BRPI0712421B1 - Proteína de fusão hipoalergênica derivada de phl p 5 - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA HIPOALERGÊNICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, HOSPEDEIRO, ANTICORPO, FORMULAÇÃO DE VACINA, USOS DE UMA PROTEÍNA HIPOALERGÊNICA, DE UM COMPLEXO HIPOALERGÊNICO E DE UMA PROTEÍNA DE CAPSÍDEO VIRAL DE UM VÍRUS DA FAMÍLIA DE PICORNAVIRIDAE, MOLÉCULA HIPOALERGÊNICA, E, USO DE UMA MOLÉCULA HIPOALERGÊNICA, UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, UM VETOR OU UM ANTICORPO A presente invenção diz respeito a uma proteína hipoalergênica que consiste de pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno, que é fundido ou conjugado a pelo menos uma segunda proteína não alergênica ou fragmento desta.

Description

[001] A presente invenção diz respeito a novas moléculas hipoalergênicas e usos destas.

[002] A alergia do tipo I é uma doença de hipersensibilidade mediada por IgE que afeta quase 25 % da população. Isto é fundamentado na re-cognição de antígenos de inseto, veneno, alergeno de alimentos e alergeno de contato de transportados pelo ar nocivos derivados de contes de antígenos nocivas per se, tais como pólen, insetos, bolor e proteínas animais pela imunoglobulina E específica. A reticulação de anticorpos de IgE ligados por células atuadoras leva a uma liberação de mediadores inflamatórios (por exemplo, histamina, leucotrienos) e, desta maneira aos sintomas imediatos de alergia (por exemplo, rinoconjuntivite, asma, dermatite, anafilaxia). A ativação de célula T por intermédio de mecanismo dependentes de IgE bem como independentes de IgE contribui com a inflamação alérgica crônica.

[003] Provavelmente, as únicas formas causativas de tratamento de alergia é a imunoterapia específica de alergeno, que está fundamentada na administração repetida de quantidades crescentes de extratos de alergeno para a maioria das fontes. Numerosos estudos clínicos documentaram a eficácia clínica da imunoterapia de injeção e existe evidência de diversos mecanismos imunológicos básicos deste tratamento. Devido à dificuldade de preparar extratos de alergeno de alta qualidade de certas fontes de alergeno e o fato de que a administração de alergenos a pacientes pode causar efeitos colaterais graves, a imunoterapia específica de alergeno pode ser apenas recomendada para certos grupos de pacientes e manifestações de doenças. É especialmente difícil tratar pacientes com co-sensibilizações a diversas fontes de alergeno diferentes e pacientes que sofrem de manifestações de doença graves, tais como asma alérgico. A asma alérgica é uma das manifestações mais vigorosas de alergia, porque esta afeta gravemente a qualidade de vida diária, causa uma taxa alta de admissões de hospitalidade e pode manifestar, por si só em formas ameaçadoras de vida sérias que requerem cuidado intensivo do paciente.

[004] Os extratos de alergeno preparados a partir de fontes naturais são brutos por natureza e é impossível de influenciar a qualidade e as quantidades de alergenos individuais em tais preparações por meios técnicos. Estes também contêm numerosos compostos não alergênicos indefinidos e diversos estudos recentes indicam a qualidade fraca de tais extratos e documenta sua heterogeneidade grande.

[005] Na última década, grande progresso foi feito no campo da caracterização de alergeno molecular usando-se a tecnologia de DNA recombinante. Um grande número dos alergenos que evocam doença importantes foram caracterizados abaixo do nível molecular e alergenos recombinantes que imitam a complexidade de epítopo de extratos de alergeno naturais foram produzidos. Além disso, diversos grupos de pesquisa usaram o conhecimento com respeito às estruturas de alergeno para o desenvolvimento de vacinas alérgicas novas definidas. Engenharia genética, química peptídeo sintética e conjugação de alergenos com seqüências de DNA imunoestimuladoras foram usadas para a redução da atividade alergênica das novas vacinas e, desta maneira, da taxa de efeitos colaterais induzidos por terapia. Os primeiros estudos clínicos promissores foram conduzidos com tais derivados de alergeno. Interessantemente, é dito que embora a reatividade de IgE de alergenos recombinantes geneticamente projetados e peptídeos contendo epítopo de célula T sintético derivado de alergeno possa ser fortemente reduzida ou ainda abolida, estes derivados ainda podem induzir efeitos colaterais sistêmicos que aparecem várias horas após a injeção. Por exemplo, foi relatado que os peptídeos de epítopo de célula T do alergeno de gato principal, Fel d 1, asma induzido e hiperreatividade brônquica diversas horas após a injeção intracutânea e existe evidência forte de que este efeito é mediado pela célula T e restrito por MHC.

[006] Este resultado indica que a remoção da reatividade de IgE diminui os efeitos colaterais mediados por IgE visto que nenhuma reação imediata foi registrada no curso destes estudos de imunoterapia. Entretanto, os epítopos de célula T específicos de alergeno que foram preservados nos derivados de alergeno recombinantes bem como nas misturas de peptídeo são responsáveis pelos efeitos colaterais tardios (por exemplo, dermatite muito problemática ou atópica, manifestação de pele alérgica mediada por célula T crônica). Os efeitos colaterais causados no caso de derivados de alergeno recombinantes foram relativamente brandos no caso das vacinas de peptídeo de célula T puderem ser superadas pela dosagem adequada. Ambos os dois novos métodos, portanto, parecem muito promissores para a imunoterapia de rinoconjuntivite alérgica mas pode ter limitações quando ocorre o tratamento de diversas formas de asma alérgico, onde a indução de efeitos colaterais tardios no pulmão pode ser muito problemática.

[007] A fim de administrar e conseqüentemente provocar uma resposta imune eficiente contra peptídeos, polipeptídeos e proteínas, adjuvantes e/ou carreadores são regularmente usados. O adjuvante de Freund completo, por exemplo, é um dos adjuvantes mais potentes disponíveis. Entretanto, por causa de seus efeitos colaterais, seu uso não é aprovado para seres humanos. Portanto, existe uma necessidade de composições de vacina capazes de induzir respostas imunes fortes contra peptídeos e polipeptídeos derivados de alergenos e, é claro, de outros antígenos que evitam o uso do adjuvante de Freund completo. Além disso, enquanto o BSA foi usado de maneira bem sucedida como um carreador em modelos animais este pode não ser apropriado para o uso em composições de vacina humana por causa do risco de reações adversas tal como o risco de transmissão de doença priônica (doença de Creutzfeldt-Jakob variante). Um outro desafio para o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra alergenos é a necessidade de uma resposta imune capaz de diminuir rapidamente os alergenos em um indivíduo ou animal. Portanto, altas concentrações de anticorpos específicos de alergeno no sangue, que são principalmente do subtipo IgG, são necessários. Nas superfícies de mucosa, os anticorpos IgA são o subtipo primário.

[008] A toxina da cólera, uma proteína carreadora conhecida na técnica, também é usada regularmente como um adjuvante, eliminando a necessidade do adjuvante de Freund completo em uma composição de vacina. Entretanto, a toxina da cólera aumenta os níveis de anticorpo IgE totais e específicos e leva a reações inflamatórias associadas com IgE.

[009] Devido aos efeitos colaterais provocados pela maioria das proteínas carreadoras usadas para a vacinação, existe uma necessidade quanto a sistemas carreadores que são capazes de estimular respostas imunes contra alergenos ou outros antígenos, sem usar adjuvantes tóxicos, sem usar proteínas carreadores deficientemente toleradas e, em certas situações, sem estímulo de respostas imunes potencialmente patológicas. Novos sistemas carreadores que encontram estas especificações podem ser usados com relação à informação de novos conjugados e composições adequadas para o tratamento ou prevenção de doenças como as doenças alérgicas.

[010] Em Bohle B. et al. (J. Immunol. 172 (11) (2004): 6642-6648) uma proteína de fusão recombinante que compreende uma proteína de camada S e a porção Bet v 1 é descrita. Esta molécula compreende a proteína Bet v 1 hiperalergênica natural.

[011] O WO 2004/004761 diz respeito a partículas semelhantes a vírus que são fundidos a um imunogênio e que podem ser usados para a imunização.

[012] No WO 2004/003143, o uso de proteínas de fusão que compreende uma partícula semelhante a vírus e uma molécula hiperalergênica como imunogênio para a vacinação é divulgado.

[013] É um objetivo da presente invenção fornecer medica- mentos e carreadores que superam as desvantagens mencionadas acima e permitem uma vacinação de alergeno com os efeitos colaterais reduzidos.

[014] Portanto, a presente invenção diz respeito a uma proteína hipoalergênica que consiste de pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno, que é fundido ou conjugado a pelo menos uma segunda proteína não alergênica ou fragmento desta.

[015] A fim de provocar uma resposta imune intensificada contra uma molécula, em particular de uma molécula hipoalergênica de acordo com a presente invenção, a dita molécula é fundida (por engenharia genética) ou conjugada (pelas reações químicas) a um carreador. Um carreador convencional e regularmente utilizado é, por exemplo, KLH (hemocianina de lapa buraco de fechadura). O KLH, que é isolado do molusco marinho gigante Megathura crenulata, é uma das proteínas carreadoras mais populares usados para criar um imunogênio para injeção. O KLH induz uma resposta de anticorpo forte por causa de sua massa grande por que esta não é uma proteína de mamífero.

[016] A segunda proteína (o "carreador" ou "proteína carreadora") a ser fundida ou conjugada a uma molécula hipoalergênica da invenção não é derivada de um alergeno ("não alergênica"). Entretanto, a proteína carreadora usada na presente invenção pode apresentar reatividade de célula T e/ou provocar uma resposta imune contra ela mesma e a molécula hipoalergênica fundida ou conjugada a esta quando administrado a um corpo animal ou humano. Conseqüentemente, se a proteína carreadora for derivada de um patogênio (por exemplo, vírus, bactérias, etc.), anticorpo (protetor) direcionado ao dito carreador e patogênios são produzidos.

[017] Como usado neste, "proteína hipoalergênico" significa uma proteína/polipeptídeo de fusão de um carreador de uma fonte não alergênica com uma molécula hipoalergênica. Além disso, uma "proteína hipoalergênica" também é pretendida ser um produto de conjugação (por exemplo, ligação química, adsorção) de um carreador com uma molécula hipoalergênica.

[018] "Hipoalergênico" como usado neste, refere-se a moléculas com potencial alergênico reduzido. Tais moléculas têm uma capacidade diminuída para provocar reações alérgicas em um indivíduo comparado com a proteína do tipo selvagem a partir das quais estas moléculas são derivadas.

[019] A pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno e fundida/conjugada a uma segunda proteína é preferivelmente truncado de terminal C e/ou N. A "truncação de terminal C e/ou N", como usado neste, significa que os resíduos de aminoácido do terminal N ou do terminal C ou ambos do terminal N e C do alergeno do tipo selvagem são removidos por anulação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30 resíduos de aminoácido.

[020] As moléculas hipoalergênicas, isto é, peptídeos/polipeptídeos, compreende preferivelmente de 10 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente de 15 a 40 aminoácidos, em particular, de 20 a 30 aminoácidos e apresentam reatividade IgE reduzida. Estas moléculas são designadas excluir os epítopos de célula T que podem causar efeitos colaterais mediadas pela célula T. Os epítopos e as moléculas de célula T que apresentam a resposta da célula T reduzida podem ser determinados e identificados pelos métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (por exemplo, Bercovici N. et al. Clin Diagn Lab Immunol. (2000) 7:859-864).

[021] Foi observado que é possível projetar vacinas de peptídeo derivadas de alergenos como os alergenos de pólen de grama principais, por exemplo, Phl p 1 e para o alergeno de pólen de bétula, Bet v 1, usando-se peptídeos expostos de superfície. Os dados obtidos mostram que tais vacinas de peptídeo podem ser produzidos para qualquer alergeno cuja estrutura primária é conhecida de acordo com o mapeamento de epítopo de IgE, os dados de estrutura tri-dimensional ou predição auxiliada por computador de domínios expostos por superfície. Entretanto, a seleção de peptídeos adequados que podem ser usados para a vacinação permanecer crucial, porque nem todos os peptídeos identificados com estes métodos podem ser utilizados na vacinação. Os peptídeos adequadamente usados para os propósitos de vacinação devem apresentar capacidade de ligação de IgE reduzida e - a fim de reduzir ou evitar os efeitos colaterais tardios - apresenta a reatividade de célula T reduzida.

[022] O termo "derivado de um alergeno", como usado neste, significa que as moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção são obtidos diretamente de um alergeno por fragmentação ou truncação. A seqüência de aminoácido das moléculas hipoalergênicas da presente invenção são preferivelmente pelo menos 80 % idênticos, mais preferivelmente pelo menos 90 % idênticos, mais preferivelmente pelo menos 95 % idênticos, em particular 100 % idênticos, para o estiramento da seqüência amino do alergeno do tipo selvagem, a partir do qual a molécula hipoalergênica é derivada. Entretanto, as moléculas que não são 100 % idênticos aos fragmentos de alergeno do tipo selvagem devem ser capazes de ligar-se com pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % de concentração para um anticorpo ou para anticorpos, preferivelmente a anticorpos de IgG, que são direcionados aos fragmentos de alergeno do tipo selvagem.

[023] Os graus de identidade de uma primeira seqüência de aminoácido a um segundo aminoácido pode ser determinado por uma comparação direta entre ambas as seqüências de aminoácido usando-se certos algoritmos. Tais algoritmos são, por exemplo, incorporados em vários programas de computador (por exemplo, "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-25; Corpet F, Nucl. Acids Res. (1988) 16:10881-10890).

[024] As moléculas truncadas de acordo com a presente invenção pode ser definida como as partes sendo do alergeno completo que induz a ativação menor de células T específicas de alergeno do que o alergeno do tipo selvagem completo (preferivelmente pelo menos a 30 %, mais preferivelmente pelo menos uma redução de 50 %, mais preferivelmente pelo menos uma de 70 %), apresenta uma atividade alergênica maior do que 50 % (preferivelmente maior do que 70 %) como avaliado por ensaios de ligação de IgE e a capacidade de induzir a ativação de célula mediada por IgE e quando ligado a um carreador como descrito induzir os anticorpos de IgG que apresenta a ligação de IgE policlonal de pacientes alérgicos ao alergeno do tipo selvagem completo.

[025] Os peptídeos devem conter seqüências dos alergenos para evitar sobreposições com os mimótopos. Os mimótopos, entretanto, que são imitações de peptídeo pequenas (menores do que 15 aminoácidos) de pedaços de antígenos e são obtidos de bibliotecas de peptídeo randômico não representam moléculas derivadas de alergeno originais como definido neste. Estes não podem ser suados de acordo com a invenção porque estes são muito pequenos para induzir uma resposta de IgG de bloqueio robusto.

[026] As moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção podem ser obtidas pelos métodos recombinantes ou síntese química. Alternativamente, é claro, também é possível obter as moléculas pela clivagem enzimática ou química do alergeno do tipo selvagem ou um polipeptídeo/proteína que abriga a molécula de interesse.

[027] A molécula hipoalergênica pode compreender preferivelmente pelo menos duas moléculas de alergeno truncadas derivadas de pelo menos um alergeno, em que a ordem dos fragmentos de alergeno truncados diferem da ordem dos fragmentos no alergeno do tipo selvagem se pelo menos as duas moléculas forem derivadas do mesmo alergeno.

