CN111936856A - 新型免疫球蛋白e的表位、与其结合的抗体及包括所述抗体的用于分析试料中免疫球蛋白e的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
涉及作为新型免疫球蛋白E(Immunoglobulin E：IgE)的表位(epitope)的序列号3的氨基酸序列构成的肽、与所述肽结合的抗免疫球蛋白E抗体，能够将所述肽及抗体用于过敏疾病的诊断或治疗剂研究等。并且，涉及包括所述抗体的用于分析试料中免疫球蛋白E的试剂盒及利用所述试剂盒的过敏疾病的诊断方法，能够定性分析有无韩国人当中发生频率高的典型的吸入性、食物过敏，能够在采血后短时间内诊断过敏。
Description
技术领域
涉及新型免疫球蛋白E的表位、与其结合的抗体及包括所述抗体的用于分析试料中免疫球蛋白E的试剂盒。
背景技术
生物体与某种外来性物质接触的情况下由于抗原-抗体反应而在活体内发生急剧的过敏变化，将其称之为过敏(allergy)，将引起这种过敏的外来性物质称为过敏原(allergen)。将多种类型的过敏反应中免疫球蛋白-E(immunoglobulin E；IgE)所干预的过敏称为第1型过敏。
第1型过敏是由于过敏原附着在附着于肥大细胞(mast cell)或嗜碱性粒细胞(basophil)表面的免疫球蛋白(immunoglobulin)的情况下肥大细胞或嗜碱性粒细胞受到刺激而放出引起过敏反应的化合物而发生。通常过敏症状包括哮喘(astma)、湿疹(eczema)、荨麻疹(hives)、皮炎(dermatitis)、鼻炎(rhinitis)等。
所有IgE抗体及过敏原-特异性IgE抗体在有过敏的个人血液中可增加，因此测定血清中总IgE浓度或过敏原-特异性IgE浓度一直以来用作有效区分典型过敏反应引起的症状和与过敏相近的疾病的检查。通常出生时的脐带血内总IgE抗体的浓度为1IU/ml(2.4ng＝1IU)左右，随着年龄增加逐渐而增加，成人保持大致83.3IU/ml(200ng/ml)以下。
特异性过敏抗原的识别提供用于追踪疾病的信息，过敏抗原包括螨、花粉、动物的上皮细胞及多种食物。测定血清内的IgE抗体会为治疗过敏患者提供有用的临床信息。
发明内容
技术问题
根据一个方面，提供一种由作为免疫球蛋白E(Immunoglobulin E：IgE)的表位(epitope)的序列号3的氨基酸序列构成的肽。
根据另一方面，提供一种结合于所述肽的抗免疫球蛋白E抗体。
根据又一方面，提供一种包括所述抗体的用于分析试料中免疫球蛋白E的试剂盒。
根据又一方面，提供一种包括所述试剂盒及标本滴落部的过敏诊断或预后预测用设备。
根据另一方方面，提供一种过敏疾病的诊断方法，包括：采集个体的血液并混合到标本稀释液的步骤；将所述稀释液滴到(drop)标本滴落部进行反应的步骤。
技术方案
根据一个方面，提供一种由作为免疫球蛋白E(Immunoglobulin E：IgE)的表位(epitope)的序列号3的氨基酸序列构成的肽。
所述表位可以是与增加免疫原性的物质或承载体(carrier)接合的物质，所述增加免疫原性的物质或承载体例如可以是钥孔戚血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)。
所述肽可以由免疫球蛋白E的氨基酸序列的一部分氨基酸序列构成，可用作免疫球蛋白E的表位，即，抗体的结合部位。所述肽与所述抗免疫球蛋白E结合时其具有优异的结合力。
所述免疫球蛋白E的表位的氨基酸序列可以是由12个至15个氨基酸序列构成的肽，更具体来讲，可以是由序列号3的氨基酸序列构成的肽。
所述术语“肽(Peptide)”是指由通过酰胺键或肽键连接的两个以上的氨基酸构成的组合物。所述多肽可以由序列号3的氨基酸序列构成。可以包括与所述序列号3的氨基酸序列的序列同源性分别为约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约92％以上、约95％以上、约97％以上、约98％以上或约99％以上的肽。
