ES2831723T3

ES2831723T3 - Acidos nucleicos para tratar alergias

Info

Publication number: ES2831723T3
Application number: ES12878776T
Authority: ES
Inventors: William Hearl; Teri Heiland
Original assignee: Immunomic Therapeutics Inc
Current assignee: Immunomic Therapeutics Inc
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: BR112014031327B1; US20160271245A1; IL236174A0; JP5807994B2; US9744230B2; WO2013187906A1; KR102107646B1; EP2861240A4; HRP20201815T1; US20180009857A1; PL2861240T3; SI2861240T1; KR102386481B1; AU2018200625A1; AU2018200625B2; AU2012382406B2; RS61098B1; CN104519896B; DK2861240T3; LT2861240T

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica para su uso en el tratamiento de alergias, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene los siguientes elementos fusionados en el marco ('in-frame') en orden secuencial: una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal; una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio luminal de una proteína de membrana asociada a lisosomas (o LAMP) humana; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína alergénica, de manera que la secuencia de ácido nucleico no incluye una secuencia de señal natural de la proteína alergénica; una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio transmembrana -o dominio transmembranal- de una LAMP humana; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización -o dominio de direccionamiento- de una LAMP humana, de manera que la LAMP humana se selecciona del siguiente grupo: LAMP-1 humana, LAMP-2 humana, CD63/LAMP-3 humana o DC-LAMP humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Ácidos nucleicos para tratar alergias

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0001] La presente invención está relacionada con los campos de la medicina y la biología molecular. Más específicamente, la presente invención está relacionada con los ácidos nucleicos que se usan como vacunas de a Dn y con los métodos para usarlos para tratar a sujetos que sufren reacciones alérgicas o que son susceptibles de sufrirlas.

Descripción de la técnica relacionada

[0002] La alergia es una enfermedad de hipersensibilidad que se caracteriza por la producción de anticuerpos IgE contra un alérgeno o una molécula que provoca la alergia. Las alergias afectan a más de un 25% de la población. Los alérgenos pueden penetrar en el cuerpo a través de múltiples vías, incluyendo el tracto respiratorio, el contacto con la piel, la ingestión, la picadura de un insecto o la inyección de un fármaco o medicamento.

[0003] La gestión de una enfermedad alérgica comprende el diagnóstico y el tratamiento. Los alergólogos diagnostican una alergia utilizando diversas técnicas, como una prueba de punción cutánea, las técnicas basadas en los radioalergosorbentes, ELISA o las pruebas de exposición o provocación, para mostrar la IgE alergeno-específica e identificar la fuente de alérgenos. Más frecuentemente, el tratamiento de las alergias se divide en dos categorías: la prevención y la dosificación con antihistamínicos. Una tercera alternativa, la inmunoterapia para alergias, requiere que el paciente reciba semanalmente inyecciones que contienen pequeñas cantidades de alérgenos ofensivos para ayudar al sistema inmunitario a readaptar su respuesta frente a los alérgenos.

[0004] El uso y la producción de proteínas de fusión de alérgenos son muy conocidos en este campo. Por ejemplo, la Patente de EE. UU. n° 7,566,456 habla sobre una proteína de fusión con dominios de unión -o dominios de enlace- a IgE e IgG y también sobre la codificación de un alérgeno. Además, WO 97/07218 habla sobre proteínas de fusión de alérgenos anti-CD32 que se usan en la inmunoterapia para alergias. No obstante, ninguno de estos documentos explica cómo interactúan las respectivas proteínas de fusión con las células T mediante la presentación de antígenos para provocar o modificar una respuesta de Th1. Asimismo, no hay ninguna conexión teórica entre dirigir la vacuna que contiene anti-CD32 a las células dendríticas y obtener una inducción positiva de las células Th1. Ambos documentos presentan una composición que introduce un alérgeno terapéuticamente, de manera que el alérgeno puede hallarse en el suero como una proteína de fusión de alérgenos.

[0005] Toda et al., 2002, han demostrado que un epítopo de células T de un alérgeno, en este caso un epítopo de Cry J2 situado en los aminoácidos 247-258, puede unirse a una proteína de fusión y usarse para llevar a cabo una inmunoterapia específica para alergias. La composición específica que describen Toda et al., 2002, se basa en el uso de una vacuna de ADN que codifica el epítopo principal de la célula T CD4 de Cry J2, situado en los aminoácidos 247-258, que se une a un CLIP o péptido de cadena invariante asociado a la clase II. El CLIP contiene una secuencia de tráfico lisosómica/endosómica y contiene un dominio que se une al surco de unión de péptidos de CMH II (o MHC II). Toda et al., 2002, demuestran que con la inmunización con la vacuna de ADN de péptido de Cry J2/CLIP se ceba un ratón y se obtiene principalmente una respuesta de Th1, que se caracteriza por una producción más alta de IgG2a e interferón gamma (IFN-gamma). Sin embargo, Toda et al. no explican la señalización intracelular de toda la secuencia de codificación de proteínas de un alérgeno que es útil para llevar a cabo una inmunoterapia específica para alergias.

[0006] Las Patentes de EE. UU. n° 6,982,326 y n° 6,090,386 describen secuencias de ácido nucleico que codifican los principales alérgenos del polen de Cryptomeria japónica, Cry J1, Cry J2, Jun s I y Jun v I, y fragmentos o péptidos de estos. La invención también proporciona Cry J1, Cry J2, Jun s I y Jun v I purificados y al menos un fragmento de estos producido en una célula huésped transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica a Cry J1, Cry J2, Jun s I, y Jun v I, o al menos un fragmento de estos, y fragmentos de Cry J1, Cry J2, Jun s I o Jun v I, o al menos un fragmento de estos, y fragmentos de Cry J1, Cry J2, Jun s I o Jun v I preparados sintéticamente. Se desvela que Cry J1, Cry J2, Jun s I y Jun v I, y los fragmentos de estos, son útiles para diagnosticar, tratar y prevenir la polinosis del cedro japonés. La invención también proporciona péptidos aislados de Cry J1 y Cry J2. Los péptidos que entran dentro del alcance de la invención comprenden al menos un epítopo de células T o, preferiblemente, al menos dos epítopos de células T de Cry J1 o Cry j2. La invención también se refiere a los péptidos modificados que tienen unas propiedades terapéuticas mejoradas o similares a los correspondientes alérgenos naturales o a una porción de estos, pero que tienen menos efectos secundarios. También se proporcionan métodos para tratar o diagnosticar la sensibilidad al polen del cedro japonés de un individuo; composiciones terapéuticas; y formulaciones multipeptídicas que contienen uno o más péptidos de la invención. La invención no explica cómo combinar los epítopos o los alérgenos en una vacuna de ADN con propiedades inmunoestimuladoras.

[0007] Las Patentes de EE. UU. nos 7,547,440 y 7,112,329 identifican el sitio del epítopo de las células T en una molécula de alérgenos del polen de un ciprés japonés (hinoki) estimulando la línea de células T determinada a partir de un paciente que tiene alergia al polen de ciprés japonés con un péptido superpuesto que abarca la estructura primaria del alérgeno del polen del ciprés japonés. El péptido es útil para la inmunoterapia a base de péptidos para pacientes con polinosis de los árboles primaverales, incluidos los pacientes con polinosis del ciprés japonés que tienen reactividad cruzada con el polen del ciprés japonés. El péptido también es útil para diagnosticar la polinosis de árboles primaverales. La invención se limita a los diagnósticos y la entrega de epítopos por parte de polipéptidos.

[0008] Las vacunas de ADN se han desarrollado como una alternativa para las tradicionales vacunas de virus completos o células completas. En general, las vacunas de ADN son ácidos nucleicos modificados que contienen secuencias que codifican uno o más epítopos. Los ácidos nucleicos se envían a las células, normalmente a las células presentadoras de antígenos (o APCs, por sus siglas en inglés); después, los ácidos nucleicos se expresan y los epítopos presentes en las proteínas expresadas se procesan en el compartimento endosómico/lisosómico y, finalmente, se presentan en la superficie de la célula. La Patente de EE. UU. n° 5,633,234, de August et al., desvela y describe la secuencia de señalización endosómica/lisosómica de las proteínas de membrana asociadas a lisosomas (o LAMPs, por sus siglas en inglés). Esta patente identifica los residuos cruciales de la región C-terminal de la proteína que son necesarios para el direccionamiento -o señalización- de la proteína al compartimento endosómico/lisosómico. La patente desvela que la fusión de péptidos antigénicos con la secuencia de señalización de la LAMP C-terminal puede proporcionar un mejor procesamiento y una mejor presentación de epítopos para generar una respuesta inmunitaria.

[0009] Además, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. n° 2004/0157307, de Harris et al., desvela el uso del dominio luminal -o dominio lumenal- como un 'dominio de tráfico' para dirigir las proteínas quiméricas expresadas a partir de vacunas de ADN a través de uno o más compartimentos/orgánulos celulares, por ejemplo a través de la ruta o vía vesicular lisosómica. Las proteínas quiméricas incluyen el dominio luminal de un polipéptido LAMP, un dominio antigénico que comprende una secuencia de epítopos de péptidos identificada previamente y seleccionada de una proteína antigénica, un dominio transmembranal y una secuencia de señalización endosómica/lisosómica.

[0010] Las vacunas de ADN se han propuesto como tratamiento para las enfermedades alérgicas (Raz et al., 1996; Hartl et al., 2004; Hsu et al., 1996; Crameri 2007; Weiss et al., 2006). La lógica subyacente es que las proteínas alergénicas codificadas por una vacuna de ADN activarán preferentemente la respuesta célular de Th1 alérgenoespecífica con la producción de interferones por parte de las APCs, las células asesinas (o NKs, por sus siglas en inglés) y las células T, en lugar de la característica respuesta de tipo Th2, como la secreción de IL-4, IL-5 y IL-13, la formación de IgE por parte de los linfocitos B, y la maduración y el reclutamiento o captación de eosinófilos en las reacciones de fase tardía. Sin embargo, al parecer los mecanismos que subyacen bajo la inducción diferencial de los fenotipos de las células Th1 y Th2 atañen a un gran número de factores, como las propiedades únicas del ADN bacteriano de las preparaciones de las vacunas, por ejemplo los residuos de ADN de CpG y ADN no metilado, el entorno de citoquinas causado por la inmunidad innata, y las propiedades de tráfico celular de los alérgenos (Chen et al., 2001; Kaech et al., 2002). No existe ningún método o invención que haya proporcionado una solución satisfactoria para la incertidumbre de los tratamientos antialérgicos que se basan en la administración de ácidos nucleicos que codifican un alérgeno. Por lo tanto, hasta la fecha no ha sido posible contar con un método de este tipo para tratar las alergias. Además, la administración de vacunas de ADN para tratar enfermedades alérgicas provoca la secreción de péptidos alergénicos en el entorno extracelular, lo que potencialmente conlleva la inducción accidental de una respuesta alérgica mediante la activación de la IgE.

[0011] WO 2002/080851 A2 (August et al.) describe proteínas quiméricas que contienen un dominio antigénico y un dominio de tráfico (que incluye el dominio luminal de LAMP) que se usan para producir vacunas con una mayor inmunogenicidad. WO 2001/76642 A1 (Raz et al.) describe vacunas de polinucleótidos que contienen un ácido nucleico que codifica un antígeno que se ha modificado para mejorar o aumentar su expresión en las células huésped. WO 1994/24281 A1 (Garman et al.) describe un péptido modificado -y aislado- de un alérgeno proteico del género Dermatophagoides que contiene al menos un epítopo de células T. WO 2006/099574 A2 (Yoo et al.) describe un método de tratamiento o profilaxis que incluye administrar a un mamífero un polinucleótido que contiene una secuencia que codifica un alérgeno de cucaracha. WO 1994/11512 A2 (Kuo et al.) describe un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un alérgeno de polen de cedro japonés (Cry j II).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0012] La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica y que se usa para tratar alergias, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene -fusionados en el marco o la estructura en orden secuencial- los siguientes componentes: una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal; una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio luminal de una proteína de membrana asociada a lisosomas (o LAMP) humana; una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína alergénica, de manera que la secuencia de ácido nucleico no incluye una secuencia de señal natural de la proteína alergénica; una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio transmembranal de una LAMP humana; y una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización de una LAMP humana, de manera que la LAMP humana se selecciona del siguiente grupo: LAMP-1 humana, LAMP-2 humana, CD63/LAMP-3 humana o DC-LAMP humana.

[0013] Asimismo, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[0014] La presente invención también proporciona un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención para que se use en el tratamiento de alergias, y una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la invención para que se use en el tratamiento de alergias.

[0015] La presente invención se especifica en las reivindicaciones anexas y está relacionada con los ácidos nucleicos (que en el presente documento también se denominan 'constructos') que codifican proteínas alergénicas, polipéptidos alergénicos y péptidos alergénicos. Los ácidos nucleicos están diseñados para liberarse o enviarse a las células inmunitarias y para producir proteínas, polipéptidos y péptidos alergénicos en estas células. Las proteínas, polipéptidos y péptidos codificados tienen secuencias de señalización para la señalización de las proteínas en el compartimento de CMH-II a fin de procesar y expresar uno o más epítopos, lo que provoca una respuesta inmunitaria a el o los epítopos. En general, los ácidos nucleicos contienen los siguientes dominios, que se corresponden con los respectivos dominios de la proteína codificada: un dominio de secuencia de señal; un dominio de estabilización intraórganulos; un dominio alergénico; un dominio transmembrana; y un dominio citoplasmático de señalización lisosómica/endosómica.

[0016] En el contexto de la proteína codificada, la secuencia de señal -o secuencia de señales- se proporciona para dirigir la proteína codificada hacia el retículo endoplasmático o un lisosoma. El dominio de estabilización intraorgánulos es una secuencia que está diseñada para ser proteolíticamente resistente y para proteger de la degradación a las restantes porciones de la proteína -y, más particularmente, el dominio alergénico- antes del procesamiento para la presentación de los epítopos por parte de la célula. En las realizaciones ejemplares, el dominio de estabilización intraorgánulos es el dominio luminal de LAMP-1. El dominio alergénico contiene la secuencia de uno o más epítopos alergénicos que pueden servir para aumentar la respuesta inmunitaria en un animal en el que se presentan los epítopos. Normalmente, el dominio alergénico contiene una o más proteínas alergénicas, aunque en las realizaciones pueden usarse polipéptidos inmunogénicos o fragmentos de péptidos de proteínas alergénicas. En las realizaciones ejemplares que se describen más adelante, el epítopo es un epítopo de una planta alergénica. En las proteínas codificadas de la invención, el dominio alergénico no incluye un péptido de señal, como los péptidos de señal que existen de forma natural como parte de las proteínas alergénicas. El dominio alergénico puede contener o comprender un solo péptido, polipéptido o proteína alergénica, o puede contener dos o más péptidos, polipéptidos o proteínas alergénicas. Cuando están presentes dos o más alérgenos, cada alérgeno puede proceder de la misma especie/fuente o uno o más alérgenos pueden proceder de una o más fuentes diferentes. Cuando están presentes dos o más alérgenos, se expresan de manera coordinada para proporcionar el mismo número de copias de cada región de codificación en la proteína expresada. El dominio transmembrana -o dominio transmembranal- puede ser cualquier secuencia que sea adecuada para dirigir la inserción y la transferencia de una proteína a través de una membrana. Muchas de estas secuencias son muy conocidas en este campo o pueden diseñarse fácilmente. El dominio transmembrana de la invención es el de una LAMP humana. El dominio de señalización lisosómica/endosómica puede ser cualquier secuencia que sea capaz de dirigir el péptido a un lisosoma o endosoma. Dichas secuencias son muy conocidas en este campo y en el presente documento están ejemplificadas por la secuencia de la cola citoplasmática de LAMP-1. El dominio de señalización de la invención es el de una LAMP humana.

[0017] Tal y como se ha mencionado anteriormente, en las realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos contienen un dominio alergénico que incluye una secuencia de codificación alergénica completa para una proteína alergénica, pero carece de la secuencia de codificación para la secuencia de señal del alérgeno. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención no contienen la secuencia de codificación alergénica completa; en lugar de ello, solo contienen una cantidad suficiente de la secuencia de codificación, de tal manera que el polipéptido codificado, al expresarse, es capaz de plegarse para adoptar la estructura tridimensional natural de al menos un epítopo que está presente en el polipéptido. Al igual que en los constructos que contienen una secuencia de codificación alergénica completa, cuando está presente menos que la secuencia de codificación completa, el constructo de ácidos nucleicos también carece de la secuencia de codificación para un péptido de señal natural para el péptido o polipéptido alergénico.

[0018] En las realizaciones preferidas, el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de codificación para múltiples proteínas, polipéptidos y/o péptidos alergénicos en el dominio alergénico. Cada alérgeno presente puede proceder de la misma fuente, o cada alérgeno puede ser de una fuente diferente, o cualquier combinación de ambos casos.

[0019] Los ácidos nucleicos de la invención -y, por consiguiente, las proteínas, polipéptidos y péptidos codificadospueden usarse en métodos para tratar a sujetos y, más particularmente, a sujetos animales que padecen alergias o que potencialmente pueden desarrollarlas. En general, un método de tratamiento que utiliza las composiciones de la presente invención incluye administrar un ácido nucleico de la invención a un sujeto en una cantidad suficiente para entregar o enviar el ácido nucleico a una o más células inmunitarias y, preferiblemente, a una o más células presentadoras de antígenos (o APCs) del sistema inmunitario. Una vez administrado, el ácido nucleico se expresa, la proteína codificada se procesa dentro de la célula y el o los epítopos se muestran o presentan en la superficie de la célula. El método de tratamiento puede considerarse un método que utiliza las proteínas y los ácidos nucleicos para proporcionar una respuesta inmunitaria terapéutica o profiláctica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES

[0020]

La Figura 1 (Fig. 1) es una representación esquemática de un ácido nucleico de acuerdo con una realización de la presente invención en la que un único antígeno que contiene un único epítopo se proporciona en el dominio alergénico.

La Figura 2 muestra un mapa vectorial de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, de manera que el dominio alergénico contiene el alérgeno CryJ2 (un alérgeno procedente de C. japónica), pero sin una secuencia de señal, insertado entre las secuencias N-terminales de LAMPs humanas (SS e ISOD) y las secuencias C-terminales de LAMPs humanas (TM y TG).

La Figura 3 es una representación esquemática de un ácido nucleico de acuerdo con una realización alternativa de la presente invención, de manera que en el dominio alergénico se proporcionan múltiples secuencias de epítopos de un único alérgeno.

La Figura 4 es una representación esquemática de un ácido nucleico de acuerdo con una realización alternativa de la presente invención, de manera que en el dominio alergénico se proporcionan múltiples secuencias alergénicas diferentes.

La Figura 5 muestra un mapa vectorial de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, de manera que el dominio alergénico contiene las secuencias alergénicas (sin péptidos de señal) para los alérgenos CryJ1 (un alérgeno procedente de C. japónica) y CryJ2 (otro alérgeno procedente de C. japónica).

La Figura 6A muestra un mapa vectorial de un ácido nucleico que incluye tres alérgenos del cacahuete (AraH1, AraH2 y AraH3; todos carecen de secuencias de señal) en el dominio alergénico.

La Figura 6B muestra un esquema de la proteína codificada por el ácido nucleico de la Figura 6A.