[028] A molécula hipoalergênica de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais (preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3) moléculas hipoalergênicas como definido neste, desta maneira, resultando em uma proteína de fusão. As moléculas hipoalergênica simples da proteína de fusão que, é claro, também precisa da capacidade de ligação de IgE e precisa de epítopos de célula T, podem ser derivadas de alergenos da mesma origem e/ou diferente. Se as moléculas forem derivadas do mesmo alergeno, a ordem na proteína de fusão hipoalergênico não deve ser idêntica à ordem no alergeno do tipo selvagem (isto evita a reconstituição e a formação de locais de ligação) (ver, por exemplo, WO2004/065414, Linhart B and Valenta R (Int Arch Allergy Immunol. (2004) 134:324-31)).

[029] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a pelo menos uma molécula hipoalergênica é fundida ao terminal N e/ou terminal C da dita pelo menos uma segunda proteína ou fragmento desta.

[030] O alergeno ou os fragmentos deste podem ser conjugados quimicamente, por exemplo, ou pelos métodos recombinantes um ao outro. Se o alergeno ou fragmento deste for conjugado quimicamente a um carreador, o dito alergeno ou fragmento deve ser fornecido com um resíduo de cisteína terminal (resultando em um grupo sulfidrila livre). Ao dito resíduo de cisteína terminal, (terminal N ou C) qualquer proteína carreadora ativada por maleimida pode ser conjugada, desta maneira, criando um complexo de imunogênio/carreador. Se o alergeno ou fragmento deste não tiver um grupo sulfidrila em um terminal, química EDC (cloridreto de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida) a fim de ligar as aminas (lisina) ou ácidos carboxílicos (ácido glutâmico, aspártico ou 5’-fosfato) à proteína carreadora pode ser utilizada.

[031] Se a molécula hipoalergênica fundida ao terminal N ou C do carreador, métodos recombinantes são utilizados.

[032] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a pelo menos uma segunda proteína é um é uma proteína viral, em particular RNA ou DNA viral, bacteriana, fúngica ou de protozoário.

[033] A pelo menos uma segunda proteína ("carreador") pode ser de qualquer um da origem mencionada acima. Entretanto, em particular é preferido usar proteínas que provoquem uma resposta imune contra a proteína, por si só e a molécula hipoalergênica fundida ou conjugada a este. Devido à indução de formação de anticorpos (protetores) também direcionados a pelo menos uma segunda proteína, a proteína hipoalergênico de acordo com a presente invenção também pode ser utilizada como vacina para a dita segunda proteína e sua fonte de origem (por exemplo, vírus, bactérias, fungos). É claro, também é possível usar proteínas carreadoras bem conhecidas na técnica (por exemplo, KLH) pelo menos como a segunda proteína.

[034] A proteína viral de acordo com a presente invenção é, preferivelmente uma proteína de capsídeo.

[035] As proteínas de capsídeo virais são especialmente adaptadas porque estas induzem a atividade antiviral, provocam a formação de anticorpos com adesão de bloco de vírus, por exemplo, rinovírus, a células epiteliais, apresentam uma atividade imunomoduladora em torno de uma resposta de Th1, aumenta a imunogenicidade do peptídeo (isto é, antipeptídeo superior e em conseqüência, níveis superiores de anticorpos IgG protetores), são adaptados e experimentados para a vacinação profilática (vacinação viral) e são seguros, quando as proteínas de capsídeo são usadas aqueles seres humanos estão continuamente expostos (por exemplo, rinovírus).

[036] De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção a pelo menos uma proteína de capsídeo viral é derivada de um vírus patogênico humano, preferivelmente um vírus da família de picornaviridae.

[037] O vírus da família de picornaviridae é, preferivelmente do gênero de rinovírus, preferivelmente das espécies de rinovírus humanos, em particular, rinovírus humano 89 e 14. A proteína de capsídeo pode ser VP1, VP2, VP3 e/ou VP4.

[038] O alergeno a ser fundido a uma proteína de capsídeo viral é preferivelmente selecionado do grupo que consiste de alergenos de pólen de bétula principal, em particular Bet v 1 e Bet v 4, alergenos de pólen de capim-rabo-de-rato principal, em particular Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 e Phl p 7, alergenos de ácaro do pó doméstico, em particular Der p 1 e Der p 2, alergeno de gato principal Fel d 1, alergenos de abelha principais, alergenos de vespa principais, profilinas, especialmente Phl p 12 e alergenos de ácaro de armazenagem, especialmente Lep d 2.

[039] Outros alergenos adaptados a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser derivados da seguinte tabela. Referências 1 Marsh, D.G., and L.R. Freidhoff. 1992. ALBE, an alergen database. IUIS, Baltimore, MD, Edition 1.0. 2 Marsh, D. G. et al. 1986. Alergen nomenclature. Bull WHO 64:767-770. 3 King, T.P. et al. 1964. Biochemistry 3:458-468. 4 Lowenstein, H. 1980. Allergy 35:188-191. 5 Aukrust, L. 1980. Allergy 35:206-207. 6 Demerec, M. et al. 1966. Genetics 54:61-75. 7 Bodmer, J. G.et al. 1991. Immunogenetics 33:301-309 8 Griffith, I.J. et al. 1991. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96:296-304. 9 Roebber, M. et al. 1985. J. Immunol. 134:3062-3069. 10 Metzler, W. J. et al. 1992. Biochemistry 31:5117-5127. 11 Metzler, W. J. et al. 1992. Biochemistry 31:8697-8705. 12 Goodfriend, L. et al. 1979. Fed. Proc. 38:1415. 13 Ekramoddoullah, A. K. M. et al. 1982. Mol. Immunol. 19:1527- 1534. 14 Ansari, A. A. et al. 1987. J. Allergy Clin. 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[040] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a molécula hipoalergênica apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida.

[041] De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção a molécula hipoalergênica apresenta reatividade de célula reduzida.

[042] Entretanto, também, os fragmentos de alergeno que compreendem pelo menos um epítopo de célula T podem ser usados na proteína hipoalergênica de acordo com a presente invenção.

[043] "que apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida", como usado neste, significa que as moléculas de acordo com a presente invenção mostra capacidade ou atividade de ligação de IgE significantemente reduzida (pelo menos 50 % menos, preferivelmente pelo menos 70 % menos, mais preferivelmente pelo menos 80 % menos, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % menos, mais preferivelmente pelo menos 95 % menos, capacidade de ligação em comparação com o alergeno do tipo selvagem) ou ainda perda deste em todos.

[044] A atividade/capacidade de ligação de IgE de moléculas semelhantes a peptídeos e proteínas pode ser determinado por, por exemplo, um ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA) usando-se, por exemplo, soro obtido de um paciente, (isto é, um paciente alérgico) que foi previamente exposto ao alergeno do tipo selvagem. Resumidamente, um peptídeo a ser testado é revestido nos reservatórios de uma placa microtituladora. Após a lavagem e o bloqueio dos reservatórios, uma solução de anticorpo consistindo do plasma de um paciente alérgico, que foi exposto ao peptídeo sendo testado ou proteína a partir da qual este foi derivado, é incubada nos reservatórios. Um anticorpo secundário rotulado é adicionado aos reservatórios e incubado. a quantidade de ligação de IgE é então quantificada e comparada à quantidade de IgE ligado por um alergeno do tipo selvagem purificado.

[045] Alternativamente, a atividade de ligação de um peptídeo pode ser determinada pela análise de Western blot. Por exemplo, um peptídeo a ser testado é usado e um gel de poliacrilamida usando-se SDS- PAGE. O peptídeo é então transferido à nitrocelulose e subseqüentemente incubado com soro de um paciente alérgico. Após a incubação com o anticorpo secundário rotulado, a quantidade de IgE ligada é determinada e quantificada.

[046] Um outro ensaio que pode ser suado para determinar a ligação da atividade de IgE de um peptídeo é um ensaio ELISA de competição. Resumidamente, um grupo de anticorpo IgE é gerado pela combinação de plasma de pacientes alérgicos que mostraram, por ELISA direto, ser reativo ao IgE com alergeno do tipo selvagem. Este grupo é usado em ensaios de competição de ELISA para a comparação da ligação de IgE ao alergeno do tipo selvagem ao peptídeo testado. A ligação de IgE para o alergeno do tipo selvagem e o peptídeo sendo testado é determinada e quantificada.

[047] Um "epítopo de célula T" significa uma proteína (por exemplo, alergeno) ou fragmento desta, para que a célula T tenha um local de ligação específico, o resultado da ligação ao dito local de ligação à célula T. O termo "apresenta reatividade de célula T reduzida", como usado neste, refere- se à moléculas que apresentam reatividade de célula T que é significantemente reduzida em comparação com o estímulo reduzido em comparação com o estímulo induzido pelo alergeno do tipo selvagem, a partir do qual a molécula hipoalergênica é derivadas usando-se quantidades equimolares em ensaios padrão conhecidos na técnica (reatividade de célula T reduzida significa pelo menos 30 %, preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, menos estímulo de molécula hipoalergênicas em comparação com o alergeno do tipo selvagem em quantidades equimolares). Em uma forma de realização preferida particular desta invenção, as moléculas podem "perder" os epítopos de célula T e, desta maneira, a molécula mostra reatividade de célula T reduzida nos indivíduos a serem tratados (isto é, que devem receber uma molécula de plataforma de valência que apresenta epítopo). É provável que, por exemplo, uma molécula derivada de alergeno possa precisar de epítopos de célula T com respeito a um indivíduo ou a um grupo de indivíduos, enquanto possuem um epítopo de célula T com respeito a outros indivíduos. Os métodos para detectar a presença de um epítopo de célula T são conhecidos na técnica e incluem ensaios que detectam a proliferação de célula T (tal como a incorporação de timidina). Os imunogênios que falham em induzir a incorporação estatisticamente significante de timidina acima da base (isto é, no geral p menos que 0,05 usando-se métodos estatisticamente padrão) são, no geral considerados precisar dos epítopos de célula T, embora seja estimado que a quantidade quantitativa de incorporação de timidina possa variar dependendo do imunogênio sendo testado (ver, por exemplo, Zhen L. et al. (Infect Immun. (2003) 71:39203926)). No geral, um índice de estímulo abaixo de cerca de 2 a 3, mais preferivelmente menos do que cerca de 1, indica perda de reatividade de célula T e epítopos. A presença de epítopos de célula T também pode ser determinada pela medição da secreção de linfocinas derivadas de célula T de acordo com métodos padrão. O índice de estímulo (SI) pode ser calculado pela divisão da taxa de proliferação (entrada de timidina) de células estimuladas através da taxa de proliferação de células não estimuladas em meio apenas. SI=1 significa nenhum estímulo, SI<1 indica efeitos tóxicos e SI>1 indica estímulo de células. A localização e o teor do epítopo de células T, se presentes, podem ser determinados empiricamente.

[048] A secreção de citocina pode ser determinada além do estímulo de células T. Por exemplo, IFN-gama foi reconhecido como uma citocina nociva. Outros exemplos podem ser TNF-alfa, IL-5, IL-4, IL-8 etc.

[049] O fragmento de alergeno é preferivelmente composto de aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 ou 212 a 241 de Phl p 1, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a 162, 217 a 246, 252 a 283 ou 176 a 212 de Phl p 5, aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 de cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 de cadeia 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79 ou 75 a 104 de Bet v 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1-35, 36-70, 71-110, 111145, 140-170, 175-205, 210-250 ou 250-284 de Der p 10, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241. a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou fragmentos ou variações de seqüência destes.

[050] As seqüências de aminoácido específicas das moléculas derivadas de alergeno identificadas acima são:

[051] Os termos “fragmentos destes” e “variações de seqüência destes” referem-se a peptídeos que são deduzidos das moléculas derivadas de alergeno divulgados neste e mostram propriedades bioquímicas (por exemplo, a capacidade de evitar a ligação de IgE ao alergeno a partir do qual estas moléculas são derivadas) que são comparáveis ou idênticos Às ditas moléculas derivadas de alergeno. Os fragmentos da presente invenção compreendem, pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 10, sucessivos e/ou um máximo de 95 %, preferivelmente um máximo de 90 %, mais preferivelmente um máximo de 80 % de resíduos de aminoácido da molécula derivada de alergeno. O termo “variação de seqüência” inclui modificações tais como fragmentação (ver acima), substituições de aminoácido (por exemplo, com outros aminoácidos naturais ou não naturais ou derivados de aminoácido), anulações ou adições. “Variação de seqüência" também refere-se às ditas moléculas derivadas de alergeno da tabela acima, em que pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 (5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20) resíduos de aminoácido são adicionados ao terminal C e/ou N.

[052] É observado que o alergeno clone 30 é um alergeno derivado do ácaro de pó doméstico Dermatophagoides pteronyssinus e consiste da seguinte seqüência: MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFA DPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT (SEQ ID N° 140; ver também AT A 733/2006).

[053] De acordo com a presente invenção também são abrangidos peptídeos que são pelo menos 80 % idênticos, preferivelmente 90 % idênticos, às seqüências de aminoácido divulgadas neste.

[054] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína hipoalergência fundida de acordo com a presente invenção.

[055] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[056] O dito vetor é preferivelmente um vetor de expressão.

[057] O vetor que abriga a molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser usado para os propósitos de clonagem ou para a produção de vetores de expressão. O dito vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou qualquer outro vetor comumente usado na engenharia genética e pode incluir, além da molécula de ácido nucleico da invenção, elementos eucarióticos ou procarióticos para o controle da expressão, tal como seqüências reguladoras para a iniciação e a terminação da transcrição e/ou tradução, intensificadores, promotores, seqüências sinalizadoras e outros.

[058] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o vetor é um vetor bacteriano, fúngico, inseto, viral ou mamífero.

[059] O vetor da presente invenção pode ser preferivelmente utilizado para os propósitos de clonagem e expressão em vários hospedeiros. Portanto, o dito vetor compreende, além disso, um ácido nucleico que codifica uma molécula hipoalergênica ou proteína de fusão de acordo com a presente invenção, seqüências reguladoras específicas de hospedeiro.

[060] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um hospedeiro que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a presente invenção.

[061] A molécula de ácido nucleico e o vetor de acordo com a presente invenção podem ser introduzidos em um hospedeiro adequado. A dita molécula pode ser incorporada no genoma do hospedeiro. O vetor pode existir de maneira extracromossômica no citoplasma ou incorporado no cromossomo do hospedeiro.

[062] Ainda, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um anticorpo direcionado contra a molécula hipoalergênica, proteína de fusão hipoalergênica ou uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[063] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.

[064] Os anticorpos de acordo com a presente invenção incluem, mas não limitam-se a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab') e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Além disso, os anticorpos são considerados serem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contém um local de ligação de antígeno que ligam-se imunoespecificamente um antígeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção são, preferivelmente dos tipos IgG, IgM, IgD, IgA e IgY, classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[065] Os anticorpos policlonais podem ser preparados pela mistura de um polipeptídeo da invenção, preferivelmente usando-se um adjuvante, a um mamífero não humano e coletando-se o anti-soro resultante. Os tituladores melhorados podem ser obtidos por injeções repetidas por um período de tempo. Não existe limitação particular às espécies de mamíferos que podem ser usadas para evocar os anticorpos; no geral, é preferido usar coelhos ou porquinhos da índia, mas cavalos, gatos, cães, cabras, porcos, ratos, vacas, ovelhas, camelos etc., também podem ser usados. Na produção de anticorpos, uma quantidade definida de imunogênio da invenção é, por exemplo, diluída com solução salina fisiológica a uma concentração adequada e a solução diluída resultante é misturada com, por exemplo, adjuvante de Freund completo para a preparação de uma suspensão ou com géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tal como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianinas do lapa buraco de fechadura, dinitrofenol e, potencialmente, adjuvantes úteis humanos, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e corynebacterium parvum. As suspensões e as misturas são administradas a mamíferos, por exemplo, intraperitonealmente, por exemplo, a um coelho, usando-se de cerca de 50 μg a cerca de 2.500 μg de polipeptídeo da invenção por administração. A suspensão é preferivelmente administrada a cada duas semanas por um período de até cerca de 2 a 3 meses, preferivelmente cerca de 1 mês, para realizar a imunização. O anticorpo é recuperado pela coleta de sangue a partir do animal imunizado após a passagem de 1 a 2 semanas após a última administração, centrifugando-se o sangue e isolando-se o soro do sangue.

