BRPI0712421A2 - proteìna hipoalergênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro, anticorpo, formulação de vacina, usos de uma proteìna hipoalergênica, de um complexo hipoalergênica e de uma proteìna de capsìdeo viral de um vìrus da famìlia picornaviridade, molécula hipoalergênica, e, uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteìna de fusão, uma molécula de ácido nucleico, um vetor ou um anticorpo. - Google Patents

proteìna hipoalergênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro, anticorpo, formulação de vacina, usos de uma proteìna hipoalergênica, de um complexo hipoalergênica e de uma proteìna de capsìdeo viral de um vìrus da famìlia picornaviridade, molécula hipoalergênica, e, uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteìna de fusão, uma molécula de ácido nucleico, um vetor ou um anticorpo. Download PDF

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Johanna Tinhofer
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Abstract

PROTEìNA HIPOALERGêNICA, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, HOSPEDEIRO, ANTICORPO, FORMULAçãO DE VACINA, USOS DE UMA PROTEìNA HIPOALERGêNICA, DE UM COMPLEXO HIPOALERGêNICO E DE UMA PROTEìNA DE CAPSìDEO VIRAL DE UM VìRUS DA FAMìLIA DE PICORNAVIRIDAE, MOLéCULA HIPOALERGêNICA, E, USO DE UMA MOLéCULA HIPOALERGêNICA, UMA PROTEìNA DE FUSãO, UMA MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO, UM VETOR OU UM ANTICORPO. A presente invenção diz respeito a uma proteína hipoalergénica que consiste de pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno, que é fundido ou conjugado a pelo menos uma segunda proteína não alergênica ou fragmento desta.

Description

"PROTEÍNA HIPOALERGÊNICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, HOSPEDEIRO, ANTICORPO, FORMULAÇÃO DE VACINA, USOS DE UMA PROTEÍNA HIPOALERGÊNICA, DE UM COMPLEXO HIPOALERGÊNICO E DE UMA PROTEÍNA DE CAPSÍDEO VIRAL DE UM VÍRUS DA FAMÍLIA DE PICORNAVIRIDAE, MOLÉCULA HIPOALERGÊNICA, E, USO DE UMA MOLÉCULA HIPOALERGÊNICA, UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, UM VETOR OU UM ANTICORPO"
A presente invenção diz respeito a novas moléculas hipoalergênicas e usos destas.
A alergia do tipo I é uma doença de hipersensibilidade mediada por IgE que afeta quase 25 % da população. Isto é fundamentado na re-cognição de antígenos de inseto, veneno, alergeno de alimentos e alergeno de contato de transportados pelo ar nocivos derivados de contes de antígenos nocivas per se, tais como pólen, insetos, bolor e proteínas animais pela imunoglobulina E específica. A reticulação de anticorpos de IgE ligados por células atuadoras leva a uma liberação de mediadores inflamatórios (por exemplo, histamina, leucotrienos) e, desta maneira aos sintomas imediatos de alergia (por exemplo, rinoconjuntivite, asma, dermatite, anafilaxia). A ativação de célula T por intermédio de mecanismo dependentes de IgE bem como independentes de IgE contribui com a inflamação alérgica crônica.
Provavelmente, as únicas formas causativas de tratamento de alergia é a imunoterapia específica de alergeno, que está fundamentada na administração repetida de quantidades crescentes de extratos de alergeno para a maioria das fontes. Numerosos estudos clínicos documentaram a eficácia clínica da imunoterapia de injeção e existe evidência de diversos mecanismos imunológicos básicos deste tratamento. Devido à dificuldade de preparar extratos de alergeno de alta qualidade de certas fontes de alergeno e o fato de que a administração de alergenos a pacientes pode causar efeitos colaterais graves, a imunoterapia específica de alergeno pode ser apenas recomendada para certos grupos de pacientes e manifestações de doenças. É especialmente difícil tratar pacientes com co-sensibilizações a diversas fontes de alergeno diferentes e pacientes que sofrem de manifestações de doença graves, tais como asma alérgico. O asma alérgico é uma das manifestações mais vigorosas de alergia, porque esta afeta gravemente a qualidade de vida diária, causa uma taxa alta de admissões de hospitalidade e pode manifestar, por si só em formas ameaçadoras de vida sérias que requerem cuidado intensivo do paciente.
Os extratos de alergeno preparados a partir de fontes naturais são brutos por natureza e é impossível de influenciar a qualidade e as quantidades de alergenos individuais em tais preparações por meios técnicos. Estes também contém numerosos compostos não alergênicos indefinidos e diversos estudos recentes indicam a qualidade fraca de tais extratos e documenta sua heterogeneidade grande.
Na última década, grande progresso foi feito no campo da caracterização de alergeno molecular usando-se a tecnologia de DNA recombinante. Um grande número dos alergenos que evocam doença importantes foram caracterizados abaixo do nível molecular e alergenos recombinantes que imitam a complexidade de epítopo de extratos de alergeno naturais foram produzidos. Além disso, diversos grupos de pesquisa usaram o conhecimento com respeito às estruturas de alergeno para o desenvolvimento de vacinas alérgicas novas definidas. Engenharia genética, química peptídeo sintética e conjugação de alergenos com seqüências de DNA imunoestimuladoras foram usadas para a redução da atividade alergênica das novas vacinas e, desta maneira, da taxa de efeitos colaterais induzidos por terapia. Os primeiros estudos clínicos promissores foram conduzidos com tais derivados de alergeno. Interessantemente, é dito que embora a reatividade de IgE de alergenos recombinantes geneticamente projetados e peptídeos contendo epítopo de célula T sintético derivado de alergeno possa ser fortemente reduzida ou ainda abolida, estes derivados ainda podem induzir efeitos colaterais sistêmicos que aparecem várias horas após a injeção. Por exemplo, foi relatado que os peptídeos de epítopo de célula T do alergeno de gato principal, Fel d 1, asma induzido e hiperreatividade brônquica diversas horas após a injeção intracutânea e existe evidência forte de que este efeito é mediado pela célula T e restrito por MHC.
Este resultado indica que a remoção da reatividade de IgE diminui os efeitos colaterais mediados por IgE visto que nenhuma reação imediata foi registrada no curso destes estudos de imunoterapia. Entretanto, os epítopos de célula T específicos de alergeno que foram preservados nos derivados de alergeno recombinantes bem como nas misturas de peptídeo são responsáveis pelos efeitos colaterais tardios (por exemplo, dermatite muito problemática ou atópica, manifestação de pele alérgica mediada por célula T crônica). Os efeitos colaterais causados no caso de derivados de alergeno recombinantes foram relativamente brandos no caso das vacinas de peptídeo de célula T puderem ser superadas pela dosagem adequada. Ambos os dois novos métodos, portanto, parecem muito promissores para a imunoterapia de rinoconjuntivite alérgica mas pode ter limitações quando ocorre o tratamento de diversas formas de asma alérgico, onde a indução de efeitos colaterais tardios no pulmão pode ser muito problemática.
A fim de administrar e conseqüentemente provocar uma resposta imune eficiente contra peptídeos, polipeptídeos e proteínas, adjuvantes e/ou carreadores são regularmente usados. O adjuvante de Freund completo, por exemplo, é um dos adjuvantes mais potentes disponíveis. Entretanto, por causa de seus efeitos colaterais, seu uso não é aprovados para seres humanos. Portanto, existe uma necessidade de composições de vacina capazes de induzir respostas imunes fortes contra peptídeos e polipeptídeos derivados de alergenos e, é claro, de outros antígenos que evitam o uso do adjuvante de Freund completo. Além disso, enquanto o BSA foi usado de maneira bem sucedida como um carreador em modelos animais este pode não ser apropriado para o uso em composições de vacina humana por causa do risco de reações adversas tal como o risco de transmissão de doença priônica (doença de Creutzfeldt-Jakob variante). Um outro desafio para o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra alergenos é a necessidade de uma resposta imune capaz de diminuir rapidamente os alergenos em um indivíduo ou animal. Portanto, altas concentrações de anticorpos específicos de alergeno no sangue, que são principalmente do subtipo IgG, são necessários. Nas superfícies de mucosa, os anticorpos IgA são o subtipo primário.
A toxina da cólera, uma proteína carreadora conhecida na técnica, também é usada regularmente como um adjuvante, eliminando a necessidade do adjuvante de Freund completo em uma composição de vacina. Entretanto, a toxina da cólera aumenta os níveis de anticorpo IgE totais e específicos e leva a reações inflamatórias associadas com IgE.
Devido aos efeitos colaterais provocados pela maioria das proteínas carreadoras usadas para a vacinação, existe uma necessidade quanto a sistemas carreadores que são capazes de estimular respostas imunes contra alergenos ou outros antígenos, sem usar adjuvantes tóxicos, sem usar proteínas carreadores deficientemente toleradas e, em certas situações, sem estímulo de respostas imunes potencialmente patológicas. Novos sistemas carreadores que encontram estas especificações podem ser usados com relação à informação de novos conjugados e composições adequadas para o tratamento ou prevenção de doenças como as doenças alérgicas.
Em Bohle B. et al. (J. Immunol. 172 (11) (2004): 6642-6648) uma proteína de fusão recombinante que compreende uma proteína de camada Sea porção Bet v 1 é descrita. Esta molécula compreende a proteína Bet v 1 hiperalergênica natural. O WO 2004/004761 diz respeito a partículas semelhantes a vírus que são fundidos a um imunogênio e que podem ser usados para a imunização.
No WO 2004/003143, o uso de proteínas de fusao que compreende uma partícula semelhante a vírus e uma molécula hiperalergênica como imunogênio para a vacinação é divulgado.
É um objetivo da presente invenção fornecer medicamentos e carreadores que superam as desvantagens mencionadas acima e permitem uma vacinação de alergeno com os efeitos colaterais reduzidos.
Portanto, a presente invenção diz respeito a uma proteína hipoalergênica que consiste de pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno, que é fundido ou conjugado a pelo menos uma segunda proteína não alergênica ou fragmento desta.
A fim de provocar uma resposta imune intensificada contra uma molécula, em particular de uma molécula hipoalergênica de acordo com a presente invenção, a dita molécula é fundida (por engenharia genética) ou conjugada (pelas reações químicas) a um carreador. Um carreador convencional e regularmente utilizado é, por exemplo, KLH (hemocianina de lapa buraco de fechadura). O KLH, que é isolado do molusco marinho gigante Megathura crenulata, é uma das proteínas carreadoras mais populares usados para criar um imunogênio para injeção. O KLH induz uma resposta de anticorpo forte por causa de sua massa grande por que esta não é uma proteína de mamífero.
A segunda proteína (o "carreador" ou "proteína carreadora") a ser fundida ou conjugada a uma molécula hipoalergênica da invenção não é derivada de um alergeno ("não alergênica"). Entretanto, a proteína carreadora usada na presente invenção pode apresentar reatividade de célula T e/ou provocar uma resposta imune contra ela mesma e a molécula hipoalergênica fundida ou conjugada a esta quando administrado a um corpo animal ou humano. Conseqüentemente, se a proteína carreadora for derivada de um patogênio (por exemplo, vírus, bactérias, etc.), anticorpo (protetor) direcionado ao dito carreador e patogênios são produzidos.
Como usado neste, "proteína hipoalergênico" significa uma proteína/polipeptídeo de fusão de um carreador de uma fonte não alergênica com uma molécula hipoalergênica. Além disso, uma "proteína hipoalergênica" também é pretendida ser um produto de conjugação (por exemplo, ligação química, adsorção) de um carreador com uma molécula hipoalergênica.