La Figura 7 muestra un mapa vectorial de un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención que describe la ausencia de secuencias de señal naturales para la secuencia alergénica de CryJ1. Este constructo particular se usa en los experimentos que se detallan más adelante para demostrar la importancia de eliminar la secuencia de señal natural de las secuencias alergénicas.

La Figura 8 muestra un mapa vectorial de un constructo de ácido nucleico que la presente invención no abarca, de manera que el alérgeno CryJ2 se codifica en el esqueleto de un plásmido, pero en ausencia de los dominios de SS, IOS, TM y TG. Este constructo se usa como control comparativo en los experimentos que se detallan más adelante.

La Figura 9 muestra diversos 'Western blots' o electrotransferencias que representan la expresión de constructos de acuerdo con la invención en células 293. El panel A muestra la expresión de los alérgenos combinados CryJ1-CryJ2 (ver Figura 5) y el alérgeno CryJ2 solo (ver Figura 2) en constructos de acuerdo con la invención, cuando se realizan pruebas con anticuerpos anti-CryJ2. El panel B muestra la expresión de los alérgenos combinados CryJ1-CryJ2 y el alérgeno CryJ1 (le falta su secuencia de señal nativa; ver Figura 7), cuando se realizan pruebas con anticuerpos anti-CryJ1. Además, el panel B muestra que la expresión del alérgeno CryJ1 no es detectable en un constructo en el que no se ha eliminado la secuencia de señal natural para el alérgeno CryJ1 (no se muestra el mapa vectorial).

La Figura 10 muestra gráficos lineales que representan la eficacia o eficiencia de los constructos de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en comparación con otros constructos que contienen secuencias de alérgenos. El panel A muestra que se observa un aumento significativo de la producción y detección de IgG1 como resultado de la administración del constructo de CryJ2-LAMP de la invención (ver Figura 2) en comparación con un constructo que contiene un esqueleto de plásmido fusionado con la secuencia de codificación de CryJ2 (ver Figura 8). El panel B muestra que se observa un aumento significativo de la producción y detección de IgG2a como resultado de la administración del constructo de CryJ2-LAMP de la invención (como el panel A) en comparación con un constructo que contiene un esqueleto de plásmido fusionado con la secuencia de codificación de CryJ2 (como el panel A).

La Figura 11 muestra gráficos de barras que muestran los efectos de la dosificación del constructo de CryJ2-LAMP en ratones. El panel A muestra la detección de IgG2a después de 21 días y 28 días tras la inyección de la vacuna de ADN en diversas cantidades -que van desde 10 |jg hasta 100 |jg- en comparación con la inyección de ADN vectorial solo. El panel B muestra la detección de IgG1 después de 21 días y 28 días tras la inyección de la vacuna de ADN en diversas cantidades -que van desde 10 jg hasta 100 jg - en comparación con la inyección de ADN vectorial solo.

La Figura 12 muestra gráficos de barras que muestran el efecto de la inducción de IL-4 e IFN-gamma en cultivos de bazo de ratón tratados con el constructo de CryJ2-LAMP de la invención en comparación con el vector solo. El Panel A muestra el efecto de la IL-4. El panel B muestra el efecto del IFN-gamma.

La Figura 13 muestra gráficos lineales que muestran la eficacia o eficiencia de la inmunización de ratones sensibilizados previamente con la vacuna de ADN de CryJ2-LAMP. El panel A muestra los títulos o valoraciones de la IgG1 con el paso del tiempo. El panel B muestra los títulos o valoraciones de la IgG2a con el paso del tiempo.

La Figura 14 muestra gráficos de barras que muestran la inducción de IFN-g (Panel A) e IL-4 (Panel B) en cultivos celulares de bazo de ratón.

La Figura 15 muestra un gráfico de barras que muestra la cuantificación de las proteínas de CryJ2 que están en circulación en ratones inmunizados.

La Figura 16 muestra gráficos de barras de datos de cobayas que muestran la detección de IgG1 (panel A) y la detección de IgG2a (panel B) en cobayas inmunizadas con el constructo de CryJ2-LAMP y expuestas a CryJ2 recombinante.

La Figura 17 muestra un gráfico de barras que muestra la respuesta anti-CryJ2 en conejos blancos neozelandeses inmunizados con la vacuna de ADN de CryJ2-LAMP durante un estudio de toxicología de seguridad de BPL de 85 días.

La Figura 18 muestra un 'western blot' que muestra la coexpresión de los alérgenos del cacahuete HI, H2 y H3 a partir de un constructo de acuerdo con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES EJEMPLARES

[0021] A continuación analizaremos con detalle diversas realizaciones ejemplares de la presente invención. Debe entenderse que la explicación que se ofrece a continuación sobre las realizaciones ejemplares no pretende limitar en modo alguno la presente invención, que se desvela ampliamente en el presente documento. En lugar de ello, la explicación que viene a continuación se proporciona a fin de ofrecer al lector una comprensión más detallada de algunos aspectos y características de la invención. En la práctica, la presente invención utiliza -a menos que se indique lo contrario- técnicas convencionales de biología molecular, de microbiología y de ADN recombinante que se incluyen dentro de las capacidades y conocimientos de las personas pertenecientes a este campo. Dichas técnicas se explican con todo detalle en la literatura -que resulta muy conocida para los profesionales que trabajan habitualmente en estos campos- y, por lo tanto, no es necesario explicarlas con detalle en el presente documento. De manera similar, la puesta en práctica de la invención para tratamientos médicos sigue los protocolos estándares que son muy conocidos en estos campos, por lo que no es necesario explicar detalladamente dichos protocolos en el presente documento.

[0022] Antes de describir con detalle las realizaciones de la presente invención, debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento sólo pretende describir las realizaciones particulares y no tiene carácter limitativo. Asimismo, cuando se ofrece un rango o intervalo de valores -y a menos que el contexto indique claramente lo contrario-, debe entenderse que cada valor intermedio -hasta la décima parte de la unidad del límite inferior- situado entre el límite superior y el límite inferior de dicho rango también está incluido específicamente. La invención abarca cada rango o intervalo menor situado entre cualquier valor establecido -o cualquier valor intermedio- de un rango establecido y cualquier otro valor establecido o valor intermedio situados en dicho rango. Los límites superiores e inferiores de estos rangos menores o más pequeños pueden excluirse o incluirse de manera independiente en el rango, de manera que la invención también abarca cada rango -aunque ningún límite esté incluido, o uno de los dos límites esté incluido o ambos límites estén incluidos en los rangos más pequeños-, y cada rango está sujeto a cualquier límite excluido específicamente del rango establecido. Cuando el rango o intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la invención. Por consiguiente, debe entenderse que, cuando se ofrece un rango o intervalo de valores, cada valor ubicado en dicho rango, y cada rango incluido en dicho rango, también queda mencionado o incluido intrínsecamente, de manera que el hecho de no mencionar específicamente cada uno de los valores y cada uno de los posibles rangos de valores no supone una omisión de dichos valores y dichos rangos, sino que se hace por conveniencia para el lector y en aras de la brevedad y la concisión de la divulgación.

[0023] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente una persona con conocimientos y habilidades comunes en el campo al que pertenece el término. Aunque en la puesta en práctica o el estudio de la presente invención pueden usarse cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

[0024] Tal y como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares 'un', 'una', 'el' y 'la' incluyen a sus respectivos plurales -a menos que el contexto indique claramente lo contrario-. Así, por ejemplo, la referencia a 'un alérgeno' incluye una multitud de dichos alérgenos y la referencia a 'una muestra' incluye la referencia a una o más muestras -y a los equivalentes de estas- que sean conocidas para una persona versada en este campo, etcétera. Asimismo, el uso de términos que pueden describirse utilizando términos equivalentes incluye el uso de dichos términos equivalentes. Así, por ejemplo, debe entenderse que el uso del término 'sujeto' incluye los términos 'animal', 'humano' y otros términos que se utilizan en este campo para aludir a alguien que se somete a un tratamiento médico.

[0025] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'que contiene(n)' o 'que comprende(n)' significa que los constructos, composiciones y métodos incluyen los elementos y/o pasos mencionados, pero no excluyen otros elementos y/o pasos. Cuando se usan para definir o especificar constructos, composiciones y métodos, 'que consta(n) básicamente de', 'que está(n) compuesto(s) básicamente de' o 'que se compone(n) básicamente de' significa que se excluyen otros elementos y pasos que tengan una importancia esencial para dichos constructos, composiciones y métodos. Por lo tanto, una composición que está compuesta básicamente de los elementos que se definen o especifican en el presente documento no excluye las trazas de compuestos contaminantes en los métodos de aislamiento y purificación y en los portadores farmacéuticamente aceptables, por ejemplo las soluciones salinas amortiguadas con fosfatos, los conservantes y similares. 'Que consta(n) básicamente de', 'que está(n) compuesto(s) básicamente de' o 'que se compone(n) básicamente de' significa que se excluye algo más que las trazas de elementos -o los 'elementos traza'- de otros ingredientes y los pasos importantes de los métodos para administrar las composiciones de la presente invención. Las realizaciones definidas o delimitadas por cada uno de estos términos de transición entran dentro del alcance de la presente invención.

[0026] Un 'ADN quimérico' es un segmento de ADN identificable dentro de una molécula de ADN más grande que en la naturaleza no se encuentra asociado con la molécula más grande. Por lo tanto, cuando el ADN quimérico codifica un segmento de proteína, la secuencia de codificación del segmento estará flanqueada o rodeada por ADN que no flanquea o rodea a la secuencia de codificación en cualquier genoma natural. Cuando el ADN flanqueante codifica una secuencia de polipéptidos, la proteína codificada se denomina 'proteína quimérica' (es decir, es una proteína que tiene secuencias de aminoácidos no naturales fusionadas). Las variaciones alélicas o las mutaciones que se producen de manera natural no producen un ADN quimérico o una proteína quimérica como los que se especifican en el presente documento.

[0027] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'polinucleótido' y 'molécula de ácido nucleico' se usan indistintamente para referirse a las formas poliméricas de nucleótidos con cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función conocida o desconocida. El término 'polinucleótido' incluye, por ejemplo, las moléculas monocatenarias, bicatenarias y de triple hélice, un gen o un fragmento de gen, los exones, los intrones, el ARNm, el ARNt, el ARNr, las ribozimas, las moléculas antisentido, el ADNc, los polinucleótidos recombinantes, los polinucleótidos ramificados, los aptámeros, los plásmidos, los vectores, el ADN aislado de cualquier secuencia, el ^aRⁿaislado de cualquier secuencia, las sondas de ácido nucleico y los partidores o cebadores. Una molécula de ácido nucleico también puede contener moléculas de ácido nucleico modificadas (por ejemplo, que contengan bases modificadas, azúcares y/o enlazadores o conectores internucleótidos).

[0028] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'péptido' hace referencia a un compuesto con dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos o peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar unidas mediante enlaces peptídicos o mediante cualquier otro tipo de enlace (por ejemplo, ésteres, éteres y similares). De manera genérica, el término 'péptido' se utiliza en el presente documento para referirse a los péptidos (esto es, poliaminoácidos de entre 2 y aproximadamente 20 residuos), polipéptidos (esto es, péptidos de entre aproximadamente 20 residuos y aproximadamente 100 residuos) y proteínas (esto es, péptidos que tienen aproximadamente 100 residuos o más).

[0029] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'aminoácido' hace referencia a los aminoácidos naturales y/o sintéticos o no naturales, incluyendo la glicina y los isómeros ópticos L o D, y los análogos de aminoácidos y los peptidomiméticos. Normalmente, un péptido de tres o más aminoácidos se denomina 'oligopéptido' si la cadena del péptido es corta. Aunque el término 'proteína' abarca el término 'polipéptido', un 'polipéptido' puede ser más pequeño que una proteína de longitud completa.

[0030] El término 'alérgeno' hace referencia a cualquier proteína natural o a cuaquier mezcla de proteínas que -según se ha documentado- provoca alergias, es decir, reacciones mediadas o reguladas por la IgE tras su exposición repetida a un individuo. Un alérgeno es cualquier compuesto, sustancia o material que sea capaz de provocar una reacción alérgica. Normalmente, los alérgenos se consideran una subcategoría de los antígenos, que son compuestos, sustancias o materiales capaces de provocar una respuesta inmunitaria. Para llevar a cabo la invención, el alérgeno puede seleccionarse -entre otros- de alérgenos nativos o naturales, alérgenos naturales modificados, alérgenos sintéticos, alérgenos recombinantes, alergoides y mezclas o combinaciones de estos. Son particularmente interesantes los alérgenos que son capaces de provocar una hipersensibilidad de tipo inmediato mediada por IgE.

[0031] Los alérgenos naturales incluyen los alérgenos del polen (por ejemplo, los alérgenos del polen de la hierba, la maleza, los árboles, etc.), los alérgenos de ácaros (por ejemplo, los ácaros del polvo de los hogares y los ácaros de los almacenes), los alérgenos de insectos (por ejemplo, los alérgenos que proceden del veneno, la saliva y los inhalantes), los alérgenos de animales, por ejemplo de la saliva, el pelo o las escamas -o la 'caspa'- de los animales (por ejemplo, perros, gatos, caballos, ratas, ratones, etc.), los alérgenos de hongos y los alérgenos de alimentos. El alérgeno puede ser un extracto de alérgeno, un alérgeno purificado, un alérgeno modificado, un alérgeno recombinante, un alérgeno mutante recombinante, un fragmento de alérgeno con más de 30 aminoácidos o cualquier combinación de estos.

[0032] En cuanto a su naturaleza química o bioquímica, los alérgenos pueden ser proteínas o péptidos nativos o recombinantes, fragmentos o versiones truncadas de proteínas o péptidos nativos o recombinantes, proteínas de fusión, compuestos sintéticos (alérgenos químicos), compuestos sintéticos que imitan a un alérgeno, o alérgenos modificados física o químicamente, como los alérgenos modificados por desnaturalización térmica.

[0033] Para clasificar un alérgeno como alérgeno importante o 'alérgeno mayor' puede someterse a diversas pruebas. Normalmente, un alérgeno se clasifica como 'alérgeno mayor' si al menos un 25% de los pacientes presentan una unión fuerte de IgE (puntuación 3) y al menos un 50% de los pacientes presentan una unión moderada (puntuación 2), de manera que la unión se determina mediante una electroforesis radioinmune cruzada (o CRIE, por sus siglas en inglés) (unión fuerte según CRIE: unión visible de IgE en una película de rayos X después de un día; unión moderada según CRIE: unión después de 3 días; unión débil según CRIE: unión después de 10 días). Una unión fuerte de IgE por parte de al menos un 10% de los pacientes clasifica al alérgeno como un alérgeno intermedio y una unión claramente específica por parte de menos de un 10% de los pacientes clasifica al alérgeno como un alérgeno menor. También pueden usarse otros métodos para determinar la unión a la IgE, por ejemplo los 'IgE-blots' o transferencias de IgE.

[0034] Un 'epítopo' es una estructura -que habitualmente está compuesta de una secuencia peptídica corta u oligosacárido- que un componente del sistema inmunitario reconoce específicamente -o a la que se une específicamente-. Se ha descubierto que, generalmente, los epítopos de células T son oligopéptidos lineales. Dos epítopos se corresponden entre sí si pueden unirse específicamente al mismo anticuerpo. Dos epítopos se corresponden entre sí si ambos son capaces de unirse al mismo receptor de células B o al mismo receptor de células T, de manera que la unión de un anticuerpo a su epítopo básicamente evita la unión al otro epítopo (por ejemplo, menos de aproximadamente un 30% y, preferiblemente, menos de aproximadamente un 20% y, más preferiblemente, menos de aproximadamente un 10%, un 5%, un 1% o aproximadamente un 0,1% de los otros epítopos se unen).

[0035] De acuerdo con el presente documento, dos secuencias de codificación de ácido nucleico 'se corresponden' entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos.

[0036] De acuerdo con el presente documento, cuando un polinucleótido o una región de polinucleótidos (o un polipéptido o una región de polipéptidos) tiene un porcentaje dado (por ejemplo, aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 60%, aproximadamente al menos un 70%, aproximadamente al menos un 80%, aproximadamente al menos un 85%, aproximadamente al menos un 90%, aproximadamente al menos un 95% o aproximadamente al menos un 99%) de 'identidad de secuencia' o 'igualdad de secuencia' con otra secuencia significa que, cuando se alinean al máximo, ya sea manualmente o utilizando programas de software que son comunes en este campo, el porcentaje de bases (o aminoácidos) es el mismo al comparar ambas secuencias.

[0037] Dos secuencias de nucleótidos son 'básicamente homólogas' o 'básicamente similares' cuando aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 60%, aproximadamente al menos un 70%, aproximadamente al menos un 75% y, preferiblemente, aproximadamente al menos un 80% y, más preferiblemente, aproximadamente al menos un 90% o un 95% de los nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud especificada de las secuencias de ADN. De manera similar, dos secuencias de polipéptidos son 'básicamente homólogas' o 'básicamente similares' cuando aproximadamente al menos un 40%, aproximadamente al menos un 50%, aproximadamente al menos un 60%, aproximadamente al menos un 66%, aproximadamente al menos un 70%, aproximadamente al menos un 75% y, preferiblemente, aproximadamente al menos un 80% y, más preferiblemente, aproximadamente al menos un 90% o un 95% o un 98% de los residuos de aminoácidos del polipéptido coinciden a lo largo de una longitud especificada de la secuencia de polipéptidos. Las secuencias que son básicamente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias y usando para ello un software estándar que está disponible en los bancos de datos de secuencias. Las secuencias de ácido nucleico básicamente homólogas también pueden identificarse en un experimento de 'Southern blot' o 'hibridación Southern', por ejemplo bajo condiciones estrictas definidas de acuerdo con este sistema particular. Definir o delimitar las condiciones de hibridación adecuadas entra dentro de los conocimientos y habilidades comunes en este campo. Por ejemplo, las condiciones estrictas pueden ser las siguientes: hibridación a 5xSSC y formamida al 50% a 42° C, y un lavado a 0,1xSSC y dodecilsulfato sódico al 0,1% a 60° C.

[0038] También pueden proporcionarse 'variantes modificadas de manera conservadora' de secuencias de dominio. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, el término 'variantes modificadas de manera conservadora' hace referencia a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o prácticamente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hace referencia a secuencias prácticamente idénticas. Más específicamente, pueden obtenerse sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o de todos) se sustituye con una base mixta y/o residuos de desoxiinosina (Batzer, et al., 1991, 'Nucleic Acid Res', 19: 5081; Ohtsuka, et al., 1985, 'J. Biol. Chem', 260: 2605-2608; Rossolini et al., 1994, 'Mol. Cell. Probes', 8: 91-98).

[0039] Los términos 'fragmento biológicamente activo', 'forma biológicamente activa', 'equivalente biológicamente activo' y 'derivado funcional' de una proteína natural o de tipo silvestre hacen referencia a una sustancia que posee una actividad biológica que es al menos básicamente igual a -es decir, que no difiere significativamente de- la actividad biológica de la proteína de tipo silvestre, de manera que para medirla se usa un ensayo que es adecuado para detectar la actividad. Por ejemplo, un fragmento biológicamente activo que contiene un dominio de tráfico puede 'colocalizarse' en el mismo compartimento que un polipéptido de longitud completa que contiene el dominio de tráfico.