[066] Os anticorpos monoclonais podem, por exemplo, ser de origem humana ou murina. Os anticorpos monoclonais de murino podem ser preparados pelo método de Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495), por exemplo, pela fusão de células baço de camundongos hiperimunizados com uma linha celular de mieloma de camundongo apropriada.

[067] Um anticorpo quimérico é uma molécula, em que, porções diferentes do anticorpo são derivadas de espécies animais diferentes, tais como anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; US 5.807.715; US 4.816.567 e US 4.816.397.

[068] Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécie não humana que liga o antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a partir das espécies não humanas e regiões de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente, os resíduos de estrutura nas regiões de estrutura humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente melhorar a ligação de antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas pelos métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, modelando-se as interações do CDR e dos resíduos de estrutura para identificar os resíduos de estruturas importantes para a ligação de antígeno e comparação de seqüência para identificar os resíduos de estrutura não usuais em particular posições (ver, por exemplo, Queen et al., US 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Os anticorpos podem ser humanizados usando-se uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400; WO 91/09967; US 5.225.539; US 5.530.101 e US 5.585.089), polimento ou reformação de superfície (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-913 (1994)) e mistura de cadeia (US 5,565,332).

[069] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser vantajosamente usados para a dessensibilização de um indivíduo que sofre de uma alergia, em particular de alergia de ácaros de pó doméstico. Para a imunização passiva, o anticorpo é preferivelmente um IgG ou um derivado destes (por exemplo, anticorpo quimérico ou humanizado). Além disso, este anticorpo também pode ser usado para a dessensibilização de um indivíduo.

[070] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma formulação de vacina que compreende uma proteína hipoalergênica ou um anticorpo de acordo com a presente invenção.

[071] A formulação de vacina de acordo com a presente invenção pode ser formulada como conhecido na técnica e necessariamente adaptada ao meio de administração da dita formulação de vacina.

[072] Os meios preferidos de administração de uma formulação de vacina (da presente invenção) incluem todos os regimes de administração descritos e sugeridos para a vacinação em geral e imunoterapia de alergia especificamente (oral, transdérmica, intravenosa, intranasal, por intermédio da mucosa, retalmente, etc). Entretanto, é particularmente preferido administrar as moléculas e proteínas de acordo com a presente invenção subcutânea ou intramuscularmente.

[073] A formulação de vacina de acordo com a presente invenção pode apenas compreender uma proteína de capsídeo viral ou fragmentos destes de um membro do gênero de rinovírus.

[074] A dita formulação preferivelmente ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente farmacêutico aceitável e/ou conservante.

[075] A fim de aumentar a imunogenicidade das moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção, adjuvantes, por exemplo, podem ser usados em um medicamento de acordo com a presente invenção. Um adjuvante de acordo com a presente invenção é um agente auxiliar que, quando administrado junto ou em paralelo com um antígeno, aumenta a sua imunogenicidade e/ou influencia a qualidade da resposta imune. Em conseqüência, o adjuvante pode, por exemplo, influenciar consideravelmente a extensão da resposta humoral ou imune celular. os adjuvantes de costume são, por exemplo, compostos de alumínio, compostos contendo lipídeo ou micobactérias inativadas.

[076] No geral, os adjuvantes podem ser de formas diferentes, contanto que estes sejam adequados para a administração a seres humanos. Os exemplos adicionais de tais adjuvantes são emulsões oleosas de origem mineral ou vegetal, compostos minerais, tais como fosfato ou hidróxido de alumínio ou fosfato de cálcio, produtos e derivados bacterianos, tais como P40 (derivado da parede celular de Corynebacterium granulosum), monofosforil lipídeo A (MPL, derivado de LPS) e derivados de peptídeo de muramila e conjugados destes (derivados de componentes de micobacterium), alume, adjuvante de Freund incompleto, liposina, saponina, esqualeno, etc. (ver, por exemplo, Gupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)) and Johnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289).

[077] De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção, dita formulação compreende 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica ou anticorpo.

[078] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma proteína hipoalergênica ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral e/ou uma alergia em um ser humano ou animal.

[079] O dito medicamento, preferivelmente ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitável.

[080] O medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado para ativar (administração da proteína hipoalergênica e/ou moléculas da invenção) bem como para inativar a imunização (anticorpos direcionados à proteína hipoalergênica e/ou moléculas da invenção).

[081] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o dito medicamento compreende de 10 ng a 1 g, preferivelmente de 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo.

[082] O medicamento é preferivelmente administrado a um indivíduo em uma quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.

[083] O regime de dosagem particular, isto é, dose, regulação de tempo e repetição, dependerá do indivíduo particular e daquele histórico médico do indivíduo. As considerações empíricas, tais como a vida média, no geral, contribuirão para a determinação da dosagem. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada no curso da terapia.

[084] O indivíduo cujo medicamento de acordo com a presente invenção é administrado é preferivelmente um indivíduo ou animal que está em risco de ter uma alergia.

[085] Os pacientes tendo ou em risco de ter uma condição alérgica, distúrbio ou doença incluem pacientes com uma condição alérgica existente ou conhecida ou uma predisposição suspeita com relação ao desenvolvimento de um sintoma associado com ou causado por uma condição alérgica. Desta maneira, o paciente pode ter uma condição, distúrbio ou doença alérgica crônica ativa, um episódio alérgico agudo ou uma condição alérgica latente. Certas condições alérgicas estão associadas com fatores ambientais sazonais ou geográficos. Desta maneira, pacientes em risco incluem aqueles em risco de sofrer de uma condição com base em um histórico pessoal ou familiar anterior e a estação ou localização física, mas que a condição ou um sintoma associado com a condição pode não se manifestar presentemente no paciente por si só.

[086] A administração do medicamento de acordo com a presente invenção, que compreende pelo menos uma molécula hipoalergênica como descrito neste, a um indivíduo pode evitar a sensibilização do dito indivíduo ou pode induzir uma resposta imune apropriada a alergenos. Se o medicamento da presente invenção for usado para evitar a sensibilização, este deve ser administrado ao indivíduo antes do primeiro contato com o dito alergeno. Portanto, é preferido administrar o medicamento de acordo com a presente invenção a recém nascidos e crianças. Também é verificado que a administração do medicamento de acordo com a presente invenção a indivíduos gestantes induzirá a formação de anticorpos direcionados contra alergenos na criança futura. É especialmente benéfico usar moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção para tais terapias, porque devido à perda do epítopo de células T, efeitos colaterais que ocorrem no curso da imunoterapia de alergeno podem ser significantemente reduzidos ou ainda completamente evitados.

[087] Ainda, um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma proteína hipoalergênica ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para o diagnóstico de uma alergia e/ou uma infecção viral em um indivíduo.

[088] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma proteína de capsídeo viral de um vírus da família de picornavirid- ae como um carreador em medicamentos ou vacinas ou para diagnosticar uma infecção viral, em particular resfriado comum.

[089] Como uma alternativa valiosa, à proteína carreadora de KLH amplamente dispersada, proteínas de capsídeo virais de vírus da família de picornaviridae podem ser usados. O carreador pode ser conjugado quimicamente ou fundido com técnicas recombinantes às peptídeos, proteínas e polipeptídeos ou outros antígenos. Além disso, a proteína de capsídeo viral pode ser usada para detectar, por exemplo, anticorpos direcionados à dita proteína de capsídeo no soro de um indivíduo.

[090] Uma das vantagens de um tal carreador é que não apenas o antígeno fundido ou conjugado neste pode ser exposto ao sistema imune, mas também uma resposta imune contra a proteína de capsídeo de um rinovírus ser induzida. Conseqüentemente, uma tal vacinação leva à prevenção e/ou tratamento de doenças causadas por rinovírus. O vírus é preferivelmente da espécie de rinovírus humano, em particular rinovírus humano 89 e 14.

[091] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um molécula hipo-alergênica derivada de Phl p 5 (Genbank Nr. X7435) tendo uma truncação de terminal C e/ou N e que precisa substancialmente da capacidade de ligação de IgE.

[092] O pólen de grama é uma das fontes sazonais externas mais potentes de alergenos carregados pelo ar responsáveis pela febre do feno e asma alérgico.

[093] Mais do que 40 % de indivíduos alérgicos apresentam reatividade de IgE com alergenos de pólen de grama, que são divididos em mais do que 11 grupos. Mais do que 80 % dos pacientes alérgicos ao pólen de grama reagem com alergenos do grupo 5.

[094] Os alergenos do grupo 5 são não glicosilados, proteínas altamente homólogas com uma faixa de massa molecular de 25 a 33 kD. Diversos alergenos do grupo 5 alergenos foram clonados e/ou imunologicamente caracterizados.

[095] O teste para reduzir a atividade alergênica pela introdução de mutações de ponto, mutações de diversos aminoácidos em linha ou anulações não apresentaram nenhum efeito (Schramm G, et al. J Immunol 1999; 162: 2406-1435). A ligação de regiões IgE de Phl p 5 (Flicker S, et al. J Immunol 2000; 165: 3849-3859) que já foi descrita na estrutura tri-dimensional foi resolvida (Maglio O, et al. 2002. Protein Eng. 15:635-642).

[096] É mostrado que, em particular os peptídeos Phl p 5 de acordo com a presente invenção, que são truncados no terminal C e/ou N e perdem capacidade de ligação de IgE, podem ser utilizados para a vacinação ativa de indivíduos.

[097] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a molécula truncada perde os epítopos de célula T.

[098] Como já resumido acima, os efeitos colaterais tardios de imunoterapia de alergeno podem ser significantemente reduzidos ou ainda serem evitados se uma molécula hipoalergênica substancialmente perder os epítopos de célula T.

[099] As moléculas de Ph1 p 5 que precisam dos epítopos de célula T são compostas de aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58 ou 252 a 283 de Phl p 5 ou fragmentos ou variações de seqüências destes.

[100] Em particular, estas moléculas truncadas substancialmente não mostram epítopos de célula T e são, entretanto, capazes de provocar uma resposta imune apropriada direcionada contra o alergeno do tipo selvagem.

[101] De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção o Phl p 5 truncado hipoalergênico é composto de aminoácidos de 132 a 162, 217 a 246 ou 176 a 212 de Phl p 5 ou variações de seqüência destes.

[102] Estas moléculas hipoalergênicas compreendem um ou mais epítopos de célula T mas perdem a capacidade de ligação de IgE.

[103] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma molécula hipo-alergênica derivada de Fel d 1 (Genbank N° X62477 e X62478) tendo uma truncação de terminal C e/ou N e que precisa da capacidade de ligação de ligação de IgE.

[104] As alergias a animais afetam até 40 % de pacientes alérgicos. No ambiente doméstico, as alergias aos animais domésticos mais populares, cães e gatos, são particularmente prevalescentes e conectadas com sintomas perenes. Os alergenos animais estão presentes em caspa, epitélio, saliva, soro e urina. A exposição aos alergenos pode ocorrer pelo contato direto com a pele ou por inalação de partículas que carregam os alergenos. Os alergenos de cães e gatos principais mostraram-se estar presentes muito difundidos e ainda podem ser detectados em casas que não possuem animais domésticos e em locais públicos, por exemplo, escolas. Isto pode ser atribuído ao número alto e crescente de casas que mantém animais domésticos em países industrializados (cerca de 50 %) e a estabilidade alta dos alergenos, que são carregados e distribuídos.

[105] O Fel d 1 foi identificado como o alergeno de gato principal, que é reconhecido por mais do que 90 % de pacientes alérgicos a gato. O Fel d 1 representa uma glicoproteína ácida de 38 kDa de função biológica desconhecida. Este consiste de dois heterodímeros não covalentemente ligados idênticos, que, novamente, são compostos de duas cadeias de polipeptídeo antiparalelamente ligados por três ligações de bissulfeto. A cadeia 1 e a cadeia 2 são codificados em genes diferentes, cada um consistindo de 3 exons. O Fel d 1 recombinante (rFel d 1), expressado como uma cadeia 2 - para a proteína de fusão de cadeia 1, foi gerado em E. coli. Este Fel d 1 recombinante é capaz de imitar completamente as propriedades imunológicas do alergeno do tipo selvagem.

[106] Os peptídeos derivados do alergeno de gato principal Fel d 1 e a carência da capacidade de ligação de IgE são adequados, por exemplo, para imunoterapia e vacinação contra alergia profilática. Estes peptídeos podem estar compreendidos em um polipeptídeo maior ou estar ligado a uma proteína carreadora adequada, tal como a hemocianina do lapa buraco de fechadura. Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 - como o Phl p 5 e os peptídeos derivados de alergeno divulgados neste - são capazes de induzir uma resposta de IgG, isto é, a produção dos denominados "anticorpos bloqueadores" ou "anticorpos protetores". Estes anticorpos evitam a ligação de IgE ao alergeno Fel d 1. Uma redução significante nos sintomas alérgicos pode ser atingida desta maneira.

[107] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a molécula truncada apresenta reatividade de célula T reduzida.

[108] A fim de evitar ou reduzir significantemente os efeitos colaterais posteriores a molécula hipoalergênica derivadas de Fel d 1 apresentam reatividade de célula T reduzida como definido na presente invenção.

[109] O Fel d 1 truncado é preferivelmente composto de aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 de cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 de cadeia 2 de Fel d 1 ou variações de seqüência destes.

[110] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a moléculas hipoalergênicas sendo compostas de ou compreendendo aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou fragmentos ou variações de seqüência destes.

[111] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão hipoalergênica que compreende pelo menos duas moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção apresentando capacidade de ligação de IgE reduzida e apresentando reatividade de célula T opcionalmente reduzida.

[112] As moléculas hipoalergênicas da presente invenção que são derivadas de um alergeno e precisam da capacidade de ligação de IgE podem ser fundidas de maneira recombinante ou conjugadas quimicamente uma à outra. Como componentes simples (fragmentos de alergeno) da proteína de fusão/polipeptídeo também a dita proteína de fusão/polipeptídeo precisa da capacidade de ligação de IgE.

[113] A proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode compreender, pelo menos dois, preferivelmente pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro, ainda mais preferivelmente pelo menos cinco, moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção. É claro, também é possível fundir as moléculas hipoalergênicas a outros peptídeos, polipeptídeos e proteínas não derivadas de alergenos. Estes peptídeos, polipeptídeos e proteínas podem, quando administrados a um indivíduo também induz uma reação imunológica ou pode atuar como um carreador ou apresentar atividades enzimáticas. As moléculas hipoalergênicas na proteína de fusão de acordo com a presente invenção podem estar ligadas diretamente uma a outra ou por intermédio de um ligador que é preferivelmente composto de resíduos de aminoácido.

[114] Os métodos para a produção de proteínas de fusão são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em referências de biologia molecular padrão tal como Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2° ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3° ed; Wiley and Sons, 1995). No geral, uma proteína de fusão é produzida construindo-se primeiro um gene de fusão que é inserido em um vetor de expressão adequado, que é, por sua vez, usado para a transfecção de uma célula hosT adequada. No geral, as construções de fusão recombinantes são produzidas por uma série de digestões de enzima de restrição e reações de ligação que resultam nas seqüências desejadas sendo incorporadas em um plasmídeo. Se locais de restrição adequados não estiverem disponíveis, os adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou ligadores podem ser usados como é conhecidos por aqueles habilitados na técnica e descrito nas referências citadas acima. As seqüências de polinucleotídeo que codificam alergenos e proteínas naturais podem ser montadas antes da inserção em um vetor adequado ou a seqüência que codifica o alergeno podem ser inseridas adjacentes a uma seqüência que codifica uma seqüência natural já presente em um vetor. A inserção da seqüência dentro do vetor deve estar na estrutura de modo que a seqüência possa ser transcrita em uma proteína. Estará evidente para aqueles habilitados na técnica que as enzimas de restrição precisas, ligadores e/ou adaptadores requeridos bem como as condições de reação precisas variarão com as seqüências e vetores de clonagem usados. A montagem de construções de DNA, entretanto, é rotina na técnica e pode ser facilmente realizada por uma pessoa habilitada na técnica.