并且，为了获得更佳化学稳定性、增强的药理特性(半衰期、吸收性、滴度、效能等)、变更的特异性(例如，广泛的生物学活性谱)、减小的抗原性，所述肽的N-或C-末端可结合有保护基。所述保护基可以是乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基或聚乙二醇(PEG)，但只要是能够对肽改性，尤其是能够提高肽的稳定性的成分，则均可以不受限制地包含于其中。
所述术语“稳定性”不仅表示针对活体内蛋白质裂解酶的攻击保护所述肽的体内(in vivo)稳定性，还可以表示保存稳定性(例如，常温保存稳定性)。
并且，所述肽还可以包括靶向序列、为了标签(tag)、标记的残基的特定目的而制备的氨基酸序列。
所述术语“同源性(Homology)”用于表示与野生型氨基酸序列的相近程度，可通过本领域公知的比较程序比较这种同源性，可用百分比(％)算出两个以上序列之间的同源性。
所述肽可天然获得，也可通过本领域公知的多种肽合成方法获得。作为一例，可利用多核苷酸重组与蛋白质表达系统制备，或者用通过肽合成之类的化学合成在试管内合成的方法及无细胞蛋白质合成法等制备。并且，作为一例，所述肽可以是多肽、植物来源的组织或细胞的提取物、微生物(例如，细菌类或真菌类，尤其酵母)培养得到的产物，具体来讲可以是来源于免疫球蛋白E，更具体来讲可以是免疫球蛋白E的氨基酸序列的一部分。
并且，根据一个方面，提供一种编码所述表位的基因，所述基因编码由序列号3的氨基酸序列构成的肽。
并且，根据一个方面，提供一种包括编码所述表位的基因的载体。
所述载体可被导入到宿主用于宿主表达所述基因，从而能够用于制备所述肽。并且，所述载体可以是本领域公知的表达载体中导入了所述基因的物质。
所述载体可以是与启动子、编码信号序列的核苷酸序列之类的表达调节序列连接的载体，所述载体为了分选导入了载体的宿主而可包括抗生素抗性标记，其可以是载体内在的或者是从外部导入的。
根据另一方面，提供一种结合到所述肽的抗免疫球蛋白E抗体。
所述抗体能够将所述肽识别为表位并结合于该部分，因此能够特异结合于免疫球蛋白E。所述抗体不仅与所述肽的结合力优异，而且与免疫球蛋白E的结合力也非常优异。所述抗体可通过公知的抗体制备方法制备，具体来讲可通过生成多克隆抗体或单克隆抗体的细胞等制备。
根据又一方面，提供一种包括所述抗体的试剂盒，是能够在个体与试料接触后10分钟至40分钟以内定性分析过敏原(allergen)特异免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)的过敏疾病的诊断或预后分析用试剂盒。
所述试剂盒可包括过敏原及被涂覆所述抗体的膜。具体来讲，所述过敏原可以是韩国人当中发生频率高的典型的吸入性或食物过敏。例如，可以是屋尘螨、黑麦草、橡树、艾蒿、葎草、蒜、猪肉、金枪鱼、霉、狗、芝麻、花生、牛肉、黄花茅、虾、苹果、猫、赤杨木、桦木、大豆、核桃、鳕鱼、鸭茅草、牛奶、桃、土豆、豚草、蛋清、小麦、螃蟹、大麦、芦苇蟑螂、荞麦或屋尘等。所述抗体如上所述。
所述膜可以是可包括标记的材料，例如，硝酸纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃或塑料等。
并且，一个具体例的试剂盒可以是用于免疫色谱分析的试剂盒。具体来讲，所述试剂盒可以是以免疫层析法为原理在检查线部位固定(Immobilization)有各过敏原的硝酸纤维素膜上展开人的血清或血浆以检查有无对过敏原的特定IgE抗体的试剂盒。
所述术语“免疫层析法(Immunochromatographic Assay；ICA)”是指应用免疫化学(mmuno-chemistry)与薄膜色谱(thin-layer chromatography)技术的检查方法，应用对抗原(antigen)的抗体(antibody)的特异反应性、胶体金的显色特性及流动性、在多孔性硝酸纤维素膜上借助毛细管力(capillary force)的标本及分子的移动性。
即，根据一个具体例的试剂盒，首先使含有对过敏原的特定IgE抗体的标本与抗IgE金复合体(Gold conjugate)反应后，在检查线部位固定(immobilization)有过敏原且对照线部位固定有小鼠IgG的多孔性硝酸纤维素膜上展开标本。可构成为沿着膜移动的抗原(标本)-抗IgE抗体金复合体中对固定于膜上的各过敏原的特定IgE抗体存在于标本内的情况下，金抗原-抗体复合体将会通过固定有各过敏原的部位，因此在该位置形成红色带，并且在对照线部位山羊抗-小鼠IgG金复合体通过与小鼠IgG抗原-抗体反应被捕获，因此对照线总是显色。