[0040] Una célula ha sido 'transformada', 'transducida' o 'transfectada' por ácidos nucleicos exógenos o heterólogos cuando dichos ácidos nucleicos han sido introducidos en el interior de la célula. Puede o no integrarse (unirse covalentemente) ADN transformador con el ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula. En las células de mamíferos, levaduras y procariotas, por ejemplo, el ADN transformador puede mantenerse en un elemento o componente episomal, como un plásmido. En una célula eucariota, una célula transformada establemente es aquella en la que el ADN transformador se ha integrado en un cromosoma de tal manera que es heredado por las células hijas mediante la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad que tienen las células eucariotas para establecer clones o líneas celulares que están compuestos de una población de células hijas que contienen el ADN transformador. Un 'clon' es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común mediante mitosis. Una 'línea celular' es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer establemente 'in vitro' durante muchas generaciones (por ejemplo, aproximadamente al menos 10).

[0041] Un 'replicón' es cualquier elemento genético (por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN 'in vivo'.

[0042] Tal y como se utiliza en el presente documento, un 'vector viral' es un virus o una partícula viral que contiene un polinucleótido que se ha de liberar en una célula huésped, ya sea 'in vivo', 'ex vivo' o 'in vitro'. Los ejemplos de vectores virales incluyen -pero no se limitan a- vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales y similares. En los aspectos en los que la transferencia genética está mediada o regulada por un vector adenoviral, un 'constructo vectorial' es el polinucleótido que contiene el genoma del adenovirus o una parte de este, y un gen seleccionado y no adenoviral que está asociado con las proteínas de la cápside adenoviral.

[0043] Tal y como se utiliza en el presente documento, un 'vector de entrega o administración de ácido nucleico' es una molécula de ácido nucleico que puede transportar un polinucleótido de interés hasta una célula. Preferiblemente, este vector contiene una secuencia de codificación que está unida funcionalmente a una secuencia de control de expresión. Sin embargo, una secuencia de polinucleótidos de interés no tiene por qué contener necesariamente una secuencia de codificación. Por ejemplo, en un aspecto, una secuencia de polinucleótidos de interés es un aptámero que se une a una molécula diana. En otro aspecto, la secuencia de interés es una secuencia complementaria de una secuencia reguladora que se une a una secuencia reguladora para inhibir la regulación de la secuencia reguladora. En otro aspecto, la secuencia de interés es una secuencia reguladora (por ejemplo, para titular o valorar los factores reguladores en una célula).

[0044] Tal y como se utiliza en el presente documento, un 'medio o vehículo de entrega o administración de ácido nucleico' es cualquier molécula -o grupo de moléculas o macromoléculas- que puede portar o transportar polinucleótidos insertados hasta una célula huésped (por ejemplo, genes o fragmentos de genes, moléculas antisentido, ribozimas, aptámeros y similares) y que está asociada a un vector de entrega de ácido nucleico, tal y como se ha explicado anteriormente.

[0045] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'entrega -o administración- de ácido nucleico' o 'transferencia de ácido nucleico' hacen referencia a la introducción de un polinucleótido exógeno (por ejemplo, un transgén) en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la introducción. El polinucleótido introducido puede mantenerse en la célula huésped de manera estable o transitoria. Normalmente, para que se mantenga establemente es necesario que el polinucleótido introducido tenga un origen de replicación compatible con la célula huésped o se integre en un replicón de la célula huésped, como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial.

[0046] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'expresión' hace referencia al proceso mediante el cual los polinucleótidos se transcriben en ARNm y/o se traducen en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir el 'splicing' o 'corte y empalme' del ARNm transcrito a partir del ADN genómico.

[0047] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'bajo control transcripcional' o 'unido operativamente o funcionalmente' hacen referencia a la expresión (esto es, la transcripción o la traducción) de una secuencia de polinucleótidos que se controla mediante la yuxtaposición adecuada de un elemento de control de expresión y una secuencia de codificación. En un aspecto, una secuencia de ADN está 'unida funcionalmente' a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción de esa secuencia de ADN.

[0048] Tal y como se utiliza en el presente documento, una 'secuencia de codificación' es una secuencia que se transcribe y se traduce en un polipéptido cuando está bajo el control de secuencias de control de expresión adecuadas. Los límites de una secuencia de codificación se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada o codón de terminación de traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir -pero no se limita a- una secuencia procariota, ADNc de ARMn eucariótico, una secuencia de ADN genómico procedente de ADN eucariótico (por ejemplo, un mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Normalmente, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción estarán situadas en 3' respecto a la secuencia de codificación.

[0049] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'modificación genética' hace referencia a cualquier adición o deleción o disrupción de una secuencia de nucleótidos normal de una célula. Pueden usarse diversos métodos para obtener la modificación genética de APCs. Los métodos reconocidos en este campo incluyen la transferencia genética mediada o regulada por virus, la transferencia mediada por liposomas, la transformación, la transfección y la transducción, por ejemplo la transferencia genética mediada por virus, como el uso de vectores basados en virus de ADN como adenovirus, virus adenoasociados y virus del herpes, así como vectores basados en retrovirus.

[0050] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'compartimento lisosómico/endosómico' hace referencia a las vacuolas ácidas unidas a la membrana que contienen moléculas LAMP en la membrana, las enzimas hidrolíticas que están relacionadas con el procesamiento de antígenos y las moléculas CMH de clase II para la presentación y el reconocimiento de antígenos. Este compartimento funciona como un sitio o lugar de degradación para las materias o materiales extraños asimilados o interiorizados desde la superficie celular mediante diversos mecanismos, incluyendo la endocitosis, la fagocitosis y la pinocitosis, y para el material intracelular que llega hasta este compartimento debido a fenómenos autolíticos especializados (ver, por ejemplo, De Duve, Eur. J. Biochem., 137: 391, 1983). Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'endosoma' abarca los lisosomas.

[0051] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'orgánulo relacionado con lisosomas' hace referencia a cualquier orgánulo que contiene lisozimas e incluye -pero no se limita a- MIIC, CIIV, melanosomas, gránulos secretores, gránulos líticos, gránulos densos en plaquetas, gránulos de basófilos, gránulos de Birbeck, fagolisosomas, lisosomas secretores y similares. Preferiblemente, estos orgánulos carecen de receptores de manosa 6-fosfato y contienen LAMPs, pero pueden contener -o no- una molécula CMH de clase II. Ver, por ejemplo, Blott y Griffiths, Nature Reviews, 'Molecular Cell Biology', 2002; Dell'Angelica, et al., The FASEB Journal 14: 1265 1278, 2000.

[0052] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'polipéptido LAMP' hace referencia a LAMP-1, LAMP-2, CD63/LAMP-3, DC-LAMP o cualquier 'proteína de membrana asociada a lisosomas' (o 'LAMP'), o sus homólogos, ortólogos, variantes (por ejemplo, variantes alélicas) y formas modificadas (por ejemplo, que contengan una o más mutaciones, tanto naturales como sintéticas). En un aspecto, un polipéptido LAMp es una proteína de membrana asociada a lisosomas de mamífero, por ejemplo una proteína de membrana asociada a lisosomas de humanos o ratones. De manera más general, una 'proteína de membrana lisosomal o lisosómica' es cualquier proteína que contiene un dominio que se encuentra en la membrana de un compartimento endosómico/lisosómico o un orgánulo relacionado con lisosomas y que también contiene un dominio luminal.

[0053] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'señalización' o 'direccionamiento' ('targeting', en inglés) hacen referencia a una secuencia de polipéptidos que dirige una proteína quimérica de la invención a un sitio preferido, como un compartimento u orgánulo celular en el que tienen lugar el procesamiento de antígenos y la unión a CMH II. Así, los términos 'dominio de señalización' o 'dominio de direccionamiento' hacen referencia a una serie de aminoácidos que son necesarios para la administración o entrega a un compartimento/orgánulo celular. Preferiblemente, un dominio de señalización es una secuencia que se une a un adaptador o una proteína AP (por ejemplo, una proteína AP1, AP2 o AP3). En Dell'Angelica, 2000, por ejemplo, se describen secuencias de dominios de señalización ejemplares.

[0054] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'entrega de ácido nucleico in vivo', 'transferencia de ácido nucleico', 'terapia de ácido nucleico' y similares hacen referencia a la introducción de un vector que contiene un polinucleótido exógeno directamente en el cuerpo de un organismo, como un humano o un mamífero no humano, de manera que el polinucleótido exógeno se introduce 'in vivo' en una célula de uno de estos organismos.

[0055] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'in situ' hace referencia a un tipo de entrega o administración de ácido nucleico 'in vivo' en la que el ácido nucleico se acerca a una célula diana (es decir, el ácido nucleico no se administra sistemáticamente). Por ejemplo, los métodos de administración 'in situ' incluyen -pero no se limitan a- inyectar un ácido nucleico directamente en en un sitio o lugar (por ejemplo, un tejido, como un tumor o un músculo cardíaco), poner en contacto el ácido nucleico con células o tejidos a través de una abertura quirúrgica o entregar o liberar el ácido nucleico en un sitio o lugar usando un dispositivo de acceso médico como un catéter.

[0056] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'aislado' y 'purificado' a veces se usan indistintamente y significan 'separado de los elementos o componentes, celulares o de otro tipo, a los que los polinucleótidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos o fragmentos de estos están asociados normalmente en la naturaleza'. Por ejemplo, refiriéndonos a un polinucleótido, un polinucleótido aislado es aquel que está separado de las secuencias 5' y 3' a las que está asociado normalmente en el cromosoma. Como es evidente para las personas versadas en este campo, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína o anticuerpo no natural -o un fragmento de estos- no requiere un 'aislamiento' para distinguirlo de su homólogo o equivalente natural. Asimismo, los términos 'aislado' y 'purificado' no implican un aislamiento total o una pureza o purificación total. Estos términos se usan para denotar una pureza total o parcial respecto a algunas o todas las demás sustancias que -de manera natural- se encuentran asociadas al polinucleótido, etc. Por lo tanto, estos términos pueden referirse al aislamiento o la purificación respecto a una sustancia asociada naturalmente (por ejemplo, el aislamiento o la purificación del ADN respecto al ARN), al aislamiento o la purificación respecto a otras sustancias del mismo tipo general de molécula (por ejemplo, una proteína particular que presenta un 20% de pureza en comparación con todas las proteínas de la muestra), o a cualquier combinación de estos supuestos. El aislamiento y la purificación pueden hacer referencia a cualquier nivel de entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 100%, incluyendo un 100%. Así, una población de células 'aislada' o 'purificada' carece básicamente de las células y los materiales a los que está asociada en la naturaleza. Los términos 'APCs básicamente libres de -o carentes de-' o 'APCs básicamente purificadas' significan que al menos un 50% de la población de células son APCs, preferiblemente al menos un 70% y más preferiblemente al menos un 80%; más preferiblemente, significa que carecen al menos en un 90% de las células no-APCs a las que están asociadas en la naturaleza. Obviamente, las personas versadas en este campo sabrán que todos los valores específicos, incluyendo las fracciones de estos valores, están incluidos en estos rangos o intervalos, de manera que no es necesario que en el presente documento se mencione o enumere cada valor particular. En aras de la brevedad, no se desvela específicamente cada valor particular; sin embargo, el lector debe entender que la invención abarca y desvela de manera inherente todos y cada uno de los valores específicos.

[0057] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'célula diana' (o 'célula blanco') o 'célula receptora' hacen referencia a una célula o a una célula individual que se pretende que sea -o haya sido- la destinataria o receptora de proteínas y/o polinucleótidos y/o moléculas de ácido nucleico exógeno. El término también pretende incluir la progenie o descendencia de una sola célula, de manera que la progenie no tiene por qué ser completamente idéntica (en cuanto a su morfología o sus complementos de ADN genómico o total) a la célula parental original debido a mutaciones deliberadas, accidentales o naturales. Una célula diana puede estar en contacto con otras células (por ejemplo, en un tejido) o puede encontrarse circulando por el cuerpo de un organismo.

[0058] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'células presentadoras de antígenos' o 'APCs' (por sus siglas en inglés) hacen referencia a cualquier célula que presenta en su superficie un antígeno asociado a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad, o una porción de esta, o, de manera alternativa, a una o más moléculas CMH no clásicas, o a una porción de estas. Los ejemplos de APCs adecuadas se analizan detalladamente más adelante e incluyen -pero no se limitan a- células completas como macrófagos, células dendríticas, células B, APCs híbridas y células presentadoras de antígenos adoptivas.

[0059] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'célula presentadora de antígenos sintética' hace referencia a una célula presentadora de antígenos que tiene una fracción o porción molecular no natural en su superficie. Por ejemplo, puede que una célula de este tipo no tenga de manera natural un coestimulador en su superficie o puede que tenga en su superficie un coestimulador artificial adicional además de un coestimulador natural, o puede expresar en su superficie una molécula de clase II no natural.

[0060] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'células efectoras inmunitarias' hace referencia a las células que son capaces de unirse a un antígeno y que median o regulan una respuesta inmunitaria. Estas células incluyen -pero no se limitan a- las células T, las células B, los monocitos, los macrófagos, las células asesinas (o NKs) y los linfocitos T citotóxicos (o CTLs, por sus siglas en inglés), por ejemplo las líneas CTL, los clones CTL y los CTLs tumorales, inflamatorios o de otros infiltrados.

[0061] Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos 'sujeto' y 'paciente' se usan indistintamente para designar un animal al que está orientada la presente invención. Debe entenderse que el término 'animal' incluye animales 'humanos' y 'no humanos'; cuando es necesario diferenciar entre ambos, se usan los términos animal 'humano' y/o 'no humano'. En las realizaciones, el sujeto o paciente es un vertebrado, preferiblemente un mamífero y, más preferiblemente, un humano. Los mamíferos incluyen -pero no se limitan a- murinos, simios, humanos, animales de granja (por ejemplo, bovinos, ovinos, porcinos), animales deportivos (por ejemplo, equinos) y mascotas (por ejemplo, perros y gatos).

[0062] Los síntomas clínicos de la alergia resultan muy conocidos para las personas versadas en este campo, por lo que no resulta necesario incluir una lista exhaustiva en el presente documento. Los ejemplos no limitativos incluyen los siguientes: rinitis, conjuntivitis, asma, urticaria y eccema, los cuales incluyen reacciones en la piel, los ojos y las vías aéreas superiores e inferiores, con síntomas comunes como rojez y picor en ojos y nariz, picores, moqueo, respiración sibilante, falta de aliento e inflamación tisular.

[0063] Los ejemplos de 'pruebas inmunológicas in vivo' incluyen las pruebas de alergia cutánea (o SPT, por sus siglas en inglés), las pruebas de provocación o exposición conjuntival (CPT), las pruebas de exposición bronquial a alérgenos (BCA) y diversas pruebas clínicas en las que se monitorizan uno o más síntomas alérgicos. Ver, por ejemplo, Haugaard et al., 'J Allergy Clin Immunol', Vol. 9 l, n° 3, pp 709-722, marzo de 1993.

[0064] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'portador farmacéuticamente aceptable' abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar que son muy conocidos en este campo, como las soluciones salinas amortiguadas con fosfatos, el agua, las emulsiones, como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservantes. Para consultar ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes, ver 'Martin Remington's Pharm. Sci.', 15a Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975)).

[0065] Tal y como se utiliza en el presente documento, una 'cantidad terapéuticamente eficaz' es una cantidad que es suficiente para prevenir, corregir y/o normalizar una respuesta fisiológica anormal. En un aspecto, una 'cantidad terapéuticamente eficaz' es una cantidad que es suficiente para reducir al menos un 30%, más preferiblemente al menos un 50% y, más preferiblemente, al menos un 90% una propiedad clínicamente significativa de una patología, como, por ejemplo, el tamaño de una masa tumoral, la producción de anticuerpos, la producción de citoquinas, el nivel de fiebre o de glóbulos blancos o el nivel de histamina.

[0066] Un 'anticuerpo' es cualquier inmunoglobulina -incluyendo los anticuerpos o fragmentos de estos- que se une a un epítopo específico. El término abarca los anticuerpos monoclonales, policlonales y quiméricos (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos). Un 'sitio de combinación de anticuerpos' es una porción estructural de una molécula de un anticuerpo que contiene regiones variables e hipervariables de cadenas pesadas y ligeras que se une específicamente a los antígenos. Las moléculas de anticuerpos ejemplares son las moléculas de inmunoglobulina intacta, las moléculas de inmunoglobulina prácticamente intacta y las porciones de la molécula de inmunoglobulina que contiene el parátopo, incluyendo las porciones Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), de manera que estas porciones son las preferidas para usarse en los métodos terapéuticos que se describen en el presente documento.

[0067] El término 'administración oromucosa' hace referencia a una vía de administración en la que la forma de dosificación o forma farmacéutica se coloca bajo la lengua o en cualquier otro lugar de la cavidad oral para permitir que el ingrediente activo entre en contacto con la mucosa de la cavidad oral o la faringe del paciente a fin de obtener un efecto local o sistémico del ingrediente activo. Un ejemplo de una vía de administración oromucosa es la administración sublingual. El término 'administración sublingual' hace referencia a una vía de administración en la que una forma farmacéutica se coloca debajo de la lengua para obtener un efecto local o sistémico del ingrediente activo. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'liberación o administración intradérmica' hace referencia a la administración de una vacuna en la dermis de la piel. Sin embargo, la vacuna no tiene por qué colocarse exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa de la piel situada entre aproximadamente 1,0 mm y aproximadamente 2,0 mm bajo la superficie de la piel humana, pero existe cierta variación entre individuos y también entre las diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar llegar a la dermis a una profundidad de 1,5 mm bajo la superficie de la piel. La dermis está situada entre la capa córnea y la epidermis de la superficie y la capa subcutánea de debajo. Dependiendo del modo de administración, en última instancia la vacuna puede colocarse únicamente o principalmente en la dermis o puede distribuirse entre la epidermis y la dermis.

[0068] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término 'prevenir' -en el contexto de una inmunoterapia para alergias, un tratamiento antialérgico u otros términos que describen una intervención diseñada para un paciente alérgico- hace referencia a la prevención de una respuesta a la IgE en al menos un 20% de todos los pacientes. El término 'prevenir' no implica que se prevenga o evite completamente que todos los pacientes desarrollen una enfermedad mediada por la IgE, de manera que dicha definición queda fuera del alcance de la presente invención en lo referente a tratar alergias mediante un mecanismo que reduce los síntomas alérgicos, y no concuerda con el uso del término en este campo. Es bien sabido por las personas versadas en el campo de las inmunoterapias para alergias que los tratamientos antialérgicos no son un 100% eficaces en el 100% de los pacientes y, por consiguiente, en el contexto de la presente invención no se aplica una definición absoluta de 'prevenir'. El concepto de 'prevención' reconocido en este campo también está contemplado en la presente invención.

[0069] La presente invención proporciona ácidos polinucleicos, poliaminoácidos y composiciones para usarse en métodos para tratar a sujetos que necesitan dichos poliaminoácidos y ácidos polinucleicos. En términos generales, los ácidos polinucleicos pueden considerarse vacunas de ácido nucleico (es decir, ADN, ARN) para la producción intracelular de secuencias alergénicas (poliaminoácidos) que provocan una respuesta inmunitaria protectora en el cuerpo del sujeto al que se ha administrado el ácido polinucleico. Cuando se administran, los ácidos polinucleicos provocan preferentemente una respuesta inmunitaria mediada por células a través de la vía CMH-II (o MHC-II) y la producción de anticuerpos IgG al activar una respuesta celular de Th1 (linfocitos T colaboradores de tipo 1) alérgeno-específica con una producción de interferones por parte de las células T, las células NK y las APCs, en lugar de una respuesta de tipo Th2, que incluye la producción de anticuerpos IgE, granulocitos (por ejemplo, eosinófilos) y otras sustancias. Hasta cierto punto, puede producirse tanto una respuesta de CMH-I (o MHC-I) como una respuesta de CMH-II (o MHC-II); sin embargo, la invención proporciona una respuesta que básicamente o principalmente es una respuesta de CMH-II. Preferiblemente, los ácidos nucleicos no codifican un gen resistente a los antibióticos.