"Hipoalergênico" como usado neste, refere-se a moléculas com potencial alergênico reduzido. Tais moléculas têm uma capacidade diminuída para provocar reações alérgicas em um indivíduo comparado com a proteína do tipo selvagem a partir das quais estas moléculas são derivadas.
A pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno e fundida/conjugada a uma segunda proteína é preferivelmente truncado de terminal C e/ou Ν. A "truncação de terminal C e/ou N", como usado neste, significa que os resíduos de aminoácido do terminal N ou do terminal C ou ambos do terminal N e C do alergeno do tipo selvagem são removidos por anulação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30 resíduos de aminoácido.
As moléculas hipoalergênicas, isto é, peptídeos/polipeptídeos, compreende preferivelmente de 10 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente de 15 a 40 aminoácidos, em particular, de 20 a 30 aminoácidos e apresentam reatividade IgE reduzida. Estas moléculas são designadas excluir os epítopos de célula T que podem causar efeitos colaterais mediadas pela célula T. Os epítopos e as moléculas de célula T que apresentam a resposta da célula T reduzida podem ser determinados e identificados pelos métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica (por exemplo, Bercovici N. et al. Clin Diagn Lab Immunol. (2000) 7:859-864). Foi observado que é possível projetar vacinas de peptídeo derivadas de alergenos como os alergenos de pólen de grama principais, por exemplo, Phl ρ 1 e para o alergeno de pólen de bétula, Bet v 1, usando-se peptídeos expostos de superfície. Os dados obtidos mostram que tais vacinas de peptídeo podem ser produzidos para qualquer alergeno cuja estrutura primária é conhecida de acordo com o mapeamento de epítopo de IgE, os dados de estrutura tri-dimensional ou predição auxiliada por computador de domínios expostos por superfície. Entretanto, a seleção de peptídeos adequados que podem ser usados para a vacinação permanecer crucial, porque nem todos os peptídeos identificados com estes métodos podem ser utilizados na vacinação. Os peptídeos adequadamente usados para os propósitos de vacinação devem apresentar capacidade de ligação de IgE reduzida e - a fim de reduzir ou evitar os efeitos colaterais tardios - apresenta a reatividade de célula T reduzida.
O termo "derivado de um alergeno", como usado neste, significa que as moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção são obtidos diretamente de um alergeno por fragmentação ou truncação. A seqüência de aminoácido das moléculas hipoalergênicas da presente invenção são preferivelmente pelo menos 80 % idênticos, mais preferivelmente pelo menos 90 % idênticos, mais preferivelmente pelo menos 95 % idênticos, em particular 100 % idênticos, para o estiramento da seqüência amino do alergeno do tipo selvagem, a partir do qual a molécula hipoalergênica é derivada. Entretanto, as moléculas que não são 100 % idênticos aos fragmentos de alergeno do tipo selvagem devem ser capazes de ligar-se com pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % de concentração para um anticorpo ou para anticorpos, preferivelmente a anticorpos de IgG, que são direcionados aos fragmentos de alergeno do tipo selvagem.
Os graus de identidade de uma primeira seqüência de aminoácido a um segundo aminoácido pode ser determinado por uma comparação direta entre ambas as seqüências de aminoácido usando-se certos algoritmos. Tais algoritmos são, por exemplo, incorporados em vários programas de computador (por exemplo, "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-25; Corpet F, Nucl. Acids Res. (1988) 16:10881-10890).
As moléculas truncadas de acordo com a presente invenção pode ser definida como as partes sendo do alergeno completo que induz a ativação menor de células T específicas de alergeno do que o alergeno do tipo selvagem completo (preferivelmente pelo menos a 30 %, mais preferivelmente pelo menos uma redução de 50 %, mais preferivelmente pelo menos uma de 70 %), apresenta uma atividade alergênica maior do que 50 % (preferivelmente maior do que 70 %) como avaliado por ensaios de ligação de IgE e a capacidade de induzir a ativação de célula mediada por IgE e quando ligado a um carreador como descrito induzir os anticorpos de IgG que apresenta a ligação de IgE policlonal de pacientes alérgicos ao alergeno do tipo selvagem completo.
Os peptídeos devem conter seqüências dos alergenos para evitar sobreposições com os mimótopos. Os mimótopos, entretanto, que são imitações de peptídeo pequenas (menores do que 15 aminoácidos) de pedaços de antígenos e são obtidos de bibliotecas de peptídeo randômico não representam moléculas derivadas de alergeno originais como definido neste. Estes não podem ser suados de acordo com a invenção porque estes são muito pequenos para induzir uma resposta de IgG de bloqueio robusto.
As moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção podem ser obtidas pelos métodos recombinantes ou síntese química. Alternativamente, é claro, também é possível obter as moléculas pela clivagem enzimática ou química do alergeno do tipo selvagem ou um polipeptídeo/proteína que abriga a molécula de interesse. A molecula hipoalergênica pode compreender preferivelmente pelo menos duas moléculas de alergeno truncadas derivadas de pelo menos um alergeno, em que a ordem dos fragmentos de alergeno truncados diferem da ordem dos fragmentos no alergeno do tipo selvagem se pelo menos as duas moléculas forem derivadas do mesmo alergeno.
A molécula hipoalergênica de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais (preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3) moléculas hipoalergênicas como definido neste, desta maneira, resultando em uma proteína de fusão. As moléculas hipoalergênica simples da proteína de fusão que, é claro, também precisa da capacidade de ligação de IgE e precisa de epítopos de célula T, podem ser derivadas de alergenos da mesma origem e/ou diferente. Se as moléculas forem derivadas do mesmo alergeno, a ordem na proteína de fusão hipoalergênico não deve ser idêntica à ordem no alergeno do tipo selvagem (isto evita a reconstituição e a formação de locais de ligação) (ver, por exemplo, W02004/065414, Linhart B and Valenta R (Int Arch Allergy Immunol. (2004) 134:324-31)).
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a pelo menos uma molécula hipoalergênica é fundida ao terminal N e/ou terminal C da dita pelo menos uma segunda proteína ou fragmento desta.
O alergeno ou os fragmentos deste podem ser conjugados quimicamente, por exemplo, ou pelos métodos recombinantes um ao outro. Se o alergeno ou fragmento deste for conjugado quimicamente a um carreador, o dito alergeno ou fragmento deve ser fornecido com um resíduo de cisteína terminal (resultando em um grupo sulfidrila livre). Ao dito resíduo de cisteína terminal, (terminal N ou C) qualquer proteína carreadora ativada por maleimida pode ser conjugada, desta maneira, criando um complexo de imunogênio/carreador. Se o alergeno ou fragmento deste não tiver um grupo sulfidrila em um terminal, química EDC (cloridreto de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida) a fim de ligar as aminas (Iisina) ou ácidos carboxílicos (ácido glutâmico, aspártico ou 5'-fosfato) à proteína carreadora pode ser utilizada.
Se a molécula hipoalergênica fundida ao terminal N ou C do carreador, métodos recombinantes são utilizados.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a pelo menos uma segunda proteína é um é uma proteína viral, em particular RNA ou DNA viral, bacteriana, fungica ou de protozoário.
A pelo menos uma segunda proteína ("carreador") pode ser de qualquer um da origem mencionada acima. Entretanto, em particular é preferido usar proteínas que provoquem uma resposta imune contra a proteína, por si só e a molécula hipoalergênica fundida ou conjugada a este. Devido à indução de formação de anticorpos (protetores) também direcionados a pelo menos uma segunda proteína, a proteína hipoalergênico de acordo com a presente invenção também pode ser utilizada como vacina para a dita segunda proteína e sua fonte de origem (por exemplo, vírus, bactérias, fungos). É claro, também é possível usar proteínas carreadoras bem conhecidas na técnica (por exemplo, KLH) pelo menos como a segunda proteína.
A proteína viral de acordo com a presente invenção é, preferivelmente uma proteína de capsídeo.
As proteínas de capsídeo virais são especialmente adaptadas porque estas induzem a atividade antiviral, provocam a formação de anticorpos com adesão de bloco de vírus, por exemplo, rinovírus, a células epiteliais, apresentam uma atividade imunomoduladora em torno de uma resposta de Thl, aumenta a imunogenicidade do peptídeo (isto é, antipeptídeo superior e em conseqüência, níveis superiores de anticorpos IgG protetores), são adaptados e experimentados para a vacinação profilática (vacinação viral) e são seguros, quando as proteínas de capsídeo são usadas aqueles seres humanos estão continuamente expostos (por exemplo, rinovírus).
De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção a pelo menos uma proteína de capsídeo viral é derivada de um vírus patogênico humano, preferivelmente um vírus da família de pi- cornaviridae.
O vírus da família de picornaviridae é, preferivelmente do gênero de rinovírus, preferivelmente das espécies de rinovírus humanos, em particular, rinovírus humano 89 e 14. A proteína de capsídeo pode ser VP1, VP2, VP3 e/ou VP4.
O alergeno a ser fundido a uma proteína de capsídeo viral é preferivelmente selecionado do grupo que consiste de alergenos de pólen de bétula principal, em particular Bet ν 1 e Bet ν 4, alergenos de pólen de capim- rabo-de-rato principal, em particular Phl ρ 1, Phl ρ 2, Phl ρ 5, Phl ρ 6 e Phl ρ 7, alergenos de ácaro do pó doméstico, em particular Der ρ 1 e Der ρ 2, alergeno de gato principal Fel d 1, alergenos de abelha principais, alergenos de vespa principais, profilinas, especialmente Phl ρ 12 e alergenos de ácaro de armazenagem, especialmente Lep d 2.
Outros alergenos adaptados a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser derivados da seguinte tabela.
ALERGENOS
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Referências
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De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a molécula hipoalergênica apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida.
De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção a molécula hipoalergênica apresenta reatividade de célula reduzida.
Entretanto, também, os fragmentos de alergeno que compreendem pelo menos um epítopo de célula T podem ser usados na proteína hipoalergênica de acordo com a presente invenção.
"que apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida", como usado neste, significa que as moléculas de acordo com a presente invenção mostra capacidade ou atividade de ligação de IgE significantemente reduzida (pelo menos 50 % menos, preferivelmente pelo menos 70 % menos, mais preferivelmente pelo menos 80 % menos, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % menos, mais preferivelmente pelo menos 95 % menos, capacidade de ligação em comparação com o alergeno do tipo selvagem) ou ainda perda deste em todos.
A atividade/capacidade de ligação de IgE de moléculas semelhantes a peptídeos e proteínas pode ser determinado por, por exemplo, um ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA) usando-se, por exemplo, soro obtido de um paciente, (isto é, um paciente alérgico) que foi previamente exposto ao alergeno do tipo selvagem. Resumidamente, um peptídeo a ser testado é revestido nos reservatórios de uma placa microtituladora. Após a lavagem e o bloqueio dos reservatórios, uma solução de anticorpo consistindo do plasma de um paciente alérgico, que foi exposto ao peptídeo sendo testado ou proteína a partir da qual este foi derivado, é incubada nos reservatórios. Um anticorpo secundário rotulado é adicionado aos reservatórios e incubado, a quantidade de ligação de IgE é então quantificada e comparada à quantidade de IgE ligado por um alergeno do tipo selvagem purificado.