根据又一方面，提供一种包括所述试剂盒及标本滴落部的过敏诊断或预后预测用设备。所述试剂盒的具体内容如上所述。
所述标本滴落部可以是含有展开溶液的，所述展开溶液可以是例如牛血清白蛋白、山羊血清、氯化钠、氯化钾、聚山梨酯20、叠氮化钠、3次蒸馏水、液体生物防腐剂300、三氨基甲烷或其混合溶液。
根据又一方面，提供一种包括采集个体的血液混合到标本稀释液的步骤；以及将所述稀释液滴到(drop)标本滴落部使得反应10至40分钟的步骤的过敏疾病的诊断方法。
一个具体例的方法包括采集个体的血液混合到标本稀释液的步骤。所述血液可通过公知的方法采集，混合到稀释液的血液的体积可以是0.5ml至2ml。例如，可以是0.5ml至1.8ml、0.5ml至1.5ml、0.7ml至2ml、0.7ml至1.5ml、0.8ml至1.4ml或1ml至1.5ml。在此，血液的体积小于所述范围的情况下，抗原-抗体反应发生不充分，因此存在诊断准确度可能下降的问题。所述标本稀释液可以是对标本稀释2倍至64倍的，例如，可以是2倍、4倍、8倍、16倍、32倍或64倍稀释的。
在一个具体例的方法中，所述血液可以是血浆或血清。向所述标本稀释液混合血浆或血清的情况下，所述血浆或血清的体积可以是0.1ml至1ml。例如，可以是0.1ml至1ml、0.1ml至0.9ml、0.1ml至0.8ml、0.2ml至1ml或0.2ml至0.8ml。在此，血浆或血清的体积小于所述范围的情况下，抗原-抗体反应发生不充分，因此存在诊断准确度可能下降的问题。
一个具体例的方法包括将所述稀释液滴到标本滴落部使得反应10至40分钟的步骤。具体来讲，可利用吸管向标本滴落部滴(drop)1至5滴所述稀释液，例如，可滴1至5滴、1至4滴、2至5滴或2至4滴。之后使之反应10至40分钟，例如，可使之反应10至40分钟、10至35分钟、10至30分钟、15至40分钟、15至35分钟或15至30分钟。在此，反应时间小于所述范围的情况下，存在标本稀释液无法与标本滴落部的IgE充分反应的问题。
一个具体例的方法还可以包括对所述反应结束的设备利用结果确认用卡确认有无各过敏原特异抗体的步骤。
技术效果
一个方面的肽及抗体可作为免疫球蛋白E的表位用于免疫学、过敏等的诊断或治疗剂研究等。并且，包括所述抗体的试剂盒能够定性分析有无韩国人当中发生频率高的典型的吸入性、食物过敏，能够采血后短时间内用肉眼确认结果。并且，能够最小化检查所需的标本量，因此具有还能够适用于采血困难的幼儿的优点。
附图说明
图1为一个方面的试剂盒的反应示意图；
图2为示出一个具体例的设备的制造工程的示意图。
具体实施方式
以下，为了帮助理解本发明而公开优选实施例。然而下述实施例是为了帮助更容易理解本发明而提供的，本发明的内容不限于下述实施例。
[实施例]
实施例1.新型免疫球蛋白E表位的确认
(1)多克隆抗体的制备及滴度的确认
混合抗原(IgE pep-40)100μl与同量的完全佐剂(Complete adjuvant)制备抗原乳化液后，向6周龄的雌性小鼠(BALB/C)皮下给药以诱导免疫反应。第1次给药后，以两周间隔利用相同的抗原100μl与等量的不完全佐剂(Incomplete adjuvant)向所述小鼠的皮下给药(表1)。
[表1]
抗原给药三次后，从所述小鼠的尾静脉采血少量的血清(serum)，通过ELISA测试确认血清内多克隆抗体的滴度。具体来讲，将抗原(IgE pep-40)2μg/ml按照每孔(well)100μl在4℃反应18小时后进行涂覆。次日利用成块缓冲区(blocking buffer)在室温反应(blocking)1小时。之后使用从小鼠血液得到的血清按倍率稀释并将100μl分注到孔后使之在室温反应1小时。使用PBST清洗反应结束的板后按照1:2000比率稀释接合(conjugation)有HRP的Goat anti-mouse IgG-HRP并将100μl分注到孔使之在室温反应1小时。之后使用PBST清洗，分注TMB溶液使之反应15分钟后使用反应终止液结束反应。在450/620nm测定吸光度值确认血清内滴度(titer)(表2)。
[表2]
| 血清浓度 | 区别 | 对照组 | NC1 | IgE pep-40 |