[115] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as moléculas são fundidas umas às outras uma ordem diferente da ordem dos fragmentos no alergeno do tipo selvagem se as pelo menos duas moléculas forem derivadas do mesmo alergeno.

[116] A proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode compreender, pelo menos duas moléculas hipoalergênicas que são derivadas do mesmo alergeno do tipo selvagem. Em um tal caso, as moléculas simples (fragmentos de alergeno) são fundidos um ao outro a fim de diferir da ordem no alergeno do tipo selvagem. Um tal método evita a re-formação de locais de ligação de IgE/epítopos potenciais na proteína de fusão hipoalergênica.

[117] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica quanto a uma molécula hipoalergênica e uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.

[118] A molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser utilizada, por exemplo, para a produção das ditas moléculas de maneira recombinante.

[119] A dita molécula de ácido nucleico pode - de acordo com um outro aspecto da presente invenção - estar compreendida em um vetor.

[120] Este vetor é, preferivelmente, um vetor de expressão.

[121] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma formulação de vacina que compreende a molécula hipoalergênica, uma proteína de fusão ou um anticorpo de acordo com a presente invenção.

[122] A formulação ainda compreende, preferivelmente, pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitável.

[123] O uso de substâncias carreadoras particulares, tais como KLH (hemocianina do lapa buraco de fechadura) também está entre os últimos métodos correntes para aumentar as respostas imunes. As molécula hipoalergênicas da presente invenção também podem ser fundidas ou conjugadas a proteínas de capsídeo virais que também podem atuar como um carreador (ver acima).

[124] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a dita formulação compreende de 10 ng a 1 g, preferivelmente de 100 ng a 10 mg, especialmente de 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica ou anticorpo.

[125] A formulação de vacina pode estar substancialmente composta como o medicamento da presente invenção (ver acima).

[126] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteína de fusão ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um alergia em um indivíduo.

[127] A molécula hipoalergênica, proteína de fusão e anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser fundidos para a vacinação de um indivíduo. Esta vacinação pode reduzir ou evitar a resposta alérgica causada por um alergeno do tipo selvagem.

[128] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o dito medicamento ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.

[129] O medicamento de acordo com a presente invenção compreende, preferivelmente, 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula imunogênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo.

[130] De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção o medicamento é administrado a um indivíduo na quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente de 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.

[131] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção o dito indivíduo está em risco e pegar uma alergia.

[132] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteína de fusão ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para diagnosticar uma alergia ou monitorar o progresso de uma terapia contra alergia em um indivíduo.

[133] A molécula hipoalergênica, proteína de fusão ou anticorpo de acordo com a presente invenção pode não usado apenas em medicamentos, mas também podem ser adequadamente utilizados para vários propósitos de diagnóstico. Por exemplo, estas moléculas e proteínas de fusão podem ser usadas para diagnosticar uma alergia pela exposição, por exemplo, de uma amostra de um indivíduo que compreende células que liberam histamina ao dito polipeptídeo (ver, por exemplo, Purohit et al., Clin.Exp.Allergy 35 (2005): 186-192). Além disso, estas moléculas, proteínas de fusão e anticorpos podem ser imobilizados em uma superfície a fim de formar um polipeptídeo série/chip. Tais séries podem ser usadas, por exemplo, em avaliação de resposta alta a fim de diagnosticar uma alergia em várias amostras retiradas de diversos indivíduos.

[134] A presente invenção ainda é ilustrada pelas seguintes figuras e exemplos, pelas seguintes figuras e exemplos, entretanto, sem estar restrito a esta.

[135] A Fig. 1A mostra uma visão geral esquemática do vetor p89VP1.

[136] A Fig. 1B mostra a seqüência de DNA do local de clonagem múltiplo do vetor pET-17b e o gene codificador 89VP1.

[137] A Fig. 1C mostra a representação esquemática de três possibilidades para criar fusões de ácido nucleico.

[138] A Fig. 2 mostra um gel de SDS-PAGE a 12 % tingido com Coomassie blue contendo proteína rotulada por his de 89VP1 purificada (linha 1: 5 μg de marcador molecular; linha 2 a 5: 10 μl de amostras de eluição de 89VP1).

[139] A Fig. 3 mostra o reconhecimento de IgG de 14VP1: Imunotingimento de 14VP1 e controles. Os pontos são visualizados por auto- radiografia (linha 1 a 6: incubação com 1:500 a 1:16000 de anti-soro de anti- 14VP1 de coelho; linha 7 a 12: incubação com 1:500 a 1:16000 de soro pré- imune diluído).

[140] A Fig. 4 mostra resposta de IgG1 específica de 89VP1em camundongos. Os grupos de camundongos foram imunizados com antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa. Os tituladores de IgG1 específicos de 89VP1 foram medidos por ELISA e são expressados como valores OD no eixo y. os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos.

[141] A Fig. 5 mostra resposta de IgG1 específica de Ph1 p 1 em camundongos. Os grupos de camundongos foram imunizados com antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa. Os tituladores de IgG1 específicos de rPhl p 1 foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo de IgG1 no soro de camundongo. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa foram 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores médios.

[142] A Fig. 6 mostra resposta de IgG1 específica de extrato de pólen de capim-rabo-de-rato em camundongos imunizados. Os grupos de camundongos foram imunizados antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa. Os tituladores de IgG1 de extrato de pólen de capim-rabo-de- rato foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo de IgG1 no soro de camundongo. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha entre as caixas indica os valores médios.

[143] A Fig. 7 mostra a média de % de inibição da ligação de pacientes de IgE a rPhl p 1 pela pré-incubação com anti-soro contra rPhl p 1, r89P5 e KLHP5 de todos os 19 pacientes. A % de inibição é mostrada no eixo y. Os resultados são mostrados como barras.

[144] A Fig. 8 mostra a proliferação de células de baço de camundongos imunizados. As células T de camundongos imunizados com antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa foram estimulados com peptídeo 5, 89VP1(89) e KLH. O meio foi usado como uma referência. No eixo y, o índice de estímulo é mostrado. Os resultados são apresentados em barras.

[145] A Fig. 9 mostra resposta de IgG1, IgG2, IgG4 e IgA a 14VP1, 89VP1 e rPhl p 1 detectados no soro humano por medição ELISA. Os soros de 10 pacientes foram testados quanto a quatro anticorpos específicos para 89VP1, 14VP1 e rPhl p 1 como indicado no topo de cada caixa. Os soros retirados no outono e no inverno são mostrados do lado esquerdo e do lado direito de cada "par de barras", respectivamente. Os tituladores foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo no soro humano. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha entre as caixas indica os valores médios.

[146] A Fig. 10 mostra a detecção de anticorpos anti-89VP1 e anti-rPh1 p 1 no soro de pacientes alérgicos. Soros de pacientes alérgicos a 5 Phl p 1 foram testados quanto a 7 anticorpos específicos para 89VP1 (barra esquerda de cada par de base) e rPhl p 1 (barra direita de cada par de base). Os tituladores foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo no soro humano. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. a linha entre as caixas indica os valores médios.

[147] A Fig. 11 mostra a ligação de IgG anti-14VP1 ao extrato de proteína de HRV14 e 14VP1 purificado (linha 1 e 4: 5 μg de Marcador; linha 2 e 4: Extrato de vírus; linha 2 e 5: 5 μg de 14VP1). A mancha de A e B foi incubado com soro imune anti-14VP1 e soro pré-imune, re-spectivamente. O IgG ligado foi detectado por Western blotting e visualizado por auto-radiografia.

[148] A Fig. 12 mostra a neutralização de HRV14 (linha A (controle celular): As células após a pré-incubação de HRV14 com uma diluição de soro imune anti-14VP1 1:102-1:108 (série A1-A6); linha B: as células após a pré-incubação de HRV14 com uma diluição de soro pré-imune 1:102-1:108 (série B1-B6); Linha C: as células após incubação com HR-V14 10 TCD50-106 TCD50 (série C1-C6); D5: as células após a incubação com soro pré-imune; D6: células após a incubação com soro imune). As células foram colocadas em todos os reservatórios e coloridas com cristal violeta após três dias.

[149] A Fig. 13 mostra a reatividade de IgG de anti-soro anti-peptídeo com o alergeno Ph1 p 5 completo. As reatividades de IgG (valores OD) ao Phl p 5 são mostrados para as 3 amostras de soro (sangramento 1: soro pré-imune; sangramentos 2 e 3: amostras de soro coletadas em intervalos mensais) obtidos de 6 coelhos, cada um dos quais foi imunizado com um dos peptídeos conjugados KLH.

[150] A Fig. 14 mostra a atividade alergênica de rPh1 p 5 e a mistura de peptídeo foi detectada pela expressão de CD203c. As amostras de sangue heparinizadas de três pacientes alérgicos a Phl p 5 foram incubadas com diluições seriais de 10-4 a 10 μg/ml de alergeno recombinante, uma mistura equimolar de peptídeos derivados de Phl p 5, anti-IgE ou tampão de controle (co, eixo x). As células foram então tingidas com CD203c mAb e analisadas quanto à expressão de CD203c em um FACScan. O índice de estímulo (SI) é apresentado no eixo y.

[151] A Fig. 15 mostra a identificação de peptídeos derivados de Phl p 5 que induz respostas linfoproliferativas baixas. Os PBMCs de pacientes alérgicos a pólen de capim-rabo-de-rato foram estimulados com concentrações diferentes de peptídeo e para os propósitos de controle com in- terleucin-2 (eixo x). o índices de estímulo (SI) são indicados no eixo y.

[152] A Fig. 16 mostra peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1que induzem as respostas imunes de IgG específicas de Fel d 1 em coelhos. Seis coelhos foram imunizados com os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 conjugados com KLH ou rFel d 1 não conjugado e 3 a 4 sangramentos foram retirados em intervalos mensais. As reatividades de IgG do soro pré-imune e dos anti-soros a rFel d 1 ligado a placa de ELISA são mostrados como densidades óticas (valores O.D., eixo y).

[153] A Fig. 17 mostra a atividade alergênica baixa de peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1como determinado pela expressão de CD63 e CD203c em basófilos de pacientes alérgicos. Os PBMCs de 5 pacientes alérgicos a gatos foram incubados com diluições seriais de Fel d 1 (caixas fechadas) ou uma mistura de peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 (caixas abertas) (eixo x). Os RR PBMCs de pacientes também foram sondados com diluições seriais de peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes simples. A indução de expressão de marcadores de superfície CD203c e CD63 foi medida como intensidades de fluorescência média e os índices de estímulo calculados são mostrados no eixo y.

[154] A Fig. 18 mostra que um tratamento com os peptídeos derivados de Bet v 1 ligados a KLH reduz as respostas linfoproliferativas ao rBet v 1 em camundongos sensibilizados. A proliferação de célula T foi medida em culturas celulares de baço após o estímulo in vitro com o alergeno de pólen de bétula recombinante de bétula Bet v 1 (barras brancas), KLH (barras negras) ou a mistura de peptídeo (barras cinza). As barras representam os índices de estímulo médios (SI±SD) para os grupos diferentes de camundongos.

[155] A Fig. 19 mostra a vacinação profilática de camundongos simples com peptídeos derivados de Bet v 1 ligados por KLH que reduzem as respostas linfoproliferativas ao rBet v 1 após a sensibilização.

[156] A Fig. 20 mostra que a vacinação profilática de camundongos simples com peptídeos derivados de Bet v 1 ligados por KLH induz a uma resposta de IgG específica de Bet v 1 e prepara para a indução de respostas de IgG específicas de alergeno pelo alergeno completo. As respostas de IgG (valores de OD: eixo y) para Bet v 1 foram medidas em quatro grupos de tratamento em pontos diferentes de tempo (eixo x).

[157] A Fig. 21 mostra uma comparação de reatividade de IgE: a capacidade de ligação de IgE de peptídeos derivados de Phl p 5 (1, 2) e variantes (1a, 2b) foi determinada na aplicação de ensaios de mancha por pontos aplicando-se 0,20 g/ponto usando-se soros de 7 pacientes alérgicos ao pólen de grama (p1 a p7) e o soro de um indivíduo não atópico (NHS). rPhl p 5 foi usado como o controle positivo e HSA como o controle negativo. O IgE ligado foi detectado com IgE anti-humano rotulado por 125I.

[158] A Fig. 22 mostra uma resposta linfoproliferativa de peptídeos derivados de Phl p 5 (1, 2) e variantes (1a, 2b). Os PBMCs de pacientes alérgicos ao pólen de grama foram estimulados com concentrações diferentes de peptídeos e, para os propósitos de controle, com concentrações equimolares de rPhl p 5. Os índices de estimulação (SI) são indicados no eixo y.

[159] A Fig. 23 mostra a proteção cruzada de anticorpos anti VP1.

EXEMPLOS:

[160] Exemplo 1: Construção do vetor p89VP1

[161] As amostras de estoque de vírus foram preparados por RT-PCR pela adição de 1 μl do inibidor RNase (Boehringer GmbH, Germany) a uma concentração final de 0,01 U/pl após a extração de RNA de sobrenadantes de cultura celular pelo kit QlAamp viral (Qiagen, Germany).

[162] O plasmídeo p89VP1 (Fig. 1A) foi construído pela substituição do fragmento Ndel/EcoRI do local de clonagem múltipla de pET- 17b com a seqüência de cDNA codificadora pela proteína VP1 da cepa rinovírus humano 89 (89VP1). Os locais de restrição Ndel e EcoRI (em pET- 17b) foram usados para inserção de Asel/EcoRl ligado ao 89VP1 com ATG na extremidade 5’, seis histidina seguidas pelo pela códon de interrupção TGA na extremidade 3’ (Fig.1B).

[163] A inserção de 89VP1 em pET-17b foi confirmado pelo sequenciamento de nucleotídeo.

[164] Após a fusão de Ndel/Asel em vez do local Ndel CATAAT foi criado e não pode ser cortado com qualquer enzima disponível. Portanto, o local foi mutado por CTTAAG, o local de restrição de Afl II. Para inserir um fragmento alergeno adicional, a seqüência ACCGTT na extremidade 3’ foi mutado por ACCGGT, o local de restrição de AgeI. As seqüências de aminoácidos são exibidos abaixo nas seqüências de nucleotídeo de 89VP1. Os locais de restrição são mostrados sublinhados na Fig. 1B.

[165] Os ditos locais de restrição Afl II e Agel foram criados com o Kit de mutagênese de local de mudança de Quick (Stratagene).