Alternativamente, a atividade de ligação de um peptídeo pode ser determinada pela análise de Western blot. Por exemplo, um peptídeo a ser testado é usado e um gel de poliacrilamida usando-se SDS-PAGE. O peptídeo é então transferido à nitrocelulose e subseqüentemente incubado com soro de um paciente alérgico. Após a incubação com o anticorpo secundário rotulado, a quantidade de IgE ligada é determinada e quantificada.
Um outro ensaio que pode ser suado para determinar a ligação da atividade de IgE de um peptídeo é um ensaio ELISA de competição. Resumidamente, um grupo de anticorpo IgE é gerado pela combinação de plasma de pacientes alérgicos que mostraram, por ELISA direto, ser reativo ao IgE com alergeno do tipo selvagem. Este grupo é usado em ensaios de competição de ELISA para a comparação da ligação de IgE ao alergeno do tipo selvagem ao peptídeo testado. A ligação de IgE para o alergeno do tipo selvagem e o peptídeo sendo testado é determinada e quantificada.
Um "epítopo de célula T" significa uma proteína (por exemplo, alergeno) ou fragmento desta, para que a célula T tenha um local de ligação específico, o resultado da ligação ao dito local de ligação à célula Τ. O termo "apresenta reatividade de célula T reduzida", como usado neste, refere-se à moléculas que apresentam reatividade de célula T que é significantemente reduzida em comparação com o estímulo reduzido em comparação com o estímulo induzido pelo alergeno do tipo selvagem, a partir do qual a molécula hipoalergênica é derivadas usando-se quantidades equimolares em ensaios padrão conhecidos na técnica (reatividade de célula T reduzida significa pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 90%, menos estímulo de molécula hipoalergênicas em comparação com o alergeno do tipo selvagem em quantidades equimolares). Em uma forma de realização preferida particular desta invenção, as moléculas podem "perder" os epítopos de célula T e, desta maneira, a molécula mostra reatividade de célula T reduzida nos indivíduos a serem tratados (isto é, que devem receber uma molécula de plataforma de valência que apresenta epítopo). É provável que, por exemplo, uma molécula derivada de alergeno possa precisar de epítopos de célula T com respeito a um indivíduo ou a um grupo de indivíduos, enquanto possuem um epítopo de célula T com respeito a outros indivíduos. Os métodos para detectar a presença de um epítopo de célula T são conhecidos na técnica e incluem ensaios que detectam a proliferação de célula T (tal como a incorporação de timidina). Os imunogênios que falham em induzir a incorporação estatisticamente significante de timidina acima da base (isto é, no geral ρ menos que 0,05 usando-se métodos estatisticamente padrão) são, no geral considerados precisar dos epítopos de célula T, embora seja estimado que a quantidade quantitativa de incorporação de timidina possa variar dependendo do imunogênio sendo testado (ver, por exemplo, Zhen L. et al. (Infect Immun. (2003) 71:3920-3926)). No geral, um índice de estímulo abaixo de cerca de 2 a 3, mais preferivelmente menos do que cerca de 1, indica perda de reatividade de célula T e epítopos. A presença de epítopos de célula T também pode ser determinada pela medição da secreção de linfocinas derivadas de célula T de acordo com métodos padrão. O índice de estímulo (SI) pode ser calculado pela divisão da taxa de proliferação (entrada de timidina) de células estimuladas através da taxa de proliferação de células não estimuladas em meio apenas. SI=I significa nenhum estímulo, SI<1 indica efeitos tóxicos e SI>1 indica estímulo de células. A localização e o teor do epítopo de células T, se presentes, podem ser determinados empiricamente.
A secreção de citocina pode ser determinada além do estímulo de células T. Por exemplo, IFN-gama foi reconhecido como uma citocina nociva. Outros exemplos podem ser TNF-alfa, IL-5, IL-4, IL-8 etc.
O fragmento de alergeno é preferivelmente composto de aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 ou 212 a 241 de Phl ρ 1, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a 162, 217 a 246, 252 a 283 ou 176 a 212 de Phl ρ 5, aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 de cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 de cadeia 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79 ou 75 a 104 de Bet ν 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der ρ 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der ρ 7, aminoácidos 1-35, 36- 70, 71-110, 111-145, 140-170, 175-205, 210-250 ou 250-284 de Der ρ 10, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der ρ 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art ν 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241. a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou fragmentos ou variações de seqüência destes.
As seqüências de aminoácido específicas das moléculas derivadas de alergeno identificadas acima são:
<table>table see original document page 42</column></row><table> <table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table>
Os termos "fragmentos destes" e "variações de seqüência destes" referem-se a peptídeos que são deduzidos das moléculas derivadas de alergeno divulgados neste e mostram propriedades bioquímicas (por exemplo, a capacidade de evitar a ligação de IgE ao alergeno a partir do qual estas moléculas são derivadas) que são comparáveis ou idênticos As ditas moléculas derivadas de alergeno. Os fragmentos da presente invenção compreendem, pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 10, sucessivos e/ou um máximo de 95%, preferivelmente um máximo de 90%, mais preferivelmente um máximo de 80 10% de resíduos de aminoácido da molécula derivada de alergeno. O termo "variação de seqüência" inclui modificações tais como fragmentação (ver acima), substituições de aminoácido (por exemplo, com outros aminoácidos naturais ou não naturais ou derivados de aminoácido), anulações ou adições. "Variação de seqüência" também refere-se às ditas moléculas derivadas de alergeno da tabela acima, em que pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 (5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20) resíduos de aminoácido são adicionados ao terminal C e/ou N.
É observado que o alergeno clone 30 é um alergeno derivado do ácaro de pó doméstico Dermatophagoides pteronyssinus e consiste da seguinte seqüência: MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFA DPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGNTRWNEDEETCT (SEQ ID N0 140; ver também AT A 733/2006).
De acordo com a presente invenção também são abrangidos peptídeos que são pelo menos 80% idênticos, preferivelmente 90 % idênticos, às seqüências de aminoácido divulgadas neste.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína hipoalergência fundida de acordo com a presente invenção.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
O dito vetor é preferivelmente um vetor de expressão.
O vetor que abriga a molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser usado para os propósitos de clonagem ou para a produção de vetores de expressão. O dito vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou qualquer outro vetor comumente usado na engenharia genética e pode incluir, além da molécula de ácido nucleico da invenção, elementos eucarióticos ou procarióticos para o controle da expressão, tal como seqüências reguladoras para a iniciação e a terminação da transcrição e/ou tradução, intensificadores, promotores, seqüências sinalizadoras e outros.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o vetor é um vetor bacteriano, fungico, inseto, viral ou mamífero.
O vetor da presente invenção pode ser preferivelmente utilizado para os propósitos de clonagem e expressão em vários hospedeiros. Portanto, o dito vetor compreende, além disso, um ácido nucleico que codifica uma molécula hipoalergênica ou proteína de fusão de acordo com a presente invenção, seqüências reguladoras específicas de hospedeiro.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um hospedeiro que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a presente invenção.
A molécula de ácido nucleico e o vetor de acordo com a presente invenção podem ser introduzidos em um hospedeiro adequado. A dita molécula pode ser incorporada no genoma do hospedeiro. O vetor pode existir de maneira extracromossômica no citoplasma ou incorporado no cromossomo do hospedeiro.
Ainda, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um anticorpo direcionado contra a molécula hipoalergênica, proteína de fusão hipoalergênica ou uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção incluem, mas não limitam-se a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab') e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Além disso, os anticorpos são considerados serem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contém um local de ligação de antígeno que ligam-se imunoespecificamente um antígeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção são, preferivelmente dos tipos IgG, IgM, IgD, IgA e IgY, classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.
Os anticorpos policlonais podem ser preparados pela mistura de um polipeptídeo da invenção, preferivelmente usando-se um adjuvante, a um mamífero não humano e coletando-se o anti-soro resultante. Os tituladores melhorados podem ser obtidos por injeções repetidas por um período de tempo. Não existe limitação particular às espécies de mamíferos que podem ser usadas para evocar os anticorpos; no geral, é preferido usar coelhos ou porquinhos da índia, mas cavalos, gatos, cães, cabras, porcos, ratos, vacas, ovelhas, camelos etc., também podem ser usados. Na produção de anticorpos, uma quantidade definida de imunogênio da invenção é, por exemplo, diluída com solução salina fisiológica a uma concentração adequada e a solução diluída resultante é misturada com, por exemplo, adjuvante de Freund completo para a preparação de uma suspensão ou com géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tal como lisol- ecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianinas do lapa buraco de fechadura, dinitrofenol e, potencialmente, adjuvantes úteis humanos, tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e corynebacterium parvum. As suspensões e as misturas são administradas a mamíferos, por exemplo, intraperitonealmente, por exemplo, a um coelho, usando-se de cerca de 50 μg a cerca de 2.500 μg de polipeptídeo da invenção por administração. A suspensão é preferivelmente administrada a cada duas semanas por um período de até cerca de 2 a 3 meses, preferivelmente cerca de 1 mês, para realizar a imunização. O anticorpo é recuperado pela coleta de sangue a partir do animal imunizado após a passagem de 1 a 2 semanas após a última administração, centrifugando-se o sangue e isolando-se o soro do sangue.
Os anticorpos monoclonais podem, por exemplo, ser de origem humana ou murina. Os anticorpos monoclonais de murino podem ser preparados pelo método de Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495), por exemplo, pela fusão de células baço de camundongos hiperimunizados com uma linha celular de mieloma de camundongo apropriada.
Um anticorpo quimérico é uma molécula, em que, porções diferentes do anticorpo são derivadas de espécies animais diferentes, tais como anticorpos tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; US 5.807.715; US 4.816.567 e US 4.816.397.
Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécie não humana que liga o antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a partir das espécies não humanas e regiões de estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana. Freqüentemente, os resíduos de estrutura nas regiões de estrutura humanas serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente melhorar a ligação de antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas pelos métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, modelando-se as interações do CDR e dos resíduos de estrutura para identificar os resíduos de estruturas importantes para a ligação de antígeno e comparação de seqüência para identificar os resíduos de estrutura não usuais em particular posições (ver, por exemplo, Queen et al., US 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Os anticorpos podem ser humanizados usando-se uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400; WO 91/09967; US 5.225.539; US 5.530.101 e US 5.585.089), polimento ou reformação de superfície (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-913 (1994)) e mistura de cadeia (US 5,565,332).
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser vantajosamente usados para a dessensibilização de um indivíduo que sofre de uma alergia, em particular de alergia de ácaros de pó doméstico. Para a imunização passiva, o anticorpo é preferivelmente um IgG ou um derivado destes (por exemplo, anticorpo quimérico ou humanizado). Além disso, este anticorpo também pode ser usado para a dessensibilização de um indivíduo.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma formulação de vacina que compreende uma proteína hipoalergênica ou um anticorpo de acordo com a presente invenção.
A formulação de vacina de acordo com a presente invenção pode ser formulada como conhecido na técnica e necessariamente adaptada ao meio de administração da dita formulação de vacina.
Os meios preferidos de administração de uma formulação de vacina (da presente invenção) incluem todos os regimes de administração descritos e sugeridos para a vacinação em geral e imunoterapia de alergia especificamente (oral, transdérmica, intravenosa, intranasal, por intermédio da mucosa, retalmente, etc). Entretanto, é particularmente preferido administrar as moléculas e proteínas de acordo com a presente invenção subcutânea ou intramuscularmente.
A formulação de vacina de acordo com a presente invenção pode apenas compreender uma proteína de capsídeo viral ou fragmentos destes de um membro do gênero de rinovírus.
A dita formulação preferivelmente ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente farmacêutico aceitável e/ou conservante.