[0070] La invención se basa -al menos parcialmente- en la idea de que una combinación de ciertos elementos estructurales -y, por lo tanto, funcionales- proporciona propiedades beneficiosas a las vacunas de ácido nucleico y los alérgenos codificados y permite contar con métodos para tratar alergias que satisfacen necesidades hasta ahora no satisfechas en este campo. En las diversas realizaciones de la invención, que deben entenderse por sí solas como realizaciones independientes y como realizaciones que combinan dos o más características de las realizaciones independientes, las combinaciones incluyen el uso de un dominio de tráfico lisosómico que dirige las secuencias de aminoácidos alergénicos hacia los lisosomas con proteínas CMH II. Esto permite que se produzca predominantemente una respuesta de IgG -en lugar de una respuesta de IgE- frente a las secuencias de alérgenos. Asimismo, otras realizaciones independientes o combinaciones de realizaciones proporcionan constructos que contienen una secuencia de ácido nucleico con una longitud suficiente como para codificar una secuencia de aminoácidos que proporciona un epítopo con una estructura tridimensional natural. En las realizaciones preferidas, la secuencia de ácido nucleico proporciona/codifica la secuencia de codificación de alérgenos de longitud completa, de manera que carece de cualquier secuencia de péptidos señal naturales asociada con la secuencia de alérgenos. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico codifica al menos una región alergénica de un alérgeno, pero no la proteína alergénica de longitud completa (y también carece de una secuencia de señal, en el caso de que estuviera presente de manera natural). Aunque en este campo se considera que es posible generar una respuesta inmunitaria frente a la secuencia primaria de un epítopo, la presente invención considera que las vacunas de ácido nucleico para producir una respuesta inmunitaria de CMH-II a los epítopos codificados deben utilizar preferiblemente constructos de ácido nucleico que codifican los suficientes datos de secuencia para producir una estructura peptídica tridimensional correcta en la región que contiene un epítopo alergénico, al menos cuando la secuencia alergénica se envía o entrega a un lisosoma para su procesamiento. Sin ceñirnos a ninguna teoría molecular particular, se cree que la entrega de una proteína, péptido o polipéptido -plegados tridimensionalmente de forma correcta- a un endosoma mejora el procesamiento y la presentación de epítopos alergénicos para obtener una respuesta inmunitaria.

[0071] En otro ejemplo de una realización que puede implementarse, por sí sola o como parte de una combinación de realizaciones, se proporciona la expresión de múltiples alérgenos a partir de un único constructo. Hasta la fecha, no se ha demostrado que pueda producirse y usarse eficazmente una vacuna de ácido nucleico que procure protección contra un alérgeno. La presente invención no solo proporciona una vacuna de ácido nucleico que es eficaz contra un alérgeno; también proporciona una vacuna de ácido nucleico que es eficaz contra múltiples alérgenos al mismo tiempo. Estos alérgenos pueden provenir de la misma fuente (por ejemplo, una sola planta) o pueden provenir de dos o más fuentes (por ejemplo, un árbol, una flor, un alimento, etc.). Como se ha explicado previamente, pueden usarse secuencias de alérgenos de longitud completa (que carezcan de cualquier secuencia de señal para el alérgeno naturalmente asociada) o también pueden usarse porciones alergénicas. En los constructos que contienen múltiples secuencias de alérgenos puede usarse cualquier mezcla de secuencias de alérgenos truncadas o de longitud completa. Además, como en otras realizaciones, es preferible que se elimine la secuencia de señal natural para cada secuencia alergénica (es decir, las secuencias de señal naturales para cada secuencia alergénica no están presentes en los constructos).

[0072] Si bien se ha descubierto que utilizar secuencias de señal para secuencias alergénicas independientes dentro del dominio alergénico es perjudicial para la función del constructo de ácido nucleico, también se ha descubierto que es importante utilizar dominios o regiones de secuencias de señal en los constructos de las vacunas de ácido nucleico. Así, en las realizaciones, la vacuna de ácido nucleico incluye al menos una secuencia de señal en el dominio de secuencia de señal para dirigir el péptido codificado hasta una membrana y a través de esta. Aunque la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señal puede variar de un constructo a otro, y se puede seleccionar cualquier secuencia de señal conocida, se ha descubierto que, en las realizaciones preferidas, la secuencia de señal está presente y se proporciona 'in-frame' (o en el marco) junto con la secuencia de codificación de las secuencias alergénicas. El uso de una sola secuencia de señal es adecuado para dirigir la proteína quimérica codificada completa hasta una membrana y a través de esta. De este modo, no son necesarias las secuencias de señal para cada secuencia alergénica y, de hecho, se ha descubierto que son perjudiciales para la correcta localización, procesamiento y expresión de los epítopos alergénicos -o epítopos de alérgenos- situados en la superficie de las células inmunitarias.

[0073] Asimismo, en algunas realizaciones especificas y en combinaciones de las realizaciones, se ha descubierto que la 'reclusión' -o protección física- de las secuencias alergénicas durante la transferencia del polipéptido desde el citoplasma hasta el endosoma -lo cual incluye el tiempo pasado en el endosoma antes de la escisión o descomposición del polipéptido en unidades para la presentación en la superficie celular- puede ser un factor importante para proporcionar vacunas útiles de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Así, en general, la presente invención incluye un constructo que contiene un dominio de estabilización intraorgánulos (o IOSD, por sus siglas en inglés) para proteger las secuencias alergénicas. El IOSD de la invención es un dominio luminal de una LAMP humana.

[0074] El ácido nucleico de la invención contiene al menos los siguientes dominios: un dominio de secuencia de señal; un dominio de estabilización intraorgánulos; un dominio alergénico (que puede contener un solo alérgeno o dos o más alérgenos, de manera que cada uno de ellos contiene uno o más epítopos alergénicos); un dominio transmembrana; y un dominio citoplasmático de señalización lisosómica/endosómica. Los diversos dominios están presentes en un solo ácido nucleico quimérico o sintético. Los diversos dominios pueden combinarse en cualquier orden lineal usando técnicas que son muy conocidas y se practican ampliamente en este campo. En las realizaciones preferidas, los dominios se combinan y se organizan de tal manera que contienen un solo marco de lectura abierto que codifica una proteína quimérica, de manera que el marco de lectura abierto está conectado funcionalmente a los elementos transcripcionales que son suficientes para la expresión de la proteína quimérica. Por lo tanto, el ácido nucleico puede ser un vector de expresión, como un plásmido, un fagémido, un vector viral o similares. Preferiblemente, el ácido nucleico contiene elementos de transcripción que son adecuados para la expresión en células de mamíferos, como células humanas. Estos vectores de expresión y elementos de vectores de expresión son muy conocidos y se utilizan ampliamente en este campo, por ejemplo en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. n° 2004/0157307. Ocasionalmente, en el presente documento, un ejemplo no limitativo de un esqueleto de plásmido que se usa para crear constructos de ácido nucleico de acuerdo con la invención se denomina 'plásmido 'pITI'' y su secuencia se proporciona como la SEQ ID NO:1.

[0075] En las Figuras 1, 3 y 4, respectivamente, se muestran esquemáticamente tres configuraciones ejemplares del ácido nucleico de la presente invencion. La Figura 1 muestra una disposición o distribución secuencial de diversos dominios, de manera que un único alérgeno que contiene un único epítopo se incluye en la proteína quimérica codificada. La Figura 3 muestra una disposición secuencial de los dominios en la que múltiples epítopos diferentes de un único alérgeno se incluyen en la proteína quimérica codificada dentro del dominio alergénico. Los dos epítopos están dispuestos o distribuidos de tal manera que están en el mismo marco de lectura y, por lo tanto, ambos se producen como parte de la proteína quimérica. Las personas versadas en este campo se percatarán inmediatamente de que pueden proporcionarse tres o más epítopos en el mismo marco de lectura dentro del dominio de epítopo utilizando técnicas de biología molecular estándares. La Figura 4 muestra una disposición secuencial de los dominios en la que dos alérgenos diferentes están presentes en el dominio alergénico. Evidentemente, un profesional cualificado sabrá que cada secuencia alergénica puede contener uno o múltiples epítopos alergénicos. Basándose en estas tres representaciones esquemáticas de las realizaciones de los ácidos nucleicos de la invención, el lector comprenderá inmediatamente que puede incluirse cualquier número de alérgenos -de cualquier número de fuentes y que contengan cualquier número de epítopos- en el dominio alergénico y que pueden conectarse 'in-frame' (en la propia estructura o marco) utilizando técnicas de biología molecular estándares.

[0076] La Figura 2 muestra un mapa vectorial -o mapa de vectores- de un ácido nucleico de acuerdo con una realización de la presente invención ('pITI-CRY J2-LAMP'; en el presente documento también se denomina 'CRYJ2-LAMP'), que de manera general está relacionado con la realización de la invención que se representa esquemáticamente en la Figura 1. El vector o vehículo de entrega incluye un esqueleto de plásmido con un origen de replicación pUC y diversos elementos de expresión y transcripción para la producción de la proteína codificada. Más específicamente, incluye la secuencia del esqueleto de pITI (SEQ ID NO:1). Cabe señalar que el constructo de ácido nucleico no incluye un gen de resistencia a los antibióticos, de acuerdo con las realizaciones preferidas de la presente invención. Asimismo, el ácido nucleico contiene secuencias para la proteína codificada, que contiene una región N-terminal de la proteína LAMP humana, que incluye una secuencia de señal y un dominio de estabilización intraorgánulos. Asimismo, el ácido nucleico proporciona secuencias para la proteína codificada que contiene la secuencia del alérgeno CryJ2 (que carece de su secuencia de señal) fusionada 'in-frame' con la región N-terminal de la proteína LAMP. Asimismo, el ácido nucleico incluye secuencias que codifican una porción de la región C-terminal de la proteína LAMP humana, que incluye una región transmembrana y una región de señalización -o región de direccionamiento-. La región de codificación para la secuencia de la proteína quimérica CRY J2-LAMP se proporciona como SEQ ID NO:2. La secuencia de aminoácidos para la proteína quimérica CRY J2-LAMP se proporciona como SEQ ID NO:3.

[0077] En las realizaciones ejemplares, la invención también está relacionada con los constructos de ácido nucleico para la entrega y expresión de otros alérgenos de C. japónica, incluido el alérgeno CryJ1. Utilizando el mismo esqueleto de plásmido se ha creado un constructo de pITI-CRYJ1-LAMP. La proteína quimérica puede desencadenar una respuesta inmunitaria de tipo CMH-II. La región de codificación para el constructo de pITI-CRYJ1-LAMP se presenta como SEQ ID NO:4. La secuencia de aminoácidos para la proteína quimérica CRY J1-LAMP se proporciona como SEQ ID NO:5.

[0078] Tal y como se muestra en las Figuras 3 y 4, el dominio alergénico puede incluir un alérgeno que tiene múltiples epítopos alergénicos, o puede incluir múltiples alérgenos (de manera que cada uno de ellos tiene uno o más epítopos alergénicos). La Figura 5 muestra un mapa vectorial de una realización ejemplar particular de un constructo de ácido nucleico, de manera que el dominio alergénico incluye dos secuencias alergénicas. En esta realización ejemplar, el dominio alergénico contiene los alérgenos CryJ1 y CryJ2 (de manera que ambos carecen de su secuencia de señal natural) de C. japónica fusionados 'in-frame' y fusionados en el extremo N-terminal con un dominio de secuencia de señal LAMP y un dominio de estabilización intraorgánulos. Las secuencias de CryJ1-CryJ2 también están fusionadas en el extremo C-terminal con un dominio transmembrana LAMP y un dominio de señalización. La secuencia de nucleótidos completa de la región de codificación para la proteína quimérica se presenta como SEQ ID NO:6. La secuencia de aminoácidos completa de la proteína quimérica codificada se presenta como SEQ ID NO:7, en la que: los residuos 1-27 corresponden a la secuencia de señal para la protéina quimérica; los residuos 28-380 corresponden al dominio de estabilización intraorgánulos (la secuencia tomada de LAMP humana); los residuos 381 y 382 corresponden a un enlazador o conector; los residuos 383-735 corresponden a la región de codificación de CryJ1 (sin su secuencia de señal); los residuos 736-741 corresponden a una región enlazadora; los residuos 742-1232 corresponden a la región de codificación para el alérgeno CryJ2; los residuos 1233-1234 corresponden a una región enlazadora; los residuos 1235-1258 corresponden al dominio de señalización y al dominio transmembrana; y los residuos 1259-1270 corresponden a los residuos C-terminales adicionales.

[0079] Los constructos de ácido nucleico de la presente invención son básicamente ilimitados en cuanto al número de alérgenos que pueden producirse de manera coordinada. Por lo tanto, en los constructos de ácido nucleico de la presente invención pueden incluirse dos, tres, cuatro, cinco, seis, diez, veinte o más alérgenos diferentes (de la misma fuente o de una mezcla de fuentes diferentes). La Figura 6A muestra un mapa vectorial de otro ácido nucleico ejemplar de acuerdo con una realización de la invención. El vector o vehículo de entrega incluye un esqueleto de plásmido con un origen de replicación pUC y diversos elementos de expresión y transcripción para la producción de la proteína codificada. El esqueleto o estructura principal puede ser -aunque no necesariamente- el esqueleto pITI de la SEQ ID NO:1. Asimismo, el ácido nucleico contiene secuencias para la proteína codificada, que contiene una región N-terminal de la proteína LAMP humana, que incluye un dominio de secuencia de señal y un dominio de estabilización intraorgánulos. Asimismo, el ácido nucleico proporciona secuencias para una proteína quimérica codificada que contiene la poliproteína alergénica del cacahuete AraH1/AraH2/AraH3. Asimismo, el ácido nucleico incluye secuencias que codifican una porción de la región C-terminal de la proteína LAMP humana, que incluye una región transmembrana y una región de señalización. La secuencia de nucleótidos para la región de codificación de la proteína quimérica se proporciona como SEQ ID NO:8. La proteína quimérica codificada por el vector de la Figura 6A se muestra esquemáticamente en la Figura 6B (como SEQ ID NO:9).

[0080] Los dominios que están presentes en los ácidos nucleicos de la invención se describen con más detalle más adelante en lo referente a las funciones que desempeñan las proteínas quiméricas codificadas. Debe entenderse que la puesta en práctica de la presente invención no depende de o está limitada por ninguna secuencia de proteínas o ácido nucleico particular; así, es la combinación de los elementos y los dominios la que proporciona a los constructos sus ventajas y propiedades. También debe entenderse que la descripción de los diversos dominios del constructo de ácido nucleico, en el contexto de las características físicas y funcionales de la proteína codificada, y viceversa, es suficiente para informar a una persona versada en este campo sobre las características físicas y funcionales de los ácidos nucleicos o de las proteínas. Valiéndose de un ordenador y de la degeneración del código genético, resulta sencillo conocer todas las posibles moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de proteínas conocidas y conocer la proteínas codificadas por los ácidos nucleicos. Por consiguiente, las referencias a una característica física o funcional de una secuencia de proteínas particular desvela de inmediato a un profesional cualificado todas las posibles secuencias de ácido nucleico asociadas con dicha característica física o funcional, y viceversa.

[0081] También entra dentro de las competencias de las personas versadas en este campo diseñar y combinar dos o más secuencias o moléculas de ácido nucleico a fin de conocer u obtener una secuencia que codifica una proteína quimérica de acuerdo con la invención. De manera similar, también entra dentro de las capacidades de un profesional cualificado seleccionar y combinar los elementos de control de traducción y transcripción para expresar las secuencias de codificación y las proteínas quiméricas 'in vivo' o 'in vitro' según se desee. Por consiguiente, no es necesario explicar con detalle en el presente documento dichas técnicas de uso habitual para poder poner en práctica la presente invención.

[0082] El ácido nucleico de la presente invención contiene un dominio de secuencia de señal. El dominio de secuencia de señal contiene una secuencia de señal que se proporciona para introducir o insertar la proteína quimérica codificada en una membrana biológica que delimita el límite o la frontera entre el medio o entorno externo y el medio o entorno interno. La secuencia de señal también dirige la transferencia de la proteína desde el medio externo hasta el medio interno. La estructura general de una secuencia de señal es muy conocida en este campo, y también son muy conocidos los numerosos ejemplos de las secuencias de señal particulares. El profesional -o quien ponga en práctica la invención- puede elegir cualquier secuencia de señal adecuada de acuerdo con los diversos parámetros de selección para cada realización que entre dentro del alcance de la presente invención. En las realizaciones ejemplares, la secuencia de señal dirige la proteína quimérica hacia el retículo endoplasmático. En este punto, es importante señalar que el dominio de secuencia de señal es la única porción de la proteína quimérica que contiene una secuencia de señal. Así, las secuencias de señal naturales de los alérgenos que se encuentran en el dominio alergénico se han eliminado antes de la inclusión de las secuencias alergénicas en el constructo. Se ha descubierto que la eliminación de estas secuencias de señal individuales mejora el rendimiento global del constructo 'in vivo'.

[0083] El ácido nucleico de la invención contiene un dominio de estabilización intraorgánulos (o IOSD, por sus siglas en inglés), de manera que el mencionado IOSD es un dominio luminal de una proteína de membrana asociada a lisosomas (o LAMP, por sus siglas en inglés) humana. El IOSD contiene una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos que se une -mediante enlaces químicos- a una o más secuencias en el dominio alergénico y evita que estas secuencias se degraden (es decir, que sufran una 'proteólisis') antes de que la proteína quimérica llegue al compartimento endosómico/lisosómico. En esencia, el IOSD puede considerarse un tapón o tapa protectora para las secuencias del dominio alergénico, pues protege dichas secuencias -y, en particular, las secuencias de los epítopos alergénicos- de las enzimas proteolíticas, el pH bajo y otras sustancias y condiciones que desestabilizan las proteínas. La característica clave del IOSD es su capacidad para unirse al dominio alergénico y protegerlo de la proteólisis hasta que la molécula CMH de clase II se libera del péptido invariante. De este modo, las estructuras tridimensionales de el o los epítopos alergénicos se conservan hasta que las moléculas CMH de clase II activas estén disponibles para interactuar.

[0084] El constructo de ácido nucleico de la invención contiene un dominio de alérgenos o dominio alergénico. El dominio alergénico contiene una o más secuencias que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos alergénicos que contienen uno o más epítopos alergénicos. El dominio alergénico no incluye secuencias de señal de los alérgenos presentes. En este campo se conocen numerosos alérgenos proteicos, de manera que, de acuerdo con la presente invención, pueden usarse cualesquiera alérgenos o combinaciones de alérgenos y/o epítopos alérgenicos. Cuando se usa menos que una secuencia alergénica de longitud completa, preferiblemente se proporcionan uno o más epítopos de la proteína alergénica de longitud completa en sus posiciones naturales dentro de la proteína alergénica. Más específicamente, la presente invención versa sobre vacunas de ácido nucleico mejoradas, de manera que las vacunas codifican proteínas quiméricas que conservan o básicamente conservan su estructura tridimensional hasta que las moléculas CMH de clase II están preparadas para unirse a los epítopos de las proteínas quiméricas. De este modo, puede provocarse o desencadenarse una respuesta inmunitaria mejorada en comparación con la entrega de péptidos cortos a las moléculas CMH de clase II (de manera que, generalmente, los péptidos cortos carecerán de las estructuras tridimensionales adecuadas). En consecuencia, es preferible que el dominio alergénico codifique secuencias de aminoácidos relativamente largas que contienen uno o más epítopos, si es que están presentes originalmente en la proteína alergénica.