[166] Os cDNAs para os fragmentos do gene deste modo podem ser inseridos pela fácil purificação nos locais de restrição remanescentes na extremidade 5’ (usando Afl II) ou na extremidade 3’ (usando Agel) de 89VP1 ou em ambos os locais como indicado na Figura 1C. Os fragmentos alergenos recombinantes seriam deste modo expressados no terminal N e/ou no terminal C de 89VP1.Tabela I: Iniciadores de clonagem e mutagênese (5’ a 3')

[167] Exemplo 2: Clonagem de uma construção que expressa uma proteína de fusão do fragmento alergeno 89VP1

[168] O método descrito acima foi exemplificado por um fragmento alergeno Phl p 1 do terminal C, isto é peptídeo 5 (CVRYTTEGGTK- TEAEDVIPEGWKADTAYESK; M. Focke et al. FASEB J (2001) 15:2042-4). A seqüência de DNA de peptídeo 5 foi amplificado por PCR usando o cDNA Phl p 1 (GenBank: X78813) como um padrão (Iniciadores: Phl p 1 avançado 5'-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3' (SEQ ID N°. 7); Phi p 1 reverso 5'-CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAG GCGGTGTCGGC-3' (SEQ ID N°. 8)). O produto PCR foi inserido no local de restrição Afl II do vetor p89VP1 e a construção resultante é referida como vector p89P5 e produto do gene r89P5.

[169] Exemplo 3: Expressão e purificação da proteína de fusão do peptídeo 5 89VP1 e 89VP1

[170] A fim de atingir a expressão do 89VP1 ou r89P5 (proteína de fusão de peptídeo 5 de 89VP1 recombinante), os plasmídeos foram transformados em E. coli BL21 (DE3). As células de E. coli transformadas foram desenvolvidas em 250 ml do meio LB contendo 100 mg/l de ampicilina a 37° C por uma densidade óptica (600 nm) de 0,4, e a expressão da proteína foi induzida pela adição de isopropil-beta-D-tiogalactosidase (IPTG) a uma concentração final de 1 mM. As células de E. coli foram coletadas após 4 horas pela centrifugação a 3500 rpm a 4° C por 10 minutos. A purificação foi realizada com o protocolo Qiagen usando Qiagen Ni-NTA e colunas. O grânulo celular foi recolocado em suspensão sob condições de desnaturação em 5 ml de 6 M de cloridreto de guanidínio por 1 hora. Após a centrifugação (20 minutos, 10000 x g) o sobrenadante foi incubado com 1 ml de Ni-NTA por uma hora adicional. A suspensão foi então carregada em uma coluna, lavada duas vezes com 5 ml de tampão de lavagem (8 M de uréia de pH 6,3) e então eluído com 4 ml de tampão de eluição (8 M de uréia de pH 3,5). A renaturação foi atingida após a diálise com molaridade decrescente de uréia.

[171] A pureza e tamanho da proteína purificada foram analisados por SDS-PAGE como mostrado na Figura 2. As fitas de proteína correlacionada com o tamanho de proteína calculado de 33,6 kD. A integridade das proteínas também foram confirmados pela análise de Western blot, usando anticorpo tag anti-histidina.

[172] Exemplo 4: Detecção de anticorpos de coelho específico 14VP1 pelo imunotingimento

[173] 5 μg 14VP1 (proteína VP1 da cepa de rinovírus humano 14) e controles (Bet v 1, Phl p 5, BSA) foram marcados em faixas de membrana nitrocelulose. Estas faixas foram expostas por uma diluição de anti- soro de coelho anti-14VP1 (linha 1 a 6) e soro pré-imune (linha 8 a 12). Anticorpos IgG de coelho ligado foram detectados com IgG anti-coelho de burro rotulado 125I 1:1000 e visualizado por autografia (Fig.3).

[174] A análise de mancha de ponto do soro anti-14 VP1 de coelho mostrou que 14VP1 é fortemente imunogênico. Os anticorpos IgG ainda foram detectados com um 1:16000 de diluição do anti-soro em contraste ao soro pré-imune e os controles Bet v 1, Phl p 5 e BSA.

[175] Exemplo 5: Resposta de anticorpo específico 89VP1 em camundongos determinados por ELISA

[176] A fim de determinar a imunogenicidade de 89VP1 e esta capacidade de atuar como um carreador pelo peptídeo 5, grupos de camundongos de balb/c fêmeas de seis semanas de idade (Charles River) foram imunizados com os antígenos seguintes: peptídeo 5 ligado ao maleimida KLH, KLH (KLHP5) e peptídeo 5 ligado a KLH EDC (KLHP5edc). A ligação química foi feita com a maleimida Imject ativado mcKLH e Kit EDC imunogênio Imject (Pierce). O grupo maleimida reage com grupos SH e o EDC reage com carboxila e grupos amino para formar ligações estáveis. Os grupos de 4 camundongos foram imunizados com camundongos 89VP1, r89P5 e 89P5edc e 2 foram imunizados com apenas peptídeo 5 (cada 5 μg e mistura 1:2 com hidróxido de alumínio). Os camundongos foram imunizados subcutaneamente em aproximadamente intervalos de três semanas e sangrados a partir das veias da calda. O nível de anticorpo IgG1 específico 89 VP1 foi determinado por ELISA.

[177] As placas de ELISA (Nunc) foram cobertas com 5 μg/ml de 89VP1. Os camundongos anti-89VP1, anti- r89P5 e soro de peptídeo 5 foram diluídos a 1:500. O IgGl ligado foi ligado com IgGl de anti- camundongo de rato (BD Pharmingen) 1:1000 e então com IgG de cabra antirato ligado por POX (Amersham Bioscience) 1:2000. O valor óptico (OD 405nm) é exibido no eixo y e correspondem ao nível do anticorpo IgG1 no soro de camundongo (Fig.4).

[178] O KLHP5, KLHP5edc, KLH e peptídeo 5 foram usados como controles. Os anticorpos IgG1 foram detectados com um título aumentado durante a imunização em camundongos injetados com 89VP1 (89VP1, 89P5edc e r89P5). Coelhos imunizados com 89VP1, r89P5 e KLHP5 mostrou o mesmo resultado.

[179] Exemplo 6: Resposta de anticorpo específico rPhl p 1 em camundongos determinados por ELISA

[180] Para avaliar se a imunização com r89P5 será induzido com os anticorpos IgG que reage com o Phl p 1 completo, o mesmo método e os mesmos soros de camundongos foram usados como descrito no exemplo 5. As placas de ELISA foram cobertas com 5 μg/ml de rPhl p 1 e o título de anticorpo IgG1 foi determinado (Fig.5).

[181] Todos os peptídeos derivados de Phl p 1 ligados ao KLH ou 89VP1 induzido pelos anticorpos IgG1 específico com respostas crescentes durante a imunização. Coelhos imunizados com r89P5 e KLHP5 mostrou o mesmo resultado.

[182] Exemplo 7: Detecção de ELISA de anticorpos de IgG1 específicos de extrato de pólen de capim-rabo-de-rato

[183] A imunização de camundongos e análise de ELISA foi realizado como descrito na seção 5. Enquanto o extrato de pólen de capim- rabo-de-rato foi revestido (100 μg/ml) nas placas de ELISA e o título de anticorpo IgG1 foi determinado (Fig.6).

[184] Após anticorpos específico de extrato de três imunizações IgG1 pode ser detectado em camundongos imunizado com peptídeo 5.

[185] Exemplo 8: Ligação de IgE de pacientes com bloqueio de anticorpos anti-r89P5 de coelho por rPhl p 1

[186] Para determinar a capacidade de coelho Ig induzido por peptídeo para induzir a ligação dos anticorpos IgE de pacientes alérgicos por rPhl p 1, as placas de ELISA foram cobertas com 1 μg/ml de rPhl p 1, lavado e bloqueado. As placas foram pré-incubadas com 1:100 diluído pelo peptídeo anti-coelho (89P5, KLHP5), um rPhl p 1 anti-coelho e, para os propósitos de controle, com o soro pré-imune correspondente. Após a lavagem, as placas foram incubadas como soro humano de pacientes Phl p 1 alérgicos (1:3 diluído) e IgE ligado foi ligado com IgE anti-humano de camundongo (Pharmingen 1:1000) e então como IgG anti-camundongo de ovelha ligado por POX (Amersham Bioscience) 1:2000.

[187] A porcentagem da inibição de ligação IgE atingido pela pré-incubação com o anti-soro de anti-peptídeo foi calculado como seguintes: 100-ODi/ODP x 100.

[188] O ODi e ODp representa as extinções após a pré- incubação como o coelho imune e soro pré-imune, respectivamente. A Tabela 2 mostra a capacidade de anticorpos de peptídeo anti-Ph1 p 1 para induzir a ligação de 19 pacientes alérgicos IgE para completar rPhl p 1. A Figura 7 exibe o meio de inibição (em %) e todos os soros imunes anti-rPh1 p 1, anti-r89P5 e anti-KLHP5. O soro de anti-peptídeo bloqueado com a ligação de IgE melhor do que rPhl p 1. A capacidade para a inibição é com 89P5 e KLHP5 quase parecido. A Tabela 2 mostra uma inibição (em %) de todos os 19 pacientes. Tabela 2: % de inibição de ligação IgE de 19 pacientes por rPhl p 1 após a incubação com anti-rPhl p 1 de coelho, r89P5 e anti-soro anti-KLHP5

[189] Exemplo 9: Proliferação de célula T de células do baço do camundongo após a estimulação do antígeno.

[190] Os grupos de três camundongos foram imunizados com KLH, KLHP5 e KLHP5edc. Os grupos de 4 camundongos foram imunizados quatro vezes com 89VP1, r89P5 e 89P5edc, e 2 camundongos foram imunizados com apenas peptídeo 5 (5 μg cada). As células do baço foram retiradas 10 dias após a última imunização e culturas celulares simples foram estimuladas e triplicadas em placas de 96 reservatórios com peptídeo 5 (P5), 89VP1, KLH, Con A e um meio como um controle positivo e negativo, respectivamente. Após quatro dias a [3H]timidina radioativa 0,5 de μCi foi adicionado em cada reservatório. As células foram então coletadas como uma placa de unifiltro em Coletor de Célula Packard após 15 horas. A radioatividade associada celular foi medida com um beta-contador. Os índices de estimulação onde calculados e são mostrados no eixo y. O antígeno que foi usado para estimulação é mostrado no eixo x. Cada caixa representa o dado do antígeno que foi usado para a imunização dos camundongos (Fig. 8). Todos os valores acima dois contam como positivo. Os camundongos KLH e KLHP5 imunizados são apenas positivos quando estimulados com KLH e os camundongos de peptídeo 5 são completamente negativos. O grupo KLHP5edc também é negativo que corresponde aos resultados de ELISA. As células de camundongos r89P5, 89P5edc e 89VP1 imunizados proliferaram apenas após a estimulação com 89VP1. O camundongo de controle simples mostra não proliferação em todos os casos. Estes resultados mostram que os epítopos das células T são fornecidos pelo carreador 89VP1 e não pelo peptídeo 5.

[191] Exemplo 10: Detecção de anticorpos 14VP1-, 89VP1- e rPhl p 1 específicos no soro humano obtido no Outono e Inverno por ELISA.

[192] O 5 soro humano de pessoas escolhidas aleatoriamente foram retirados no Outono e cinco no Inverno. O nível de anticorpo IgGl, IgG2, IgG4 e IgA contra 14VP1, 89VP1 e rPhl p 1 foi determinado por ELISA como descrito no exemplo 5. O IgG1, IgG2, IgG4 e IgA humanos foram detectados (BD Pharmingen) 1:1000 com IgG anti- camundongo de ovelha ligado por POX (Amersham Bioscience) 1:2000. Um alto título de anti-14VP1 e 89VP1 IgG1 do soro retirado no Outono e Inverno pode ser detectado (Fig. 9). O título do anticorpo anti-rPhl p 1 IgGl foi mais inferior. Os anticorpos IgG2, IgG4 e IgA podem ser detectados em todos os casos no nível mais baixo. As proteínas VP1 de cepas HRV diferentes são estritamente relatadas e a reatividade cruzada tem sido mostrado em outros estudos.

[193] Exemplo 11: Anticorpos Anti- 89VP1 e anti-rPhl p 1 de pacientes alergenos Phl p 1

[194] O soro de cinco pacientes alergenos Phl p 1 foram retirados e um experimento de ELISA foi realizado como descrito no exemplo 5. As placas de ELISA foram cobertas com rPhl p 1 e 89VP1 e o título do anticorpo IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE específico foram determinados (Fig. 10). Mais anticorpos anti-89VP1 IgG1 do que anticorpos anti-rPhl p 1 IgGl podem ser detectados.

[195] Exemplo 12: Detecção de ligação de anticorpo anti- 14VP1 pela análise Western blot do vírus total

[196] A ligação do anticorpo IgG do soro do 14VP1 de coelho injetado pelo vírus total foi confirmado pelo uso do vírus HRV14 total (linha 2 e 5) e 5 μg purificado por 14VP1 (linha 3 e 6) como controle. O extrato do vírus foi separado por 12 % de SDS-Page e tingido na membrana de nitrocelulose. O anti-soro de coelho anti-14VP1 (linha 1 a 3) 1:500 e soro pré- imune (linha 4 a 6) 1:500 foram testados pela ligação por HRV14 e 14VP1. O IgG ligado foi ligado com anticorpo anti-coelho de burro rotulado 125I e visualizado por autografia (Fig.11).

[197] A ligação do anti-soro 14VP1 pode ser detectado no mesmo grupo (33,6 kD) como 14VP1.

[198] Exemplo 13: A neutralização de anticorpos do rinovírus 14 humanos intactos

[199] A dose de cultura de tecido 50 (TCD50) de HRV14 foi determinado. Portanto, uma diluição do vírus de 1:102 a 1:108 em MEM de Eagle 1 % de FCS e 40 mM de MgC12 foi realizado e incubado em placas de 24 reservatórios a 34° C em uma atmosfera umidificada de 5 % de CO2 junto com HeLa de células Ohio por três dias. Como controle sem o vírus também foi expandido.

[200] O efeito citotóxico do vírus foi visualizado com violeta genciana após três dias e o TCD50 (a diluição onde 50 % das células estão mortas) foi calculado.

[201] As diluições do soro e vírus (100TCD50) na fila A e B foram incubados a 34 ° C. Após 2 horas as células foram expandidas em todos os reservatórios. D5 e D6 são controles de soro. O esquema experimental é mostrado na Fig. 12. O efeito de neutralização dos anticorpos foi detectado após três dias com violeta genciana (Fig. 12).

[202] Exemplo 14: Características dos peptídeos sintéticos derivado de Phl p 5

[203] Os peptídeos foram sintetizados usando a estratégia Fmoc com ativação HBTU (0,1 mmol dos ciclos de escala menores) no modelo de sintetizador de peptídeo de Biosystems Applied 433A como descrito. (Focke et al. Faseb J (2001) 15:2042). Após a análise da profundidade de seis alergenos Phl p 5 de peptídeos derivados de Phl p 5 que variam de 31 (P1: 3026 Dalton) a 38 (P6: 3853 Dalton) aminoácidos em comprimento que são ricos em aminoácidos expostos à solventes foram preparados (Tabela 3). Estes peptídeos tem pontos isoelétricos entre 4,32 e 8.98 e três destes (peptídeo 3, 4 e 6) podem conter epítopos das células T humanas.

[204] Tabela 3. Características dos peptídeos sintéticos não alergênicos derivados de Phl p 5. Posição (em relação à molécula Phl p 5), seqüência, comprimento, peso molecular (MW), ponto isoelétrico (pI) e a presença de epítopos das células T dos peptídeos derivados de Phl p 5 são exibidos. O resíduo de cisteína adicionado para facilitar a ligação é marcado em evidente e sublinhado.

[205] Exemplo 15: Falta dos peptídeos derivados de Phi p 5 da reatividade IqE e atividade alergênica

[206] 15.1. Falta da reatividade IgE

[207] Para analisar a reatividade IgE de seis peptídeos derivados de Phl p 5, o isolado bem como peptídeos ligados por KLH derivados de Phl p 5 foram comparados com rPhl p 5 completo que diz respeito a capacidade de ligação de IgE por ELISA usando soro de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim (Tabela 4). Tabela 4: Caracterização sorológica de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim e um controle não alergênico. Sexo, idade, níveis IgE de soro total (kU/L), IgE específico do extrato de capim-rabo-de-rato (kUA/L), anticorpos IgE específicos por rPhl p 5 e os 6 peptídeos isolados (P1 a P6) e ligados a KLH (KLH-PI-KLH-P6) foram medidos por ELISA e ODs (densidades ópticas) são mostrados. Traços indicam a falta da reatividade IgE ao isolado bem como aos peptídeos ligados por KLH.

