивается: за последние три десятилетия количество страдающих от аллергии удваивается каждые 10 лет. Существует острая необходимость в полной и точной диагностике аллергических и связанных с ними заболеваний, а также в эффективном контроле лечения пациентов.

Аллергены, как правило, не индивидуальные вещества, а смеси белковых и небелковых соединений. Согласно классификации по Кумбсу и Джеллу существует 4 различных типа аллергических реакций в зависимости от внутреннего механизма и типа аллергена.

Тип 1 (так называемая истинная аллергия) - реакция немедленного типа, клинические проявления которой появляются через 15-20 мин. Реакция основана на высвобождении гистамина, происходящего с участием иммуноглобулинов Е (IgE). К заболеваниям, развивающимся по 1 типу, относятся анафилактический шок, атопическая бронхиальная астма, аллергический ринит, крапивница, аллергическая астма. Симптомы включают сенную лихорадку, покраснение и опухание кожных покровов, экзему, воспаление слизистых оболочек.

Тип 2 - реакция цитотоксического типа, происходящая с участием IgG и IgM. Иммунный ответ вызывается компонентами клеток, например, при переливании крови. Антигенами для возникновения реакции этого типа являются клеточные компоненты или вещества, с ними связанные, например резусфактор.

Тип 3 - реакция иммунокомплексного типа. Возникает в результате образования циркулирующих иммунных комплексов с участием в основном IgG. Воспалительная реакция появляется через 2-3 ч после контакта с аллергеном. Происходит активация системы комплемента, приводящая к воспалительным процессам в сосудах и тканях. Основными антигенами для возникновения реакции 3-го типа являются вирусные и бактериальные антигены, аутоантигены (ДНК, РНК и др.), профессиональные антигены (птицы, плесневые грибки) и, возможно, макромолекулы пищи.

Тип 4 - гиперчувствительность замедленного типа. Заболевание развиваются через 24-48 ч после контакта с аллергеном. Рецепторы сенсибилизированных Т-лимфоцитов специфически взаимодействуют с аллергенами, выделяя медиаторы клеточного иммунитета лимфокины, которые вызывают скопление макрофагов и других лимфоцитов, в результате чего возникает воспаление. Типичные заболевания - контактные аллергии, например контактная кожная экзема. Основными антигенами для возникновения реакции этого типа являются гаптены, такие как никель, хроматы и др.

Иммуноглобулин G составляет 75-80% антител сыворотки крови (концентрация 10-20 мг/мл), IgM около 10%, IgE - около 0,002%. Концентрация общего IgE в сыворотке крови сильно зависит от возраста; для здоровых взрослых людей она составляет до 85 МЕ/мл (1 ME соответствует 2.4 нг/мл, WHO Ref. 75/502). У лиц, страдающих аллергией, уровень IgE часто повышен.

Для эффективного лечения аллергии важно не только диагностировать сам факт наличия заболевания, но и выявить индивидуальные источники, вызывающие аллергию, чтобы прекратить или уменьшить их влияние на организм и провести адекватную иммунотерапию. Для этого необходимо определить, какие именно аллергены или компоненты аллергенов ответственны за аллергическую реакцию и каков их

- 1 031771 уровень у пациента.

Традиционным методом диагностики аллергии 1-го типа являются кожные пробы, в частности пробы тест-уколом. Пробы тест-уколом обычно делаются на коже предплечья с такими аллергенами, как пыльцевые, аллергены домашней пыли, пищевые. Не существует серологических методов идентификации аллергии замедленного типа (тип 4), и в этом случае используются аппликационные кожные пробы. Кожные тесты высокочувствительны, но имеют низкую специфичность и высокую вариабельность результатов из-за индивидуальной восприимчивости пациента, умения лаборанта и метода оценки кожной реакции. Основным клиническим недостатком кожных проб является риск провокация повышенной сенсибилизации к тестируемому аллергену, а также к другим аллергенам. Кожные пробы нельзя проводить во время лечения аллергии.

Еще более опасными для пациента являются провокационные тесты, проводимые при непосредственном контакте аллергена с органом пациента: назальный, бронхиальный, тест на пищевые аллергены. Следует ожидать возможного развития анафилактической реакции. Такие тесты необходимо проводить только под наблюдением врача.

Для определения некоторых типов аллергий (лекарственных и латексной аллергий, контактных дерматитов и др.) используют иммуноблоттинг (разделение белковых смесей на основе молекулярной массы), тест пролиферации лимфоцитов, тест дегрануляции базофилов, однако эти тесты проводятся в основном в научно-исследовательских, а не в медицинских лабораториях, и информативность этих тестов недостаточно изучена (Аллергология и иммунология. Национальное руководство, изд. группа ГЭОТАР-Медиа, М: 2009, гл. 1).

Современным методом диагностики аллергий 1-го типа является определение уровня аллергенспецифичных и общих иммуноглобулинов Е in vitro. Преимуществом метода является отсутствие контакта пациента с аллергенами, т.е. полная безопасность для пациента, возможность выявления сенсибилизации к большому количеству аллергенов; лабораторное исследование можно проводить у пациентов любого возраста и в период обострения и лечения заболевания. Метод основан на связывании специфичных IgE из биологического образца с аллергенами, иммобилизованными на твердом носителе, например в иммунологическом планшете, с последующим проявлением анти-IgE антителами. Используются радиоаллергосорбентный тест (PACT) с анти-IgE, меченными радиоактивной меткой, иммуноферментный анализ (конъюгаты анти-IgE с ферментами), иммунофлюоресцентный анализ и др. (Hubscher T.T., A New in vitro Allergy Diagnostic System: The Acti Tip Allerg E and Allerg Ens Test System for the Determination and Quantitation of Total Serum IgE and Allergen Specific IgE in Human Serum, Allerg. Immunol. (Paris), 1990, vol. 22 (9), p. 360-366; Hamilton R.G. and Adkinson N.F., In vitro Assays for the Diagnosis of IgEMediated Disorders, J. Allergy Clin. Immunol., 2004, v. 114 (2), p. 213-225).

Коммерческие ИФА-системы (наборы для иммуноанализа IgE) выпускаются сейчас рядом компаний, наиболее известными из которых являются фирма Phadia (Pharmacia Diagnostics, Швеция, Dr. Fooke Laboratorien (Германия, http://fooke-labs.de), Cypress Diagnostics (Бельгия), Hycor Biomedical (США). Наличие калибровочных проб (стандартных сывороток) с известным содержанием аллергенспецифичных IgE (WHO 75/502) позволяет проводить количественное или полуколичественное определение различных иммуноглобулинов в крови пациента.

Широкое применение в качестве твердых носителей для ковалентного связывания аллергенов получили в последнее время целлюлозные диски (аллергодиски), которые при проведении анализа помещаются в лунки иммунологического планшета. Аллергодиски выпускаются, например, компаниями Allergopharma, R-Biopharm AG, Германия и Dr. Fooke Laboratorien, Германия. Разработаны также тестсистемы для анализа IgE методом реверсивного иммуноанализа, при котором в лунках планшета сорбированы анти-IgE-антитела и используются биотинилированные аллергены (Dr. Fooke Laboratorien, Германия).

Относительно недавно несколькими фирмами начали выпускаться наборы для определения антител класса IgG (IgG4), которые используются в основном для контроля иммунотерапии. Определение иммуноглобулинов не только IgE, но и IgG класса позволяет более надежно диагностировать аллергическое заболевание и определить его тип.

Благодаря хорошей чувствительности и специфичности, наличию стандартной аппаратуры, позволяющей автоматизировать процедуру анализа, например автоматических микропланшетных анализаторов, иммунологические методы получили широкое распространение во всем мире. Недостатком традиционных методов является то, что они позволяют в одном анализе определить, как правило, уровень только одного аллерген-специфичного иммуноглобулина или одной группы иммуноглобулинов в образце, в то время как для современной диагностики аллергических заболеваний необходим параллельный высокочувствительный анализ целого ряда иммуноглобулинов, специфичных к аллергенам, принадлежащих к различным группам.