| x100 | A | 0.203 | 0.087 | 2.576 |
| x200 | B | 0.084 | 0.037 | 2.195 |
| x400 | C | 0.03 | 0.014 | 2.001 |
| x800 | D | 0.013 | 0.009 | 1.637 |
| x1600 | E | 0.009 | 0.006 | 1.119 |
| x3200 | F | 0.006 | 0.006 | 0.583 |
| x6400 | G | 0.005 | 0.005 | 0.332 |
| x12800 | H | 0.005 | 0.005 | 0.117 |
(2)杂交瘤细胞的制备
确认生成了以通过抗体滴度确认实验确认的小鼠的血清内滴度为基准具有高滴度的抗体，并分离所述小鼠的淋巴细胞实施细胞融合。无损伤地摘出被诱导免疫反应的小鼠的脾脏并用DMEM(Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium)培养基清洗，分离淋巴细胞，将DMEM培养基装在60㎜皿(dish)分离成单一细胞。之后，使用RBC裂解缓冲液(lysis buffer)去除掺杂在淋巴细胞的红血球后，用DMEM培养基清洗，按细胞数之比1:5混合准备的骨髓瘤细胞(Myeloma cell，SP2/0Ag 14-ATCC#CRL-1581)与淋巴细胞。之后，向混合的所述细胞添加PEG1500 1.7ml诱导细胞融合，向96孔板按每孔200μl分注细胞后在CO2培养器(incubator)进行培养。细胞融合2日后，将每孔50％替换成HAT培养基(hypoxanthine-aminopterinthymidine medium)，12日后，确认集落(colony)，按照上述ELISA(Asb.450nm)方式确认是否与IgE pep-40蛋白质肽(ELISA确认用抗原)反应。在所述ELISA结果中，以O.D值为基准在1.0以上的情况下，选定为阳性(positive)并分选单克隆细胞。
(3)生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株的分选
从制备的融合细胞群中分选仅对IgE pep-40特异反应的细胞，为了确认是否生成抗体而利用酶免疫方法筛选。
细胞融合后第12日更换培养基，将更换的培养基作为1次抗体进行ELISA试验。ELISA试验后选择对该抗原呈阳性的孔并移到24孔进行培养。用相同的方法对在24孔培养的杂交瘤细胞株再次进行ELISA试验以确认抗体滴度。通过ELISA确认在24孔培养的融合细胞的吸光度(O.D值)，仅选择吸光度超过1的融合细胞并移到6-孔培养瓶进行培养，经过离心分离后取得上层液进行ELISA确认以执行3次筛选。将根据3次筛选选择的融合细胞重新移到75T/C培养瓶进行培养，通过ELISA确认吸光度并仅选择吸光度超过1的融合细胞。
(4)分析单克隆抗体对IgE pep-40蛋白质的表位(epitope mapping)
使用用于生产抗体的肽实施表位作图(epitope mapping)。所使用的用于作图的肽是作为目前用于抗原生产的IgE pep-40蛋白质的一部分的具有12、13、15个氨基酸序列的肽(表3)。
从中发现了与Pep-6肽结合的抗体，判断出Pep-6是之前未知的新型抗原(IgEpep-40)的结合部位(epitope)。
[表3]
| 肽种类 | 氨基酸序列 | 序列号 |
| Pep-1 | LEDGQVMDVDLST | 1 |
| Pep-4 | EVTRAEWEQKDE | 2 |
| Pep-6 | SRASGKPVNHSTR | 3 |
实施例2.过敏疾病诊断或预后分析用试剂盒的制造
(1)过敏原的分离
向以下表4所示的原材料添加能够浸没TSM过敏源(TSM Allergen Source)的程度的乙醚(Ether)后，好好混合的同时在常温培养(incubation)5分钟。
[表4]
之后，小心地倒出乙醚(Ether)，再次放入新鲜醚(fresh ether)，重复三次上述过程脱脂(Defatting)以准备各试样。之后，i)将所述各试样与PBS(pH 8.0)按1:5(v/v)的比率混合后，在冰上利用Polytron均质器(Polytron Homogenizer)提取，并在4℃培养24小时，或者，ii)向所述试样添加5倍体积的COCA’s溶液后在4℃旋转培养24小时。