A fim de aumentar a imunogenicidade das moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção, adjuvantes, por exemplo, podem ser usados em um medicamento de acordo com a presente invenção. Um adjuvante de acordo com a presente invenção é um agente auxiliar que, quando administrado junto ou em paralelo com um antígeno, aumenta a sua imunogenicidade e/ou influencia a qualidade da resposta imune. Em conseqüência, o adjuvante pode, por exemplo, influenciar consideravelmente a extensão da resposta humoral ou imune celular, os adjuvantes de costume são, por exemplo, compostos de alumínio, compostos contendo lipídeo ou micobactérias inativadas.
No geral, os adjuvantes podem ser de formas diferentes, contanto que estes sejam adequados para a administração a seres humanos. Os exemplos adicionais de tais adjuvantes são emulsões oleosas de origem mineral ou vegetal, compostos minerais, tais como fosfato ou hidróxido de alumínio ou fosfato de cálcio, produtos e derivados bacterianos, tais como P40 (derivado da parede celular de Corynebacterium granulosum), monofosforil lipídeo A (MPL, derivado de LPS) e derivados de peptídeo de muramila e conjugados destes (derivados de componentes de micobacterium), alume, adjuvante de Freund incompleto, liposina, saponina, esqualeno, etc. (ver, por exemplo, Gupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993)) and Johnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289).
De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção, dita formulação compreende 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica ou anticorpo.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma proteína hipoalergênica ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral e/ou uma alergia em um ser humano ou animal. O dito medicamento, preferivelmente ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitável.
O medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado para ativar (administração da proteína hipoalergênica e/ou moléculas da invenção) bem como para inativar a imunização (anticorpos direcionados à proteína hipoalergênica e/ou moléculas da invenção).
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o dito medicamento compreende de 10 ng a 1 g, preferivelmente de 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo.
O medicamento é preferivelmente administrado a um indivíduo em uma quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.
O regime de dosagem particular, isto é, dose, regulação de tempo e repetição, dependerá do indivíduo particular e daquele histórico médico do indivíduo. As considerações empíricas, tais como a vida média, no geral, contribuirão para a determinação da dosagem. A freqüência de administração pode ser determinada e ajustada no curso da terapia.
O indivíduo cujo medicamento de acordo com a presente invenção é administrado é preferivelmente um indivíduo ou animal que está em risco de ter uma alergia.
Os pacientes tendo ou em risco de ter uma condição alérgica, distúrbio ou doença incluem pacientes com uma condição alérgica existente ou conhecida ou uma predisposição suspeita com relação ao desenvolvimento de um sintoma associado com ou causado por uma condição alérgica. Desta maneira, o paciente pode ter uma condição, distúrbio ou doença alérgica crônica ativa, um episódio alérgico agudo ou uma condição alérgica latente. Certas condições alérgicas estão associadas com fatores ambientais sazonais ou geográficos. Desta maneira, pacientes em risco incluem aqueles em risco de sofrer de uma condição com base em um histórico pessoal ou familiar anterior e a estação ou localização física, mas que a condição ou um sintoma associado com a condição pode não se manifestar presentemente no paciente por si só.
A administração do medicamento de acordo com a presente invenção, que compreende pelo menos uma molécula hipoalergênica como descrito neste, a um indivíduo pode evitar a sensibilização do dito indivíduo ou pode induzir uma resposta imune apropriada a alergenos. Se o medicamento da presente invenção for usado para evitar a sensibilização, este deve ser administrado ao indivíduo antes do primeiro contato com o dito alergeno. Portanto, é preferido administrar o medicamento de acordo com a presente invenção a recém nascidos e crianças. Também é verificado que a administração do medicamento de acordo com a presente invenção a indivíduos gestantes induzirá a formação de anticorpos direcionados contra alergenos na criança futura. E especialmente benéfico usar moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção para tais terapias, porque devido à perda do epítopo de células T, efeitos colaterais que ocorrem no curso da imunoterapia de alergeno podem ser significantemente reduzidos ou ainda completamente evitados.
Ainda, um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma proteína hipoalergênica ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para o diagnóstico de uma alergia e/ou uma infecção viral em um indivíduo.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma proteína de capsídeo viral de um vírus da família de picornaviridae como um carreador em medicamentos ou vacinas ou para diagnosticar uma infecção viral, em particular resfriado comum. Como uma alternativa valiosa, à proteína carreadora de KLH amplamente dispersada, proteínas de capsídeo virais de vírus da família de picornaviridae podem ser usados. O carreador pode ser conjugado quimicamente ou fundido com técnicas recombinantes às peptídeos, proteínas e polipeptídeos ou outros antígenos. Além disso, a proteína de capsídeo viral pode ser usada para detectar, por exemplo, anticorpos direcionados à dita proteína de capsídeo no soro de um indivíduo.
Uma das vantagens de um tal carreador é que não apenas o antígeno fundido ou conjugado neste pode ser exposto ao sistema imune, mas também uma resposta imune contra a proteína de capsídeo de um rinovírus ser induzida. Conseqüentemente, uma tal vacinação leva à prevenção e/ou tratamento de doenças causadas por rinovírus. O vírus é preferivelmente da espécie de rinovírus humano, em particular rinovírus humano 89 e 14.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um molécula hipo-alergênica derivada de Phl ρ 5 (Genbank Nr. X7435) tendo uma truncação de terminal C e/ou N e que precisa substancialmente da capacidade de ligação de IgE.
O pólen de grama é uma das fontes sazonais externas mais potentes de alergenos carregados pelo ar responsáveis pela febre do feno e asma alérgico.
Mais do que 40% de indivíduos alérgicos apresentam reatividade de IgE com alergenos de pólen de grama, que são divididos em mais do que 11 grupos. Mais do que 80% dos pacientes alérgicos ao pólen de grama reagem com alergenos do grupo 5.
Os alergenos do grupo 5 são não glicosilados, proteínas altamente homólogas com uma faixa de massa molecular de 25 a 33 kD. Diversos alergenos do grupo 5 alergenos foram clonados e/ou imunologicamente caracterizados.
O teste para reduzir a atividade alergênica pela introdução de mutações de ponto, mutações de diversos aminoácidos em linha ou anulações não apresentaram nenhum efeito (Schramm G, et al. J Immunol 1999; 162: 2406-1435). A ligação de regiões IgE de Phl ρ 5 (Flicker S, et al. J Immunol 2000; 165: 3849-3859) que já foi descrita na estrutura tri-dimensional foi resolvida (Maglio O, et al. 2002. Protein Eng. 15:635-642).
É mostrado que, em particular os peptídeos Phl ρ 5 de acordo com a presente invenção, que são truncados no terminal C e/ou N e perdem capacidade de ligação de IgE, podem ser utilizados para a vacinação ativa de indivíduos.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a molécula truncada perde os epítopos de célula T.
Como já resumido acima, os efeitos colaterais tardios de imunoterapia de alergeno podem ser significantemente reduzidos ou ainda serem evitados se uma molécula hipoalergênica substancialmente perder os epítopos de célula T.
As moléculas de Phl ρ 5 que precisam dos epítopos de célula T são compostas de aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58 ou 252 a 283 de Phl ρ 5 ou fragmentos ou variações de seqüências destes.
Em particular, estas moléculas truncadas substancialmente não mostram epítopos de célula T e são, entretanto, capazes de provocar uma resposta imune apropriada direcionada contra o alergeno do tipo selvagem.
De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção o Phl ρ 5 truncado hipoalergênico é composto de aminoácidos de 132 a 162, 217 a 246 ou 176 a 212 de Phl ρ 5 ou variações de seqüência destes.
Estas moléculas hipoalergênicas compreendem um ou mais epítopos de célula T mas perdem a capacidade de ligação de IgE.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma molécula hipo-alergênica derivada de Fel d 1 (Genbank N0 X62477 e Χ62478) tendo uma truncação de terminal C e/ou N e que precisa da capacidade de ligação de ligação de IgE.
As alergias a animais afetam até 40 % de pacientes alérgicos. No ambiente doméstico, as alergias aos animais domésticos mais populares, cães e gatos, são particularmente prevalescentes e conectadas com sintomas perenes. Os alergenos animais estão presentes em caspa, epitélio, saliva, soro e urina. A exposição aos alergenos pode ocorrer pelo contato direto com a pele ou por inalação de partículas que carregam os alergenos. Os alergenos de cães e gatos principais mostraram-se estar presentes muito difundidos e ainda podem ser detectados em casas que não possuem animais domésticos e em locais públicos, por exemplo, escolas. Isto pode ser atribuído ao número alto e crescente de casas que mantém animais domésticos em países industrializados (cerca de 50 %) e a estabilidade alta dos alergenos, que são carregados e distribuídos.
O Fel d 1 foi identificado como o alergeno de gato principal, que é reconhecido por mais do que 90 % de pacientes alérgicos a gato. O Fel d 1 representa uma glicoproteína ácida de 38 kDa de função biológica desconhecida. Este consiste de dois heterodímeros não covalentemente ligados idênticos, que, novamente, são compostos de duas cadeias de polipeptídeo antiparalelamente ligados por três ligações de bissulfeto. A cadeia 1 e a cadeia 2 são codificados em genes diferentes, cada um consistindo de 3 exons. O Fel d 1 recombinante (rFel d 1), expressado como uma cadeia 2 - para a proteína de fusão de cadeia 1, foi gerado em E. coli. Este Fel d 1 recombinante é capaz de imitar completamente as propriedades imunológicas do alergeno do tipo selvagem.
Os peptídeos derivados do alergeno de gato principal Fel d 1 e a carência da capacidade de ligação de IgE são adequados, por exemplo, para imunoterapia e vacinação contra alergia profilática. Estes peptídeos podem estar compreendidos em um polipeptídeo maior ou estar ligado a uma proteína carreadora adequada, tal como a hemocianina do lapa buraco de fechadura. Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 - como o Phl ρ 5 e os peptídeos derivados de alergeno divulgados neste - são capazes de induzir uma resposta de IgG, isto é, a produção dos denominados "anticorpos bloqueadores" ou "anticorpos protetores". Estes anticorpos evitam a ligação de IgE ao alergeno Fel d 1. Uma redução significante nos sintomas alérgicos pode ser atingida desta maneira.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a molécula truncada apresenta reatividade de célula T reduzida.
A fim de evitar ou reduzir significantemente os efeitos colaterais posteriores a molécula hipoalergênica derivadas de Fel d 1 apresentam reatividade de célula T reduzida como definido na presente invenção.
O Fel d 1 truncado é preferivelmente composto de aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 de cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 de cadeia 2 de Fel d 1 ou variações de seqüência destes.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a moléculas hipoalergênicas sendo compostas de ou compreendendo aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der ρ 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der ρ 7, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der ρ 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Parj 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art ν 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amba 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou fragmentos ou variações de seqüência destes.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão hipoalergênica que compreende pelo menos duas moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção apresentando capacidade de ligação de IgE reduzida e apresentando reatividade de célula T opcionalmente reduzida.
As moléculas hipoalergênicas da presente invenção que são derivadas de um alergeno e precisam da capacidade de ligação de IgE podem ser fundidas de maneira recombinante ou conjugadas quimicamente uma à outra. Como componentes simples (fragmentos de alergeno) da proteína de fusão/polipeptídeo também a dita proteína de fusão/polipeptídeo precisa da capacidade de ligação de IgE.
A proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode compreender, pelo menos dois, preferivelmente pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro, ainda mais preferivelmente pelo menos cinco, moléculas hipoalergênicas de acordo com a presente invenção. E claro, também é possível fundir as moléculas hipoalergênicas a outros peptídeos, polipeptídeos e proteínas não derivadas de alergenos. Estes peptídeos, polipeptídeos e proteínas podem, quando administrados a um indivíduo também induz uma reação imunológica ou pode atuar como um carreador ou apresentar atividades enzimáticas. As moléculas hipoalergênicas na proteína de fusão de acordo com a presente invenção podem estar ligadas diretamente uma a outra ou por intermédio de um ligador que é preferivelmente composto de resíduos de aminoácido. Os métodos para a produção de proteínas de fusão são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em referências de biologia molecular padrão tal como Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2 o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3o ed; Wiley and Sons, 1995). No geral, uma proteína de fusão é produzida construindo-se primeiro um gene de fusão que é inserido em um vetor de expressão adequado, que é, por sua vez, usado para a transfecção de uma célula hosT adequada. No geral, as construções de fusão recombinantes são produzidas por uma série de digestões de enzima de restrição e reações de ligação que resultam nas seqüências desejadas sendo incorporadas em um plasmídeo. Se locais de restrição adequados não estiverem disponíveis, os adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou ligadores podem ser usados como é conhecidos por aqueles habilitados na técnica e descrito nas referências citadas acima. As seqüências de polinucleotídeo que codificam alergenos e proteínas naturais podem ser montadas antes da inserção em um vetor adequado ou a seqüência que codifica o alergeno podem ser inseridas adjacentes a uma seqüência que codifica uma seqüência natural já presente em um vetor. A inserção da seqüência dentro do vetor deve estar na estrutura de modo que a seqüência possa ser transcrita em uma proteína. Estará evidente para aqueles habilitados na técnica que as enzimas de restrição precisas, ligadores e/ou adaptadores requeridos bem como as condições de reação precisas variarão com as seqüências e vetores de clonagem usados. A montagem de construções de DNA, entretanto, é rotina na técnica e pode ser facilmente realizada por uma pessoa habilitada na técnica.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as moléculas são fundidas umas às outras uma ordem diferente da ordem dos fragmentos no alergeno do tipo selvagem se as pelo menos duas moléculas forem derivadas do mesmo alergeno. A proteína de fusão de acordo com a presente invenção pode compreender, pelo menos duas moléculas hipoalergênicas que são derivadas do mesmo alergeno do tipo selvagem. Em um tal caso, as moléculas simples (fragmentos de alergeno) são fundidos um ao outro a fim de diferir da ordem no alergeno do tipo selvagem. Um tal método evita a re-formação de locais de ligação de IgE/epítopos potenciais na proteína de fusão hipoalergênica.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica quanto a uma molécula hipoalergênica e uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção.
A molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser utilizada, por exemplo, para a produção das ditas moléculas de maneira recombinante.
A dita molécula de ácido nucleico pode - de acordo com um outro aspecto da presente invenção - estar compreendida em um vetor.
Este vetor é, preferivelmente, um vetor de expressão.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma formulação de vacina que compreende a molécula hipoalergênica, uma proteína de fusão ou um anticorpo de acordo com a presente invenção.
A formulação ainda compreende, preferivelmente, pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitável.
O uso de substâncias carreadoras particulares, tais como KLH (hemocianina do lapa buraco de fechadura) também está entre os últimos métodos correntes para aumentar as respostas imunes. As molécula hipoalergênicas da presente invenção também podem ser fundidas ou conjugadas a proteínas de capsídeo virais que também podem atuar como um carreador (ver acima).
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a dita formulação compreende de 10 ng a 1 g, preferivelmente de 100 ng a 10 mg, especialmente de 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica ou anticorpo.
A formulação de vacina pode estar substancialmente composta como o medicamento da presente invenção (ver acima).
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteína de fusão ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um alergia em um indivíduo.
A molécula hipoalergênica, proteína de fusão e anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser fundidos para a vacinação de um indivíduo. Esta vacinação pode reduzir ou evitar a resposta alérgica causada por um alergeno do tipo selvagem.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o dito medicamento ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
O medicamento de acordo com a presente invenção compreende, preferivelmente, 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 da dita molécula imunogênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo.
De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção o medicamento é administrado a um indivíduo na quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente de 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção o dito indivíduo está em risco e pegar uma alergia.
Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao uso de uma molécula hipoalergênica, uma proteína de fusão ou um anticorpo de acordo com a presente invenção para diagnosticar uma alergia ou monitorar o progresso de uma terapia contra alergia em um indivíduo.
A molécula hipoalergênica, proteína de fusão ou anticorpo de acordo com a presente invenção pode não usado apenas em medicamentos, mas também podem ser adequadamente utilizados para vários propósitos de diagnóstico. Por exemplo, estas moléculas e proteínas de fusão podem ser usadas para diagnosticar uma alergia pela exposição, por exemplo, de uma amostra de um indivíduo que compreende células que liberam histamina ao dito polipeptídeo (ver, por exemplo, Purohit et al., Clin.Exp.Allergy 35 (2005): 186-192). Além disso, estas moléculas, proteínas de fusão e anticorpos podem ser imobilizados em uma superfície a fim de formar um polipeptídeo série/chip. Tais séries podem ser usadas, por exemplo, em avaliação de resposta alta a fim de diagnosticar uma alergia em várias amostras retiradas de diversos indivíduos.
A presente invenção ainda é ilustrada pelas seguintes figuras e exemplos, pelas seguintes figuras e exemplos, entretanto, sem estar restrito a esta.
A Fig. 1A mostra uma visão geral esquemática do vetor p89VPl.
A Fig. 1B mostra a seqüência de DNA do local de clonagem múltiplo do vetor pET-17b e o gene codificador 89VP1.
A Fig. 1C mostra a representação esquemática de três possibilidades para criar fusões de ácido nucleico.
A Fig. 2 mostra um gel de SDS-PAGE a 12 % tingido com Coomassie blue contendo proteína rotulada por his de 89VP1 purificada (linha 1: 5 μg de marcador molecular; linha 2 a 5: 10 μl de amostras de eluição de 89VP1).
A Fig. 3 mostra o reconhecimento de IgG de 14VP1: Imunotingimento de 14VP1 e controles. Os pontos são visualizados por auto- radiografia (linha 1 a 6: incubação com 1:500 a 1:16000 de anti-soro de anti- 14VP1 de coelho; linha 7 a 12: incubação com 1:500 a 1:16000 de soro pré- imune diluído). A Fig. 4 mostra resposta de IgGl específica de 89VPlem camundongos. Os grupos de camundongos foram imunizados com antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa. Os tituladores de IgGl específicos de 89VPl foram medidos por ELISA e são expressados como valores OD no eixo y. os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos.
A Fig. 5 mostra resposta de IgGl específica de Phl ρ 1 em camundongos. Os grupos de camundongos foram imunizados com antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa. Os tituladores de IgGl específicos de rPhl ρ 1 foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo de IgGl no soro de camundongo. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa foram 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores médios.
A Fig. 6 mostra resposta de IgGl específica de extrato de pólen de capim-rabo-de-rato em camundongos imunizados. Os grupos de camundongos foram imunizados antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa. Os tituladores de IgGl de extrato de pólen de capim-rabo-de- rato foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo de IgGl no soro de camundongo. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha entre as caixas indica os valores médios.
A Fig. 7 mostra a média de % de inibição da ligação de pacientes de IgE a rPhl ρ 1 pela pré-incubação com anti-soro contra rPhl p 1, r89P5 e KLHP5 de todos os 19 pacientes. A % de inibição é mostrada no eixo y. Os resultados são mostrados como barras.
A Fig. 8 mostra a proliferação de células de baço de camundongos imunizados. As células T de camundongos imunizados com antígenos diferentes como indicado no topo de cada caixa foram estimulados com peptídeo 5, 89VP1(89) e KLH. O meio foi usado como uma referência. No eixo y, o índice de estímulo é mostrado. Os resultados são apresentados em barras.
A Fig. 9 mostra resposta de IgGl, IgG2, IgG4 e IgA a 14VP1, 89VP1 e rPhl ρ 1 detectados no soro humano por medição ELISA. Os soros de 10 pacientes foram testados quanto a quatro anticorpos específicos para 89VP1, 14VPl e rPhl ρ 1 como indicado no topo de cada caixa. Os soros retirados no outono e no inverno são mostrados do lado esquerdo e do lado direito de cada "par de barras", respectivamente. Os tituladores foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo no soro humano. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras. A linha entre as caixas indica os valores médios.
A Fig. 10 mostra a detecção de anticorpos anti-89VPl e anti- rPhl ρ 1 no soro de pacientes alérgicos. Soros de pacientes alérgicos a 5 Phl ρ 1 foram testados quanto a 7 anticorpos específicos para 89VP1 (barra esquerda de cada par de base) e rPhl ρ 1 (barra direita de cada par de base).
Os tituladores foram medidos por ELISA e são expressados como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo no soro humano. Os resultados são mostrados como plotagens de caixa, onde 50 % dos valores estão dentro das caixas e não fora entre as barras, a linha entre as caixas indica os valores médios.
A Fig. 11 mostra a ligação de IgG anti-14VPl ao extrato de proteína de HRV14 e 14VP1 purificado (linha 1 e 4: 5 μg de Marcador; linha 2 e 4: Extrato de vírus; linha 2 e 5: 5 μg de 14VP1). A mancha de A e B foi incubado com soro imune anti-14VPl e soro pré-imune, respectivamente. O IgG ligado foi detectado por Western blotting e visualizado por auto- radiografia.
A Fig. 12 mostra a neutralização de HRV14 (linha A (controle celular): As células após a pré-incubação de HRV14 com uma diluição de soro imune anti-14VPl 1:IO2-IilO8 (série A1-A6); linha B: as células após a pré-incubação de HRV14 com uma diluição de soro pré-imune 1:10-1:10^8 (série B1-B6); Linha C: as células após incubação com HR-V14 10 TCD50- 10^6 TCD50 (série C1-C6); D5: as células após a incubação com soro pré- imune; D6: células após a incubação com soro imune). As células foram colocadas em todos os reservatórios e coloridas com cristal violeta após três dias.
A Fig. 13 mostra a reatividade de IgG de anti-soro anti- peptídeo com o alergeno Phl ρ 5 completo. As reatividades de IgG (valores OD) ao Phl ρ 5 são mostrados para as 3 amostras de soro (sangramento 1: soro pré-imune; sangramentos 2 e 3: amostras de soro coletadas em intervalos mensais) obtidos de 6 coelhos, cada um dos quais foi imunizado com um dos peptídeos conjugados KLH.
A Fig. 14 mostra a atividade alergênica de rPhl ρ 5 e a mistura de peptídeo foi detectada pela expressão de CD203c. As amostras de sangue heparinizadas de três pacientes alérgicos a Phl ρ 5 foram incubadas com diluições seriais de IO"4 a 10 μ^πΑ de alergeno recombinante, uma mistura equimolar de peptídeos derivados de Phl ρ 5, anti-IgE ou tampão de controle (co, eixo x). As células foram então tingidas com CD203c mAb e analisadas quanto à expressão de CD203c em um FACScan. O índice de estímulo (SI) é apresentado no eixo y.
A Fig. 15 mostra a identificação de peptídeos derivados de Phl ρ 5 que induz respostas linfoproliferativas baixas. Os PBMCs de pacientes alérgicos a pólen de capim-rabo-de-rato foram estimulados com concentrações diferentes de peptídeo e para os propósitos de controle com in- terleucin-2 (eixo x), o índices de estímulo (SI) são indicados no eixo y.