Существует несколько тест-систем для одновременного определения различных аллергенспецифичных иммуноглобулинов в образце крови пациента, основанных на принципе иммуноблотинга. В тест-системе IVT Allergy Screen компании Arlington Scientific (США) (www.arlingtonscientific.com) для полуколичественного анализа аллергены иммобилизованы внутри капиллярной трубки. Образцы

- 2 031771 сыворотки крови и проявляющие агенты (коньюгат анти-IgE с ферментом уреазой) вносятся в капилляр с помощью шприца. Уровень аллергенов оценивается по степени окрашивания индикатора. Имеется тест на 11 различных смесей ингаляционных аллергенов, включая пыльцевые, плесневые и клещевые аллергены, тест на ряд ингаляционных и пищевых аллергенов, возможно определение общего IgE. Система включает положительный и отрицательный контроли.

Полуколичественный иммуноферментный экспресс-анализ осуществляется также на нитроцеллюлозных полосках фирмы Heska, Швейцария (www.heska.com) с сорбированными аллергенами и/или смесями аллергенов. По результатам анализа (окрашивание полосок) содержание аллерген-специфичных иммуноглобулинов оценивается по 4 уровням.

Данные простые тест-системы не осуществляют точную оценку концентрации аллергенспецифичных иммуноглобулинов в образце. Они могут использоваться только для предварительной оценки наличия аллергии у пациента, и для диагностики требуется подтверждение результатов более точными методами.

Существуют более сложные системы для одновременного определения ряда аллерген-специфичных иммуноглобулинов. Компанией Hitachi (Япония) разработан множественный аллергосорбентный тест с применением хемилюминесцентного анализа (тест-система MAST-CLA). Для анализа используется панель, представляющая собой полый прозрачный пластмассовый корпус с параллельно расположенными внутри тонкими целлюлозными нитями, на которых адсорбированы аллергены; панель заполняется сывороткой крови пациента. После инкубации с образцом и промывания добавляют проявляющий реагент, включающий люминол и Н₂О₂. Анализ проводится в автоматическом анализаторе (люминометре) MAST-CLA 1 (Lee S., Lim H.S., et al., A new automated multiple allergen simultaneous test-chemiluminescent assay (MAST-CLA) using an AP720S analyzer. Clin. Chim. Acta, 2009, v. 402, p. 182-188). Имеется несколько типов панелей аллергенов, включающих до 36 аллергенов, например пищевая панель, смешанная российская панель и др. Этот метод является одним из самых чувствительных на сегодняшний день методов в определении специфичных IgE и IgG, минимальная определяемая концентрация IgE составляет 0,52 нг/мл. К недостаткам данного метода относятся его недостаточная точность, а также дороговизна прибора и реагентов для хемилюминесцентной детекции.

Принцип иммуноблотинга используется при анализе аллерген-специфичных иммуноглобулинов в системе RIDA AllergyScreen компании R-Biopharm AG (Германия, http://www.r-biopharm.com). Аллергены нанесены на поверхность нитроцеллюлозных мембран (стрипов) по 20 тест-полос на каждом стрипе, каждая полоска заключена в пластиковую кассету. Выпускаются, например, панель 20 респираторных аллергенов, панель 20 пищевых аллергенов, смешанная панель, педиатрическая панель из 20 аллергенов и др. IgE-антитела, специфичные к аллергенам, присутствующие в образцах пациентов, реагируют с аллергенами на стрипах и далее с проявляющими антителами (анти-IgE человека, конъюгированные с биотином), и конъюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза. Результаты оцениваются по интенсивности окрашивания продукта, полученного в результате ферментативной реакции, и исследуемый образец относят к одному из классов аллергореактивности (от 0 до 6). Недостатком данного метода является ограниченное число одновременно анализируемых аллерген-специфичных иммуноглобулинов в панели (до 20). Кроме того, используемый способ расчета по интенсивности окраски с помощью сканера не обладает достаточной точностью.

Основными направлениями дальнейшего развития и совершенствования методов аллергодиагностики являются их миниатюризация, повышение чувствительности и возможность проведения одновременного многопараметрического анализа.

Компания Phadia AB (Швеция, http://www.phadia.com) выпускает автоматическую систему ImmunoCAP 250, которая помимо приборной части содержит набор микроколпачков с иммобилизованными аллергенами. Разнообразные типы аллергенов (более 300 типов) представлены в формате 1 аллерген - 1 колпачок. Концентрации общего и специфичных IgE в крови автоматически рассчитываются по калибровочным кривым, полученным в ходе проведения иммуноанализа исследуемых растворов и контрольных образцов. Многопараметрическое тестирование образца в данной системе достигается путем одновременного проведения большого количества индивидуальных анализов на каждый аллергенспецифичный иммуноглобулин. В результате использование этой системы для расширенной клинической диагностики, например, в педиатрии затруднено, поскольку для анализа панели специфичных иммуноглобулинов требуется большой объем забираемой крови. Кроме того, стоимость анализов для пациента оказывается очень высокой.

Задача проведения многопараметрического анализа при минимальном объеме тестируемого образца решается при использовании биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды (ДНК, олигонуклеотиды, олигосахариды, белки и др.). Создание биочипов позволило осуществить перенос макроварианта иммунохимического анализа в формат микрочипа и проводить одновременный количественный анализ биологического образца для определения концентраций нескольких анализируемых веществ, что заменяет несколько индивидуальных иммунохимических тестов. Использование технологии микрочипов для проведения лабораторных исследований позволяет миниатюризировать и упростить процедуру анализа, в частности анализа аллерген-специфичных имму

- 3 031771 ноглобулинов, по сравнению с другими in vitro тестами (Ferrer M., Sanz M.L., et al., Molecular Diagnosis in Allergology: Application of the Microarray Technique, J. Investig. Allergol. Clin. Immunol., 2009, v. 19, p. 1924). Разработка микрочипов для анализа аллергенов тесно связана с развитием технологии получения белковых микрочипов.

Для анализа аллерген-специфичных иммуноглобулинов на микрочипах обычно используют мультиплексный твердофазный иммуноанализ, при котором аллергены иммобилизованы на подложке. Специфические антитела, присутствующие в сыворотке пациента, захватываются иммобилизованными аллергенами и далее микрочипы проявляют с помощью меченых видоспецифичных антител (Harwanegg С. and Hiller R., Protein Microarrays for the Diagnosis of Allergic Diseases: State-of-the-Art and Future Development, Clin. Chem. Lab. Med., 2005, v. 43, p. 1321-1326).

В большинстве работ, посвященных анализу иммуноглобулинов, ответственных за аллергическую реакцию, на микрочипах, микрочипы являются двумерными, т.е. аллергены находятся на поверхности носителя; при этом аллергены могут быть либо адсорбированы, либо ковалентно связаны с подложкой. Для увеличения количества аллергена, связанного с поверхностью носителя, используются различные спейсеры. К недостаткам двумерных чипов относятся денатурация белков на поверхности носителя и на границе раздела фаз, приводящая к потере белками функциональной активности, недостаточная концентрация активных белков в ячейках микрочипа и, вследствие этого, невысокая чувствительность анализа.

Описано также применение рекомбинантных аллергенов, иммобилизованных на микрочипах (Harwanegg С., Laffer S., Hiller R., et al., Microarrayed Recombinant Allergens for Diagnosis of Allergy, Clin. Exp. Allergy, 2003, v. 33, p. 7-13). Отмечается, что использование рекомбинантных аллергенов в комбинации с технологией микрочипов приведет к созданию новых форм мультиаллергенных тестов, которые позволят в одном анализе определить и следить за изменением комплексных профилей сенсибилизации у пациентов, страдающих аллергией.

Компанией VBC Genomics Bioscience Research GmbH (компания далее была объединена с компанией Phadia, Швеция, http://www.phadia.com/) описан способ обнаружения аллерген-специфичных иммуноглобулинов на двумерном микрочипе (международная патентная заявка WO 2002/029415). Способ включает иммобилизацию одного и более аллергенов на микрочипе, причем аллергены наносят в виде пятен диаметром 10-2000 мкм на твердую поверхность (предметное стекло, лунку иммунологического планшета, различные мембраны и др.); исследуемый образец инкубируют в присутствии иммобилизованных аллергенов и далее осуществляют детекцию иммуноглобулинов, связавшихся с аллергенами.