[208] As placas de ELISA (Nunc Maxisorp, Denmark) foram cobertas com peptídeos derivados de Phl p 5 (5 μg/ml) ou rPhl p 5 como controle (5 μg/ml), lavado e bloqueado. Subseqüentemente, as placas foram incubadas com 1:3 de soro de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim diluídos e de um indivíduo não atópico durante a noite a 4° C. O sofrimento dos pacientes alérgicos a pólen de capim a partir de rinoconjuntivite alérgica e/ou asma foram selecionados de acordo com a história do caso indicado pela polinose de capim sazonal e caracterizado pelo teste da picada da pele com extrato de pólen de capim-rabo-de-rato e teste CAP-FEIA sorológico (Phar- macia Diagnostics, Uppsala, Sweden). Os níveis IgE totais no soro foram determinados pela medição de CAP (Pharmacia). Anticorpos IgE específicos por rPhl p 5 foram determinados por ELISA. O soro a partir de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim e um indivíduo não atópico foram usados para estudos de competição IgE. Os pacientes alérgicos ao grupo de pólen de capim consiste de 13 machos e 16 fêmeas com uma faixa de idade de 35 anos (que variam de 25 a 51 anos) (Tabela 4).

[209] Anticorpos IgE ligados foram detectados com um anticorpo IgE anti-humano monoclonal de camundongo ligado por alcalina- fosfatase 1:1000 diluído (Pharmingen, CA).

[210] Os níveis IgE totais e IgE específico de extrato de pólen varia de 24,9 a 2000 kU/L (significa: 262,7) e 2,2 a 100 kUA/L (significa: 41,5), respectivamente. Todos os pacientes contendo anticorpos IgE específicos de rPhl p 5 variarão entre 0,157 a 2,530 OD unidades (significa: 1,082 OD unidades), mas nenhuma dos 29 pacientes mostraram reatividade IgE por qualquer dos peptídeos (P1 a P6) ou por uma mistura equimolar dos peptídeos (OD < 0,08). Estes resultados demonstram que nenhum soro contendo anticorpos IgE detectáveis com especificidade por qualquer dos seis peptídeos derivados de Phl p 5.

[211] 15.2. Atividade alergênica reduzida dos peptídeos como detectado pela expressão CD 203 c em basófilos: Ativação de Basófilo e citometria de fluxo:

[212] A super-regulação de CD 203 c tem sido descrito como um marcador substituto pela ativação de Basófilo induzido por alergeno e desgranulação (Hauswirth et al., J Allergy Clin Immunol 2002; 110:102). Portanto, a atividade alergênica do alergeno rPhl p 5 completo e uma mistura equimolar de peptídeos pela medição de CD 203 c e sub-regulação em basófilo dos pacientes alérgicos à pólen de capim foram comparados.

[213] As células sanguíneas periféricas foram obtidas de 3 doadores alérgicos após informado tem sido dado permissão. Alíquotas de sangue heparinizadas 1,11) foram incubadas com diluições em série de alergenos recombinantes (10 a 4 por 10 μg/ml), anticorpo anti-IgE (1 μg/ml) ou tampão de controle (solução salina tamponada de fosfato = PBS) por 15 minutos a 37° C. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS contendo 20 mM de EDTA. As células foram então incubadas com 10 μl de CD203c conjugado por PE mAb 97A6 por 15 minutos em temperatura ambiente (RT). Depois disso, os eritrócitos foram lisados com 2 ml de solução de FACSTM Lysing. As células foram então lavadas, recolocadas em suspensão em PBS, e analisadas pela citometria de fluxo de duas cores em um FACScan (Becton Dickinson), usando um software Paint-a-Gate. A Sub-regulação induzida por alergeno de CD203c foi calculado dos meios de intensidade de fluorescência (MFIs) obtido com células estimuladas (MFlstim) e não estimuladas (MFlcontrol), e expressadas como índice de estimulação (MFIstim : MFlcontrol). Um SI de > 2,0 (> sub-regulação de 2 bocas) foi considerado indicativo de uma resposta específica.

[214] Como mostrado na Figura 14 foi observado que o rPhl p 5 completo mostra um aumento dependendo da dose (10 a 4 por 10 μg/ml) na expressão de CD203c no basófilo de sangue periférico em um indivíduo sensibilizado, considerando uma mistura equimolar dos peptídeos mostram nenhum efeito.

[215] A determinação da expressão CD 203c em basófilo a partir dos pacientes alérgicos de pólen de capim indicam que nenhuma atividade alergênica pode ser observado com os peptídeos derivados de Phl p 5.

[216] Exemplo 16: Imunização com os peptídeos derivados de Phl p 5 que induz anticorpos IgG reativo com rPhl p 5 e alergenos naturais a partir de espécies de capim diferentes.

[217] 16.1. Alergenos recombinantes e extratos alergenos

[218] O recombinante purificado Phl p 5 foi expressado em E. coli como descrito (Vrtala et al. J of Immunol (1993) 151:4773-4781).

[219] O pólen de capim de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum foram obtidos de Allergon Pharmacia (Sweden), e um extrato de pólen aquoso foi preparado como descrito (Vrtala et al., Int Arch Allergy Immunol (1993) 102:160-9.).

[220] 16.2. A imunização de coelhos

[221] Os peptídeos purificados por HPLC foram ligados ao KLH (hemocianina do lapa buraco de fechadura, MW 4,5 x 103 a 1, 3 x 107, Pierce, USA) de acordo com conselho dos fabricantes e purificados usando um kit de conjugação (Sigma, USA).

[222] Os coelhos foram imunizados com cada um dos peptídeos conjugados por KLH (200 μg/injeção) e, para os propósitos de controle, com rPhl p 5 completo usando Adjuvantes completos e incompletos de Freunds (Charles River). As amostras do soro foram obtidas no intervalo de quatro semanas.

[223] 16.3. Reatividade de anticorpos de coelho com rPhl p 5 completo e alergenos naturais a partir de espécies de capim diferentes

[224] A fim de investigar se os anticorpos induzidos após a imunização com peptídeos ligados por KLH reconhece o rPhl p 5, alergenos de pólen de capim relacionado ao Phi p 5 e Phl p 5 natural a partir de outras espécies de pólen de capim, experimentos de ELISA foram realizados. Para detecção de ELISA, as placas (Nunc Maxisorp, Denmark) foram cobertas com extratos de alergenos de pólen (100 μg/ml: Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum) ou o alergeno purificado recombinante (5 μg/ml: rPhl p 5). As placas de ELISA foram lavadas e bloqueadas e subseqüentemente incubadas com anti-soro de peptídeo anti-coelho e soro pré-imune correspondente diluído a 1:2500. O IgG de ligação de coelho foi ligado com um anti-soro Ig de anti-coelho de cabra ligado por HRP (Jackson Immunresearch, Pennsylvania). Os meios dos resultados representam a determinação duplicada com um erro de < 5 % (Figura 13, Tabela 5).

[225] Tabela 5: Reatividade cruzada de anti-soro de peptídeo anti-Phi p 5 com grupo rPhl p 5 e 5 alergenos naturais de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum. As reatividades IgG (valor OD) de anti-soro de peptídeo (anti-P1 ao anti -P6) por Phl p 5 e extratos de pólen a partir do pólen de capim são exibidos por 6 coelhos que foram imunizados com peptídeos derivados de Phl p 5 conjugados por KLH (P1-P6).

[226] 16.4. Imunização com peptídeos Ph1 p 5 que induz a reatividade cruzada dos anticorpos IgG

[227] A imunização com cada um dos peptídeos induz uma resposta IgG específica de Ph1 p 5 forte que tornar-se detectável quatro semanas após a primeira imunização e aumentada após a segunda imunização (Figura 13). A imunização com peptídeo 2 induz o Phl p 5 mais alto de resposta IgG específica seguido pelos peptídeos 6, 4, 5 e 1 que induz a resposta inferior. Com a exceção de anticorpos de anti-peptídeo 1 que reativada que falta com 5 grupos alergenos em Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale e Hordeum vulgare, o outro anti-soro de peptídeo reagido cruzado com cada um dos extratos de pólen de capim testados (Tabela 5).

[228] Exemplo 17: Imunização com os peptídeos derivados de Phl p 5 que induz anticorpos IgG que inibem a ligação dos pacientes alérgicos ao pólen de capim IgE por Phl p 5

[229] 17.1. Inibição de ligação IgE de pacientes alérgicos por rPhl p 5a pelo IgG específico de peptídeo

[230] A informação que diz respeito à capacidade dos peptídeos induz anticorpos bloqueadores é importante visto que os anticorpos bloqueadores foram mostrados para fazer um papel maior na imunoterapia.

[231] A fim de examinar a capacidade do coelho Ig induzido por peptídeo para induzir a ligação de IgE de pacientes alérgicos para completar rPhl p 5 por ELISA, os experimentos de competição foram realizados usando soro de 29 pacientes alérgicos à pólen.

[232] As placas de ELISA foram cobertas com rPhl p 5 (1 μg/ml) e pré-incubado com uma diluição de 1:250 de cada um do anti-soro de anti-peptídeo (anti-Pl-anti-P6), uma mistura do anti-soro de anti-peptídeo, um anti-soro de anti-rPhl p 5 ou para os propósitos de controle, com o soro pré- imune correspondente ou uma mistura do soro pré-imune. Após a lavagem, as placas foram incubadas com 1:3 diluídas no soro de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim e IgE ligado a anticorpos foram detectados com o anticorpo IgE anti-humano monoclonal de camundongo ligado à alcalina fosfatase (Pharmingen). Uma inibição da porcentagem de ligação IgE atingido pela pré- incubação com o anti-soro de anti-peptídeo foi calculado como seguintes: % de inibição da ligação IgE = 100-ODI/Odpx100. O ODI e ODp representa as extinções após a pré-incubação com os coelhos imunes e soro pré-imune, respectivamente. A pré-incubação de Phl p 5 com coelho Ig induzido pelo IgE da reatividade dos pacientes alérgicos inibidos por peptídeo G por um grau de variação. O grau médio da inibição da inibição de IgE varia de 19,3 % pelo IgG anti-peptídeo 6 a 28,5 % com IgG anti-peptídeo 1. Anticorpos de coelho crescente mais uma vez completam Phl p 5 induzido um meio de inibição da ligação IgE de 43,6 %.

[233] Tabela 6: Anti-soro de peptídeo anti-Phl p 5 de coelho que inibe o a ligação do soro IgE de pacientes alérgicos ao pólen de capim-de- rabo-de-rato por Phl p 5. Uma inibição da porcentagem de ligação IgE por Phl p 5 é exibido para cada paciente após a pré-incubação de Phl p 5 com anti-soro de anti-peptídeo (anti-P1 a anti-P6), com uma mistura de seis anti-soro de anti- peptídeo (anti-Pl-P6) ou com um anti-soro de anti-rPhl p 5. A porcentagem significa a inibição que é exibida na linha da parte inferior. N.d.: Nenhum Realizado.

[234] Exemplo 18: Peptídeos derivados de Phl p 5 induz as respostas de linfoproliferativa específica baixa.

[235] 18.1. Ensaios de linfoproliferação

[236] A fim de identificar os peptídeos com a reatividade da célula T possível mais baixa para minimizar os efeitos colaterais relacionados à terapia, a reatividade celular T foi examinado pelos ensaios de linfoproliferação. As células mononuclear se sangue periférico (PBMC) foram isolados de 2 pacientes alérgicos à pólen de capim pela centrifugação gradiente de densidade Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, UK). O PBMC (2 x 105) foi cultivado e triplicado em placas de 96 reservatórios (Nunclone; Nalge Nunc International, Denmark) em 200 μl de meio de cultura de soro livre Ultra (BioWhittaker, Rockland, ME) suplementado com 2 mM de glutamina L (SIGMA, USA), 50 μM de beta-mercaptoetanol (SIGMA) e 0,1 mg de gentamicina por ml (SIGMA) a 37° C e 5 % de CO2 em uma atmosfera umidificada. As células foram estimuladas com concentrações diferentes de peptídeos sintéticos (1,25, 0,6 e 0,3 μg por reservatório) e, por comparação, com 4 U de Interleucina 2 por reservatório (Boehringer Mannheim, Germany) e com meio sozinho. Após 6 dias de cultura 0,5 μCi por reservatório [3H]timidina (Amersham Pharmacia Biotech) foi adicionado e 16 horas depois disso incorporado a radioatividade ser medida pela contagem de cintilação líquida usando um contador de cintilação de microbeta (Wallac ADL, Germany). O meio cpm foi calculado a partir do triplicados, e o índice de estimulação (SI) foi calculado como o quociente do cpm obtido por antígeno ou estimulação de Interleucina 2 e os controles não estimulados.

[237] Os PBMCs a partir dos pacientes alérgicos a pólen de capim-rabo-de-rato foram estimulados com concentrações diferentes de petídeos sintéticos. Os índices de estimulação com peptídeos foram significantemente inferiores do que com IL2. Os peptídeos derivados de Phl p 5 induz as respostas linfoproliferativa específica baixa. A resposta inferior foi vista com peptídeo 5 seguido pelo peptídeo 4.

[238] Exemplo 19: Características dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1

[239] A fim de obter os peptídeos adequados para vacinação de alergia de gato, cinco peptídeos que são 30 a 36 aminoácidos longos e cobre a molécula total que são designadas de acordo com à seqüência de aminoácido conhecido de Fel d 1.

[240] Os peptídeos foram sintetizados usando uma estratégia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil) com ativação de HBTU (2-(1H- benzotriazol-1-il) 1,1,3,3 hexafluorofosfato de tetrametilurônio) (0,1 mmol dos ciclos de escala menores) no modelo de sintetizador de peptídeo de Biosystems Applied 433A (USA). As resinas PEG-PS pré-carregadas (polietilenoglicol poli-estireno) (carregando 0,15 a 0,2 mmol/g) (PerSeptive Biosystems, UK) foram usados como fase sólida para construir os peptídeos. As químicas foram adquiridas de Applied Biosystems. A ligação de aminoácidos foi confirmado pelo monitoramento da condutividade em um sistema de controle de resposta. Um resíduo de cisteína foi adicionado aos polipeptídeos 1, 3, 4, e 5 para facilitar a ligação aos carreadores (Tabela 7). Os peptídeos foram clivados a partir de resinas com uma mistura de 250 μl de água destilada, 250 μl de triisopropilsilano (Fluka, Switzerland), 9,5 ml de TFA por 2 horas e precipitado em terc-butilmetiletílico (Fluka, Switzerland) (Focke 2001). A identidade dos peptídeos foi checada pela espectrometria de massa e peptídeos foram purificados a > 90 % de pureza pelo HPLC preparativo (PiChem, Austria). Tabela 7: Características moleculares dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1. A posição dentro da molécula do Fel d 1 natural, seqüência de aminoácido, diversos aminoácidos, calculados por peso molecular (MW) e ponto isoelétrico teórico (pI) dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 são mostrados. Todos os peptídeos são solúveis em água.

[241] Os cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 tem pesos moleculares na faixa de 3246 a 4083 Dalton e tem calculado ponto isoelétrico a partir de 4,30 a 4,93. Todos os cinco peptídeos são solúveis em água e os peptídeos 1, 2 e 3 podem conter epítopos das células T humanas (Tabela 7). Tabela 8. IgE de reatividade reduzida dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 comparado aos rFel d 1

[242] Exemplo 20: Peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 tem IgE de reatividade reduzida comparado aos rFel d 1 e peptídeos sintéticos derivados da atividade alergênica da falta de Fel d 1.