之后，以4℃、15,000rpm离心分离30分钟以分离其上清液后，用厄特曼纸(whatmanpaper)过滤。之后，利用0.1xPBS(pH 7.5)透析所述试样24至48小时。将经过透析的试样在以该状态在冷藏室风干(air dry)的同时，干燥至减少到1/10左右。以4℃、15,000rpm离心分离1小时后，利用45μm针头式过滤器(Syringe Filter)过滤。之后利用布拉德福德测定(Bradford assay)定量蛋白质，冻结干燥。
(2)结合到Pep-6的抗体的制备
1)确认抗体的滴度
发现与所述Pep-6肽结合的抗体并确立利用其的单克隆抗体细胞株后，利用细胞培养液实施抗体的滴度确认试验。在此，作为Pep-6的载体使用KLH蛋白质。
[表5]
| 克隆(clone) | Pep6-KLH | 人IgE | KLH |
| 8-7_100细胞 | 1.5540 | 0.4070 | 0.0660 |
| 59-3_500细胞 | 1.3840 | 0.1000 | 0.0670 |
| 67-2_500细胞 | 1.5000 | 0.2470 | 0.0670 |
| 140-13_500细胞 | 1.5090 | 0.3320 | 0.0650 |
| 213-1_100细胞 | 1.3890 | 0.1310 | 0.0660 |
| 285-1_100细胞 | 1.5030 | 0.2150 | 0.0630 |
| 302-2_100细胞 | 1.4480 | 0.3030 | 0.0670 |
| 370-7_500细胞 | 0.9040 | 0.0620 | 0.0640 |
| 373-3_500细胞 | 1.5030 | 0.1770 | 0.0670 |
| 405-1_100细胞 | 1.4370 | 0.2020 | 0.0640 |
| H5-14_500细胞 | 1.4040 | 0.2130 | 0.0630 |
| H8-1_500细胞 | 1.3990 | 0.0830 | 0.0640 |
| 563-5(分离) | 1.4420 | 0.1210 | 0.0640 |
| 空白(Blank) | 0.0610 | 0.0580 | 0.0580 |
涂板(Plate coating)：Pep-6-KLH，人IgE(Human IgE)，KLH
空白(Blank)：未添加细胞培养液的负调控(negative control)
其结果能够确认如所述表5所示的结果，可确认8-7_100细胞、140-13_500细胞、302-2_100细胞不结合到KLH，对重组IgE全蛋白(IgE whole protein)具有结合力，对pep-6-KLH具有高结合力。
2)与在售抗体比较性能
进行在所述抗体的滴度确认时对Pep-6-KLH的结合力高的8-7_100细胞、140-13_500细胞、302-2_100细胞与在售抗IgE抗体的性能比较试验(表6)。
[表6]
| 克隆(clone) | Pep6-KLH | 人IgE | KLH |
| 8-7_100细胞 | 1.7200 | 0.4420 | 0.0820 |
| 59-3_500细胞 | 1.5030 | 0.1440 | 0.0840 |
| 67-2_500细胞 | 1.5930 | 0.2330 | 0.0870 |
| 140-13_500细胞 | 1.6540 | 0.3670 | 0.0850 |
| 213-1_100细胞 | 1.5020 | 0.1410 | 0.0810 |
| 285-1_100细胞 | 1.5730 | 0.2240 | 0.0770 |
| 302-2_100细胞 | 1.5370 | 0.3450 | 0.0740 |
| 370-7_500细胞 | 1.0410 | 0.0820 | 0.0790 |
| 373-3_500细胞 | 1.6430 | 0.2120 | 0.0880 |
| 405-1_100细胞 | 1.5620 | 0.2220 | 0.1090 |