Компанией Phadia (http://www.phadia.com) изготавливаются аллергочипы ImmunoCAP ISAC, содержащие 103 природных и рекомбинантных аллергена, иммобилизованных на подложке в виде пятен. Образец сыворотки крови наносят на микрочип, и после инкубации с раствором флуоресцентно меченных анти-IgE антител регистрируют флуоресцентный сигнал с ячеек микрочипа при помощи конфокального сканера. Программное обеспечение позволяет качественно определить уровень аллергенспецифичных IgE по трем калибровочным точкам, расположенным на микрочипе. Результат выдается в специальных единицах измерения (ISAC Standardized Units), величина которых соответствует четырем классам аллергических реакций: отрицательная, низкая, средняя и высокая). К недостаткам данного метода можно отнести высокую стоимость одного микрочипа (более 10 тыс. руб.) и то, что данный метод не позволяет количественно определить содержание специфичных IgE в образце и не может быть использован для точной диагностики и, главное, для мониторинга хода лечения аллергии.

Randox Laboratories Ltd. запатентована технология производства двумерных микрочипов для анализа аллерген-специфичных IgE (патент US 2003/0073249), а также способ проведения анализа с использованием калибровочной кривой на микрочипе (патент US 7846713). Аллергены иммобилизованы на твердом носителе (нитроцеллюлозе, полистироле и др.). По технологии фирмы Randox получен микрочип для определения специфичных IgE, представляющий собой стеклянное предметное стекло, на которое нанесено 94 различных аллергена. Использовали очищенные аллергены-белки как рекомбинантные, так и из природных источников, а также пептиды и низкомолекулярные соединения (Hiller R., Laffer S., Harwanegg C., et al., Microarrayed Allergen Molecules: Diagnostic Gatekeepers for Allergy Treatment, FASEB J., 2002, v. 15, p. 414-416). Описан также микрочип для определения антител к пищевым аллергенам (Harwanegg С., Hutter S., and Hiller R., Allergen Microarrays for the Diagnosis of specific IgE against Components of Cow's Milk and Hen's Egg in a Multiplex Biochip-Based Immunoassay, Methods Mol. Biol., 2007, v. 385, p. 145-157).

Двумерные микрочипы для анализа аллергенов описаны также в следующих работах:

Vigh-Conrad K.A., Conrad D. F., and Preuss В., A Protein Allergen Microarray Detects Specific IgE to Pollen Surface, Cytoplasmic, and Commercial Allergen Extracts, PLoS One, 2010, v. 5 (4), e10174). Аллергены наносили на эпокси-активированные стеклянные слайды;

Cretich M., Breda D., et al Allergen microarrays on high-sensitivity silicon slides, Anal. Bioanal. Chem., 2010, v. 398 (4), p. 1723-1733. Для иммобилизации аллергенов использовали кремниевые стекла, на которые был нанесен полимер для увеличения площади поверхности;

Kim E., Park S.W., Cho N.Y., et al., Quantitative Measurement of Serum Allergen-Specific IgE on Protein Chip, Exp. Mol. Med., 2002, v. 34 (2), p. 152-158. Для анализа аллергенов использовали белковые микро

- 4 031771 чипы, в которых белки-аллергены нанесены на нитроцеллюлозную мембрану;

Fall B.I., Eberlein-Konig В., Behrendt H., et al., Microarrays for the Screening of Allergen-Specific IgE in Human Serum, Anal. Chem, 2003, v. 75, p. 556-562. Аллергены иммобилизованы на поверхности стеклянного предметного стекла, активированного производным триметоксисилана;

Mezzasoma L., Bacarese-Hamilton Т., Di Cristina M., et al., Antigen Microarrays for Serodiagnosis of Infectious Diseases, Clin. Chem., 2002, v. 48 (1), p. 121-130. Микрочип получен путем нанесения растворов аллергенов на поверхность активированного стеклянного предметного стекла. Микрочип также содержит элементы с иммобилизованными IgG и IgM, формирующими внутренние калибровочные зависимости, по которым определяется содержание аллергенов в образце.

В работе Lebrun S.J., Petchpud W.N., Hui A., and McLaughlin C.S., Development of a Sensitive Colorometric Microarray Assay for Allergen-Responsive Human IgE, J. Immunol. Methods, 2005, v. 300 (1-2), p. 2431. Аллергены для иммобилизации наносили на трехмерный высокопористый носитель Zeta-GripTM. В этом случае достигалась большая степень иммобилизации по сравнению с плоскими поверхностями, однако в этом случае иммобилизация зондов (аллергенов) происходит неравномерно, в основном на поверхности слоя, что приводит к ухудшению чувствительности и воспроизводимости анализа.

В международной публикации заявки WO 2006/071132 (Институт молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН) описан биологический микрочип на основе трехмерных гидрогелей для одновременного иммунологического анализа различных соединений и способы иммуноанализа, в которых биочип используется. Биологический микрочип может одновременно содержать ячейки с иммобилизованными белками, олигонуклеотидами и низкомолекулярными соединениями, причем в каждой отдельной ячейке иммобилизовано индивидуальное соединение. Поскольку природные аллергены (экстракты) представляют собой, как правило, не индивидуальные соединения, а смеси (миксты) белков, отличающихся друг от друга по молекулярной массе и физико-химическим свойствам, и низкомолекулярные соединения, описанный в патенте биочип нельзя использовать для проведения анализа большинства аллергенспецифичных антител, т.е. для анализа аллергий различных типов.

Недостатки микрочипов для анализа аллергенов, известных из уровня техники, и способов иммунологического анализа, в которых они используются, преодолены настоящим изобретением, обеспечивающим биологический микрочип на основе трехмерных гидрогелей, содержащий элементы, в которых иммобилизованы аллергены или смеси аллергенов, для определения аллерген-специфичных IgE и IgG и элементы для формирования внутренней калибровочной зависимости. Микрочип используется для одновременного количественного анализа различных аллерген-специфичных IgE и IgG в крови человека и других биологических жидкостях. Определение концентрации IgE и IgG проводится с использованием элементов микрочипа, которые формируют внутреннюю калибровочную кривую, т.е. анализ в формате один пациент - один микрочип. Изобретение также обеспечивает способ количественного определения аллерген-специфичных IgE и IgG с использованием трехмерного биологического микрочипа. Для проведения одновременного количественного анализа аллерген-специфичных IgE и IgG в одном из воплощений изобретения микрочип после взаимодействия с образцом обрабатывают конъюгатами антител против IgE и антител против IgG, излучающих свет в различных областях спектра, и при этом калибровочные зависимости для определения IgE и IgG получают от одних и тех же элементов микрочипа.

Раскрытие изобретения

Первым аспектом изобретения является биологический микрочип для количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е (IgE) и G (IgG) в крови человека и других биологических жидкостях. Биологический микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, расположенных на подложке из стекла или пластика. Элементы массива представляют собой микрокапли заданного объема, полученные методом полимеризационной иммобилизации и содержащие ковалентно связанные лиганды. В данном случае микрочип содержит иммобилизованные аллергены, способные вызывать у человека аллергические реакции с участием IgE и IgG, а также иммобилизованные иммуноглобулины человека IgE и IgG в разных концентрациях. Каждый элемент массива содержит либо иммобилизованный аллерген (смесь аллергенов), либо иммобилизованные IgE, либо иммобилизованные IgG. Микрочип позволяет проводить одновременное количественное определение ряда специфичных IgE и IgG в одном образце, что чрезвычайно важно для диагностики аллергии.

Трехмерные элементы гидрогелевого микрочипа обладают большой емкостью, во много раз превышающей емкость элементов двумерных микрочипов. В качестве лигандов могут выступать соединения белковой и небелковой природы. В элементах массива может быть иммобилизован аллерген, выделенный из одного источника (пыльца березы, коровье молоко, пенициллин, пчелиный яд, латекс и др.), или смесь (микст) аллергенов, принадлежащих одной или разным группам, например микст аллергенов из группы грибов, микст аллергенов из группы эпителиев, бытовой микст (смесь, включающая клещей Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae, эпителий и шерсть кошки, эпителий и шерсть собаки). Гидрофильное окружение лигандов внутри гелевых элементов позволяет полностью сохранить их биологическую активность.

Аллергены или смеси аллергенов, иммобилизованные в гидрогелевых элементах микрочипа, могут представлять собой соединения или смеси соединений белковой и небелковой природы, выделенные из

- 5 031771 природных источников, а также соединения небелковой природы, полученные синтетическим путем, или аллергены белковой природы, полученные генно-инженерными методами. Для иммобилизации могут также использоваться конъюгаты аллергенов белковой и небелковой природы с различными соединениями.