A Fig. 16 mostra peptídeos sintéticos derivados de Fel d Ique induzem as respostas imunes de IgG específicas de Fel d 1 em coelhos. Seis coelhos foram imunizados com os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 conjugados com KLH ou rFel d 1 não conjugado e 3 a 4 sangramentos foram retirados em intervalos mensais. As reatividades de IgG do soro pré-imune e dos anti-soros a rFel d 1 ligado a placa de ELISA são mostrados como densidades óticas (valores O.D., eixo y).
A Fig. 17 mostra a atividade alergênica baixa de peptídeos sintéticos derivados de Fel d lcomo determinado pela expressão de CD63 e CD203c em basófilos de pacientes alérgicos. Os PBMCs de 5 pacientes alérgicos a gatos foram incubados com diluições seriais de Fel d 1 (caixas fechadas) ou uma mistura de peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 (caixas abertas) (eixo x). Os RR PBMCs de pacientes também foram sondados com diluições seriais de peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes simples. A indução de expressão de marcadores de superfície CD203c e CD63 foi medida como intensidades de fluorescência média e os índices de estímulo calculados são mostrados no eixo y.
A Fig. 18 mostra que um tratamento com os peptídeos derivados de Bet v 1 ligados a KLH reduz as respostas linfoproliferativas ao rBet v 1 em camundongos sensibilizados. A proliferação de célula T foi medida em culturas celulares de baço após o estímulo in vitro com o alergeno de pólen de bétula recombinante de bétula Bet v 1 (barras brancas), KLH (barras negras) ou a mistura de peptídeo (barras cinza). As barras representam os índices de estímulo médios (SI±SD) para os grupos diferentes de camundongos.
A Fig. 19 mostra a vacinação profilática de camundongos simples com peptídeos derivados de Bet v 1 ligados por KLH que reduzem as respostas linfoproliferativas ao rBet v 1 após a sensibilização. A Fig. 20 mostra que a vacinação profilática de camundongos simples com peptídeos derivados de Bet ν 1 ligados por KLH induz a uma resposta de IgG específica de Bet ν 1 e prepara para a indução de respostas de IgG específicas de alergeno pelo alergeno completo. As respostas de IgG (valores de OD: eixo y) para Bet ν 1 foram medidas em quatro grupos de tratamento em pontos diferentes de tempo (eixo x).
A Fig. 21 mostra uma comparação de reatividade de IgE: a capacidade de ligação de IgE de peptídeos derivados de Phl ρ 5 (1, 2) e variantes (la, 2b) foi determinada na aplicação de ensaios de mancha por pontos aplicando-se 0,20 g/ponto usando-se soros de 7 pacientes alérgicos ao pólen de grama (pl a p7) e o soro de um indivíduo não atópico (NHS). rPhl ρ 5 foi usado como o controle positivo e HSA como o controle negativo. O IgE ligado foi detectado com IgE anti-humano rotulado por 125I.
A Fig. 22 mostra uma resposta linfoproliferativa de peptídeos derivados de Phl ρ 5 (1, 2) e variantes (la, 2b). Os PBMCs de pacientes alérgicos ao pólen de grama foram estimulados com concentrações diferentes de peptídeos e, para os propósitos de controle, com concentrações equimolares de rPhl ρ 5. Os índices de estimulação (SI) são indicados no eixo y.
A Fig. 23 mostra a proteção cruzada de anticorpos anti VPl.
EXEMPLOS:
Exemplo 1: Construção do vetor p89VPl
As amostras de estoque de vírus foram preparados por RT- PCR pela adição de 1 μl do inibidor RNase (Boehringer GmbH, Germany) a uma concentração final de 0,01 U/pl após a extração de RNA de sobrenadantes de cultura celular pelo kit QlAamp viral (Qiagen, Germany).
O plasmídeo p89VPl (Fig. 1A) foi construído pela substituição do fragmento Ndel/EcoRI do local de clonagem múltipla de pET- 17b com a seqüência de cDNA codificadora pela proteína VPl da cepa rinovírus humano 89 (89VP1). Os locais de restrição Ndel e EcoRI (em pET- 17b) foram usados para inserção de Asel/EeoR1 ligado ao 89VP1 com ATG na extremidade 5', seis histidina seguidas pelo pela códon de interrupção TGA na extremidade 3' (Fig.1B).
A inserção de 89VP1 em pET-17b foi confirmado pelo sequenciamento de nucleotídeo.
Após a fusão de Ndel/Asel em vez do local Ndel CATAAT foi criado e não pode ser cortado com qualquer enzima disponível. Portanto, o local foi mutado por CTT AAG, o local de restrição de Afl II. Para inserir um fragmento alergeno adicional, a seqüência ACCGTT na extremidade 3' foi mutado por ACCGGT, o local de restrição de AgeI. As seqüências de aminoácidos são exibidos abaixo nas seqüências de nucleotídeo de 89VP1. Os locais de restrição são mostrados sublinhados na Fig. 1B.
Os ditos locais de restrição Afl II e Agel foram criados com o Kit de mutagênese de local de mudança de Quick (Stratagene).
Os cDNAs para os fragmentos do gene deste modo podem ser inseridos pela fácil purificação nos locais de restrição remanescentes na extremidade 5' (usando Afl II) ou na extremidade 3' (usando Agel) de 89VPl ou em ambos os locais como indicado na Figura 1C. Os fragmentos alergenos recombinantes seriam deste modo expressados no terminal N e/ou no terminal Cde 89VP1.
Tabela I: Iniciadores de clonagem e mutagênese (5'a 3')
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Exemplo 2: Clonagem de uma construção que expressa uma proteína de fusão do fragmento alergeno 89VP1
O método descrito acima foi exemplificado por um fragmento alergeno Phl p 1 do terminal C, isto é peptídeo 5 (CVRYTTEGGTK- TEAEDVIPEGWKADTAYESK; M. Focke et al. FASEB J (2001) 15:2042- 4). A seqüência de DNA de peptídeo 5 foi amplificado por PCR usando o cDNA Phl ρ 1 (GenBank: X78813) como um padrão (Iniciadores: Phl p 1 avançado 5'-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3 (SEQ ID N°. 7); Phi p 1 reverso 5'-CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAG GCGGTGTCGGC-3 (SEQ ID N°. 8)). O produto PCR foi inserido no local de restrição Afl II do vetor p89VPl e a construção resultante é referida como vector p89P5 e produto do gene r89P5.
Exemplo 3: Expressão e purificação da proteína de fusão do peptídeo 5 89VP1 e 89VP1
A fim de atingir a expressão do 89VP1 ou r89P5 (proteína de fusão de peptídeo 5 de 89VP1 recombinante), os plasmídeos foram transformados em E. coli BL21 (DE3). As células de E. coli transformadas foram desenvolvidas em 250 ml do meio LB contendo 100 mg/l de ampicilina a 37°C por uma densidade óptica (600 nm) de 0,4, e a expressão da proteína foi induzida pela adição de isopropil-beta-D-tiogalactosidase (IPTG) a uma concentração final de 1 mM. As células de E. coli foram coletadas após 4 horas pela centrifugação a 3500 rpm a 4°C por 10 minutos. A purificação foi realizada com o protocolo Qiagen usando Qiagen Ni-NTA e colunas. O grânulo celular foi recolocado em suspensão sob condições de desnaturação em 5 ml de 6 M de cloridreto de guanidínio por 1 hora. Após a centrifugação (20 minutos, 10000 x g) o sobrenadante foi incubado com 1 ml de Ni-NTA por uma hora adicional. A suspensão foi então carregada em uma coluna, lavada duas vezes com 5 ml de tampão de lavagem (8 M de uréia de pH 6,3) e então eluído com 4 ml de tampão de eluição (8 M de uréia de pH 3,5). A renaturação foi atingida após a diálise com molaridade decrescente de uréia. A pureza e tamanho da proteína purificada foram analisados por SDS-PAGE como mostrado na Figura 2. As fitas de proteína correlacionada com o tamanho de proteína calculado de 33,6 kD. A integridade das proteínas também foram confirmados pela análise de Western blot, usando anticorpo tag anti-histidina.
Exemplo 4: Detecção de anticorpos de coelho específico 14VPl pelo imunotingimento
5 μg 14VPl (proteína VPl da cepa de rinovírus humano 14) e controles (Bet ν 1, Phl ρ 5, BSA) foram marcados em faixas de membrana nitrocelulose. Estas faixas foram expostas por uma diluição de anti-soro de coelho anti-14VPl (linha 1 a 6) e soro pré-imune (linha 8 a 12). Anticorpos IgG de coelho ligado foram detectados com IgG anti-coelho de burro rotulado 1251 1:1000 e visualizado por autografia (Fig.3).
A análise de mancha de ponto do soro anti-14 VPl de coelho mostrou que 14VP1 é fortemente imunogênico. Os anticorpos IgG ainda foram detectados com um 1:16000 de diluição do anti-soro em contraste ao soro pré-imune e os controles Bet ν 1, Phl ρ 5 e BSA.
Exemplo 5: Resposta de anticorpo específico 89VP1 em camundongos determinados por ELISA
A fim de determinar a imunogenicidade de 89VP1 e esta capacidade de atuar como um carreador pelo peptídeo 5, grupos de camundongos de balb/c fêmeas de seis semanas de idade (Charles River) foram imunizados com os antígenos seguintes: peptídeo 5 ligado ao maleimida KLH, KLH (KLHP5) e peptídeo 5 ligado a KLH EDC (KLHP5edc). A ligação química foi feita com a maleimida Imject ativado mcKLH e Kit EDC imunogênio Imject (Pierce). O grupo maleimida reage com grupos SH e o EDC reage com carboxila e grupos amino para formar ligações estáveis. Os grupos de 4 camundongos foram imunizados com camundongos 89VP1, r89P5 e 89P5edc e 2 foram imunizados com apenas peptídeo 5 (cada 5 μ§ e mistura 1:2 com hidróxido de alumínio). Os camundongos foram imunizados subcutaneamente em aproximadamente intervalos de três semanas e sangrados a partir das veias da calda. O nível de anticorpo IgGl específico 89 VPl foi determinado por ELISA.
As placas de ELISA (Nunc) foram cobertas com 5 μg/ml de 89VP1. Os camundongos anti-89VPl, anti- r89P5 e soro de peptídeo 5 foram diluídos a 1:500. O IgGl ligado foi ligado com IgGl de anti-camundongo de rato (BD Pharmingen) 1:1000 e então com IgG de cabra anti-rato ligado por POX (Amersham Bioscience) 1:2000. O valor óptico (OD 405nm) é exibido no eixo y e correspondem ao nível do anticorpo IgGl no soro de camundongo (Fig.4).
O KLHP5, KLHP5edc, KLH e peptídeo 5 foram usados como controles. Os anticorpos IgGl foram detectados com um título aumentado durante a imunização em camundongos injetados com 89VP1 (89VP1, 89P5edc e r89P5). Coelhos imunizados com 89VP1, r89P5 e KLHP5 mostrou o mesmo resultado.
Exemplo 6: Resposta de anticorpo específico rPhl ρ 1 em camundongos determinados por ELISA
Para avaliar se a imunização com r89P5 será induzido com os anticorpos IgG que reage com o Phl ρ 1 completo, o mesmo método e os mesmos soros de camundongos foram usados como descrito no exemplo 5. As placas de ELISA foram cobertas com 5 μg/ml de rPhl ρ 1 e o título de anticorpo IgGl foi determinado (Fig.5).