[0085] El dominio alergénico puede incluir dos o más alérgenos, de manera que cada uno de ellos contiene uno o más epítopos alergénicos. Se sabe que algunas proteínas alergénicas contienen dos o más epítopos. Puesto que una realización preferida de la invención utiliza una región de codificación alergénica completa (o una porción significativa de esta; de manera que la región de codificación carece de una secuencia de señal) de una proteína alergénica, algunos dominios alergénicos incluyen dos o más epítopos en su relación natural. De manera alternativa, dos o más epítopos conocidos pueden fusionarse en una región de codificación. De nuevo, en las realizaciones ejemplares, en el dominio alergénico están presentes dos o más proteínas alergénicas o regiones alergénicas de estas. Cuando se diseñan o modifican dos o más epítopos para que estén presentes en un único dominio de epítopo, los epítopos pueden proceder de la misma proteína antigénica. De manera alternativa, pueden proceder de dos proteínas diferentes de la misma especie. Así, pueden proceder de la misma proteína de dos especies diferentes. Más aún, pueden proceder de dos o más proteínas diferentes de dos o más especies diferentes. Básicamente, la presente invención contempla cualquier combinación de epítopos procedentes de la misma proteína -o de proteínas diferentes- de la misma especie -o de especies diferentes-. De manera similar, el orden de los diversos alérgenos y epítopos puede modificarse de cualquier manera que se pueda concebir. La mezcla de proteínas alergénicas y/o péptidos alergénicos de múltiples especies permite crear una vacuna de ácido nucleico resistente que puede proporcionar un tratamiento para las alergias a un único organismo fuente (por ejemplo, una especie particular de árboles) basándose en múltiples alérgenos, y también puede proporcionar un tratamiento para las alergias a múltiples organismos fuente (por ejemplo, múltiples plantas que liberan esporas durante la misma estación del año) basándose en múltiples alérgenos. Hasta la fecha no se ha demostrado la capacidad para combatir múltiples alergias mediante una única vacuna de ácido nucleico.

[0086] El constructo de ácido nucleico de la presente invención también contiene un dominio transmembrana -o dominio transmembranal-, de manera que dicho dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una LAMP humana. Los dominios transmembrana son unos elementos físicos y funcionales -muy conocidos y ampliamente descritos- de las proteínas que existen parcialmente en ambos lados de una membrana biológica. En esencia, un dominio transmembrana es una secuencia lineal de aminoácidos que generalmente son hidrófobos o lipófilos en la naturaleza y cuya función es fijar una proteína en una membrana biológica. Generalmente, estas secuencias tienen una longitud de 20-25 residuos.

[0087] Además de los elementos analizados previamente, el ácido nucleico de la presente invención contiene un dominio de señalización -o dominio de direccionamiento-. El dominio de señalización es una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la proteína quimérica codificada hacia el compartimento endosómico/lisosómico. En las realizaciones de la invención, el dominio de señalización contiene la secuencia de señalización citoplasmática C-terminal del polipéptido de LAMP humana, DC-LAMP humana, LAMP-2 humana o LAMP-3 humana.

[0088] En las realizaciones, el ácido nucleico de la presente invención contiene -como parte del dominio alergénicola secuencia de SEQ ID NO:2 (esto es, la secuencia de nucleótidos de Cry J2 sin su secuencia de señal) u otra secuencia que codifica la SEQ ID NO:3 (esto es, la secuencia de proteínas de Cry J2 sin su secuencia de señal) en el dominio alergénico. SEQ ID NO:2 se compone de nucleótidos que codifican la secuencia de codificación de proteínas completa de Cry J2, excepto su secuencia de señal (esto es, SEQ ID NO:2), una proteína pectato lisasa que se encuentra en el polen de Cryptomeria japónica. En este campo se sabe que Cry J2 está correlacionada con las alergias estacionales y persistentes en zonas en las que hay polen de cedro. En los pacientes alérgicos de zonas cercanas a bosques de cedros se encuentra habitualmente IgE específica para Cry J2. Cabe señalar que en la Lista de Secuencias ('Sequence Listing') que se proporciona como parte de la divulgación de la presente invención se indica o menciona la secuencia de señal para cada alérgeno (si está presente). Debe entenderse que estas secuencias de señal no están presentes en los constructos de la presente invención.

[0089] En otras realizaciones, el ácido nucleico contiene la secuencia de SEQ ID NO:4 (esto es, la secuencia de nucleótidos de Cry J1 sin su secuencia de señal) u otra secuencia que codifica la SEQ ID NO:5 (esto es, la secuencia de proteínas de Cry J2 sin su secuencia de señal). En otras realizaciones, el ácido nucleico contiene la secuencia de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, u otras secuencias que codifican SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5, respectivamente. En diversas realizaciones, el ácido nucleico contiene una o más del resto de secuencias que se desvelan en el presente documento, por ejemplo las que codifican cualquiera de los siguientes alérgenos: Cry J3 (Cry J3.8; C. japónica; SEQ ID NO:10; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-26), CJP-4 (C. japónica; SEQ ID NO:11), CJP-6 (C. japónica; SEQ ID NO:12), CJP-8 (C. japónica; SEQ ID NO:13; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-35), CPA63 (C. japónica; SEQ ID NO:14; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-20), CJP38 (C. japónica; SEQ ID NO:15; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-28), Cha o 1 (C. óbtuse; SEQ ID NO:16; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-21), Jun a 1 (J. Ashei; SEQ ID NO:17; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-21), Jun v 1 (J. virginiana: SEQ ID NO:18; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-21), Cup a 1 (H. arizónica; SEQ ID NO:19; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-21), Jun o 1 (J. óxycedrus; ^sE^qID NO:20; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-21), Cup s 1 (C. sempervirens; SEQ ID NO:21; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-21), Cha o 2 (C. óbtuse; SEQ ID NO:22; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-22), Jun a 2 (J. ashei; SEQ ID NO:23; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-22), Cup a 2 (H. arizónica; SEQ ID NO:24), Jun a 3 (J. ashei; SEQ ID NO:25; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-16), Jun r 3 (J. rigida; SEQ ID NO:26; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-26), Cup s 3 (C. sempervirens; SEQ ID NO:27; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-26), Cup a 3 (H. arizónica; SeQ ID NO:28), Ch4A (P.mónticóla; SEQ ID NO:29; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-25), Ch4-1 (P. menziesii; SEQ ID NO:30; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-26), PT-1 (P.taeda; SEQ ID NO:31) y LTP (P.abies; SEQ ID NO:32; la secuencia de señal corresponde a los residuos 1-25). Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que no se mencionan en referencia a las 'SEQ ID NO's también son de dominio público. Para obtener o conocer las secuencias de proteínas de acuerdo con la presente invención basta con implementar un programa informático tomando como base las secuencias de ácido nucleico. Evidentemente, estas realizaciones abarcan las secuencias bioquímicamente homólogas a estas secuencias de proteínas. Estas realizaciones abarcan, por ejemplo, las secuencias que presentan un 30% o más de identidad o igualdad -como un 40% o más, un 50% o más, un 75% o más, un 90% o más, un 95% o más, un 98% o más o un 99% o más- con las secuencias desveladas. Debe entenderse que este concepto no solo se aplica a las secuencias de alérgenos particulares que se desvelan en el presente documento, sino también a todas las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos que se proporcionan en el presente documento. Además, tal y como se ha explicado previamente, debe entenderse que la presente divulgación abarca específicamente cada valor que se encuentre dentro de los rangos o intervalos desvelados.

[0090] En un ejemplo particular de la invención, se proporciona una vacuna de ADN que contiene la SEQ ID NO:2 u otra secuencia que codifica la SEQ ID NO:3 en el dominio alergénico. Cuando esta vacuna se administra a un paciente que presenta signos evidentes de alergia al sugi o cedro rojo japonés, la vacuna provoca la síntesis 'de novo' de una proteína quimérica o proteína de fusión (ambos términos se usan indistintamente en el presente documento) que contiene el alérgeno Cry J2 (que se muestra en la SEQ ID NO:3). Debido a la combinación de dominios que están presentes en la proteína quimérica, la proteína se dirige desde el retículo endoplasmático hasta la vía o ruta endolisosómica, lo que provoca la conversión de la proteína de fusión en epítopos en las vesículas CMH, de manera que algunos de ellos se unen a moléculas CMH de clase II, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria humoral mejorada.

[0091] En otro ejemplo de la invención, se proporciona una vacuna de ADN que contiene la SEQ ID NO:4 u otra secuencia que codifica la SEQ ID NO:5 en el dominio alergénico. Cuando esta vacuna se administra a un paciente que presenta signos evidentes de alergia al sugi o cedro rojo japonés, la vacuna provoca la síntesis 'de novo' de una proteína quimérica o proteína de fusión (ambos términos se usan indistintamente en el presente documento) que contiene el alérgeno Cry J1 (que se encuentra en la SEQ ID NO:4). Debido a la combinación de dominios que están presentes en la proteína quimérica, la proteína se dirige desde el retículo endoplasmático hasta la vía o ruta endolisosómica, lo que provoca la conversión de la proteína de fusión en epítopos en las vesículas CMH, de manera que algunos de ellos se unen a moléculas CMH de clase II, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria humoral mejorada.

[0092] En otro ejemplo de la invención, se proporciona una vacuna de ADN que contiene la SEQ ID NO:6 en el dominio alergénico. Cuando esta vacuna se administra a un paciente que presenta signos evidentes de alergia al sugi o cedro rojo japonés, la vacuna provoca la síntesis 'de novo' de una proteína quimérica o proteína de fusión (ambos términos se usan indistintamente en el presente documento) que contiene los alérgenos Cry J1 y Cry J2 (SEQ ID NO:7). Debido a la combinación de dominios que están presentes en la proteína quimérica, la proteína se dirige desde el retículo endoplasmático hasta la vía o ruta endolisosómica, lo que provoca la conversión de la proteína de fusión en epítopos en las vesículas CMH, de manera que algunos de ellos se unen a moléculas CMH de clase II, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria humoral mejorada.

[0093] En otro ejemplo de la invención, en el dominio alergénico se proporciona un ácido nucleico que codifica la secuencia de codificación de proteínas completa de Jun a1, una pectato lisasa que pertenece al género Juniperus ashei. Jun a1 presenta un alto grado de identidad de secuencia con Cry J1, conserva una actividad enzimática similar a Cry J1 y tiene una gran similitud en los epítopos conocidos.

[0094] Es bien sabido que otros polipéptidos presentan reactividad cruzada con Cry J1 y que esta reactividad cruzada se debe a los epítopos compartidos que están relacionados con la actividad enzimática de los polipéptidos de la familia de la pectato lisasa. Esta familia incluye el alérgeno principal del ciprés japonés (Chamaecyparis obtusa (Ch o1)) y también incluye alérgenos de: Juniperus ashei (Jun a 1), Juniperus virginiana (Jun v 1), Cuppressus arizonica (Cup a 1), Juniperus oxycedrus (Jun o 1) y Cupressus sempervirens (Cup s 1). En la literatura se menciona que existe una fuerte reactividad cruzada entre los pacientes alérgicos al polen de la familia de los cedros (Cupressus). La Tabla 1 de más abajo muestra los niveles de reactividad cruzada entre proteínas relacionadas. Si bien la presente invención se ha descrito detalladamente en relación con Cry J1 y Cry J2, debe entenderse que uno o más de los alérgenos que se desvelan en el presente documento -y, particularmente, en la Tabla 1- pueden usarse además de o como alternativas a las secuencias de Cry J1 y Cry J2.

Tabla 1: reactividad cruzada de Cryptomeria japónica con otros alérgenos

[0095] En este campo es bien sabido que algunos sitios para insertar o introducir una secuencia de nucleótidos para una región de codificación en la secuencia de nucleótidos para una región de codificación diferente (es decir, los sitios de fusión) son más favorables o adecuados que otros. La ubicación de la secuencia alergénica que se muestra, por ejemplo, en las Figuras 1-5, se considera la ubicación favorable para usar la composición que se desvela en la presente invención. Entra dentro del alcance de la presente divulgación desplazar la ubicación de la secuencia alergénica a otras ubicaciones, por ejemplo al dominio luminal de un polipéptido de LAMP o a otro dominio de estabilización intraorgánulos. No obstante, es preferible no situar el alérgeno en la región de codificación del dominio transmembrana o el dominio citoplasmático. En un ejemplo preferido de la divulgación, la secuencia alergénica se inserta en el dominio luminal de un polipéptido de LAMp a 5 aminoácidos como mucho de la unión con el dominio transmembrana y a 20 aminoácidos como mucho en el lado de 5' del extremo N-terminal del dominio luminal de un polipéptido de LAMP.

[0096] El ácido nucleico de la invención puede proporcionarse como una molécula aislada o purificada. El ácido nucleico también puede proporcionarse como parte de una composición. La composición puede estar compuesta básicamente del ácido nucleico, lo cual significa que el ácido nucleico es el único ácido nucleico en la composición que es adecuado para la expresión de una secuencia de codificación. De manera alternativa, la composición puede contener un ácido nucleico de la invención. En las realizaciones ejemplares, la composición es una composición farmacéutica que contiene el ácido nucleico de la invención junto con una o más sustancias o portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la composición contiene una sustancia que favorece la absorción del ácido nucleico por parte de una célula. En algunas realizaciones, la composición contiene una molécula de señalización que ayuda a entregar o llevar el ácido nucleico a un tipo específico de célula, como una célula inmunitaria (por ejemplo, una APC). En las realizaciones, el ácido nucleico forma parte de un vector o vehículo de entrega para entregar el ácido nucleico a una célula o tejido.

[0097] En un ejemplo particular de la invención, la composición contiene una mezcla de dos vacunas de ADN, de manera que una vacuna contiene la secuencia de un alérgeno y la otra vacuna contiene la secuencia de otro alérgeno. Los dos constructos de la vacuna pueden mezclarse con un ratio o proporción de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4...

secuencialmente hasta 1:10. El ratio preferido es 1:1.

[0098] En un ejemplo particular de la invención, los ácidos nucleicos de Cry J1, Cry J2 y/o Jun a2 están presentes en un vector de entrega de ácido nucleico. En una realización preferida de la invención, el vector de entrega de ácido nucleico no contiene un gen de resistencia a los antibióticos, como el vector de entrega de ácido nucleico que analiza la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. n° 2008/006554, o los vectores que se desvelan o se derivan de la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. n° 2006/003148. En un ejemplo particular de la invención, el ácido nucleico es un vector viral, por ejemplo un vector adenoviral.

[0099] Los ácidos nucleicos y las composiciones son agentes útiles y novedosos para reducir las reacciones alérgicas de los pacientes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos y las composiciones son útiles para reducir la polinosis en pacientes con una reacción alérgica comprobada que está correlacionada con el polen del sugi o cedro rojo japonés, o de un alérgeno o polen homólogo. En otro ejemplo no limitativo, los ácidos nucleicos son útiles para reducir las alergias alimentarias, como la alergia a los cacahuetes y otros frutos secos. La entrega de ácidos nucleicos y composiciones para tratar la polinosis del polen de cedro rojo japonés, de manera que los ácidos nucleicos y las composiciones transfectan una célula presentadora de antígenos, provoca un aumento de los niveles séricos de la inmunoglobulina G (IgG) específica para los epítopos contenidos en Cry J1 y/o Cry J2. Esta respuesta es útil para reducir los síntomas alérgicos. La entrega o liberación de alérgenos de otras alergias, incluyendo la ambrosía, otros pólenes de árboles y otros alimentos, también provoca un aumento de los niveles séricos de IgG.

[0100] La presente invención también proporciona composiciones que se usan en métodos para tratar a sujetos con necesidades. Dichos métodos son métodos para tratar profilácticamente o terapéuticamente a un sujeto que padece una reacción alérgica a uno o más alérgenos o corre el riesgo de desarrollarla. El método incluye administrar al sujeto una vacuna de ADN de acuerdo con la invención en una cantidad suficiente para provocar la absorción y la expresión de la vacuna de ADN por parte de una APC. La expresión de la vacuna de ADN provoca la presentación del (de los) epítopo(s) alergénico(s) codificado(s) en la APC y provoca el desarrollo de una respuesta inmunitaria de IgG.

[0101] En un ejemplo particular de la invención se proporcionan la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4 y/u otras secuencias de codificación de alérgenos para su administración a una célula. En las realizaciones preferidas, la célula es una célula presentadora de antígenos, como una célula dendrítica. Preferiblemente, la célula dendrítica es una célula dendrítica humana. La presente invención puede administrarse usando métodos que son muy conocidos en este campo y que se sabe que son métodos de administración eficaces para las vacunas de ácido nucleico, de manera que incluyen la inyección intramuscular, la inyección subcutánea, la electroporación, la vacunación con pistola génica o la transferencia mediada por liposomas.

[0102] La presente invención proporciona una formulación que es útil para tratar la polinosis correlacionada con el polen del cedro rojo japonés. Anteriormente se ha establecido que administrar a un animal un plásmido de ADN que codifica la secuencia de codificación de proteínas de un alérgeno puede aumentar la producción de IFN-gamma y disminuir la producción de IL-4, lo cual es útil para tratar animales alérgicos al alérgeno específico. La presente invención proporciona una composición de una vacuna de ADN mejorada para tratar a pacientes con una alergia correlacionada con el polen del cedro rojo japonés. La proteína de fusión de la invención tiene un patrón de tráfico intracelular específico que se cruza o interseca con las vesículas CMH de clase II, lo cual da como resultado una mejor presentación de los epítopos alergénicos al sistema inmunitario y, específicamente, provoca una respuesta de anticuerpos mejorada. Los ácidos nucleicos y las composiciones que proporciona la presente invención son útiles para llevar a cabo una inmunoterapia para alergias.

[0103] La presente invención proporciona una formulación que, cuando se administra a una célula, provoca una respuesta de anticuerpos específica aumentada. La respuesta -aumentada- de anticuerpos al alérgeno es útil para tratar enfermedades alérgicas mediadas o reguladas por la IgE. La IgE tiene algunas propiedades relacionadas con su restricción celular y la señalización intracelular resultante tras unirse a alérgenos afines o similares. Se genera IgE contra un alérgeno cuando las células B reciben IL-4 secretada por células Th2. Esto ayuda a dar la orden a las células B para que produzcan anticuerpos IgE. Tras ser secretada por las células B, la IgE se une a Fc-eRI y su receptor de alta afinidad es expresado por los mastocitos y los eosinófilos, lo cual da como resultado que estas células y el propio animal se sensibilicen frente a futuras exposiciones a alérgenos. Por lo tanto, los síntomas alérgicos pueden desencadenarse tras la ingesta, la inhalación o el contacto de la mucosa con un alérgeno. Debido a las propiedades de unión de los anticuerpos, se ha propuesto que una manera de reducir los síntomas alérgicos consiste en quelatar los alérgenos libres que están disponibles para unirse a la IgE mediante la competencia con otras clases de anticuerpos. Más particularmente, se ha propuesto que una formulación para alergias que aumente la IgG puede ser una vía para reducir las enfermedades alérgicas. La invención que se describe en el presente documento provoca una mayor producción de IgG, lo que causa una disminución en el ratio de IgE respecto a IgG que es clínicamente significativa. Los resultados de los estudios realizados indican que en el día 98 el nivel de IgG provocado por el constructo de Cry J2-LAMP es mayor que el provocado por la entrega o administración de nucleótidos que codifican Cry J2 no modificado.