Биологический микрочип, предлагаемый в данном изобретении, предназначен для количественного определения аллерген-специфичных IgE и IgG в биологических жидкостях. Биологические жидкости включают сыворотку крови, плазму крови, выделения из носовой полости, бронхиальный (альвеолярный) лаваж, но не ограничиваясь ими.

В элементах с иммобилизованными аллергенами происходит связывание как специфичных IgE, так и специфичных IgG из образца, что делает возможным определение их концентраций после обработки микрочипа проявляющими растворами, содержащими антитела против IgE и IgG, содержащими детектируемые метки.

В элементах массива с иммобилизованными IgE и IgG происходит образование комплексов с антителами против IgE и IgG из проявляющего раствора, содержащими детектируемые метки, и сигналы из этих элементов используются в качестве калибровочных при количественном определении концентраций аллерген-специфичных IgE и IgG.

Биологический микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, содержащих иммобилизованные аллергены, иммобилизованные иммуноглобулины класса Е (IgE) в разных концентрациях и иммобилизованные иммуноглобулины класса G (IgG) в разных концентрациях, и предназначен для количественного определения аллерген-специфичных IgE и IgG. Концентрации IgE и IgG определяются по калибровочным зависимостям, полученным непосредственно на микрочипе на элементах, содержащих иммобилизованные в разных концентрациях IgE и IgG.

Биологический микрочип, являющийся предметом данного изобретения, позволяет по калибровочным зависимостям определить концентрацию (количество) каждого из анализируемых аллергенспецифичных иммуноглобулинов в исследуемом образце и/или уровень каждого из анализируемых аллерген-специфичных иммуноглобулинов, например уровень 1, низкий (низкая концентрация иммуноглобулинов для аллергенов определенного типа), уровень 2, средний (средняя концентрация иммуноглобулинов для аллергенов определенного типа), уровень 3, умеренно высокий (умеренно высокая концентрация иммуноглобулинов для аллергенов определенного типа) и т.д. Именно уровни аллергенспецифичных иммуноглобулинов имеют терапевтическую и прогностическую ценность для врача при диагностике и лечении аллергий различного типа.

Вторым аспектом изобретения является способ одновременного количественного определения различных аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G в биологических жидкостях с использованием биологического микрочипа по первому аспекту, включающий:

а) взаимодействие биологического микрочипа с биологическим образцом в условиях, обеспечивающих образование специфических иммунных комплексов аллергенов, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с соединениями, содержащимися в анализируемом образце;

б) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;

в) количественное определение иммуноглобулинов, входящих в состав указанных комплексов.

На первой стадии определения проводят инкубацию биологического микрочипа с анализируемым образцом. В качестве образца используются (разбавленные или неразбавленные) сыворотка крови, плазма крови, выделения из носовой полости, бронхиальный (альвеолярный) лаваж, но не ограничиваясь ими. На этой стадии происходит образование специфических иммунных комплексов внутри гидрогелевых элементов микрочипа: иммобилизованные аллергены - аллерген-специфичные IgE и IgG из образца.

После образования комплексов микрочип проявляют конъюгатами антител против человеческих IgE и IgG, содержащими детектируемую метку. Детекцию образовавшихся иммунных комплексов на стадии б) проводят флуориметрически, хемилюминометрически или биолюминометрически. Антитела, используемые для детекции, могут содержать различные детектируемые метки, например флуоресцентные метки, или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света. Регистрация сигналов проводится непосредственно с гидрогелевых элементов микрочипа.

Возможен также вариант, когда реакционная смесь на стадии а) содержит проявляющие соединения, и инкубация микрочипа с анализируемым образцом и проявление происходят одновременно.

Для количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов на стадии в) проводят стадии а) и б) со стандартными образцами, содержащими известные концентрации анализируемого аллерген-специфичного иммуноглобулина, и строят калибровочную зависимость флуоресцентный сигнал элемента микрочипа - концентрация анализируемого иммуноглобулина, по которой определяют их концентрацию в образце.

Калибровочные зависимости для определения концентраций аллерген-специфичных IgE и IgG можно получить разными методами. В одном варианте используют элементы микрочипа, содержащие иммобилизованные аллергены. Проводят стадии а) и б) со стандартными образцами, содержащими из

- 6 031771 вестные концентрации аллерген-специфичных иммуноглобулинов, и строят калибровочные зависимости флуоресцентный сигнал -концентрация анализируемого аллерген-специфичного иммуноглобулина. Калибровочные зависимости для определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов можно также получить с использованием элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные иммуноглобулины IgE и IgG в разных концентрациях. После взаимодействия микрочипа с проявляющими антителами сигналы от элементов, содержащих известные концентрации IgE и IgG, служат для построения непосредственно на микрочипе калибровочных кривых, по которым определяют неизвестные концентрации IgE и IgG.

Для одновременного количественного определения аллерген-специфичных IgE и IgG проводят стадии а) и б) со смесью антител против IgE и IgG, являющихся конъюгатами, флуоресцирующими в разных областях спектра; детекцию аллерген-специфичных IgE осуществляют по образованию комплекса с конъюгатом антител против IgE, флуоресцирующим в одной области спектра, а детекцию аллергенспецифичных IgG осуществляют по образованию комплекса с конъюгатом антител против IgG, флуоресцирующим в другой области спектра. Одновременное количественное определение аллергенспецифичных иммуноглобулинов возможно также при последовательной обработке микрочипа растворами, содержащими сначала одни меченые антитела, а затем другие меченые антитела, и в этом варианте проявляющие антитела могут содержать как различные, так и одинаковые метки.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на чертежи и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует вид (увеличенное фотоизображение) гидрогелевого биологического микрочипа для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G. Каждое иммобилизованное соединение представлено в трех одинаковых элементах. Массив гидрогелевых элементов содержит элементы с иммобилизованными аллергенами, элементы с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса Е в разных концентрациях, элементы с иммобилизованными иммуноглобулинами человека класса G в разных концентрациях, а также дополнительно элементы с иммобилизованными анти-IgE и анти-IgG. Аллергены: 1) t2, 2) t3, 3) betv1 (рекомбинантный), 4) betv2 (рекомбинантный), 5) t4, 6) t14, 7), w1, 8) w5, 9), w6, 10) w8, 11) g3, 12) g4, 13) g5, 14) g6, 15) ph1 p1 (рекомбинантный), 16) ph1 p5 (рекомбинантный), 17) ph1 p7 (рекомбинантный), 18) g12, 19) e1, 20) e5, 21) d1, 22) 62, 23) m1, 24) m2, 25) m3, 26) m4, 27) m5, 28) m6, 29) f1, 30) f2, 31) f3, 32) f4, 33) f7, 34) f13, 35) f14, 36) f24, 37) f29, 38) f53, 39) CCD (конъюгат олигосахаридов с пероксидазой), 40) элементы, не содержащие биоматериала, 41-46) элементы с иммобилизованными IgE в различных концентрациях, 47) элементы с иммобилизованными анти-IgE, 48) элементы с иммобилизованными анти-IgG, 49-54) элементы с иммобилизованными IgG в различных концентрациях, 55) смесь аллергенов пыльцы деревьев и кустарников, 56) смесь аллергенов сорных трав и цветов, 57) смесь аллергенов луговых трав и злаков), 58) смесь эпителиальных аллергенов и белков-аллергенов животного происхождения, 59) смесь бытовых аллергенов (клещи), 60) смесь аллергенов плесневых и дрожжевых грибков, 61) детская пищевая смесь (аллергены f1, f2, f3, f4, f7, f13, f14), 62) пищевая смесь (аллергены f11, f17, f24, f29, f1, f33, f39, f49, f53).

Фиг. 2 представляет флуоресцентное изображение биологического микрочипа при проведении одновременного анализа аллерген-специфичных IgE в образце сыворотки крови человека (структура микрочипа показана на фиг. 1). Микрочипы инкубировали с образцом сыворотки крови и проявляли антителами против IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5.