| H5-14_500细胞 | 1.5510 | 0.2590 | 0.0850 |
| H8-1_500细胞 | 1.4720 | 0.1060 | 0.0830 |
| 563-5(分离) | 1.5450 | 0.1530 | 0.0820 |
| 抗IgE(2ug/ml，销售产品) | 0.0800 | 0.4940 | 0.0760 |
| 空白(blank) | 0.0800 | 0.0740 | 0.0770 |
其结果如所述表8所示，可确认三种抗体(8-7_100细胞、140-13_500细胞、302-2_100细胞)是相比于在售的抗体具有不同的结合部位的抗体，但对重组IgE的结合力程度相近，判断出所述三种抗体(8-7_100细胞、140-13_500细胞、302-2_100细胞)可用于制造试剂盒。
3)确认分选的抗体对天然IgE(native IgE)的结合力
作为用于制造试剂盒的抗体的分选基准，选定对重组IgE的结合力与销售产品相近的三种抗体(8-7_100细胞、140-13_500细胞、302-2_100细胞)。并且为了确认三种抗体对血液内存在的天然IgE(native IgE)的结合力程度而用以下方法通过ELISA试验进行确认。
将在售人IgE(human IgE)的抗体2μg/ml按每孔(well)100μl在4℃反应18小时并涂覆。次日利用成块缓冲区(blocking buffer)在室温反应(blocking)1小时。进行反应期间按商业化的生物素化试剂盒(biotinylation kit)的使用说明对分选的三种抗体进行生物素化(biotinylation)。之后，将判定为与重组IgE蛋白质发生过敏的患者血清向各孔分注10μl后使得在室温反应1小时。使用PBST清洗反应结束的板后，按1:5000的比率稀释接合(conjugation)有HRP的链霉亲和素(straptavidin)并向孔分注100μl使之在室温反应1小时。之后使用PBST清洗，分注TMB溶液使得反应15分钟后使用反应终止液结束反应。在450/620nm测定吸光度值以确认分选的抗体结合到重组IgE、天然IgE(native IgE)的程度。
[表7]
试验结果如所述表7所示，可知分选的三种抗体结合于重组IgE、天然(native)IgE，三种抗体均能够用于制造试剂盒。
(3)金接合体的准备
使用氯金酸与还原剂制备直径为40至60nm的胶体性金粒子。添加3次蒸馏水使得胶体性金粒子在520nm时OD值为1.0±1.0。向金溶液1ml添加在实施例1-2准备的单克隆抗-人IgE(anti-Human IgE)抗体5μg至15μg后在室温进行1小时振荡反应。清洗反应结束的金粒子并利用吸光度计在520nm测定定量后，将浓度稀释成OD值为5.0±1.0并添加保存剂。
(4)试剂盒及设备的制造
使用硼酸盐缓冲液将在实施例1-(1)准备的过敏原抗原稀释成5㎎/ml，将抗-小鼠IgG(anti-mouse IgG)
稀释成2㎎/ml，使用自动定量分注器分别分注到检查线及对照线位置对膜进行涂覆。之后，将涂覆的所述膜放在确认检查台，全量肉眼检查各涂覆液是否被正常分注。将正常分注的膜在37±2℃恒温干燥1小时以上后，直至组装为止保持密封前以除湿状态保管。
混合在所述实施例1-(3)制备的金接合体与稳定剂并均质地吸收到玻璃纤维。在此，玻璃纤维每1.1㎝x0.4㎝使用19.63μl，因此向一个设备按照14.59±1.06μg原液基准质量添加单克隆抗人IgE(anti-Human IgE)抗体金接合体。直至组装密封在37±2℃干燥1小时的玻璃纤维以除湿状态保管。
将接合体垫与标本垫依次重叠地附着在以上涂覆的膜的下端，在上端附着吸收垫。使用专用切削机切断成(45±5.2)㎜x(4.4±1.5)㎜规格，直至设备组装为止防湿包装保管。之后，将切断的条放在下部塑料设备上之后盖住上部塑料设备并与干燥的硅胶一起放入银箔密封包装。
[实验例]
检出限的确认
为了确认在所述实施例2制造的试剂盒的检出限，对在免疫-CAP(immuno-CAP)检查被判定为阳性(3.5IU/ml以上)的标本的原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀释后，将对各过敏原的标本按照标准试验法反复进行三次试验，按照判定基准判定并在以下表8示出其结果。