[0104] En otro ejemplo de la divulgación, se describe un método para seleccionar polipéptidos de pectato lisasa que se encuentran en el polen de cedro a fin de determinar el grado de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de un Cry J1, una pectato lisasa, de manera que puede producirse una nueva composición de una sustancia o materia similar a Cry J1, y de manera que administrar a un paciente la composición de materia homóloga producirá un resultado terapéutico que es útil para tratar alergias correlacionadas con el polen de cedro.

EJEMPLOS

[0105] A continuación describiremos la invención tomando como referencia sus realizaciones ejemplares. Los siguientes ejemplos pretenden ofrecer al lector una mejor comprensión de la estructura y la actividad de los constructos de la invención y debe entenderse que no limitan en modo alguno el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Métodos y materiales generales

Inmunizaciones y recogida de sueros

[0106] Se realizó una compra de ratones hembra BALB/c de entre seis y ocho semanas a Harlan Laboratories (Frederick, Maryland, Estados Unidos) y los animales se guardaron en nuestras instalaciones para animales ubicadas en Rockville (Maryland, Estados Unidos). Las vacunas o inmunizaciones de ADN se administraron intramuscularmente o intradérmicamente con 50 |jg de ADN de plásmido en un volumen de 10 j l de PBS o tampón fosfato salino esterilizado. Los sueros se obtuvieron mediante sangrado orbital y se guardaron a -20° C para su posterior análisis. Para su sensibilización, a los ratones se les inyectaron 5 jg/ml de CRYJ2 recombinante (rCRYJ2) o CRYJ1 recombinante (rCRYJI) junto con 100 j l de alumbre (2 mg/ml) en un volumen total de 200 jl. Se extrajo sangre a los ratones semanalmente y se analizaron los sueros mediante ELISA en busca de anticuerpos específicos de CRYJ.

Cobayas

[0107] Se realizó una compra de cobayas hembra a Spring Valley Laboratories (Woodline, Maryland, Estados Unidos) y se guardaron en los mismos laboratorios. Las inmunizaciones de ADN se administraron intramuscularmente con 100 jg de ADN de plásmido en un volumen de 200 j l de solución salina esterilizada. Los sueros se obtuvieron mediante sangrado cardíaco y se guardaron a 20° C para su posterior análisis.

Detección de las respuestas de inmunoglobulina específicas de CRYJ2

[0108] Las placas de inmunoensayo de Nunc Maxisorp se recubrieron con rCRYJ2 con una concentración de 5 jg/ml en PBS durante la noche a 4° C. Tras bloquearlos con albúmina de suero bovino (BSA) de un 1% en PBS, los sueros se diluyeron en PBS que contenía un 0,05% de Tween-20 (PBS-T) añadido y se incubaron durante 1 hora. La IgG, IgG1 o IgG2a unida al CRYJ2 inmovilizado en los pocillos se detectó usando anticuerpos IgG, IgG1 o IgG2a antirratón de cabra conjugados con peroxidasa (Jackson Laboratories). Se añadió sustrato de TMB (KPL) y la actividad enzimática se detuvo con la solución de parada de TMB. Se midieron las placas a 450 nm. En algunos casos, se usó una 'Sure Stop Solution' o solución de parada segura (KPL) y se midieron las placas a 650 nm.

Preparación de esplenocitos para las mediciones de citoquinas

[0109] Se extrajeron los bazos asépticamente y se desmenuzaron para preparar una suspensión unicelular. Para estudiar la respuesta primaria, se cultivaron los esplenocitos en placas de 24 pocillos (4 x 105 células/pocillo) en presencia o ausencia de 10 jg/ml, 5 jg/ml o 2,5 jg/ml de rCRYJ2 durante 72 horas.

Ensayos de citoquinas

[0110] Los sobrenadantes se analizaron mediante ELISA en busca de IFN-gamma e IL-4. Se usaron pares de anticuerpos emparejados para el IFN-gamma y la IL-4 siguiendo las instrucciones del fabricante. Las curvas estándar se generaron con IL-4 e IFN-gamma recombinante de ratón. Todos los anticuerpos y citoquinas se adquirieron a Invitrogen (Carlsbad, California, Estados Unidos). Los límites de detección de los ensayos de IFN-gamma e IL-4 fueron de 20 y 10 pg/ml, respectivamente.

Ejemplo 2: Expresión de alérgenos a partir de constructos

[0111] Para demostrar que los constructos de ácido nucleico de la invención pueden usarse para expresar uno o múltiples alérgenos en células transformadas, se transfectaron células 293 humanas con el plásmido de CryJ2-LAMP, el plásmido de CryJ1+J2-LAMP (Figura 4), el plásmido de CryJ1-LAMP, el plásmido de CryJ1 (sin la secuencia de señal de CryJ1; Figura 7), y el vector de plásmido base solo (control negativo; SEQ ID NO:1). Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 9.

[0112] La Figura 9A muestra los resultados de las reacciones de transfección, de manera que la detección usó un anticuerpo anti-CryJI. En pocas palabras, se sometieron a electroforesis 30 microgramos de lisado celular y después se transfirieron a una membrana para la inmunotransferencia ('immunoblotting'). Se detectaron las proteínas mediante inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal de CryJ2, a lo que siguió la quimioluminiscencia. Como puede observarse en la Figura, se detectaron los constructos que contenían el alérgeno CryJ2 solo y los alérgenos CryJ1+CryJ2 (ruta o carril 2 y 3), mientras que los demás alérgenos no se detectaron. En este experimento, las secuencias de señal naturales para los alérgenos CryJ1 y CryJ2 se eliminaron antes del experimento, a excepción del constructo en el carril 5. Estos resultados no solo demuestran que los constructos de la invención son adecuados para la expresión de alérgenos, sino también que pueden coexpresarse múltiples alérgenos.

[0113] La Figura 9B muestra los resultados de las reacciones de transfección, de manera que la detección usó un anticuerpo anti-CryJ1. En pocas palabras, se sometieron a electroforesis 30 microgramos de lisado celular y después se transfirieron a una membrana para la inmunotransferencia ('immunoblotting'). Se detectaron las proteínas mediante inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal de CryJ1, a lo que siguió la quimioluminiscencia. Como puede observarse en la Figura, se detectaron los constructos que contenían los alérgenos CryJ1+CryJ2 (que carecían de secuencias de señal naturales; carril 3), y también se detectó el constructo que contenía el alérgeno CryJ1, cuya secuencia de señal natural se había eliminado (carril 5). Sin embargo, el constructo con el alérgeno CryJ1 que incluía su secuencia de señal natural no se detectó. Estos resultados demuestran que los constructos de la invención son adecuados para la expresión y la detección de múltiples alérgenos, y que la eliminación de las secuencias de señal naturales es importante para expresar y detectar productos.

Ejemplo 3: Datos que respaldan la vía de procesamiento de CMH II para los constructos

[0114] Para determinar si las proteínas quiméricas producidas a partir de los constructos de la invención se procesan a través de la vía CMH II, se llevaron a cabo diversos experimentos para comparar la respuesta inmunitaria a la proteína de CryJ2 cuando se administra como una región de codificación en un plásmido o como un dominio alergénico en un constructo de acuerdo con la presente invención. Los resultados se muestran en la Figura 10, Paneles A y B.

[0115] Más específicamente, esta figura muestra la respuesta específica a CryJ2 después de cuatro inmunizaciones de ADN y la sensibilización con extracto de polen bruto. Se inmunizaron grupos de ratones (n=5) subcutáneamente con ADN de plásmido de CRYJ2-LAMP o ADN de plásmido de CRYJ2 (ver Figura 8) los días 0, 7, 14 y 21. Seis semanas (día 77) después de la última inmunización con ADN, los ratones se sensibilizaron con extracto de polen bruto en alumbre y se les administró una dosis de refuerzo tres semanas después (día 91). Los datos muestran los valores generados a partir de los sueros agrupados para cada punto temporal. La respuesta de IgG1 (Panel A) e IgG2a (Panel B) en ratones que habían recibido ADN de CRYL2-LAMP siguió siendo alta hasta el día 112 y fue muy superior a la de los ratones que habían recibido ADN de plásmido de CRY-J2 que no incluía lAm P. Por consiguiente, la administración de alérgenos a través de constructos de acuerdo con la presente invención proporciona una mejor respuesta de CMH II que la administración de alérgenos sin los constructos de la invención. Ejemplo 4: Fundamentos de la dosificación - Comparación de la respuesta inmunitaria a diferentes dosis de los constructos y al vector solo

[0116] La Figura 11 muestra una respuesta específica a CryJ2 después de cuatro inmunizaciones de ADN con diferentes niveles de dosificación, para la producción de IgG2a y la producción de IgG1. A diversos grupos de ratones (n=5) se les administraron intramuscularmente 10 |jg, 50 |jg o 100 |jg de ADN de plásmido de CRYJ2-LAMP o ADN vectorial los días 0, 7, 14 y 21. Tres semanas después de la última inmunización con ADN, se sacrificó a los ratones y se extrajeron los bazos para los ensayos de inducción de citoquinas.

[0117] Los datos muestran los valores generados a partir de los sueros agrupados para cada dosis de la vacuna. Las tres concentraciones de ADN de plásmido de CRYJ2-LAMP produjeron respuestas de IgG1 e IgG2a; según parece, la dosis de 50 jg provocó la respuesta de anticuerpos más elevada. El vector solo, con cualquier concentración, no provocó ninguna respuesta de anticuerpos. Estos datos demuestran que existe una respuesta dependiente de la dosis para provocar una respuesta inmunitaria y que dicha respuesta inmunitaria es, al menos en parte, una respuesta de tipo CMH II.

Ejemplo 5: Datos adicionales que muestran una respuesta inmunitaria a través de la vía CMH II

[0118] En este grupo de experimentos, se determinó la secreción de citoquinas en sobrenadantes de células del bazo estimuladas usando IL-4 e IFN-gamma como marcadores. Más específicamente, el día 42 se extrajeron células del bazo de ratones (n=3) y se cultivaron en presencia de 10 jig/ml, 5 jig/ml, 2,5 jig/ml de rCRYJ2 o sin rCRYJ2. Las células del bazo de ratones naturales o 'ingenuos' se usaron como control negativo. Los niveles de IL-4 e IFN-gamma de los esplenocitos estimulados con rCRYJ2 se midieron mediante ELISA en pg/ml.

[0119] Los datos se muestran en la Figura 12, Paneles A y B. Estos datos demuestran que los ratones que recibieron 50 |jg de ADN de plásmido de CRYJ2-LAMP tenían una expresión significativamente más elevada de IFN-gamma (un biomarcador establecido para la activación de la vía de respuesta inmunitaria CMH II) que aquellos que recibieron la dosis más baja de ADN de plásmido. Se observó una respuesta muy baja en los niveles de IL-4 de cualquiera de los grupos, un biomarcador establecido para la vía CMH I. También hubo una respuesta muy baja -si es que la hubo- con IL-5 (no se muestran los datos). Estos resultados indican que la inmunización con ADN de CRYJ2-LAMP provocó la captación de células Th1 -o linfocitos- de memoria y no de células Th2, tal y como indica la producción de IFN-gamma y no de IL-4 tras la estimulación con la proteína de Cry J2 recombinante.

Ejemplo 6: Estudios sobre los efectos terapéuticos de la inmunización con la vacuna de ADN de CryJ2-LAMP en ratones sensibilizados previamente con CryJ2

[0120] Para estudiar los efectos terapéuticos de la vacuna de ADN-LAMP-CryJ2, se sensibilizaron grupos de ratones (n=5) con tres inyecciones de 5 jg de proteínas recombinantes de rCRYJ2 y, cuatro semanas después, se trataron con cuatro inyecciones de ADN de plásmido de CRYJ2-LAMP que se administraron en intervalos semanales (7 días). Las inmunizaciones de ADN produjeron un efecto estimulante o de refuerzo para IgG2a y un aumento transitorio para los anticuerpos de IgG1, lo cual indica que la vacuna de ADN tiene un efecto modulador dirigido por Th1. Dos inmunizaciones de ADN adicionales en los días 167 y 174 estimularon la respuesta de IgG2a específica para CRYJ2 y casi no provocaron cambios en la respuesta de IgG1. El examen o reconocimiento visual de los ratones no reveló ningún malestar físico ni reacciones en la piel. Tampoco hubo cambios en su apetito y no parecían apáticos o aletargados. Los efectos en los títulos de IgG1 e IgG2a se muestran en la Figura 13, en los Paneles A y B, respectivamente.

Ejemplo 7: Inducción de IFN-gamma e IL-4 en cultivos celulares de bazo de ratón

[0121] También se estudiaron los efectos terapéuticos de la vacuna de ADN de CryJ2-LAMP en lo referente a la inducción de citoquinas. El día 183 se extrajeron células del bazo de ratones (n=3) y se estimularon con diversas concentraciones de rCRYJ2. Como control negativo se usaron células del bazo de ratones 'ingenuos' o naturales. Los niveles de IL-4 e IFN-gamma de los esplenocitos estimulados con rCRYJ2 se midieron mediante ELISA en pg/ml. Se detectó una expresión significativamente alta de IFN-gamma en el grupo vacunado con CRYJ2-LAMP en comparación con la del grupo del vector. Sin embargo, la expresión de IL-4 no presentó ninguna diferencia respecto al grupo del vector. Presumiblemente, el aumento del IFN-gamma como resultado de la inmunización de ADN de CryJ2-LAMP está relacionado con la captación de células Th1 específicas para antígenos y con la creación de un entorno de citoquinas de Th1. Los datos obtenidos con este experimento se muestran en la Figura 14, Paneles A y B.

Ejemplo 8: Detección de las proteínas de CryJ2 que circulan en el suero

[0122] Los ratones se inmunizaron con proteínas de CryJ2, pDNA-Cry J2 (sin LAMP) y CryJ2-LAMP-vax. Los días 0, 1, 2, 3, 4 y 7 se tomaron muestras de suero y se analizaron en busca de proteínas de CryJ2 libre en un inmunoensayo sándwich sensible. En la inmunización de proteínas y la inmunización sin LAMP se detectó CryJ2 libre. Sin embargo, no se detectó ningún alérgeno libre en ningún punto temporal de ningún experimento con los ratones inmunizados con CryJ2-LAMP-vax (nivel mínimo detectable: 2 ng/ml). En la Figura 12 se proporcionan datos que apoyan estas afirmaciones.

[0123] Las vacunas de LAMP de acuerdo con la invención son las únicas formulaciones que tratan alergias sin introducir sistemáticamente alérgenos libres en el paciente. Esto se diferencia de la inmunoterapia tradicional, que en ocasiones puede provocar reacciones anafilácticas debido a la introducción sistemática de alérgenos. Este experimento demuestra que los ratones que recibieron el plásmido de ADN de CryJ2-LAMP no tenían proteínas de CryJ2 libre y, por lo tanto, no se liberaban en la circulación sistémica, tal y como se observa en los ratones a los que se les administró la proteína sola o ADN de CryJ2 sin LAMP.

Ejemplo 9: Eficacia de las vacunas de ADN en cobayas

[0124] Para expandir o aumentar la comprensión científica de las funciones de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en otros mamíferos, se llevaron a cabo estudios con cobayas hembra inmunizadas con la vacuna de ADN de CryJ2-LAMP, y después se les expuso a proteínas de CryJ2 recombinante. Los resultados de los estudios se muestran en la Figura 16, Paneles A y B.

[0125] Más específicamente, las cobayas hembra recibieron inyecciones intramusculares de 100 jg de la vacuna de ADN de CryJ2-LAMP, o del vector solo, los días 0, 7 y 14. Cuatro semanas después de la última inmunización con la vacuna de ADN en el día 14, las cobayas recibieron inyecciones subcutáneas de 10 jg/ml de proteína/alumbre de rCRYJ2 los días 42 y 49. Los días 0, 21, 35, 63 y 77 se obtuvieron muestras de suero de las cobayas. Los datos muestran que los valores de la absorbancia promedio de las cobayas que recibieron ADN de CRYJ2-LAMP aumentaron hasta el día 35 para IgG2, de manera que hubo muy poca o ninguna respuesta de IgG1. El aumento de IgG2a es compatible con lo que se observa habitualmente en una respuesta influenciada por Th1.

Ejemplo 10: Investigaciones adicionales con otros mamíferos - Datos toxicológicos sobre seguridad

[0126] Los conejos blancos de Nueva Zelanda recibieron inyecciones intramusculares de 4,128 mg de ADN de CRYJ2-LAMP. Los conejos de control, emparejados según el sexo y la edad, recibieron solo una solución salina. Los conejos fueron inmunizados los días 1, 14, 28, 42 y 56. Se obtuvieron muestras de suero de los conejos los días 1,14, 28, 42, 56, 58 y 85. Los valores de la absorbancia promedio del suero de ratón a 1:100 tras múltiples inyecciones intramusculares de solución salina o plásmido de Cryj2-LAMP se muestran en la Figura 17. Como puede observarse en la figura, los datos muestran que los valores de la absorbancia promedio para los conejos que recibieron la solución salina son de menos de 0,100. En general, los valores de absorbancia de los conejos de los grupos tratados con ADN de CRYJ2-LAMP aumentaron hasta el día 42 y, en algunos casos, aumentaron hasta el día 85.

Ejemplo 11: Aplicabilidad a alergias alimentarias

[0127] Durante los últimos 25 años, se han identificado 8 alérgenos importantes del cacahuete basándose en la sensibilización en pacientes alérgicos al cacahuete. La IgE de los individuos alérgicos al cacahuete reconoce habitualmente tres alérgenos principales del cacahuete: en el 65-100% de los casos reconoce a Ara h1, una proteína de almacenamiento de semillas (de 63,5 kDa) de la familia de la vicilina; en el 71-100% de los casos reconoce a Ara h2, una proteína de almacenamiento de semillas (de 17 kDa) de la familia de la conglutinina; en el 45-95% de los casos reconoce a Ara h3, una proteína de almacenamiento de semillas (de 14 kDa) de la familia de la glicinina. Además de ser agentes causales habituales que desencadenan la anafilaxis y las reacciones alérgicas al cacahuete, parece que estas tres proteínas también ayudan a provocar reacciones alérgicas más fuertes. Identificar y señalar estos alérgenos como base de la inmunoterapia para las alergias al cacahuete tiene el potencial de proporcionar la más amplia protección frente a las reacciones alérgicas fuertes entre la variada población de alérgicos al cacahuete. Actualmente se están realizando diversos ensayos clínicos de fase I que utilizan formas hipoalergénicas de estos tres alérgenos principales y un adyuvante de bacterias muertas por calor como inmunoterapia para las alergias. Estos ensayos están en desarrollo, pero la futura comercialización de esta terapia supondrá todo un reto debido a su proceso de fabricación altamente complejo.