Фиг. 3 представляет флуоресцентное изображение биологического микрочипа при проведении одновременного анализа аллерген-специфичных IgG образце плазмы крови человека (структура микрочипа показана на фиг. 1). Микрочипы инкубировали с образцом плазмы крови и проявляли биотинилированными анти-IgG и далее стрептавидином, меченным флуоресцентным красителем Су3.

Фиг. 4 демонстрирует флуоресцентное изображение биологического микрочипа, структура которого показана на фиг. 1, при проведении одновременного определения аллерген-специфичных IgE и IgG. Микрочип инкубировали с исследуемым образцом и последовательно обрабатывали мечеными анти-IgE и мечеными анти-IgG. В данном варианте оба проявляющих антитела содержали одинаковые флуоресцентные метки Су5.

Фиг. 5 представляет графики зависимости интенсивности хемилюминесцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные аллергены, от концентрации аллерген-специфичных IgE в образцах сывороток крови. Хемилюминесцентные сигналы регистрировали после проявления биочипа конъюгатом анти-IgE с пероксидазой и обработкой раствором, содержащим люминол и Н₂О₂.

Фиг. 6А и 6Б иллюстрируют получение калибровочных зависимостей для определения концентраций аллерген-специфичных IgE и IgG непосредственно на микрочипе от элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные IgE и IgG в разных концентрациях (элементы 41-46 и 49-54 на фиг. 1-4). Приведены графики зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала элементов с иммобилизованными IgE (фиг. 6А) и иммобилизованными IgG (фиг. 6Б) от концентрации иммобилизованного иммуноглобулина.

- 7 031771

Фиг. 7 демонстрирует воспроизводимость анализа на микрочипах для количественного определения IgE и IgG в крови человека. Представлен профиль интенсивностей флуоресцентных сигналов, полученных при проведении анализа одного и того же образца на десяти микрочипах, и приведены значения коэффициентов вариации.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает биологический микрочип для количественного определения аллерген-специфичных IgE и IgG в биологических жидкостях. Микрочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов в форме микрокапель заданного объема, расположенных на подложке из стекла или пластика. Количество и объем элементов массива определяется количеством анализируемых иммуноглобулинов и аппаратурой, используемой при получении микрочипов (например, размером пина робота, наносящего капли раствора на подложку) и при регистрации сигналов (флуоресцентный микроскоп, биочип-анализатор, сканер и др.). Микрочипы изготавливают методом полимеризационной иммобилизации по технологии, раскрытой в публикации международной заявки WO 03/033539. По данной технологии получают микрочипы, гидрогелевые элементы которых содержат иммобилизованные лиганды белковой и небелковой природы, включая антитела, и низкомолекулярные соединения различного типа. Иммобилизация лиганда в гидрогеле может происходить непосредственно в процессе формирования геля, либо опосредованно, например, через образование специфических комплексов, например комплексов типа авидин - биотин (образование комплекса между иммобилизованным в гидрогелевом элементе авидином и биотинилированным антителом), типа антиген -антитело (образование комплекса между иммобилизованным в гидрогелевом элементе антигеном и антителом, полученным против этого антигена) и других типов.

Биологический микрочип, являющийся предметом изобретения, представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, включающий элементы, содержащие иммобилизованные аллергены, способные вызывать у человека аллергические реакции с участием иммуноглобулинов Е и G;

элементы, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины человека класса Е в разных концентрациях;

элементы, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины человека класса G в разных концентрациях.

Аллергены для иммобилизации выбирают, в частности, из следующих групп:

натуральные и искусственные волокна (хлопок, лен, шерсть, шелк, тик и др., древесная, соломенная и др. пыль);

пыльца деревьев и кустарников (ольха, береза, лещина, дуб, тополь, пальма и др.);

сорные травы и цветы (амброзия, полынь и др.);

луговые травы и злаки (овсяница, тимофеевка, рожь, пшеница, кукуруза, пырей и др.);

лекарственные препараты (антибиотики, противомикробные препараты, анальгетики и нестероидные противовоспалительные средства, анестетики и миорелаксанты, гормональные препараты и прочие лекарства);

эпидермальные аллергены и белки животного происхождения (эпителий животных, оперение птиц, сыворотки, и др.);

плесневые и дрожжевые грибы (Penicillium notatum, Cladosporium spp., Aspergillus fumigatus, Mucor racemosus и др.);

яды насекомых;

консерванты (бутилпарабен, сорбиновая кислота, бензоат и др.);

семенная жидкость (эякулят);

паразитарные и клещевые аллергены (аскарида, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Euroglyphus maynei и др.);

профессиональные и хобби-аллергены (кофейные зерна, формальдегид, латекс, хлорамин, красители и др.);

пищевые аллергены (яичные продукты, молочные продукты и сыры, мясные продукты, рыба и морепродукты, соевые продукты, грибы, мука и крупы, овощи и бахчевые культуры, бобовые, зелень и пряности, орехи, цитрусовые, фрукты, ягоды, чаи и лекарственные травы, пищевые добавки и прочие продукты), но не ограничиваясь этими группами.

Каждый элемент массива с иммобилизованными аллергенами содержит аллерген или смесь аллергенов, принадлежащих к одной группе, либо смесь (микст) аллергенов, принадлежащих к разным группам. Для иммобилизации в гидрогелевых элементах микрочипа используют аллергены, выделенные из природных источников. Используют также аллергены небелковой природы, полученные синтетическим путем, аллергены белковой природы, полученные генно-инженерными методами (рекомбинантные аллергены), а также конъюгаты аллергенов белковой и небелковой природы, например конъюгаты с авидином, человечьим сывороточным альбумином (ЧСА), пероксидазой, биотином и другими соединениями.

Смесь (микст) аллергенов для иммобилизации в элементе микрочипа может включать аллергены всех вышеперечисленных типов, и массив элементов микрочипа может включать элементы с аллергена

- 8 031771 ми или смесями аллергенов различного типа. Например, на фиг. 1 представлен биологический микрочип, содержащий иммобилизованные аллергены, выделенные из одного источника (например, t2 (ольха), e1 (эпителий кошки), f1 (яичный белок) и др.) и смеси аллергенов (смесь аллергенов пыльцы деревьев и кустарников, детская пищевая смесь (смесь аллергенов f1, f2, f3, f4, f7, f13 и f14) и др.). На чипе иммобилизованы аллергены, выделенные из природных источников (например, t3 (береза белая), t14 (тополь), f2 (коровье молоко), Н4 (соевые бобы), луговые травы и злаки и др.), рекомбинантные аллергены (bet v1 и bet v2 (береза белая), ph1 p1, ph1 p5 и ph1 p7 (тимофеевка луговая)), а также аллергены, полученные синтетическим путем (CCD - конъюгат олигосахаридов с пероксидазой).

Биологический микрочип, являющийся предметом изобретения, также содержит элементы с иммобилизованными IgE человека в разных концентрациях и IgG человека в разных концентрациях. Для иммобилизации используются моноклональные антитела, поликлональные антитела, рекомбинантные антитела, различные антигенсвязывающие фрагменты антител, например Fab-фрагменты, Fc-фрагменты, и одноцепочечные антитела (scFv и другие), мини-антитела различного типа и т.д.

При взаимодействии микрочипа с биологическим образцом в каждом элементе с иммобилизованными аллергенами происходит образование иммунных комплексов иммобилизованный аллерген - IgE, специфичный к данному аллергену, иммобилизованный аллерген - IgG, специфичный к данному аллергену. После обработки микрочипа проявляющими растворами, содержащими антитела против IgE (IgG), меченные детектируемой меткой, по уровню сигнала с элемента микрочипа определяют концентрацию аллерген-специфичных IgE (или IgG).

Массив элементов микрочипа содержит иммобилизованные IgE и IgG в разных концентрациях. При обработке микрочипа проявляющими растворами, содержащими антитела против IgE и IgG, меченные детектируемыми метками, в этих элементах происходит образование комплексов иммобилизованный IgE (IgG) - меченное антитело против IgE (IgG), и сигналы этих рядов элементов используются для получения непосредственно на микрочипе калибровочных зависимостей для определения концентраций аллерген-специфичных IgE и IgG.

Биологический микрочип, содержащий иммобилизованные аллергены и иммобилизованные иммуноглобулины для построения калибровочных кривых, показан на фиг. 1.