Todos os peptídeos derivados de Phl ρ 1 ligados ao KLH ou 89VPl induzido pelos anticorpos IgGl específico com respostas crescentes durante a imunização. Coelhos imunizados com r89P5 e KLHP5 mostrou o mesmo resultado.
Exemplo 7: Detecção de ELISA de anticorpos de IgGl específicos de extrato de pólen de capim-rabo-de-rato A imunização de camundongos e análise de ELISA foi realizado como descrito na seção 5. Enquanto o extrato de pólen de capim- rabo-de-rato foi revestido (100 μg/ml) nas placas de ELISA e o título de anticorpo IgGl foi determinado (Fig.6).
Após anticorpos específico de extrato de três imunizações IgGl pode ser detectado em camundongos imunizado com peptídeo 5.
Exemplo 8: Ligação de IgE de pacientes com bloqueio de anticorpos anti-r89P5 de coelho por rPhl ρ 1
Para determinar a capacidade de coelho Ig induzido por peptídeo para induzir a ligação dos anticorpos IgE de pacientes alérgicos por rPhl ρ 1, as placas de ELISA foram cobertas com 1 μg/ml de rPhl ρ 1, lavado e bloqueado. As placas foram pré-incubadas com 1:100 diluído pelo peptídeo anti-coelho (89P5, KLHP5), um rPhl ρ 1 anti-coelho e, para os propósitos de controle, com o soro pré-imune correspondente. Após a lavagem, as placas foram incubadas como soro humano de pacientes Phl ρ 1 alérgicos (1:3 diluído) e IgE ligado foi ligado com IgE anti-humano de camundongo (Pharmingen 1:1000) e então como IgG anti-camundongo de ovelha ligado por POX (Amersham Bioscience) 1:2000.
A porcentagem da inibição de ligação IgE atingido pela pré- incubação com o anti-soro de anti-peptídeo foi calculado como seguintes: 100-ODi/ODp x 100.
O ODi e ODp representa as extinções após a pré-incubação como o coelho imune e soro pré-imune, respectivamente. A Tabela 2 mostra a capacidade de anticorpos de peptídeo anti-Phl ρ 1 para induzir a ligação de 19 pacientes alérgicos IgE para completar rPhl ρ 1. A Figura 7 exibe o meio de inibição (em %) e todos os soros imunes anti-rPhl ρ 1, anti-r89P5 e anti- KLHP5. O soro de anti-peptídeo bloqueado com a ligação de IgE melhor do que rPhl ρ 1. A capacidade para a inibição é com 89P5 e KLHP5 quase parecido. A Tabela 2 mostra uma inibição (em %) de todos os 19 pacientes. Tabela 2: % de inibição de ligação IgE de 19 pacientes por rPh1 p 1 após a incubação com anti-rPh1 ρ 1 de coelho, r89P5 e anti-soro anti-KLHP5
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Exemplo 9: Proliferação de célula T de células do baço do camundongo após a estimulação do antígeno.
Os grupos de três camundongos foram imunizados com KLH, KLHP5 e KLHP5edc. Os grupos de 4 camundongos foram imunizados quatro vezes com 89YP1, r89P5 e 89P5edc, e 2 camundongos foram imunizados com apenas peptídeo 5 (5 μg cada). As células do baço foram retiradas 10 dias após a última imunização e culturas celulares simples foram estimuladas e triplicadas em placas de 96 reservatórios com peptídeo 5 (P5), 89VP1, KLH, Con A e um meio como um controle positivo e negativo, respectivamente. Após quatro dias a [3H]timidina radioativa 0,5 de μCi foi adicionado em cada reservatório. As células foram então coletadas como uma placa de unifiltro em Coletor de Célula Packard após 15 horas. A radioatividade associada celular foi medida com um beta-contador. Os índices de estimulação onde calculados e são mostrados no eixo y. O antígeno que foi usado para estimulação é mostrado no eixo x. Cada caixa representa o dado do antígeno que foi usado para a imunização dos camundongos (Fig. 8). Todos os valores acima dois contam como positivo. Os camundongos KLH e KLHP5 imunizados são apenas positivos quando estimulados com KLH e os camundongos de peptídeo 5 são completamente negativos. O grupo KLHP5edc também é negativo que corresponde aos resultados de ELISA. As células de camundongos r89P5, 89P5edc e 89VP1 imunizados proliferaram apenas após a estimulação com 89VP1. O camundongo de controle simples mostra não proliferação em todos os casos. Estes resultados mostram que os epítopos das células T são fornecidos pelo carreador 89VP1 e não pelo peptídeo 5.
Exemplo 10: Detecção de anticorpos 14VP1-, 89VP1- e rPhl ρ 1 específicos no soro humano obtido no Outono e Inverno por ELISA.
O 5 soro humano de pessoas escolhidas aleatoriamente foram retirados no Outono e cinco no Inverno. O nível de anticorpo IgGl, IgG2, IgG4 e IgA contra 14VP1, 89VPl e rPhl ρ 1 foi determinado por ELISA como descrito no exemplo 5. O IgGl, IgG2, IgG4 e IgA humanos foram detectados (BD Pharmingen) 1:1000 com IgG anti-camundongo de ovelha ligado por POX (Amersham Bioscience) 1:2000. Um alto título de anti- 14VPl e 89VPl IgGl do soro retirado no Outono e Inverno pode ser detectado (Fig. 9). O título do anticorpo anti-rPhl ρ 1 IgGl foi mais inferior. Os anticorpos IgG2, IgG4 e IgA podem ser detectados em todos os casos no nível mais baixo. As proteínas VPl de cepas HRV diferentes são estritamente relatadas e a reatividade cruzada tem sido mostrado em outros estudos.
Exemplo 11: Anticorpos Anti- 89VP1 e anti-rPhl ρ 1 de pacientes alergenos Phl ρ 1
O soro de cinco pacientes alergenos Phl ρ 1 foram retirados e um experimento de ELISA foi realizado como descrito no exemplo 5. As placas de ELISA foram cobertas com rPhl ρ 1 e 89VP1 e o título do anticorpo IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE específico foram determinados (Fig. 10). Mais anticorpos anti-89VPl IgGl do que anticorpos anti-rPhl ρ 1 IgGl podem ser detectados.
Exemplo 12: Detecção de ligação de anticorpo anti-14VPl pela análise Western blot do vírus total
A ligação do anticorpo IgG do soro do 14VP1 de coelho injetado pelo vírus total foi confirmado pelo uso do vírus HRV14 total (linha 2 e 5) e 5 μg purificado por 14VP1 (linha 3 e 6) como controle. O extrato do vírus foi separado por 12 % de SDS-Page e tingido na membrana de nitrocelulose. O anti-soro de coelho anti-14VPl (linha 1 a 3) 1:500 e soro pré- imune (linha 4 a 6) 1:500 foram testados pela ligação por HRV14 e 14VPl. O IgG ligado foi ligado com anticorpo anti-coelho de burro rotulado 1251 e visualizado por autografia (Fig.l 1).
A ligação do anti-soro 14VP1 pode ser detectado no mesmo grupo (33,6 kD) como 14VP1.
Exemplo 13: A neutralização de anticorpos do rinovírus 14 humanos intactos
A dose de cultura de tecido 50 (TCD50) de HRV14 foi determinado. Portanto, uma diluição do vírus de 1:10 a 1:10 em MEM de
Eagle 1 % de FCS e 40 mM de MgCl2 foi realizado e incubado em placas de 24 reservatórios a 34° C em uma atmosfera umidificada de 5 % de CO2 junto com HeLa de células Ohio por três dias. Como controle sem o vírus também foi expandido.
O efeito citotóxico do vírus foi visualizado com violeta genciana após três dias e o TCD50 (a diluição onde 50 % das células estão mortas) foi calculado.
As diluições do soro e vírus (100TCD50) na fila AeB foram incubados a 34°C. Após 2 horas as células foram expandidas em todos os reservatórios. D5 e D6 são controles de soro. O esquema experimental é mostrado na Fig. 12. O efeito de neutralização dos anticorpos foi detectado após três dias com violeta genciana (Fig. 12).
Exemplo 14: Características dos peptídeos sintéticos derivado de Ph1 ρ 5
Os peptídeos foram sintetizados usando a estratégia Fmoc com ativação HBTU (0,1 mmol dos ciclos de escala menores) no modelo de sintetizador de peptídeo de Biosystems Applied 433A como descrito. (Focke et al. Faseb J (2001) 15:2042). Após a análise da profundidade de seis alergenos Ph1 ρ 5 de peptídeos derivados de Ph1 ρ 5 que variam de 31 (PI: 3026 Dalton) a 38 (P6: 3853 Dalton) aminoácidos em comprimento que são ricos em aminoácidos expostos à solventes foram preparados (Tabela 3).
Estes peptídeos tem pontos isoelétricos entre 4,32 e 8.98 e três destes (peptídeo 3, 4 e 6) podem conter epítopos das células T humanas. Tabela 3. Características dos peptídeos sintéticos não alergênicos derivados de Phl ρ 5. Posição (em relação à molécula Phl ρ 5), seqüência, comprimento, peso molecular (MW), ponto isoelétrico (pi) e a presença de epítopos das células T dos peptídeos derivados de Phl ρ 5 são exibidos. O resíduo de cisteína adicionado para facilitar a ligação é marcado em evidente e sublinhado.
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Exemplo 15: Falta dos peptídeos derivados de Ph1 ρ 5 da reatividade IqE e atividade alergênica 15.1. Falta da reatividade IgE
Para analisar a reatividade IgE de seis peptídeos derivados de Phl ρ 5, o isolado bem como peptídeos ligados por KLH derivados de Phl ρ 5 foram comparados com rPhl ρ 5 completo que diz respeito a capacidade de ligação de IgE por ELISA usando soro de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim (Tabela 4).
Tabela 4: Caracterização sorológica de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim e um controle não alergênico. Sexo, idade, níveis IgE de soro total (kU/L), IgE específico do extrato de capim-rabo-de-rato (kUA/L), anticorpos IgE específicos por rPhl ρ 5 e os 6 peptídeos isolados (PI a P6) e ligados a KLH (KLH-PI-KLH-P6) foram medidos por ELISA e ODs (densidades ópticas) são mostrados. Traços indicam a falta da reatividade IgE ao isolado bem como aos peptídeos ligados por KLH.
<table>table see original document page 76</column></row><table> As placas de ELISA (Nunc Maxisorp, Denmark) foram cobertas com peptídeos derivados de Phl ρ 5 (5 μg/ml) ou rPhl ρ 5 como controle (5 μg/ml), lavado e bloqueado. Subseqüentemente, as placas foram incubadas com 1:3 de soro de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim diluídos e de um indivíduo não atópico durante a noite a 4o C. O sofrimento dos pacientes alérgicos a pólen de capim a partir de rinoconjuntivite alérgica e/ou asma foram selecionados de acordo com a história do caso indicado pela polinose de capim sazonal e caracterizado pelo teste da picada da pele com extrato de pólen de capim-rabo-de-rato e teste CAP-FEIA sorológico (Phar- macia Diagnostics, Uppsala, Sweden). Os níveis IgE totais no soro foram determinados pela medição de CAP (Pharmacia). Anticorpos IgE específicos por rPhl ρ 5 foram determinados por ELISA. O soro a partir de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim e um indivíduo não atópico foram usados para estudos de competição IgE. Os pacientes alérgicos ao grupo de pólen de capim consiste de 13 machos e 16 fêmeas com uma faixa de idade de 35 anos (que variam de 25 a 51 anos) (Tabela 4).