[243] O IgE de reatividade de soro aos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 a fim de identificar os peptídeos hipoalergênicos adequado para a vacinação foi investigado.

[244] A diagnose da alergia de gato mediado por IgE foi baseado na anamnésia, teste da picada da pele (Allergopharma, Reinbek, Germany) e medido do IgE de soro total bem como do IgE do soro específico de cólera de gato (CAP-FEIA, Pharmacia Diagnósticos, Sweden). As pessoas não alérgicas foram incluídas para os propósitos de controle.

[245] 20.1. Capacidade de ligação de IgE medido nos ensaios por ELISA.

[246] A capacidade da ligação IgE dos cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foram comparados com que o alergeno rFel d 1 completo usando o soro de 14 pacientes alérgicos a gato. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Denmark) foram cobertas com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 ou rFel d 1 como controle (0,5 μg/reservat0rio), lavado e bloqueado. As placas foram então incubados durante a noite a 4° C com 1:5 diluído de soro de pacientes alérgicos a gato e de um indivíduo não atópico. Os anticorpos IgE ligados foram detectados com um peroxidase de rábano silvestre 1:2500 diluído com anticorpo de IgE anti-humano rotulado (KPL, USA).

[247] O soro a partir de 7 fêmeas e 7 machos de pacientes alérgicos a gato na idade de 22 a 75 anos foram submetidos à determinações CAP-FEIA. Medido os níveis IgE totais varia de 122 a > 4000 kU/l e níveis IgE específico de cólera de gato de 1,99 a > 100 kUA/l (Tabela 7). No ensaio ELISA a reatividade IgE de todos os soros 14 testados ao alergeno maior do gato Fel d 1 foi confirmado. Os resultados foram obtidos como densidades ópticas (OD) e varia de 0,178 a 2,838 OD unidades. A reatividade IgE do soro 14 a peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foi medido no mesmo ensaio por ELISA. Foi observado que a ligação IgE foi retida por peptídeos 1, 2, 3, e 5. A ligação IgE foi observada pelo soro 6/14 ao Peptídeo 1, pelo soro 3/14 ao peptídeo 2, pelo soro 1/14 ao peptídeo 3 e pelo soro 10/14 ao peptídeo 5. As unidades OD medidas foram entre 0,051 e 1,998 pelo peptídeo 1, entre 0,060 e 0,123 para o peptídeo 2, 0,186 para peptídeo 3 e entre 0,056 e 0,677 para peptídeo 5. Em resumo, todas as unidades OD medidas foram consideravelmente inferiores do que os valores respectivos medidos para o alergeno Fel d 1 total.

[248] Este demonstra que os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 tem uma IgE de reatividade reduzida comparado aos alergenos Fel d 1 totais. Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 podem ser portanto considerados hipoalergênicos, fornecendo uma vantagem dos efeitos colaterais mediados por IgE reduzido, quando usado em SIT.

[249] 20.2. Indução específica da expressão dos marcadores de superfície CD203c e CD63 em basófilo humanos (Fig. 17)

[250] Visto que a ligação IgE é um pré-requisito mas não amplo para indução do tipo 1 de reações alérgicas que também são requeridas reticuladas de IgE específico de ligação celular de efeito, a atividade alergênica atual dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foi investigado em ativação de ensaios de Basófilo. Estes ensaios detectam uma sub-regulação específica alergênica de marcadores de superfície CD203c e CD63, ambos reconhecidos como marcadores pela ativação basófilo (Hauswirth et al. J Allergy Clin Immunol. (2002) 110:102-109).

[251] As amostras de sangue heparinizadas foram retiradas de 5 pacientes alérgicos a gatos após informado ser dado permissão. As alíquotas de sangue (100 μl) foram incubadas com diluições em série de rFel d 1, peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes simples ou como mistura equimolar, anticorpo anti-IgE ou tampão (PBS) por 15 minutos a 37° C. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS contendo 20 mM de EDTA. As células foram então incubadas com 10 μl de CD203c conjugado por PE mAb 97A6 e 20 μl de CD63 mAb CLB-granl2 conjugado por FITC por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, as amostras foram submetidas à lise eritrócito com 2 ml de solução FACSTM Lysing. As células foram então lavadas, recolocadas em suspensão em PBS, e analisadas pela citometria de fluxo de duas cores em um FACScan (Becton Dickinson, USA), usando software Paint-a-Gate. A sub-regulação induzida por alergeno de CD203c e CD63 foi calculado dos meios de intensidade de fluorescência (MFIs) obtido com células estimulada (MFlstim) e não estimulada (MFlcontrol), e expressadas como índice de estimulação (MFlstim : MFlcontrol). Um SI de mais do que 2,0 (isto é mais do que a sub-regulação de 2 bocas) foi considerado indicativo de uma resposta (diagnóstico) específico.

[252] Em basófilo de todos os cinco estudos da estimulação de pacientes alérgicos a gatos (RR, EB, KC, MG e SM) com rFel d 1 induzido uma sub-regulação específica de alergeno de marcadores de superfície CD203c e CD63. A super-regulação de CD203c e CD63 foi observado a ser dependente da dose por pacientes 4/5 (RR, KC, MG e SM). Para estes pacientes CD203c os índices de estimulação varia de 1,1 (SM) a 3,2 (RR) para a concentração inferior testada de 0,001 μg rFel d 1/ml e de 3,6 (KC) a 6,2 (RR) para a concentração maior testada de 10 μg rFel d 1/ml. CD63 os índices de estimulação determinados no mesmo ensaio varia de 1,1 (RR) a 2,0 (MG) para a concentração inferior rFel d testada de 0,001 μg/ml e de 3,9 (RR) a 7,3 (MG) para a concentração maior rFel d 1 testada de 10 μg/ml. Para o paciente EB 0,001 μg/ml Fel d 1 já foram suficiente induzir uma sub-regulação de alto nível de marcadores de superfície CD203c e CD63 prevenindo uma observação da dependência da dose da sub-regulação do marcador de superfície.

[253] Basófilo de todos os cinco pacientes alérgicos a gatos foram sondados com cinco concentrações aumentadas (0,005, 0,05, 0,5, 5 e 50 μg/ml) de uma mistura equimolar de cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1. Basófilo de paciente RR foram adicionalmente sondados com cinco concentrações aumentadas de cinco peptídeos sintéticos simples derivados de Fel d 1 (0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10 μg/ml). Os peptídeos foram observados a ser deficientes na sub-regulação dos marcadores de superfície basófilo CD203c e CD63. Os peptídeos foram incapazes de induzir qualquer expressão aumentada de CD203c e CD63 nas células de pacientes RR, KC e SM. Uma sub-regulação insignificante de CD203c (SI=2,3) e de CD63 (SI=2,5) pode ser detectado pelo paciente MG mas apenas para a concentração maior testada de 50 μg da mistura de peptídeo/ml, enquanto as concentrações inferiores aplicadas também não tem efeito na estimulação. A sub-regulação mais pronunciada de CD203c (SI=4,2) e CD63 (SI=4,3) foi observado pelo paciente EB mas, novamente, apenas para a concentração da mistura de peptídeo maior testada. Em ambos casos, o paciente MG e EB, a taxa de sub-regulação após a estimulação com peptídeos foi de consideravelmente inferior do que os valores correspondentes para estimulação com o alergeno Fel d 1 total.

[254] Este demonstra que os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 fornece as vantagens de propriedade a uma atividade alergênica inferior do que o alergeno Fel d 1 total. Este é relevante para um risco de diminuição dos efeitos colaterais mediados por IgE quando os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 são usados em SIT.

[255] Exemplo 21: Imunização com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 que induz anticorpos IgG reativo com o alergeno rFel d 1 total.

[256] Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foram mostrados serem deficientes na ligação IgE. As moléculas candidatas para a vacinação, que ajudam na indução dos anticorpos IgG específicos de alergeno, os peptídeos que mais retém estruturas alergenos específicos e ainda podem ser capazes de induzir uma resposta específica imune IgG para o alergeno total. A fim de observar se os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 executam estes requerimentos, os experimentos da imunização em coelhos foram realizados.

[257] Os coelhos foram imunizados com rFel d 1 não ligados e peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 ligados por KLH. Os peptídeos purificados por HPLC foram ligados ao KLH por intermédio de seus resíduos de cisteína, usando um kit de conjugação de Imject Maleimide Activated Immunogen (Pierce, USA Rabbits (New Zealand White Rabbits) foram imunizados com os imunogênios (200 μg/injeção) usando CFA (primeira imunização) e IFA (primeiro a incentivar a injeção após 4 semanas; um segundo incentivo para a injeção com adjuvante incompleto foi dado após 7 semanas) (Charles River Breeding Laboratories, Germany). Os coelhos foram sangrados 8 semanas após a primeira imunização e em intervalos de quatro semanas depois disso.

[258] A indução de peptídeo e anticorpos específicos rFel d 1foi monitorado por ensaios ELISA. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Denmark) foram cobertas com rFel d 1 (0,5 μg/reservat0rio), lavado e bloqueado. O rFel d 1 ligando a placa foi então sondado para duplicar com 1:1000 de anti-soro de coelho diluído e o soro pré-imune de coelho correspondente, e o IgG ligado foi ligado com um anti-soro de anti-coelho de cabra de peroxidase de rábano silvestre 1:2000 diluído (Jackson ImmunoResearch Inc., USA). Os meios de duplicar foram calculados e mostraram erros de menos do que 5 %.

[259] A imunização com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 que induz Fel d 1 dos anticorpos IgG reativos. Oito semanas após a primeira imunização com cada um dos cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1, os anticorpos IgG reativo pelo alergeno Fel d 1 total pode ser detectado em cada um dos cinco anti-soro de coelho. Os níveis do anticorpo IgG permaneceram em níveis comparáveis no sangramento subseqüente (Fig. 16).

[260] O soro de coelho do anti-peptídeo 1, anti-peptídeo 2, anti-peptídeo 4 e anti-peptídeo 5 mostraram reatividades IgG por Fel d 1 em cerca da mesma magnitude do que o anti-soro de coelho anti-Fel d 1. Também o anti-soro de coelho anti-peptídeo 3 mostra uma distinta mais uma reatividade IgG um pouco menor por Fel d 1.

[261] Este indica que todos os cinco 5 peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 são moléculas candidatas para induzir uma resposta de anticorpo Fel d 1 IgG específico.

[262] Exemplo 22: Peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 induz respostas linfoproliferativa enfraquecida por Fel d 1.

[263] As moléculas candidatas desejadas para SIT melhorado não apenas oferecem as vantagens dos efeitos colaterais mediados por IgE reduzido mas também de efeitos colaterais mediados por células T reduzidas. A fim de investigar as propriedades de ativação de célula T dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1, os ensaios linfoproliferativos foram realizados.

[264] Os PBMCs foram isolados de 7 pacientes alérgicos a gatos pela centrifugação gradiente de densidades Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, UK). O PBMC (2 x 105) foi cultivado e triplicado em placas de 96 reservatórios (Nunclone, Nalgene Nunc International, Denmark) em 200 μl de meio de cultura de soro livre Ultra (Cambrex, Belgium) suplementado com 2 mM de glutamina L (Sigma, USA), 50 μM (3-mercaptoetanol (Sigma) e 0,1 mg de gentamicina por ml (Sigma) a 37° C usando 5 % de CO2 em uma atmosfera umidificada. As células foram estimuladas com concentrações diferentes (5, 2,5, 1,25 e 0,6 μg/reservatório) de peptídeos sintéticos derivados de rFel d 1 e Fe d 1 como componentes simples ou como mistura equimolar e, para os propósitos de controle, com 4U de Interleucina 2 ou com meio sozinho. Após 6 dias de cultura, 0,5 μCi por reservatório 3H-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) foi adicionado e 16 horas depois disso, incorporado a radioatividade foi medida pela contagem de cintilação líquida usando um contador de cintilação microbeta (Wallac ADL, Germany), e o meio cpm foi calculado para triplicar. O índice de estimulação (SI) foi calculado como o quociente do cpm obtido por antígeno ou estimulação de Interleucina 2 e a não estimulada do meio de controle.

[265] A proliferação IL-2 estimulada de PBMC de todos os 7 pacientes alérgicos a gatos testados, resultando nos índices de estimulação de 9,8 por RR, 5,2 por EB, 3,2 por KC, 6,7 por MG, 6,3 por SM, 15,7 por RA e de 13,9 por AR.

[266] Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 induzido menores índices de estimulação (Tabela 9).Tabela 9: Peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 que em uma base equimolar induz um pouco as respostas linfoproliferativas do que Fel d 1 podem ser identificados. Os PBMCs de 7 pacientes alérgicos a gatos foram estimulados com diluições em série de rFel d 1 ou peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes simples. As respostas linfoproliferativas específicas são mostrados como nos índices de estimulação.

[267] Exemplo 23: Anticorpos IqG induzidos pela imunização com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 inibem a ligação de pacientes alérgicos a gatos IqE ao alergeno Fel d 1 total.

[268] A capacidade do coelho Ig induzido por peptídeo para induzir a ligação dos anticorpos IgE de pacientes alérgicos para completar rFel d 1 foi examinado no ensaio de competição ELISA. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Denmark) foram cobertas com rFel d 1 (0,05 μg/reservat0rio), lavado e bloqueado. O rFel d 1 ligado por placa foi então pré-incubado com 1:100 diluído de anti-soro de peptídeo anti-coelho (anti-soro de anti-peptídeo simples bem como uma mistura de anti-soro de anti-peptídeo que foi usado), o anti-soro anti-rFel d 1 de coelho, e para os propósitos de controle também com o soro de coelho pré-imune respectivo. Após as placas serem lavadas, estas foram incubadas com 1:5 diluído de soro humano de pacientes alérgicos a gatos. Os anticorpos IgE ligados foram detectados com a 1:2500 diluído de anticorpo IgE anti-humano rotulado de peroxidase de rábano silvestre (KPL, USA). A inibição da porcentagem da ligação IgE atingida pela pré-incubação com o anti-soro de anti-peptídeo foi calculado como seguintes: % de inibição de ligação IgE = 100 - O.D.I / O.D.p x 100, com O.D.z tendo a densidade óptica medida após a pré-incubação com o soro imune de coelho e O.D.p com soro pré-imune de coelho.

[269] A pré-incubação da placa de ELISA ligada a Fel d 1 com o anti-soro anti-peptídeo 5 de coelho resultando nas origens da inibição que varia entre 14 soro de pacientes alérgicos a gatos testados diferentes. O anti-soro anti-peptídeo 1 de coelho de ligação IgE de pacientes bloqueados por Fel d 1 pelo soro de pacientes 13/14 testados, anti-soro anti-peptídeo 2 de coelho por 8/14, anti-soro anti-peptídeo 3 por 13/14, anti-soro anti-peptídeo 4 de coelho por 9/14 e anti-soro anti-peptídeo 5 de coelho por 5/14.

[270] Também a faixa da inibição mostrou variações entre os anti-soros diferentes. Entre o anti-soro anti-peptídeo de coelho simples testado, o anti-soro anti-peptídeo 1 de coelho mostrou mais taxas de inibição com inibições de 0 a 55 % (média de 29 %). Com as taxas de inibição de anti- soro anti-peptídeo 2 de coelho de 0 a 18 % (média de 5 %) será atingido, com anti-soro anti-peptídeo 3 de coelho de 0 a 29 % (média de 11 %), com anti-soro anti-peptídeo 4 de coelho de 0 a 24 % (média de 8 %) e com anti-soro anti- peptídeo 5 de coelho de 0 a 18 % (média de 4 %).