Уровни аллерген-специфичных иммуноглобулинов определяются диапазоном концентраций, в котором они присутствуют в крови человека. В настоящем изобретении используются уровни, соответствующие классам реактивности для систем ИФА компании Dr. Fooke (Германия) (табл. 1).

Таблица 1

Уровни аллерген-специфичных иммуноглобулинов Е и G

Иммуноглобулин Е	Иммуноглобулин G
Концентрация, МЕ/мл	Уровень (интерпретация результата)	Концентрация, мкг/мл	Уровень (интерпретация результата)
<0,35	0, недетекктируемый (отрицательный)	< 1,0	отрицательный
0,35-0,7	1, низкий	1,0-2,0	вероятный
0,7-3,5	2, средний
3,5-17,5	3, умеренно высокий	2,1-3,5	положительный
17,5-50	4, высокий
50-100	5, очень высокий	>3,5	сильно положительный
> 100	6, предельно высокий

Исходя из определенного в результате анализа уровня иммуноглобулинов проводится диагностика аллергий различного типа, назначается соответствующая терапия больного и оценивается результат проведенного лечения, причем в некоторых случаях важнее установить именно уровень, а не точную концентрацию иммуноглобулина в крови пациента.

Настоящим изобретением обеспечивается также способ одновременного количественного определения различных аллерген-специфичных IgE и IgG в биологических жидкостях на биологическом микрочипе, предусматривающий:

а) взаимодействие биологического микрочипа по первому аспекту изобретения с биологическим образцом в условиях, обеспечивающих образование специфических иммунных комплексов аллергенов, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с соединениями, содержащимися в анализируемом образце;

б) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;

в) количественное определение иммуноглобулинов, входящих в состав указанных комплексов.

В качестве реакционной среды, обеспечивающей образование специфических иммунных комплексов, выбирают растворы, которые обычно используются при проведении иммуноанализов различного типа, например фосфатный буфер, трис-HCl и др. Для уменьшения неспецифических взаимодействий в реакционную среду добавляют поливиниловый спирт, сахарозу, бычий сывороточный альбумин, белки сухого молока и другие соединения, хорошо известные специалистам в данной области. Возможен также вариант, когда реакционная среда на стадии (а) дополнительно к анализируемым соединениям содержит

- 9 031771 также проявляющие соединения; при этом инкубация микрочипа с анализируемым образцом и проявление происходят одновременно.

Детекцию образовавшихся иммунных комплексов на стадии б) проводят флуориметрически, хемилюминометрически или биолюминометрически. Регистрация сигналов проводится непосредственно с гидрогелевых элементов микрочипа. Антитела, используемые для детекции, могут содержать различные детектируемые метки, например флуоресцентные метки, или являться конъюгатами с белками или другими соединениями, способными участвовать в реакциях, приводящих к излучению света, например конъюгаты антител с зеленым флуоресцирующим белком (GFP), ферментом пероксидазой, которая участвует в хемилюминесцентной реакции, конъюгаты антител с ферментом люциферазой, которая катализирует биолюминесцентную реакцию, конъюгаты антител с биотином (с последующим проявлением меченым авидином (стрептавидином), но не ограничиваясь ими. В качестве флуоресцентных красителей используют, например, цианиновый 3 (Су3), цианиновый 5 (Су5), флуоресцеин, Texas Red, но не ограничиваясь ими.

Использование в качестве проявляющих антител конъюгатов анти-IgE и/или анти-IgG с флуоресцентными красителями продемонстрировано в примерах 1, 2, 6, конъюгатов анти-IgE и/или анти-IgG с биотином и флуоресцентно-меченного авидина - в примерах 3, 4, конъюгатов антител с ферментом пероксидазой (хемилюминесцентная детекция) - в примере 5. Флуоресцентные изображения микрочипов после проведения анализа показаны на фиг. 2-4.

В качестве образцов для анализа используются разбавленные или неразбавленные биологические жидкости, включающие сыворотку крови, плазму крови, выделения из носовой полости, бронхиальный (альвеолярный) лаваж, но не ограничиваясь ими.

Количественное определение аллерген-специфичных иммуноглобулинов согласно способу настоящего изобретения проводят с использованием калибровочных зависимостей:

(1) стадию а) проводят с известными концентрациями анализируемых иммуноглобулинов и строят калибровочные зависимости (сигнал соответствующих элементов микрочипа - концентрация анализируемого иммуноглобулина), по которым количественно определяют анализируемые иммуноглобулины (фиг. 5);

(2) калибровочные зависимости строят, используя элементы микрочипа, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины человека классов Е и G в разных концентрациях (фиг. 6А, 6Б).

При взаимодействии микрочипа с биологическим образцом в элементах с иммобилизованными аллергенами одновременно происходит образование иммунных комплексов с IgE и IgG, специфичными к данному аллергену. При проявлении мечеными антителами против IgE по сигналу с данного элемента микрочипа определяют концентрацию специфичных IgE, а при проявлении мечеными антителами против IgG - концентрацию специфичных IgG.

После взаимодействия микрочипа с меченными проявляющими антителами против IgE получают сигналы от элементов массива с иммобилизованными IgE. Строят калибровочную зависимость интенсивность флуоресценции - концентрация иммуноглобулина, которую используют для определения концентрации аллерген- специфичных IgE в образце.

После взаимодействия микрочипа с меченными проявляющими антителами против IgG получают сигналы от элементов массива с иммобилизованными IgG. Строят калибровочную зависимость интенсивность флуоресценции - концентрация иммуноглобулина, которую используют для определения концентрации аллерген-специфичных IgG в образце.

Для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов обоих классов проявляющий раствор может включать смесь антител против IgE и IgG, которые являются конъюгатами с флуоресцентными красителями, излучающими свет в разных областях спектра, например конъюгатами с Су3 и Су5. При взаимодействии с проявляющим раствором на микрочипе образуются две калибровочные зависимости: одна на элементах с иммобилизованными IgE, другая на элементах с иммобилизованными IgG. Одновременное определение аллерген-специфичных иммуноглобулинов возможно также при последовательной обработке микрочипа растворами, содержащими сначала одни меченые антитела (например, анти-IgE), а затем другие меченые антитела (например, анти-IgG). В таком варианте проявляющие антитела могут содержать как различные, так и одинаковые флуоресцентные метки.

Два варианта осуществления способа количественного определения аллерген-специфичных IgE продемонстрированы в примерах 1 и 2: по калибровочной зависимости, полученной с использованием калибровочных проб с известными концентрациями IgE (пример 1) и по калибровочной зависимости, полученной непосредственно на микрочипе (пример 2). Аналогичные варианты количественного определения аллерген-специфичных IgG описаны в примерах 3 и 4.

Пример 5 иллюстрирует количественное определение аллерген-специфичных IgE с использованием калибровочных проб с известными концентрациями специфичных иммуноглобулинов (хемилюминесцентная детекция).

Одновременное количественное определение аллерген-специфичных IgE и IgG с использованием калибровочных зависимостей, полученных непосредственно на микрочипе, и при последовательной обработке микрочипа различными проявляющими антителами, продемонстрировано в примере 6.

- 10 031771

Результаты анализа, проводимого способом настоящего изобретения с использованием биологических микрочипов настоящего изобретения, отличаются хорошей воспроизводимостью: коэффициент вариации флуоресцентных сигналов, получаемый от элементов микрочипа, составляет не более 15%. Чувствительность анализа - достаточная для достоверного определения пороговых концентраций IgE и IgG (0,35 МЕ/мл и 1,0 г/л) (пример 7).

Пример 1. Количественное определение различных аллерген-специфичных IgE в образце сыворотки крови на биологическом микрочипе.

Для одновременного количественного определения различных аллерген-специфичных иммуноглобулинов использовали микрочипы, структура которых показана на фиг. 1. Перед проведением анализа для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы инкубировали в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl, 1% поливинилового спирта (блокировочный раствор), 40 мин при комнатной температуре.

Микрочипы инкубировали с образцом сыворотки крови или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации аллерген-специфичных IgE, в течение 20 ч при 37°С; микрочипы далее инкубировали с проявляющими антителами против IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5 (1 ч, 37°С). После завершения инкубации и отмывки от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы. Для измерения флуоресцентных сигналов использовали флуоресцентный микроскоп, снабженный CCD-камерой и программным обеспечением для визуализации изображения и обработки полученных данных, разработанный в ИМБ РАН (Barsky V., Perov A. Tokalov S., et al., Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, v. 7, p. 247-257).