[表8]
其结果如表8所示，按各过敏原分五步骤稀释多个标本且每个稀释标本重复三次试验，将是三次试验均被判定为阳性的标本且免疫-Cap定量值为最低值的值设为各过敏原的检出限。即，根据一个具体例的试剂盒的检出限在定量值2至8ng范围以上判定为阳性，但无法将1.68至8.39ng的标本均都判定为阳性，因此以EIA类为基准将定量值8.4ng以上设为检出限。
精密度及准确度的确认
为了判定在所述实施例2制造的试剂盒的(1)试验者之间、(2)试验日之间、(3)试验(Lot)之间、(4)相同试验日、试验场所之间对过敏原的准确度，按照标准试验法进行了测试。分别准备对过敏原的阴性标准物质及阳性标准物质按照以下试验方法进行测试，其结果如以下表9所示。
(1)试验者之间
分别由不同试验者分别使用阴性标准物质及阳性标准物质对在所述实施例2制造的试剂盒三个进行试验，分析了其结果。
(2)试验日之间
由一名试验者分别使用阴性标准物质及阳性标准物质以一日间隔对在所述实施例2制造的试剂盒共进行试验共5日，分析了其结果。
(3)试验(Lot)之间
由一名试验者分别使用阴性标准物质及阳性标准物质对三个在所述实施例2制造的试剂盒进行试验，分析了其结果。
(4)相同试验日(试验场所)之间
由一名试验者对在所述实施例2制造的试剂盒分别在不同的三处(实验室、QC室等)使用阴性标准物质及阳性标准物质进行试验，分析了其结果。
[表9]
其结果如表9所示，可知实施例2的设备与同一人、试验者、试验日、批次(Lot)之间及试验场所之间无关，利用阴性标准物质的试验所出现的结果为阴性，利用阳性标准物质的试验所出现的结果为阳性，出现了相同的试验结果。
特异度的确认
确认是否为假阳性/假阴性
为了测定标本内存在的物质引起的干涉效果，向阴性标准物质及阳性标准物质添加以下表10的物质以试验是否为假阳性(false positive)及假阴性(false negative)，其结果如表11所示。
[表10]
| 试验物质 | 浓度 |
| 人类白蛋白 | 20g/dL |
| 柠檬酸钠 | 500㎎/dL |
| 氰钴胺(维生素B12) | 1㎎/dL |
| 胆红素 | 20㎎/dL |
| EDTA | 800㎎/dL |
| 葡萄糖 | 10g/dL |
| 抗坏血酸 | 521㎎/dL |
| 血红蛋白 | 250㎎/dL |
[表11]
在此，假阳性是指干涉物质导致阴性标准物质被判定为阳性，假阴性是指含有干涉物质的阳性标准物质由于干涉物质的影响而被判定为阴性。
其结果如表11所示，本发明的试剂盒对8种干涉物质均无影响。
确认是否交叉反应
并且，为了确认有/无检查过程中使用的抗体与标本内可能存在的免疫球蛋白亚种非特异结合引起的交叉反应，向阴性标准物质分别添加IgA、IgM、IgG及IgD3㎎/ml，按照标准试验法进行试验并按照判定基准进行判定。
其结果，添加IgA、IgM、IgG及IgD的阴性标准物质均呈阴性，从而可知无干涉反应。
与在售产品比较体外检查
利用按照实施例1-2制造及分选的三种抗体中8-7_100细胞，按照实施例2制造过敏试剂盒，与在售的试剂盒(LG，Alloscan)进行了与39种过敏原中发生频率高的13种过敏原(欧洲屋尘螨(DP)、北美屋尘螨(DF)、猫、屋尘、狗、桦木、交链孢霉(alternaria)、桃、苹果、黑麦草、黄花茅、鸭茅草、梯牧草、橡树、蛋清、土豆)的一致率确认试验。试验采用了对13种中一个以上过敏原呈阳性的160标本，对呈不一致的标本进行是第三检查法且在过敏检查被视为标准试验法的体外检查判定结果。利用在售产品试剂盒的试验与体外检查委托给受托机构实施，自主开发的试剂盒以两名检查员检查的形态自主实施(表12)。
[表12]
其结果如表12所示，160个标本中52个标本出现不一致，出现不一致的检查中体外试验结果与利用自主开发的抗体的试剂盒一致标为为36个，与利用在售试剂盒的检查一致的标本为16个。
所述结果表明利用实施例2的抗体的过敏检查试剂盒由于与抗体的非特异反应或过敏原的结合力优异而具有很高的一致率。
上述本发明的说明用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员能够理解可在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下轻易变形成其他具体形态。因此应理解以上记载的实施例旨在全面例示，而不是进行限定。