[0128] Para atajar la incidencia creciente de las alergias alimentarias y, más particularmente, de las alergias al cacahuete, se creó un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la invención. El constructo se representa en la Figura 6A, y en la Figura 6B se muestra un esquema de la proteína quimérica codificada, tal y como se ha explicado anteriormente. Este constructo se puede usar para generar principalmente una respuesta CMH II en los sujetos a los que se administra. La presencia de los tres alérgenos más comunes del cacahuete en una única proteína quimérica permite una amplia inmunización que sirve para tratar la gran mayoría de alergias al cacahuete que existen entre la población.

[0129] El constructo se expresó y los resultados se muestran en la Figura 18. La Figura 19 muestra que los tres alérgenos pueden expresarse y detectarse como una única poliproteína en 'Western blots' o electrotransferencias.

[0130] Para las personas versadas en este campo resultará evidente que pueden realizarse diversas variaciones y modificaciones en la puesta en práctica de la presente invención y en la elaboración de los constructos de ácido nucleico sin apartarse por ello de la invención. Para las personas versadas en este campo también resultarán evidentes otras realizaciones de la presente invención gracias al estudio de la presente especificación y la puesta en práctica de la invención. Se pretende que los ejemplos y la presente especificación sólo se consideren ilustrativos, de manera que la invención queda definida y delimitada en las reivindicaciones anexas.

Secuencias adicionales para la Lista de Secuencias

[0131] Además de las secuencias que se proporcionan en la Lista de Secuencias formal que se proporciona como parte de la presente solicitud, las secuencias que se muestran a continuación comprenden una parte de la presente divulgación:

1. La secuencia de nucleótidos de la región de codificación para el constructo quimérico de Cry1-Cry2-LAMP es la siguiente:

SEQ ID N0:6 - Cry J1+J2-LAMP

ccgcctaatg agcgggcttt tttttcttag ggtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac 60 tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgag 120 ccccgtatcc ggccgtccgc cgtgatccat gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt 180 gtgcgacgtc agacaacggg ggagtgctcc ttttggcttc cttccccttc ttccgcttcc 240 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 300 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 360 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 420 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 480 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 540 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 600 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 660 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 720 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 780 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 840 tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 900 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 960 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1020 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1080 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1140 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1200 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tcctgcaaac cacgttgtgg 1260 tagaattggt aaagagagtc gtgtaaaata tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat 1320 tgatttttgg cgaaaccatt tgatcatatg acaagatgtg tatctacctt aacttaatga 1380 ttttgataaa aatcattagg taccccggct ctagatggca tgacattaac ctataaaaat 1440 aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 1500 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 1560 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca 1620 tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta 1680 aggagaaaat accgcatcag attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 1740 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga 1800 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 1860 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 1920 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 1980 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 2040 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 2100 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 2160 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 2220 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 2280 gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 2340 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 2400 gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggct 2460 cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt 2520 cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt 2580 ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc 2640 agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctagttctc tcgttaactt 2700 aatgagacag atagaaactg gtcttgtaga aacagagtag tcgcctgctt ttctgccagg 2760 tgctgacttc tctcccctgg gcttttttct ttttctcagg ttgaaaagaa gaagacgaag 2820 aagacgaaga agacaaaccg tcgtcgacat ggcgccccgc agcgcccggc gacccctgct 2880 gctgctactg ctgttgctgc tgctcggcct catgcattgt gcgtcagcag caatgtttat 2940 ggtgaaaaat ggcaacggga ccgcgtgcat aatggccaac ttctctgctg ccttctcagt 3000 gaactacgac accaagagtg gccctaagaa catgaccctt gacctgccat cagatgccac 3060 agtggtgctc aaccgcagct cctgtggaaa agagaacact tctgacccca gtctcgtgat 3120 tgcttttgga agaggacata cactcactct caatttcacg agaaatgcaa cacgttacag 3180 cgtccagctc atgagttttg tttataactt gtcagacaca caccttttcc ccaatgcgag 3240 ctccaaagaa atcaagactg tggaatctat aactgacatc agggcagata tagataaaaa 3300 atacagatgt gttagtggca cccaggtcca catgaacaac gtgaccgtaa cgctccatga 3360 tgccaccatc caggcgtacc tttccaacag cagcttcagc cggggagaga cacgctgtga 3420 acaagacagg ccttccccaa ccacagcgcc ccctgcgcca cccagcccct cgccctcacc 3480 cgtgcccaag agcccctctg tggacaagta caacgtgagc ggcaccaacg ggacctgcct 3540 gctggccagc atggggctgc agctgaacct cacctatgag aggaaggaca acacgacggt 3600 gacaaggctt ctcaacatca accccaacaa gacctcggcc agcgggagct gcggcgccca 3660 cctggtgact ctggagctgc acagcgaggg caccaccgtc ctgctcttcc agttcgggat 3720 gaatgcaagt tctagccggt ttttcctaca aggaatccag ttgaatacaa ttcttcctga 3780 cgccagagac cctgccttta aagctgccaa cggctccctg cgagcgctgc aggccacagt 3840 cggcaattcc tacaagtgca acgcggagga gcacgtccgt gtcacgaagg cgttttcagt 3900 caatatattc aaagtgtggg tccaggcttt caaggtggaa ggtggccagt ttggctctgt 3960 ggaggagtgt ctgctggacg agaacagcct cgagaagtcc agcccctacc agaagaaaac 4020 cgagaacccc tgcgcccagc ggtgcctgca gtcttgtcag caggaacccg acgacctgaa 4080 gcagaaggcc tgcgagagcc ggtgcaccaa gctggaatac gaccccagat gcgtgtacga 4140 ccctagaggc cacaccggca ccaccaacca gagaagccct ccaggcgagc ggaccagagg 4200 cagacagcct ggcgactacg acgacgacag acggcagccc agaagagaag agggcggcag 4260 atggggacet gccggcccta gagagagaga acgcgaggaa gattggagac agcccagaga 4320 ggactggcgg aggccttctc accagcagcc ccggaagatc agacccgagg gcagagaagg 4380 cgagcaggaa tggggcacac ctggctctca cgtgcgcgag gaaaccagcc ggaacaaccc 4440 cttctacttc ccctcccggc ggttcagcac cagatacggc aaccagaacg gccggatcag 4500 agtgctgcag agattcgacc agcggagccg gcagttccag aacctgcaga accaccggat 4560 cgtgcagatc gaggccaagc ccaacaccct ggtgctgccc aaacacgccg acgccgacaa 4620 catcctcgtg atccagcagg gccaggccac cgtgacagtg gccaacggca acaacagaaa 4680 gagcttcaac ctggacgagg gccacgccct gagaatcccc agcggcttca tcagctacat 4740 cctgaacaga cacgacaatc agaacctgag ggtggccaag atcagcatgc ccgtgaacac 4800 ccctggccag ttcgaggact tcttccccgc atcctcccgg gaccagagca gctacctgca 4860 gggcttcagc cggaataccc tggaagccgc cttcaacgcc gagttcaacg agatcagacg 4920 ggtgctgctg gaagagaacg ctggcggaga gcaggaagaa cggggccaga gaagatggtc 4980 caccagaagc agcgagaaca acgagggcgt gatcgtgaag gtgtccaaag aacacgtgga 5040 agaactgacc aagcacgcca agagcgtgtc caagaagggc tccgaggaag agggggacat 5100 caccaacccc atcaatctga gagagggcga gcccgacctg agcaacaact tcggcaagct 5160 cgacgctatc aacatcttca acgtggagaa gtacggtgct gtcggagacg ggaagcacga 5220 ctgcaccgaa gccttttcta cagcctggca agctgcctgc aagaatccct cagccatgct 5280 cctcgtgcct gggtctaaga agtttgtcgt gaataacctt ttcttcaatg gaccctgcca 5340 gccacacttt accttcaaag ttgatgggat catcgcagcc tatcagaacc cagctagctg 5400 gaagaacaat cggatctggt tgcagtttgc caaactgaca ggattcaccc tgatggggaa 5460 aggegtgatc gacggacagg gcaaacagtg gtgggcaggg cagtgcaagt gggtcaatgg 5520 tagggagatt tgcaatgaca gggaccgtcc taccgctatc aagtttgatt tcagcacagg 5580 actgattatt caggggttga agctgatgaa tagtccagag tttcaccttg tgtttggcaa 5640 ttgtgaaggt gtgaagatca taggcattag cattacagca cctcgcgatt ctcccaatac 5700 ggacggcatt gacatcttcg cctccaagaa ctttcacctg caaaagaata ccattggcac 5760 aggcgacgac tgcgtggcca ttggcactgg cagcagcaat atcgttatcg aagatttgat 5820 atgtggtcct gggcatggca taagcattgg aagcctgggt agagaaaact caagagctga 5880 agtcagctat gttcacgtta acggagcgaa gttcattgat acccagaacg gactgcgaat 5940 caaaacttgg caagggggaa gtggcatggc atctcacatc atctacgaga acgtcgagat 6000 gatcaattcc gagaacccca tactgattaa ccaattctat tgtacttccg cctctgcctg 6060 ccagaatcag agatcagccg tgcagattca ggacgtgaca tacaagaata tccgagggac 6120 gagcgctacc gctgccgcaa tacagctcaa atgttccgat agcatgccct gcaaagatat 6180 caagcttagt gatatctccc tcaaactgac tagcggaaag atagcgtcct gtctcaatga 6240 taacgcaaat ggctacttct cagggcatgt gatccctgca tgcaaaaacc ttagcccgag 6300 tgcgaaacgc aaagaatcca aatcccataa gcatccgaag actgtgatgg tcgagaacat 6360 gagagcctac gacaaaggga accggacgag gattctgctg ggctctcgac cgccaaactg 6420 taccaacaaa tgtcacggtt gttctccatg caaagctaaa ctggtgatag tgcatcgcat 6480 catgcctcaa gagtactatc cccagcgttg gatttgtagt tgccatggca agatctatca 6540 cccagaattc acgctgatcc ccatcgctgt gggtggtgcc ctggcggggc tggtcctcat 6600 cgtcctcatc gcctacctcg tcggcaggaa gaggagtcac gcaggctacc agactatcta 6660 gtaaggatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 6720 tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 6780 gtctctcact cggaaggaca taagggcggc cgctagc 6817

2. La secuencia de ácido nucleico de la región de codificación para la poliproteína de Ara H1 / H2/ H3:

SEQ ID NO:8

ccgcctaatg agcgggcttt tttttcttag ggtgcaaaag gagagcctgt aagcgggcac 60 tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa gggtatcatg gcggacgacc ggggttcgag 120 ccccgtatcc ggccgtccgc cgtgatccat gcggttaccg cccgcgtgtc gaacccaggt 180 gtgcgacgtc agacaacggg ggagtgctcc ttttggcttc cttccccttc ttccgcttcc 240 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 300 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 360 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 420 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 480 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 540 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 600 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 660 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 720 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 780 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 840 tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 900 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 960 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1020 acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1080 tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1140 agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1200 tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tcctgcaaac cacgttgtgg 1260 tagaattggt aaagagagtc gtgtaaaata tcgagttcgc acatcttgtt gtctgattat 1320 tgatttttgg cgaaaccatt tgatcatatg acaagatgtg tatctacctt aacttaatga 1380 ttttgataaa aatcattagg taccccggct ctagatggca tgacattaac ctataaaaat 1440 aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 1500 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 1560 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca 1620 tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta 1680 aggagaaaat accgcatcag attggctatt ggccattgca tacgttgtat ccatatcata 1740 atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc atgttgacat tgattattga 1800 ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 1860 gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 1920 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 1980 aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 2040 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 2100 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 2160 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 2220 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 2280 gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 2340 tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 2400 gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggct 2460 cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt 2520 cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt 2580 ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc 2640 agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctagttctc tcgttaactt 2700 aatgagacag atagaaactg gtcttgtaga aacagagtag tcgcctgctt ttctgccagg 2760 tgctgacttc tctcccctgg gcttttttct ttttctcagg ttgaaaagaa gaagacgaag 2820 aagacgaaga agacaaaccg tcgtcgacat ggcgccccgc agcgcccggc gacccctgct 2880 gctgctactg ctgttgctgc tgctcggcct catgcattgt gcgtcagcag caatgtttat 2940 ggtgaaaaat ggcaacggga ccgcgtgcat aatggccaac ttctctgctg ccttctcagt 3000 gaactacgac accaagagtg gccctaagaa catgaccctt gacctgccat cagatgccac 3060 agtggtgctc aaccgcagct cctgtggaaa agagaacact tctgacccca gtctcgtgat 3120 tgcttttgga agaggacata cactcactct caatttcacg agaaatgcaa cacgttacag 3180 cgttcagctc atgagttttg tttataactt gtcagacaca caccttttcc ccaatgcgag 3240 ctccaaagaa atcaagactg tggaatctat aactgacatc agggcagata tagataaaaa 3300 atacagatgt gttagtggca cccaggtcca catgaacaac gtgaccgtaa cgctccatga 3360 tgccaccatc caggcgtacc tttccaacag cagcttcagc aggggagaga cacgctgtga 3420 acaagacagg ccttccccaa ccacagcgcc ccctgcgcca cccagcccct cgccctcacc 3480 cgtgcccaag agcccctctg tggacaagta caacgtgagc ggcaccaacg ggacctgcct 3540 gctggccagc atggggctgc agctgaacct cacctatgag aggaaggaca acacgacggt 3600 gacaaggctt ctcaacatca accccaacaa gacctcggcc agcgggagct gcggcgccca 3660 cctggtgact ctggagctgc acagcgaggg caccaccgtc ctgctcttcc agttcgggat 3720 gaatgcaagt tctagccggt ttttcctaca aggaatccag ttgaatacaa ttcttcctga 3780 cgccagagac cctgccttta aagctgccaa cggctccctg cgagcgctgc aggccacagt 3840 cggcaattcc tacaagtgca acgcggagga gcacgtccgt gtcacgaagg cgttttcagt 3900 caatatattc aaagtgtggg tccaggcttt caaggtggaa ggtggccagt ttggctctgt 3960 ggaggagtgt ctgctggacg agaacagcct cgagaagtcc agcccctacc agaagaaaac 4020 cgagaacccc tgcgcccagc ggtgcctgca gtcttgtcag caggaacccg acgacctgaa 4080 gcagaaggcc tgcgagagcc ggtgcaccaa gctggaatac gaccccagat gcgtgtacga 4140 ccctagaggc cacaccggca ccaccaacca gagaagccct ccaggcgagc ggaccagagg 4200 cagacagcct ggcgactacg acgacgacag acggcagccc agaagagaag agggcggcag 4260 atggggaeet gccggcccta gagagagaga acgcgaggaa gattggagac agcccagaga 4320 ggactggcgg aggccttctc accagcagcc ccggaagatc agacccgagg gcagagaagg 4380 cgagcaggaa tggggcacac ctggctctca cgtgcgcgag gaaaccagcc ggaacaaccc 4440 cttctacttc ccctcccggc ggttcagcac cagatacggc aaccagaacg gccggatcag 4500 agtgctgcag agattcgacc agcggagccg gcagttccag aacctgcaga accaccggat 4560 cgtgcagatc gaggccaagc ccaacaccct ggtgctgccc aaacacgccg acgccgacaa 4620 catcctcgtg atccagcagg gccaggccac cgtgacagtg gccaacggca acaacagaaa 4680 gagcttcaac ctggacgagg gccacgccct gagaatcccc agcggcttca tcagctacat 4740 cctgaacaga cacgacaatc agaacctgag ggtggccaag atcagcatgc ccgtgaacac 4800 ccctggccag ttcgaggact tcttccccgc atcctcccgg gaccagagca gctacctgca 4860 gggcttcagc cggaataccc tggaagccgc cttcaacgcc gagttcaacg agatcagacg 4920 ggtgctgctg gaagagaacg ctggcggaga gcaggaagaa cggggccaga gaagatggtc 4980 caccagaagc agcgagaaca acgagggcgt gatcgtgaag gtgtccaaag aacacgtgga 5040 agaactgacc aagcacgcca agagcgtgtc caagaagggc tccgaggaag agggggacat 5100 caccaacccc atcaatctga gagagggcga gcccgacctg agcaacaact tcggcaagct 5160 gttcgaagtg aagcccgaca agaagaaccc ccagctgcag gacctggaca tgatgctgac 5220 ctgcgtggaa atcaaagagg gggccctgat gctgccacac ttcaactcca aagccatggt 5280 catcgtggtc gtgaacaagg gcaccggcaa cctggaactg gtggccgtgc ggaaagagca 5340 gcagcagaga ggccgcagag aggaagaaga ggacgaggac gaagaagaag agggatccaa 5400 ccgggaagtg cggcggtaca ccgccagact gaaagaaggc gacgtgttca tcatgcctgc 5460 cgcccacccc gtggccatca atgcctctag cgagctgcat ctgctgggct tcggcattaa 5520 cgccgagaac aatcaccgga tctttctggc cggcgacaaa gacaacgtga tcgaccagat 5580 cgagaagcag gccaaggacc tggcctttcc cggctctggc gaacaagtgg aaaagctgat 5640 caagaaccag aaagaaagcc acttcgtgtc cgccagaccc cagagccagt ctcagagccc 5700 tagctccccc gagaaagagt ctcctgagaa agaggaccag gaagaggaaa accagggcgg 5760 caagggccct ctgctgagca tcctgaaggc cttcaatggc ggcggaggca ggcagcagtg 5820 ggaactgcag ggcgacagaa gatgccagtc ccagctggaa cgggccaacc tgaggccttg 5880 cgagcagcac ctgatgcaga aaatccagcg cgacgaggac agctacggcc gggatcctta 5940 cagccccagc caggaccctt actcccctag ccaggatccc gacagaaggg acccctacag 6000 ccctagcccc tacgatagaa gaggcgccgg aagcagccag caccaggaaa gatgctgcaa 6060 cgagctgaac gagtttgaga acaaccagcg ctgcatgtgc gaggccctgc agcagatcat 6120 ggaaaatcag agcgaccggc tgcagggacg gcagcaggaa cagcagttca agagagagct 6180 gcggaacctg ccccagcagt gtggactgag agccccccag agatgcgacc tggaagtgga 6240 aagcggcggc agagatcggt acggcggagg gggcgtgacc ttcagacagg gcggagaaga 6300 gaatgagtgc cagtttcagc ggctgaacgc ccagaggccc gacaacagaa tcgagagcga 6360 gggcggctac atcgagacat ggaaccccaa caaccaggaa tttcagtgcg ctggggtggc 6420 cctgagcagg accgtgctga gaagaaatgc cctgaggcgg cccttctaca gcaacgcccc 6480 cctggaaatc tacgtgcagc agggcagcgg ctacttcggc ctgatctttc ccggatgccc 6540 ctccacctat gaggaacccg ctcaggaagg cagacggtat cagagccaga agcctagcag 6600 acggttccaa gtgggccagg acgatcccag ccaacagcag caggactctc accagaaggt 6660 gcaccgcttc gacgagggcg acctgatcgc tgtgccaacc ggcgtggcct tctggatgta 6720 caacgacgag gataccgacg tcgtgaccgt gaccctgagc gacaccagct ccatccacaa 6780 ccagctggac cagttcccca ggcggtttta cctggccggc aatcaggaac aggaatttct 6840 gagataccag cagcagcagg gctccagacc ccactacaga cagatcagcc ctagagtgcg 6900 gggcgacgaa caggaaaatg agggcagcaa catcttctcc ggctttgccc aggaatttct 6960 gcagcacgcc ttccaggtgg accggcagac cgtggaaaac ctgagaggcg agaacgagag 7020 agaggaacag ggcgccatcg tgactgtgaa gggcggcctg aggatcctga gccccgacga 7080 agaggatgag tcctctagaa gcccccccaa ccgccgggaa gagttcgatg aggaccgcag 7140 cagacctcag cagcggggga agtacgacga gaacaggcgg ggctacaaga acggcatcga 7200 ggaaacaatc tgcagcgcca gcgtgaagaa gaatctgggc cggtccagca accccgacat 7260 ctacaatcca caggccggca gcctgcggag cgtgaacgaa ctggatctgc ccatcctggg 7320 atggctgggc ctgtctgccc agcacggcac catctaccgg aacgccatgt tcgtgcctca 7380 ctacaccctg aatgcccaca ccatcgtggt ggctctgaac ggccgcgccc acgtccaagt 7440 ggtggacagc aacggcaatc gggtgtacga tgaagaactg caggaaggac acgtcctggt 7500 ggtgccccag aattttgccg tggccgccaa ggcccagtcc gagaactatg agtatctggc 7560 cttcaagacc gacagccggc cctctatcgc caatcaagcc ggcgagaaca gcatcatcga 7620 caacctgccc gaggaagtgg tggccaacag ctaccggctg cctagagagc aggcccggca 7680 gctgaagaac aacaaccctt tcaagttctt cgtgccccca ttcgaccacc agagcatgag 7740 agaggtggcc gaattcacgc tgatccccat cgctgtgggt ggtgccctgg cggggctggt 7800 cctcatcgtc ctcatcgcct acctcgtcgg caggaagagg agtcacgcag gctaccagac 7860 tatctagtaa ggatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg 7920 agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt 7980 ttttgtgtct ctcactcgga aggacataag ggcggccgct age 8023