Для повышения достоверности получаемых данных все иммобилизованные аллергены и антитела в составе микрочипа представлены в трех одинаковых гелевых элементах, и интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от трех одинаковых гелевых элементов.

Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные аллергены - концентрация аллерген-специфичных IgE в калибровочной пробе, по которой определяли концентрации аллерген-специфичных IgE в исследуемом образце. Результаты представлены в табл. 2 (приведены данные для специфичных IgE, концентрация которых оказалась выше 0,35 МЕ/мл). Уровни IgE определяли, как указано в табл. 1.

Пример 2. Количественное определение различных аллерген-специфичных IgE в образце сыворотки крови с использованием присутствующей на микрочипе калибровочной зависимости.

Использовали микрочипы, структура которых показана на фиг. 1. Перед проведением анализа микрочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в примере 1.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом в течение 20 ч при 37°С и далее инкубировали с проявляющими анти-IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5 (1ч, 37°С). После отмывки от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы, как описано в примере 1. Флуоресцентное изображение микрочипа после взаимодействия с сывороткой крови и проявления представлено на фиг. 2. После взаимодействия с проявляющими антителами на элементах микрочипа, содержащих иммобилизованные IgE в разных концентрациях, получают флуоресцентные сигналы, которые тем выше, чем выше концентрация иммобилизованного иммуноглобулина. Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала - концентрация IgE (фиг. 6А), по которой определяли концентрации аллерген-специфичных IgE в исследуемом образце. Результаты показаны в табл. 2 (приведены данные для специфичных IgE, концентрация которых оказалась выше 0,35 МЕ/мл). Уровни IgE определяли, как указано в табл. 1.

Таблица 2

Результаты определения аллерген-специфичных IgE в сыворотке крови

Аллерген	Концентрация аллергенспецифичного IgE, МЕ/мл, полученная в Примере 1	Концентрация аллерген* специфичного IgE, МЕ/мл, полученная в Примере 2	Уровень
Береза белая bet v2	9,0	11,5	3, умеренно высокий
Лещина обыкновенная t4	1,9	2,0	2, средний
Амброзия полыннолистная wl	1,6	1,8	2, средний
Овсянница луговая g4	0,5	0,6	1, низкий
Райграс многолетний g5	0,6	0,7	1, низкий
Рожь посевная gl2	0,5	0,4	1, низкий
Dermatophagoides pteronyssinus dl	2,6	2,5	2, средний

- 11 031771

Dermatophagoides farinae d2	4,0	3,3	3, умеренно высокий
Cladosporium herbarum m2	0,5	0,6	1, низкий
Северная креветка f24	0,4	0,4	1, низкий
Персик f53	1,0	1,4	2, средний
Перекрестные углеводные детерминанты CCD	0,5	0,7	1, низкий
Пыльца деревьев и кустарников	1,1	0,5	2, средний/1, низкий
Сорные травы и цветы	0,4	0,4	1,низкий
Луговые травы и злаки	0,4	0,4	1, низкий
Бытовые, клещи	8,5	10,5	3, умеренно высокий
Пищевая смесь	0,5	0,5	1, низкий

Пример 3. Одновременное количественное определение специфичных IgG в образце плазмы крови на биологическом микрочипе.

Использовали микрочипы, структура которых показана на фиг. 1. Перед проведением анализа микрочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в примере 1.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации IgG, в течение 20 ч при 37°С; после этого микрочипы инкубировали с биотинилированными проявляющими анти-IgG (1 ч, 37°С) и далее со стрептавидином, меченным флуоресцентным красителем Су3 (10 мин, 37°С). После отмывки от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы, как описано в примере 1.

Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные аллергены - концентрация аллерген-специфичных IgG калибровочной пробе, по которой определяли концентрации аллерген-специфичных IgG в исследуемом образце. Результаты показаны в табл. 3 (приведены данные для аллерген-специфичных IgG, концентрация которых оказалась выше 1,0 г/л). Уровни IgG определяли, как указано в табл. 1.

Пример 4. Одновременное количественное определение специфичных IgG в образце плазмы крови с использованием присутствующей на микрочипе калибровочной зависимости.

Использовали микрочипы, структура которых показана на фиг. 1. Перед проведением анализа микрочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в примере 1.

Микрочип инкубировали с образцом плазмы крови в течение 20 ч при 37°С. После этого микрочип инкубировали с биотинилированными анти-IgG (1 ч, 37°С) и далее со стрептавидином, меченным флуоресцентным красителем Су3 (10 мин, 37°С). После отмывки от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы, как описано в примере 1. Флуоресцентное изображение микрочипа после взаимодействия с плазмой крови и проявления представлено на фиг. 3. После взаимодействия с проявляющими растворами на элементах микрочипа, содержащих иммобилизованные IgG в разных концентрациях, получают флуоресцентные сигналы, которые тем выше, чем выше концентрация иммобилизованного иммуноглобулина. Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала - концентрация IgG (фиг. 6Б), по которой определяли концентрации специфичных IgG в исследуемом образце. Результаты показаны в табл. 3 (приведены данные для аллерген-специфичных IgG, концентрация которых оказалась выше 1,0 г/л). Уровни IgG определяли, как указано в табл. 1.

Таблица 3 Результаты определения аллерген-специфичных IgG в плазме крови

Аллерген	Концентрация иммуноглобулина, г/л, полученная в Примере 3	Концентрация иммуноглобулина, г/л, полученная в Примере 4	Уровень
Береза белая t3	> 10,0	> 10,0	сильно положительный
Лещина обыкновенная t4	> 10,0	9,5	сильно положительный
Dermatophagoides pteronyssimus dl	1,1	0,6	вероятный /отрицательный
Dermatophagoides farinae d2	2,6	1,4	положительный/ вероятный
Коровье молоко С	3,3	1,6	положительный/ вероятный
Персик £53	>10,0	8,6	сильно положительный
Пыльца деревьев и кустарников	>10,0	8,5	сильно положительный
Бытовые, клещи	3,5	1,8	положительный/ вероятный
Пищевая смесь	4,0	2,0	сильно положительный/ положительный

Пример 5. Одновременное количественное определение различных специфичных IgE в образце сыворотки крови (хемилюминесцентная детекция).

Использовали микрочипы, структура которых показана на фиг 1. Перед проведением анализа мик

- 12 031771 рочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в примере 1.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом или с калибровочными пробами, содержащими известные концентрации специфичных иммуноглобулинов, в течение 20 ч при 37°С. В данном примере использовали сыворотки крови, содержащие известные концентрации иммуноглобулинов, специфичных к аллергенам t2, t3, g3, g5 и g12. Микрочипы далее инкубировали с конъюгатом анти-IgE с пероксидазой хрена в течение 2 ч при комнатной температуре, и после отмывки на микрочипы наносили по 20 мкл смеси хемилюминесцентных субстратов (SuperSignal ELISA Pico Stable Peroxide, Luminol Enhancer фирмы Pierce, США), содержащей люминол, перекись водорода и усилитель. При окислении люминола, катализируемом пероксидазой, наблюдается хемилюминесценция с максимумом при 425 нм. Регистрировали сигналы с элементов микрочипа с использованием флуоресцентного микроскопа с выключенной лампой возбуждающего света, выдержка 60 с.

Одновременно получали пять калибровочных зависимостей интенсивность хемилюминесцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные аллергены - концентрация соответствующего IgE в калибровочной пробе (фиг. 5), по которым определяли концентрации специфичных IgE в исследуемом образце. Результаты приведены в табл. 4. Уровни IgG определяли, как указано в табл. 1.

Таблица 4

Результаты определения специфичных IgE в сыворотке крови с использованием калибровочных проб, содержащих известные концентрации аллерген-специфичных иммуноглобулинов

Аллерген	Концентрация иммуноглобулина Е, МЕ/мл	Уровень
Ольха серая t2	<0,35	0, отрицательный
Береза белая t3	5,5	3, умеренно высокий
Ежа сборная g3	<0,35	0, отрицательный
Райграс многолетний g5	<0,35	0, отрицательный
Рожь посевная gl 2	<0,35	0, отрицательный

Пример 6. Одновременное количественное определение специфичных IgE и IgG с использованием присутствующих на микрочипе калибровочных зависимостей.