<110> SLS生物有限公司(SLSBio)
<120> 新型免疫球蛋白E的表位、与其结合的抗体及用于分析免疫球蛋白E的包括所述抗体的试剂盒(A NOVEL EPITOPE OF IMMUNOGLOBULIN E, ANTIBODY BINDING THERETOAND
A KIT COMPRISING ABOVE ANTIBODY FOR ANALYSIS OF IMMUNOGLOBULIN E)
<130> PX058494PCT
<150> KR 10/2018/0040605
<151> 2018-04-06
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pep-1
<400> 1
Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pep-4
<400> 2
Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Pep-6
<400> 3
Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg
1 5 10
Claims (16)
1.一种肽，由作为免疫球蛋白E(Immunoglobulin E：IgE)的表位(epitope)的序列号3的氨基酸序列构成。
2.一种抗免疫球蛋白E抗体，其与权利要求1所述的肽结合。
3.一种试剂盒，其包括权利要求2所述的抗体且用于分析试料中免疫球蛋白E。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，还包括承载体或稀释剂。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试料为使个体与过敏原接触后从个体分离的生物学试料。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试料是接触后10分至40分分离的。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括过敏原及涂覆所述抗体的膜。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述过敏原为选自屋尘螨、黑麦草、橡树、艾蒿、葎草、蒜、猪肉、金枪鱼、霉、狗、芝麻、花生、牛肉、黄花茅、虾、苹果、猫、赤杨木、桦木、大豆、核桃、鳕鱼、鸭茅草、牛奶、桃、土豆、豚草、蛋清、小麦、蟹、大麦、芦苇、蟑螂、荞麦及屋尘构成的群组的任意一种以上。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述膜选自由硝酸纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃及塑料构成的群组。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于分析免疫色谱。
11.一种过敏诊断或预后预测用设备，其中，包括：
权利要求3的试剂盒；以及
标本滴落部。
12.一种过敏疾病的诊断方法，其中，包括：
采集个体的血液并混合到标本稀释液的步骤；以及
将所述稀释液滴到(drop)标本滴落部使得反应的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述反应进行10至40分钟。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血液的体积为0.5Ml至2Ml。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述血液为血浆或血清。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述血浆或血清的体积为0.1Ml至1Ml。
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