2. La secuencia de aminoácidos de la región de codificación para el constructo quimérico de poliproteínas de Ara H1 / H2 / H3 es la siguiente:

SEQ ID NO:9 - AraH-LAMP

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)..(27)

<220>

<221> N-LAMP

<222> (28)..(380)

<220>

<221> AraH1

<222> (383)..(983)

<220>

<221> AraH2

<222> (988)..(1138)

<220>

<221> AraH3

<222> (1143)..(1634)

<220>

<221> TM/CYTO

<222> (1637)..(1672)

<400> 7

M e t A la Pro A rg Ser A la A rg A rg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15

Leu Leu Leu G ly Leu M e t H is Cys A la Ser A la A la M e t Phe M e t V a l 20 25 30

Lys A sn G ly A sn G ly T h r A la Cys lie M e t A la A sn Phe Ser A la A la 35 40 45

Phe Ser V a l A sn T y r A sp T h r Lys Ser G ly Pro Lys A sn M e t T h r Leu 50 55 60

Asp Leu Pro Ser Asp A la T h r V a l V a l Leu A sn A rg Ser Ser Cys G ly 65 70 75 80

Lys G lu A sn T h r Ser A sp Pro Ser Leu V a l lie A la Phe G ly A rg G ly

85 90 95

H is T h r Leu T h r Leu A sn Phe T h r A rg A sn A la T h r A rg T y r Ser V a l 100 105 110

G ln Leu M e t Ser Phe V a l T y r A sn Leu Ser Asp T h r H is Leu Phe Pro 115 120 125

A sn A la Ser Ser Lys G lu lie Lys T h r V a l G lu Ser lie T h r Asp lie 130 135 140

A rg A la A sp lie Asp Lys Lys T y r A rg Cys V a l Ser G ly T h r G ln V a l 145 150 155 160

H is M e t A sn A sn V a l T h r V a l T h r Leu H is Asp A la T h r lie G ln A la

165 170 175

T y r Leu Ser A sn Ser Ser Phe Ser A rg G ly G lu T h r A rg Cys G lu G ln 180 185 190

Asp A rg Pro Ser Pro T h r T h r A la Pro Pro A la Pro Pro Ser Pro Ser 195 200 205

Pro Ser Pro V a l Pro Lys Ser Pro Ser V a l Asp Lys T y r A sn V a l Ser 210 215 220

G ly Thr Asn G ly Th r Cys Leu Leu A la Ser M et G ly Leu G ln Leu Asn 225 230 235 240

Leu Thr T y r G lu A rg Lys Asp Asn Thr T h r V a l Thr A rg Leu Leu Asn

245 250 255

lie Asn Pro Asn Lys Th r Ser A la Ser G ly Ser Cys G ly A la H is Leu 260 265 270

V a l Thr Leu G lu Leu H is Ser G lu G ly Th r Thr V a l Leu Leu Phe G ln 275 280 285

Phe G ly M e t A sn A la Ser Ser Ser A rg Phe Phe Leu G ln G ly lie G ln 290 295 300

Leu Asn Thr lie Leu Pro Asp A la A rg Asp Pro A la Phe Lys A la A la 305 310 315 320

Asn G ly Ser Leu A rg A la Leu G ln A la Th r V a l G ly Asn Ser T y r Lys

325 330 335

Cys Asn A la G lu G lu H is V a l A rg V a l Th r Lys A la Phe Ser V a l Asn 340 345 350

lie Phe Lys V a l Trp V a l G ln A la Phe Lys V a l G lu G ly G ly G ln Phe 355 360 365

G ly Ser V a l G lu G lu Cys Leu Leu Asp G lu Asn Ser Leu G lu Lys Ser 370 375 380

Ser Pro T y r G ln Lys Lys Th r G lu Asn Pro Cys A la G ln A rg Cys Leu 385 390 395 400

Gln Ser Cys G ln G ln G lu Pro Asp Asp Leu Lys G ln Lys A la Cys Glu

405 410 415

Ser A rg Cys Thr Lys Leu G lu Tyr Asp Pro A rg Cys V a l Tyr Asp Pro 420 425 430

A rg G ly His Thr G ly Thr Thr Asn G ln A rg Ser Pro Pro G ly G lu A rg 435 440 445

Thr A rg G ly A rg G ln Pro G ly Asp Tyr Asp Asp Asp A rg A rg G ln Pro 450 455 460

A rg A rg G lu G lu G ly G ly A rg Trp G ly Pro A la G ly Pro A rg G lu A rg 465 470 475 480

Glu A rg G lu G lu Asp Trp A rg G ln Pro A rg G lu Asp Trp A rg A rg Pro

485 490 495

Ser His G ln G ln Pro A rg Lys lie A rg Pro G lu G ly A rg Glu G ly Glu 500 505 510

Gln G lu Trp G ly Thr Pro G ly Ser H is V a l A rg G lu G lu Thr Ser A rg 515 520 525

Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Pro Ser A rg A rg Phe Ser Thr A rg T yr G ly 530 535 540

Asn G ln Asn G ly A rg lie A rg V a l Leu G ln A rg Phe Asp G ln A rg Ser 545 550 555 560

A rg G ln Phe G ln Asn Leu G ln Asn His A rg lie V a l G ln lie G lu A la

565 570 575

Lys Pro Asn Th r Leu V a l Leu Pro Lys H is A la Asp A la Asp A sn lie 580 585 590

Leu V a l lie G ln G ln G ly G ln A la T h r V a l T h r V a l A la A sn G ly A sn 595 600 605

A sn A rg Lys Ser Phe A sn Leu Asp G lu G ly H is A la Leu A rg lie Pro 610 615 620

Ser G ly Phe lie Ser T y r l ie Leu A sn A rg H is Asp A sn G ln A sn Leu 625 630 635 640

A rg V a l A la Lys lie Ser M e t Pro V a l Asn T h r Pro G ly G ln Phe G lu 645 650 655

Asp Phe Phe Pro A la Ser Ser A rg Asp G ln Ser Ser T y r Leu G ln G ly 660 665 670

Phe Ser A rg A sn T h r Leu G lu A la A la Phe A sn A la G lu Phe Asn G lu 675 680 685

lie A rg A rg V a l Leu Leu G lu G lu A sn A la G ly G ly G lu G ln G lu G lu 690 695 700

A rg G ly G ln A rg A rg T rp Ser T h r A rg Ser Ser G lu A sn A sn G lu G ly 705 710 715 720

V a l lie V a l Lys V a l Ser Lys G lu H is V a l G lu G lu Leu Th r Lys H is 725 730 735

A la Lys Ser V a l Ser Lys Lys G ly Ser G lu G lu G lu G ly Asp lie Th r 740 745 750

A sn Pro lie Asn Leu A rg G lu G ly G lu Pro Asp Leu Ser Asn A sn Phe 755 760 765

G ly Lys Leu Phe G lu V a l Lys Pro Asp Lys Lys A sn Pro G ln Leu G ln 770 775 780

Asp Leu Asp M e t M e t Leu T h r Cys V a l G lu lie Lys G lu G ly A la Leu 785 790 795 800

M e t Leu Pro H is Phe A sn Ser Lys A la M e t V a l l ie V a l V a l V a l A sn 805 810 815

Lys G ly T h r G ly A sn Leu G lu Leu V a l A la V a l A rg Lys G lu G ln G ln 820 825 830

G ln A rg G ly A rg A rg G lu G lu G lu G lu A sp G lu A sp G lu G lu G lu G lu 835 840 845

G ly Ser A sn A rg G lu V a l A rg A rg T y r T h r A la A rg Leu Lys G lu G ly 850 855 860

Asp V a l Phe lie M e t Pro A la A la H is Pro V a l A la l ie A sn A la Ser 865 870 875 880

Ser G lu Leu H is Leu Leu G ly Phe G ly lie A sn A la G lu A sn A sn H is 885 890 895

A rg lie Phe Leu A la G ly A sp Lys A sp A sn V a l l ie Asp G ln lie G lu 900 905 910

Lys G ln A la Lys Asp Leu A la Phe Pro G ly Ser G ly G lu G ln V a l G lu 915 920 925

Lys Leu lie Lys A sn G ln Lys G lu Ser H is Phe V a l Ser A la A rg Pro 930 935 940

G ln Ser G ln Ser G ln Ser Pro Ser Ser Pro G lu Lys G lu Ser Pro G lu 945 950 955 960

Lys G lu Asp G ln G lu G lu G lu A sn G ln G ly G ly Lys G ly Pro Leu Leu 965 970 975

Ser l ie Leu Lys A la Phe A sn G ly G ly G ly G ly A rg G ln G ln T rp G lu 980 985 990

Leu G ln G ly Asp A rg A rg Cys G ln Ser G ln Leu G lu A rg A la A sn Leu 995 1000 1005

A rg Pro Cys G lu G ln H is Leu M e t G ln Lys lie G ln A rg Asp G lu 1010 1015 1020

Asp Ser T y r G ly A rg Asp Pro T y r Ser Pro Ser G ln Asp Pro T y r 1025 1030 1035

Ser Pro Ser G ln Asp Pro Asp A rg A rg Asp Pro T y r Ser Pro Ser 1040 1045 1050

Pro T y r Asp A rg A rg G ly A la G ly Ser Ser G ln H is G ln G lu A rg 1055 1060 1065

Cys Cys A sn G lu Leu A sn G lu Phe G lu A sn A sn G ln A rg Cys M et 1070 1075 1080

Cys G lu A la Leu G ln G ln lie M e t G lu A sn G ln Ser Asp A rg Leu 1085 1090 1095

G ln G ly A rg G ln G ln G lu G ln G ln Phe Lys A rg G lu Leu A rg A sn 1100 1105 1110

Leu Pro G ln G ln Cys G ly Leu A rg A la Pro G ln A rg Cys Asp Leu 1115 1120 1125

G lu V a l G lu Ser

1130 1135 1140

T h r Phe

1145 1150 1155

Leu Asn A la G ln A rg Pro Asp

1160 1165 1170

T y r lie G lu T h r Trp Asn Pro Asn A sn G ln G lu Phe G ln Cys A la 1175 1180 1185

G ly V a l A la Leu Ser A rg T h r V a l Leu A rg A rg A sn A la Leu A rg 1190 1195 1200

A rg Pro Phe T y r Ser A sn A la Pro Leu G lu lie T y r V a l G ln G ln 1205 1210 1215

G ly Ser G ly T y r Phe G ly Leu lie Phe Pro G ly Cys Pro Ser Th r 1220 1225 1230

T y r G lu G lu Pro A la G ln G lu G ly A rg A rg T y r G ln Ser G ln Lys 1235 1240 1245

Pro Ser A rg A rg Phe G ln V a l G ly G ln Asp Asp Pro Ser G ln G ln 1250 1255 1260

G ln G ln Asp Ser H is G ln Lys V a l H is A rg Phe Asp G lu G ly Asp 1265 1270 1275

Leu lie A la V a l Pro Th r G ly V a l A la Phe Trp M e t T y r A sn Asp 1280 1285 1290

G lu A sp T h r A sp V a l V a l T h r V a l T h r L e u Ser A sp T h r Ser Ser 1295 1300 1305

l ie H is A s n G ln Leu A sp G ln Phe Pro A rg A rg Phe T y r Le u A la 1310 1315 1320

G ly A s n G ln G lu G ln G lu Phe Leu A rg T y r G ln G ln G ln G ln G ly 1325 1330 1335

Ser A rg Pro H is T y r A rg G ln l ie Ser Pro A rg V a l A rg G ly A sp 1340 1345 1350

G lu G ln G lu A sn G lu G ly Ser A s n l ie Phe Ser G ly Phe A la G ln 1355 1360 1365

G lu Phe Leu G ln H is A la Phe G ln V a l A sp A rg G ln T h r V a l G lu 1370 1375 1380

A sn Le u A rg G ly G lu A sn G lu A rg G lu G lu G ln G ly A la l ie V a l 1385 1390 1395

T h r V a l Lys G ly G ly Le u A rg l ie Le u Ser Pro A sp G lu G lu A sp 1400 1405 1410

G lu Ser Ser A rg Ser Pro Pro A sn A rg A rg G lu G lu Phe A sp G lu 1415 1420 1425

A sp A rg Ser A rg Pro G ln G ln A rg G ly L ys T y r A sp G lu A s n A rg 1430 1435 1440

A rg G ly T y r Lys A s n G ly l ie G lu G lu T h r l ie Cys Ser A la Ser 1445 1450 1455

V a l L ys Lys A s n Le u G ly A rg Ser Ser A s n Pro A sp l ie T y r A sn 1460 1465 1470

Pro G ln A la G ly Ser Leu A rg Ser V a l Asn G lu Leu Asp Leu Pro 1475 1480 1485

lie Leu G ly Trp Leu G ly Leu Ser A la G ln H is G ly Thr lie T yr 1490 1495 1500

A rg Asn A la M et Phe V a l Pro H is T yr Thr Leu Asn A la His Thr 1505 1510 1515

lie V a l V a l A la Leu Asn G ly A rg A la H is V a l G ln V a l V a l Asp 1520 1525 1530

Ser Asn G ly Asn A rg V a l T y r Asp G lu G lu Leu G ln G lu G ly His 1535 1540 1545

V a l Leu V a l V a l Pro G ln Asn Phe A la V a l A la A la L y s A la G ln 1550 1555 1560

Ser G lu Asn T y r G lu T y r Leu A la Phe Lys Thr Asp Ser A rg Pro 1565 1570 1575

Ser lie A la Asn G ln A la G ly G lu Asn Ser lie lie Asp Asn Leu 1580 1585 1590

Pro G lu G lu V a l V a l A la Asn Ser T yr A rg Leu Pro A rg G lu G ln 1595 1600 1605

A la A rg G ln Leu Lys Asn Asn Asn Pro Phe Lys Phe Phe V a l Pro 1610 1615 1620

Pro Phe Asp His G ln Ser M et A rg G lu V a l A la G lu Phe Thr Leu 1625 1630 1635

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica para su uso en el tratamiento de alergias, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene los siguientes elementos fusionados en el marco ('in-frame') en orden secuencial:

una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señal;

una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio luminal de una proteína de membrana asociada a lisosomas (o LAMP) humana;

una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína alergénica, de manera que la secuencia de ácido nucleico no incluye una secuencia de señal natural de la proteína alergénica;

una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio transmembrana -o dominio transmembranal- de una LAMP humana; y

una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización -o dominio de direccionamiento- de una LAMP humana,

de manera que la LAMP humana se selecciona del siguiente grupo: LAMP-1 humana, LAMP-2 humana, CD63/LAMP-3 humana o DC-LAMP humana.

2. La molécula de ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, de manera que la proteína alergénica contiene al menos un alérgeno que se selecciona de:

i) un grupo que incluye a Cry J1 y Cry J2; o

ii) una poliproteína alergénica del cacahuete AraH1/AraH2/AraH3.

3. La molécula de ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, de manera que:

i) la proteína quimérica es una CRY J1-LAMP quimérica, de manera que la proteína quimérica se compone de una secuencia de aminoácidos

que es idéntica al menos en un 90% a SEQ ID NO: 5;

que es idéntica al menos en un 95% a SEQ ID NO: 5;

que es idéntica al menos en un 98% a SEQ ID NO: 5;

que es idéntica al menos en un 99% a SEQ ID NO: 5; o

que se compone de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

ii) la proteína quimérica es una CRY J2-LAMP quimérica, de manera que la proteína quimérica se compone de una secuencia de aminoácidos

que es idéntica al menos en un 90% a SEQ ID NO: 3;

que es idéntica al menos en un 95% a SEQ ID NO: 3;

que es idéntica al menos en un 98% a SEQ ID NO: 3;

que es idéntica al menos en un 99% a SEQ ID NO: 3; o

que se compone de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; o

iii) la proteína quimérica es una AraH-LAMP quimérica, de manera que la proteína quimérica se compone de una secuencia de aminoácidos

que es idéntica al menos en un 90% a SEQ ID NO: 9;

que es idéntica al menos en un 95% a SEQ ID NO: 9;

que es idéntica al menos en un 98% a SEQ ID NO: 9;

que es idéntica al menos en un 99% a SEQ ID NO: 9; o

que se compone de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

4. La molécula de ácido nucleico para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene ADN.

5. Un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en el tratamiento de alergias.

6. Una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en el tratamiento de alergias, de manera que opcionalmente contiene un portador farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de alergias.

8. Una vacuna de ácido nucleico que contiene la composición farmacéutica de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de alergias.

9. Una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2i), la reivindicación 3i) o la reivindicación 3ii) para su uso en el tratamiento de las alergias al polen, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene ADN y de manera que, opcionalmente, la composición farmacéutica contiene un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Una vacuna de ácido nucleico que contiene una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2i), la reivindicación 3i) o la reivindicación 3ii) para su uso en el tratamiento de alergias, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene ADN y de manera que, opcionalmente, la composición farmacéutica contiene un portador farmacéuticamente aceptable.

11. La vacuna de ácido nucleico de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de las alergias al polen.

12. Una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2ii) o la reivindicación 3iii) para su uso en el tratamiento de las alergias al cacahuete, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene ADN y de manera que, opcionalmente, la composición farmacéutica contiene un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Una vacuna de ácido nucleico que contiene una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2ii) o la reivindicación 3iii) para su uso en el tratamiento de alergias, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene ADN y de manera que, opcionalmente, la composición farmacéutica contiene un portador farmacéuticamente aceptable.

14. La vacuna de ácido nucleico de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de las alergias al cacahuete.

15. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que contiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

16. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15, de manera que la molécula de ácido nucleico contiene ADN.

17. Un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16.

18. Una composición farmacéutica que contiene un vector de expresión que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 y un portador farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18 para su uso en el tratamiento de las alergias al cacahuete.