Использовали гидрогелевые микрочипы, структура которых показана на фиг. 1. Перед проведением анализа микрочипы обрабатывали блокировочным раствором, как описано в примере 1.

Микрочипы инкубировали с исследуемым образцом в течение 20 ч при 37°С и далее с проявляющими анти-IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5 (1 ч, 37°С). После отмывки от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы, как описано в примере 1. Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные IgE в разных концентрациях - концентрация IgE (фиг. 6А). По калибровочной зависимости и сигналам от элементов с иммобилизованными аллергенами и элементов с иммобилизованными IgE определяли концентрации аллерген-специфичных IgE в исследуемом образце.

Далее микрочип обрабатывали проявляющими анти-IgG, меченными флуоресцентным красителем Су5 (1 ч, 37°С), и проводили повторную отмывку и регистрацию сигналов. Строили калибровочную зависимость интенсивность флуоресцентного сигнала элементов микрочипа, содержащих иммобилизованные IgG в разных концентрациях - концентрация IgG (фиг. 6Б). Рассчитывали сигналы элементов с иммобилизованными аллергенами, соответствующие содержанию IgG, вычитая сигналы, полученные после первой инкубации, из сигналов, полученных после второй инкубации. По калибровочной зависимости и рассчитанным сигналам определяли концентрации аллерген-специфичных IgG в исследуемом образце.

Флуоресцентное изображение микрочипа после последовательной обработки двумя проявляющими растворами представлено на фиг. 4. Результаты определения приведены в табл. 5 (приведены данные для аллерген-специфичных IgE, концентрация которых была выше 0,35 МЕ/мл, и аллерген-специфичных IgG - выше 1,0 г/л).

- 13 031771

Таблица 5

Результаты одновременного количественного определения аллерген-специфичных IgE и IgG

Аллерген	Концентрация иммуноглобулина Е, МЕ/мл (уровень)	Концентрация иммуноглобулина G, г/л (уровень)
Береза белая t3	0,5 (1, низкий)	> 10 (сильно положительный)
Береза белая bet v2	12,4 (3, умеренно высокий)	0 (недетектируемый)
Амброзия полыннолистная wl	2,5 (2, средний)	0 (недетектируемый)
Овсянница луговая g4	1,0 (2, средний)	0 (недетектируемый)
Райграс многолетний g5	1,2 (2, средний)	0 (недетектируемый)
Рожь посевная gl 2	0,5 (1, низкий)	0 (недетектируемый)
Dermatophagoid.es pieronyssinus dl	3,9 (3, умеренно высокий)	0 (недетектируемый)
Dermatophagoides farinae d2	5,1 (3, умеренно высокий)	0 (недетектируемый)
Cladosporium herbarum m2	0,4 (1, низкий)	0 (недетектируемый)
Candida albicans m5	0 (недетектируемый)	1,2 (вероятный)
Банан f29	0,4 (1, низкий)	1,5 (вероятный)
Коровье молоко f2	0,9 (2, средний)	1,5 (вероятный)
Персик f53	1,4 (2, средний)	8,8 (сильно положительный)
Перекрестные углеводные детерминанты CCD	1,2 (2, средний)	0 (недетектируемый)
Пыльца деревьев и кустарников	1,0 (2, средний)	7,7 (сильно положительный)
Сорные травы и цветы	0,9 (2, средний)	0 (недетектируемый)
Луговые травы и злаки	0,6 (1, низкий)	0 (недетектируемый)
Бытовые, клещи	7,0 (3, умеренно высокий)	1,1 (вероятный)
Пищевая смесь	0,6 (1, низкий)	1,2 (вероятный)

Пример 7. Оценка воспроизводимости и чувствительности определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов с использованием гидрогелевых микрочипов.

Для оценки воспроизводимости данных, получаемых на микрочипах, проводили анализ одного и того же образца сыворотки крови на десяти микрочипах. На фиг. 7 представлен профиль интенсивностей флуоресцентных сигналов от элементов с иммобилизованными аллергенами и иммуноглобулинами.

Величину коэффициента вариации (KB) флуоресцентных сигналов, получаемых от каждого элемента, определяли по формуле (1)

где F - значение каждого флуоресцентного сигнала для данного элемента микрочипа;

- среднее арифметическое значение флуоресцентного сигнала для данного элемента;

n - число измерений.

Полученные значения коэффициента вариации для флуоресцентных сигналов от всех элементов микрочипа составили не более 15% (фиг. 7).

При диагностике аллергий пороговыми концентрациями, ниже которых уровень иммуноглобулинов определяется как недетектируемый, приняты 0,35 МЕ/мл для IgE и 1,0 г/л для IgG. В настоящем изобретении концентрации иммобилизованных на биологическом микрочипе соединений, проявляющих соединений и условия проведения анализа подобраны таким образом, что флуоресцентные сигналы для каждого элемента микрочипа с иммобилизованными аллергенами и иммобилизованными иммуноглобулинами после взаимодействия с образцом, содержащим IgE в концентрации 0,35 МЕ/мл и IgE в концентрации 1,0 г/л, по крайней мере в два раза превышали фоновые сигналы. В качестве фоновых использовали сигналы от пустых гелевых элементов, не содержащих биоматериала.

- 14 031771

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Биологический микрочип для одновременного количественного определения аллергенспецифичных иммуноглобулинов классов Е и G в биологических жидкостях, представляющий собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, характеризующийся тем, что он включает элементы, содержащие иммобилизованные аллергены, способные вызывать у человека аллергические реакции с участием иммуноглобулинов Е и G;

   элементы, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины человека класса Е в разных концентрациях;

   элементы, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины человека класса G в разных концентрациях.
2. 2. Биологический микрочип по п.1, характеризующийся тем, что каждый элемент массива с иммобилизованными аллергенами содержит аллерген, либо смесь (микст) аллергенов, принадлежащих к одной группе, либо смесь (микст) аллергенов, принадлежащих к разным группам.
3. 3. Биологический микрочип по п.1, характеризующийся тем, что иммобилизованные аллергены представляют собой соединения или смеси соединений белковой и небелковой природы, выделенные из природных источников.
4. 4. Биологический микрочип по п.1, характеризующийся тем, что иммобилизованные аллергены представляют собой соединения небелковой природы, полученные синтетическим путем, или аллергены белковой природы, полученные генно-инженерными методами, а также конъюгаты аллергенов белковой и небелковой природы.
5. 5. Способ одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G в биологических жидкостях, включающий:

   а) взаимодействие биологического микрочипа, охарактеризованного в п.1, с биологическим образцом в условиях, обеспечивающих образование специфических иммунных комплексов аллергенов, иммобилизованных в гидрогелевых ячейках микрочипа, с соединениями, содержащимися в анализируемом образце;

   б) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;

   в) количественное определение иммуноглобулинов, входящих в состав указанных комплексов.
6. 6. Способ по п.5, в котором детекцию образовавшихся иммунных комплексов проводят флуориметрически, хемилюминометрически или биолюминометрически при использовании детектируемых меток или конъюгатов, способных участвовать в реакциях, приводящих к излучению света.
7. 7. Способ по п.5, в котором стадию а) проводят с известными концентрациями анализируемых иммуноглобулинов и строят калибровочные зависимости, по которым количественно определяют анализируемые иммуноглобулины.
8. 8. Способ по п.5, характеризующийся тем, что для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов Е и G калибровочные зависимости строят, используя элементы микрочипа, содержащие иммобилизованные иммуноглобулины человека классов Е и G в разных концентрациях.
9. 9. Способ по п.5, характеризующийся тем, что для одновременного количественного определения аллерген-специфичных иммуноглобулинов классов Е и G стадию б) проводят с конъюгатами антител против иммуноглобулинов Е и конъюгатами антител против иммуноглобулинов G, излучающими свет в разных областях спектра, и получают флуоресцентные сигналы от одних и тех же элементов с иммобилизованными аллергенами, по которым количественно определяют все анализируемые иммуноглобулины.
10. 10. Способ по п.9, в котором конъюгатами, излучающими свет в разных областях спектра, являются конъюгаты с различными флуоресцентными красителями.