[271] Uma mistura de toda a ligação IgE de pacientes que inibiram o anti-soro anti- peptídeo 5 de coelho por Fel d 1 mais eficientemente com inibições atingidas por soro de todos os pacientes e taxas de inibição de 25 a 84 % (média de 59 %). Estas inibições ainda foram mais pronunciadas do que atingidas pela pré-incubação com o anti-soro anti-Fel d 1 de coelho (Tabela 10). Tabela 10: Anti-soro de coelho elevado contra peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 inibindo a ligação de IgE humano por Fel d 1. Uma inibição da porcentagem de ligação IgE por Fel d 1 atingido pela pré-incubação de Fel d 1 com anti-soro de coelho são mostrados por 14 pacientes e como significam. As pré-incubações foram realizadas com anti-soro 5 de coelho elevado contra os 5 peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 (anti-peptídeo 1 a 5), uma mistura de 5 anti-soro de anti-peptídeo (Mistura) em um anti-soro elevado contra Fel d 1 (anti-rFel d 1).

[272] Quando o anti-soro anti-peptídeo 1 de coelho foi combinado com cada um dos outros anti-soros de anti-peptídeos, a inibição da ligação de pacientes alérgicos IgE foi substancialmente aumentada atingindo entre os valores (por exemplo anti-peptídeo 1 + 4:41 %, anti-peptídeo 1 + 5:42 %) obtido com anticorpos anti-rFel d 1 (67 %) (Tabela 11).Tabela 11:

[273] Exemplo 24: Peptídeos derivados de Bet v 1 que induz respostas IgG específicas de Bet v 1 recebendo ajuda de célula T a partir dos epítopos das células T derivado de carreadores e reduz a proliferação de célula T específica por Bet v 1.

[274] O derivado de Bet v 1, os peptídeos celulares B expostos a superfície já tem sido mostrados por induzir uma resposta Bet v 1 protetora e IgG específico em um modelo de camundongo de vacinação terapêutica e profilática (Focke M et al. Clin Exp Allergy (2004) 34:1525- 1533). Em Focke M et al. (2004), 6 peptídeos derivados de Bet v 1 foram ligados à molécula de carreador KLH antes de uma imunização de camundongos. No presente exemplo é mostrado que a resposta Bet v 1 IgG específica induzida com estes peptídeos (Tabela 1) é conduzida pela ajuda dos epítopos das células T derivados do carreador mas não de alergeno Bet v 1. Foi surpreendentemente observado que nenhum dos peptídeos derivados de Bet v 1 tem as seqüências LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF (SEQ ID N°. 20), GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN (SEQ ID N°. 21) e VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK (SEQ ID N°. 22) induzindo as respostas de células T relevantes, e pode ser demonstrado que a maioria das respostas das células T foi direta contra a molécula do carreador, KLH (Figuras. 18 e 19). Esta descoberta é mais importante para a redução dos efeitos colaterais durante a vacinação terapêutica e para a redução do risco de uma sensibilização potencial durante a vacinação profilática. Tem sido demonstrado no passado que os peptídeos derivados de alergenos necessitam de qualquer reatividade IgE mas contendo epítopos das células T derivados de alergenos induzindo efeitos colaterais devido a ativação da célula T. Os peptídeos derivados de alergeno necessitam de IgE e reatividade da célula T como exemplificado pelo peptídeos Bet v 1, não induz IgE ou efeitos colaterais mediados por células T durante a vacinação terapêutica. Quando usado para a vacinação profilática, os peptídeos induzirão uma resposta IgG protetora específica de Bet v 1 sem imprimação das células T específicas por Bet v 1. Este deve minimizar o risco de pré-imprimação na resposta imune alérgica através da vacina que deve abrir caminho para uma sensibilização alérgica subseqüente.

[275] Neste exemplo os alergenos e as respostas de células T específicas por carreadores em um modelo de camundongo de vacinação de alergeno terapêutica e profilática foram dessecadas. Os peptídeos derivados de Bet v 1 2,3, e 6 (Focke M et al. (2004)) foram escolhidos e testados em se quer este que contém qualquer dos epítopos das células T específicos de Bet v 1 conhecidos em camundongos BALB/c. Os camundongos foram imunizados como seguintes (Tabela 10 mostra um protocolo de sensibilização e tratamento): Os grupos de camundongos BALB/c (n=5) foram imunizados com 10 μg de Bet v 1 recombinante (Biomay, Austria) e/ou uma mistura de peptídeos sintéticos derivados de Bet v 1 2, 3, e 6 (10 μg de cada). Os peptídeos foram ligados ao KLH como previamente descrito (Focke M et al. (2004)). Para a imunização, Bet v 1 e a mistura dos peptídeos foram absorvidas por hidróxido de alumínio (Alu-Gel-S, Serva, Germany) em um volume total de 150 μl/camundongo. Tabela 12: Protocolo de sensibilização e tratamento.

[276] O alergeno, peptídeo, e linfoproliferação específica do carreador foi analisado em um ensaio de proliferação de célula T. Os baços foram removidos sob condições estéreis e homogeneizadas. Após a lise de eritrócitos, as células foram lavadas e recolocadas em suspensão em meio completo (RPMI, 10% de soro de bezerro fetal, 0,1 mg/ml de gentamicina, 2 mM de glutamina). As suspensões celulares simples foram recolocadas em placas fundas redondo de 96 reservatórios em uma concentração de 2 x 105 células/reservatório e estimulada com concavalina A (0,5 μg/reservatório) como um controle positivo, rBet v 1 (2 μg/reservatório), KLH (2 μg/reservatório), a mistura de peptídeo (0,34 μg de cada peptídeo/reservatório) ou o meio sozinho por 4 dias. As culturas foram pulsadas com 0,5 μCi/reservatório timidina tritiada por 16 horas e coletada. As resposta da proliferação foram medidos pela contagem de cintilação. A razão do meio de proliferação após a estimulação de antígeno e valores de meio de controle, isto é o índice de estimulação (SI), foi calculado.

[277] Interessantemente, será mostrado que a vacinação terapêutica com peptídeos derivados de Bet v 1 devem reduzir a proliferação específica de Bet v 1 em camundongos sensibilizados por Bet v 1 (grupo S+/T+) comparado aos sensibilizados mas grupos não tratados S+/T-. No grupo tratado e sensibilizado nenhuma proliferação específica de peptídeo será medido, mais de acordo com o efeito do carreador, uma proliferação específica KLH foi observada. A vacina de peptídeo sozinho (grupo S-/T+) induzido principalmente por células T específicas por KLH, mas não perto da resposta da célula T específica por Bet v 1 (Figura 18).

[278] A vacinação profilática com os peptídeos induzidos quase nenhuma proliferação específica por Bet v 1 (grupo P+/S-) comparado aos grupos Bet v 1sensibilizados P-/S+ mas proliferação específica por KLH. Em camundongos profilaticamente vacinados e subseqüentemente sensibilizados (grupo P+/S+) a proliferação específica Bet v 1 foi notavelmente reduzida, além disso, nenhuma resposta específica por peptídeo será observada em qualquer grupo de camundongo (Figura 19).

[279] Deste modo, será mostrado em um modelo de camundongo alérgico que a vacinação profilática com peptídeos de célula B alergeno ligado por carreador não inicia as células T específicas por peptídeo, quase nenhum alergeno específico mas células T específicas de carreadores. A vacinação profilática precede a sensibilização alérgica mas também a vacinação terapêutica de camundongos sensibilizados que reduz a proliferação de célula T específica por alergeno.

[280] O tratamento profilático com peptídeos derivados de Bet v 1 induzido pela resposta Bet v 1 IgG específicas sem a ajuda das células T específicas de Bet v 1. Além disso, o tratamento profilático aumenta a resposta Bet v 1 IgG específica induzida pelo alergeno Bet v 1 já 20 e 40 dias após a primeira sensibilização (Figura 20).

[281] Estes resultados demonstram que a vacina de peptídeo que induz uma resposta Bet v 1 IgG específica pode ser auxiliada pela exposição do alergeno.

[282] Exemplo 25: Peptídeos derivados de Der p 2 mostram a redução a capacidade de ligação de IgE.

[283] A capacidade de ligação de IgE de peptídeos derivados de Der p 2 foi determinado como descrito no exemplos 15.1 e 20.1 utilizando os peptídeos de acordo com a Tabela 13 e usando e soro de indivíduos que sofre de alergia ao ácaro do pó doméstico.Tabela 13: Peptídeos derivados por Der p 2

[284] Os resultados claramente mostram que os peptídeos derivados de Der p 2 da presente invenção exibem significantemente redução da capacidade de ligação IgE. Tabela 14: Resultados

[285] Exemplo 26: Variações no comprimento de peptídeos não tendo efeito na capacidade de ligação de peptídeos IgE, a reatividade da célula T e imunogenicidade.

[286] 26.1. Projeto dos peptídeos

[287] Para estudar os efeitos da variação no comprimento do peptídeo, na capacidade de ligação de IgE, na reatividade da célula T e variantes de imunogenicidade dos peptídeos derivados de Phl p 5 foram projetados pelo aumento do comprimento do peptídeo 1 (P1) e diminuição do comprimento do peptídeo 2 (P2) por um pouco de aminoácido (Tabela 15).

[288] Tabela 15: Posição, seqüência, comprimento de diversos aminoácidos e peso molecular dos peptídeos sintéticos derivados de Phl p 5 (1, 2) e variantes destes (1a, 2b).Tabela 15: Variantes de peptídeos sintéticos derivados de PHL p 5.

[289] Para analisar a reatividade IgE de peptídeos derivados de Phl p 5 1, 2 e suas variantes la, 2b ensaios dot-blot foram realizados aplicando 0,2 μg de peptídeo/e não usando soro de 7 pacientes alérgicos a pólen de capim (p1 a p7) e o soro de um indivíduo não atópico (NHS). A ligação IgE foi ligada com IgE anti-humano rotulado por 125 I (Phadia, Uppsala, Sweden). O rPhl p 5 foi usado como controle positivo e HSA como controle negativo. Os pacientes reagem com rPhl p 5 mas não com os peptídeos e variantes de peptídeos (Fig. 21).

[290] 26.3. Respostas linfoproliferativas

[291] Os PBMCs de 2 pacientes alérgicos à pólen de capim foram estimulados com concentrações diferentes de peptídeos derivados de Phl p 5 1, 2, e suas variantes 1a, 2b e para os propósitos de controle com rPhl p 5. Os índices de estimulação obtido com os peptídeos foram significantemente inferiores do que aqueles obtidos com rPhl p 5 (Fig. 22).

[292] 26.4. Imunogenicidade de variantes de peptídeos

[293] Os coelhos foram imunizados com peptídeos ligados por KLH derivados de Phl p 5 e variantes. Os experimentos por ELISA foram usados para medir a reatividade IgG do anti-soro de coelho obtido aos polipeptídeos e suas variantes (Tabela 16). A imunização com peptídeos e suas variantes induz os anticorpos reativos cruzados IgG que reconhecem o peptídeo e a variante correspondente. Tabela 16: A reatividade cruzada do anti-soro de peptídeo anti-Phl p 5 elevado nos coelhos pela imunização com peptídeos conjugados por KLH. As reatividades IgG de anti-soro de peptídeo aos polipeptídeos (1, 2) e variantes (1a, 2b) são exibidos. Nenhuma reatividade foi observada com soro pré-imune (pré P1, pré P1a, pré P2, pré P2b) a. O anti-soro anti peptídeo 1 (anti P1) reage cruzado com a variante de peptídeo 1 (1a) e anti-soro anti-peptídeo 1a (anti P1a) reage cruzado com peptídeo 1. b. O anti-soro anti-peptídeo 2 (anti P2) reage cruzado com a variante de peptídeo 2 (2b) e o anti-soro anti-peptídeo 2b (anti P2b) reage cruzado com peptídeo 2. Tabela 16: A reatividade cruzada de anti-soro de Coelho

[294] 26.5. A ligação IgE de pacientes alérgicos à pólen de capim inibem o anti-soro de coelho induzido por peptídeo por rPhl p 5

[295] A capacidade do anti-peptídeo 2 de coelho e 2b IgGs para inibir a ligação IgE humana por rPhl p 5 foi estudada por competição por ELISAs. A placa de ELISA liga ao rPhl p 5 e foi pré-incubada com anti P2, anti P2b e, para os propósitos de controle, com o anti-soro anti Phl p 5. As placas foram então expostas ao soro de 12 pacientes alérgicos à pólen de capim. A porcentagem da inibição de ligação IgE por rPhl p 5 é exibido na Tabela 17. O anti-soro anti-peptídeo 2 e anti-peptídeo 2b inibe a ligação IgE em pacientes por rPhl p 5 à mesma extensão.

[296] As competições por ELISAs também foram realizadas com anti-peptídeo 1 de coelho e anti-soro 1a. No exemplo 17 (Imunização com os peptídeos derivados de Phl p 5 que induz os anticorpos IgG que inibem a ligação do pacientes alérgicos à pólen de capim IgE por Phl p 5) os anticorpos de anti- peptídeo 1 (P1) de pacientes que inibem a ligação IgE por Phl p 5 como uma taxa de meio de inibição de 28,5 %. Os resultados similares foram obtidos com anti-soro anti-peptídeo 1a que dão uma taxa de inibição de 23,7 %.

[297] Tabela 17: Inibição da ligação de pacientes IgE por rPhl p 5 pelo anti-soro anti- peptídeo. O anti-soro anti-peptídeo 2 e anti- peptídeo 2b inibe a ligação IgE dos pacientes por rPhl p 5 à mesma extensão. A placa de ELISA liga-se ao rPhl p 5 e será pré-incubada com anti P2, anti P2b e, para os propósitos de controle, com anti-soro anti-Phl p 5. As placas foram então expostas ao soro de 12 pacientes alérgicos à pólen de capim. A porcentagem da inibição de ligação IgE por rPhl p 5 é exibida. Tabela 17: % da inibição da ligação IgE

[298] Exemplo 27: Proteção cruzada de anticorpos antiVP1

[299] O rinovírus humano compreende em cem cepas diferentes. Neste teste de neutralização é mostrado que a infecção de rinovírus de uma cepa pode também ser exibida pelos anticorpos específicos VP1 de uma outra cepa. As células HeLa foram semeadas nos reservatórios em densidade igual. O 100TCD50 HRV14 foi pré-incubado com diluições de anticorpos anti- 14VP1 e anti-89VP1 (não diluídos; 1:2 a 1:32 reservatórios 1 a 6) e adicionados aos reservatórios na linha A e D, respectivamente. Nas linhas B e C 100TCD50 HRV 89 pré-incubadas com diluições de anticorpos anti-14VP1 e anti-89VP1, respectivamente, foram adicionados à células. Após 3 dias vivas as células foram tingidas com violeta. Os anticorpos anti-89VP1 e anti-14VP1 bloqueiam a infecção de HRV14 em uma maneira comparável. Os anticorpos elevados contra 14VP1 e 89VP1 também inibem a infecção de HRV89 até a mesma concentração.

Claims (4)

1. Proteína de fusão hiporalergênica derivada de PHL P 5, caracterizada pelo fato de que consiste nas sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 13 fusionada com pelo menos uma proteína de capsídeo viral, em que a pelo menos uma molécula hipoalergênica é fusionada ao terminal N e/ou terminal C do referido pelo menos uma proteína de capsídeo viral.

2. Proteína de fusão hipoalergênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma proteína de capsídeo viral é derivada de um vírus patogênico humano.

3. Proteína de fusão hipoalergênica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o vírus patogênico humano é um vírus da família picornaviridae.

4. Proteína de fusão hipoalergênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o vírus da família picornaviridae é do gênero rinovírus, preferivelmente das espécies de rinovírus humanos, em particular rinovírus humano de 89 ou 14.