Anticorpos IgE ligados foram detectados com um anticorpo IgE anti-humano monoclonal de camundongo ligado por alcalina-fosfatase 1:1000 diluído (Pharmingen, CA).
Os níveis IgE totais e IgE específico de extrato de pólen varia de 24,9 a 2000 kU/L (significa: 262,7) e 2,2 a 100 kUA/L (significa: 41,5), respectivamente. Todos os pacientes contendo anticorpos IgE específicos de rPhl ρ 5 variarão entre 0,157 a 2,530 OD unidades (significa: 1,082 OD unidades), mas nenhuma dos 29 pacientes mostraram reatividade IgE por qualquer dos peptídeos (Pia P6) ou por uma mistura equimolar dos peptídeos (OD < 0,08). Estes resultados demonstram que nenhum soro contendo anticorpos IgE detectáveis com especificidade por qualquer dos seis peptídeos derivados de Phl ρ 5.
15.2. Atividade alergênica reduzida dos peptídeos como detectado pela expressão CD 203 c em basófilos: Ativação de Basófilo e citometria de fluxo:
A super-regulação de CD 203 c tem sido descrito como um marcador substituto pela ativação de Basófilo induzido por alergeno e desgranulação (Hauswirth et al., J Allergy Clin Immunol 2002; 110:102). Portanto, a atividade alergênica do alergeno rPh1 ρ 5 completo e uma mistura equimolar de peptídeos pela medição de CD 203 c e sub-regulação em basófilo dos pacientes alérgicos à pólen de capim foram comparados.
As células sangüíneas periféricas foram obtidas de 3 doadores alérgicos após informado tem sido dado permissão. Alíquotas de sangue heparinizadas 1,11) foram incubadas com diluições em série de alergenos recombinantes (10 a 4 por 10 μg/ml), anticorpo anti-IgE (1 μg/ml) ou tampão de controle (solução salina tamponada de fosfato = PBS) por 15 minutos a 37° C. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS contendo 20 mM de EDTA. As células foram então incubadas com 10 μl de CD203c conjugado por PE mAb 97A6 por 15 minutos em temperatura ambiente (RT). Depois disso, os eritrócitos foram lisados com 2 ml de solução de FACS™ Lysing. As células foram então lavadas, recolocadas em suspensão em PBS, e analisadas pela citometria de fluxo de duas cores em um FACScan (Becton Dickinson), usando um software Paint-a-Gate. A Sub-regulação induzida por alergeno de CD203c foi calculado dos meios de intensidade de fluorescência (MFIs) obtido com células estimuladas (MFlstim) e não estimuladas (MFlcontrol), e expressadas como índice de estimulação (MFIstim : MFlcontrol). Um SI de > 2,0 (> sub-regulação de 2 bocas) foi considerado indicativo de uma resposta específica.
Como mostrado na Figura 14 foi observado que o rPh1 ρ 5 completo mostra um aumento dependendo da dose (10 a 4 por 10 μg/ml) na expressão de CD203c no basófilo de sangue periférico em um indivíduo sensibilizado, considerando uma mistura equimolar dos peptídeos mostram nenhum efeito.
A determinação da expressão CD 203 c em basófilo a partir dos pacientes alérgicos de pólen de capim indicam que nenhuma atividade alergênica pode ser observado com os peptídeos derivados de Phl ρ 5.
Exemplo 16: Imunização com os peptídeos derivados de Phl ρ 5 que induz anticorpos IgG reativo com rPhl ρ 5 e alergenos naturais a partir de espécies de capim diferentes.
16.1. Alergenos recombinantes e extratos alergenos
O recombinante purificado Phl ρ 5 foi expressado em E. coli como descrito (Vrtala et al. J of Immunol (1993) 151:4773-4781).
O pólen de capim de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum foram obtidos de Allergon Pharmacia (Sweden), e um extrato de pólen aquoso foi preparado como descrito (Vrtala et al., Int Arch Allergy Immunol (1993) 102:160-9.).
16.2. A imunização de coelhos
Os peptídeos purificados por HPLC foram ligados ao KLH (hemocianina do lapa buraco de fechadura, MW 4,5 χ 103 a 1, 3 χ 107, Pierce, USA) de acordo com conselho dos fabricantes e purificados usando um kit de conjugação (Sigma, USA).
Os coelhos foram imunizados com cada um dos peptídeos conjugados por KLH (200 μg/injeção) e, para os propósitos de controle, com rPhl ρ 5 completo usando Adjuvantes completos e incompletos de Freunds (Charles River). As amostras do soro foram obtidas no intervalo de quatro semanas.
16.3. Reatividade de anticorpos de coelho com rPhl ρ 5 completo e alergenos naturais a partir de espécies de capim diferentes
A fim de investigar se os anticorpos induzidos após a imunização com peptídeos ligados por KLH reconhece o rPhl ρ 5, alergenos de pólen de capim relacionado ao Phi ρ 5 e Phl ρ 5 natural a partir de outras espécies de pólen de capim, experimentos de ELISA foram realizados. Para detecção de ELISA, as placas (Nunc Maxisorp, Denmark) foram cobertas com extratos de alergenos de pólen (100 μg/ml: Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum) ou o alergeno purificado recombinante (5 μg/ml: rPhl ρ 5). As placas de ELISA foram lavadas e bloqueadas e subseqüentemente incubadas com anti-soro de peptídeo anti-coelho e soro pré-imune correspondente diluído a 1:2500. O IgG de ligação de coelho foi ligado com um anti-soro Ig de anti-coelho de cabra ligado por HRP (Jackson Immunresearch, Pennsylvania). Os meios dos resultados representam a determinação duplicada com um erro de < 5 % (Figura 13, Tabela 5).
Tabela 5: Reatividade cruzada de anti-soro de peptídeo anti- Phi ρ 5 com grupo rPhl ρ 5 e 5 alergenos naturais de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum. As reatividades IgG (valor OD) de anti-soro de peptídeo (anti-Pl ao anti -P6) por Phl ρ 5 e extratos de pólen a partir do pólen de capim são exibidos por 6 coelhos que foram imunizados com peptídeos derivados de Phl ρ 5 conjugados por KLH (P1-P6).
Reatividade cruzada de anti-soro de anti-peptídeo com rPhl ρ 5 e os extratos de pólen de capim.
<table>table see original document page 80</column></row><table> 16.4. Imunização com peptídeos Phl ρ 5 que induz a reatividade cruzada dos anticorpos IgG
A imunização com cada um dos peptídeos induz uma resposta IgG específica de Phl ρ 5 forte que tornar-se detectável quatro semanas após a primeira imunização e aumentada após a segunda imunização (Figura 13). A imunização com peptídeo 2 induz o Phl ρ 5 mais alto de resposta IgG específica seguido pelos peptídeos 6, 4, 5 e 1 que induz a resposta inferior. Com a exceção de anticorpos de anti-peptídeo 1 que reativada que falta com 5 grupos alergenos em Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale e Hordeum vulgare, o outro anti-soro de peptídeo reagido cruzado com cada um dos extratos de pólen de capim testados (Tabela 5).
Exemplo 17: Imunização com os peptídeos derivados de Phl ρ 5 que induz anticorpos IgG que inibem a ligação dos pacientes alérgicos ao pólen de capim IgE por Phl ρ 5
17.1. Inibição de ligação IgE de pacientes alérgicos por rPhl ρ 5a pelo IgG específico de peptídeo
A informação que diz respeito à capacidade dos peptídeos induz anticorpos bloqueadores é importante visto que os anticorpos bloqueadores foram mostrados para fazer um papel maior na imunoterapia.
A fim de examinar a capacidade do coelho Ig induzido por peptídeo para induzir a ligação de IgE de pacientes alérgicos para completar rPhl ρ 5 por ELISA, os experimentos de competição foram realizados usando soro de 29 pacientes alérgicos à pólen.
As placas de ELISA foram cobertas com rPhl ρ 5 (1 μg/ml) e pré-incubado com uma diluição de 1:250 de cada um do anti-soro de anti- peptídeo (anti-Pl-anti-P6), uma mistura do anti-soro de anti-peptídeo, um anti- soro de anti-rPhl ρ 5 ou para os propósitos de controle, com o soro pré-imune correspondente ou uma mistura do soro pré-imune. Após a lavagem, as placas foram incubadas com 1:3 diluídas no soro de 29 pacientes alérgicos à pólen de capim e IgE ligado a anticorpos foram detectados com o anticorpo IgE anti-humano monoclonal de camundongo ligado à alcalina fosfatase (Pharmingen). Uma inibição da porcentagem de ligação IgE atingido pela pré- incubação com o anti-soro de anti-peptídeo foi calculado como seguintes: % de inibição da ligação IgE = 100-ODi/OdpxlOO. O ODi e ODp representa as extinções após a pré-incubação com os coelhos imunes e soro pré-imune, respectivamente. A pré-incubação de Phl ρ 5 com coelho Ig induzido pelo IgE da reatividade dos pacientes alérgicos inibidos por peptídeo G por um grau de variação. O grau médio da inibição da inibição de IgE varia de 19,3 % pelo IgG anti-peptídeo 6 a 28,5 % com IgG anti-peptídeo 1. Anticorpos de coelho crescente mais uma vez completam Ph1 ρ 5 induzido um meio de inibição da ligação IgE de 43,6 %.
Tabela 6: Anti-soro de peptídeo anti-Ph1 ρ 5 de coelho que inibe o a ligação do soro IgE de pacientes alérgicos ao pólen de capim-de- rabo-de-rato por Ph1 ρ 5. Uma inibição da porcentagem de ligação IgE por Phl ρ 5 é exibido para cada paciente após a pré-incubação de Ph1 ρ 5 com anti- soro de anti-peptídeo (anti-P1 a anti-P6), com uma mistura de seis anti-soro de anti-peptídeo (anti-P1-P6) ou com um anti-soro de anti-rPh1 ρ 5. A porcentagem significa a inibição que é exibida na linha da parte inferior. N.d.:
Nenhum Realizado.
<table>table see original document page 82</column></row><table> <table>table see original document page 83</column></row><table>
Exemplo 18: Peptídeos derivados de Phl ρ 5 induz as respostas de linfoproliferativa específica baixa.
18.1. Ensaios de linfoproliferação
A fim de identificar os peptídeos com a reatividade da célula T possível mais baixa para minimizar os efeitos colaterais relacionados à terapia, a reatividade celular T foi examinado pelos ensaios de linfoproliferação. As células mononuclear se sangue periférico (PBMC) foram isolados de 2 pacientes alérgicos à pólen de capim pela centrifugação gradiente de densidade Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, UK). O PBMC (2 χ 10^5) foi cultivado e triplicado em placas de 96 reservatórios (Nunclone; Nalge Nunc International, Denmark) em 200 μl de meio de cultura de soro livre Ultra (BioWhittaker, Rockland, ME) suplementado com 2 mM de glutamina L (SIGMA, USA), 50 μΜ de beta-mercaptoetanol (SIGMA) e 0,1 mg de gentamicina por ml (SIGMA) a 37°C e 5% de CO2 em uma atmosfera umidificada. As células foram estimuladas com concentrações diferentes de peptídeos sintéticos (1,25, 0,6 e 0,3 μg por reservatório) e, por comparação, com 4 U de Interleucina 2 por reservatório (Boehringer Mannheim, Germany) e com meio sozinho. Após 6 dias de cultura 0,5 μCi por reservatório [3H]timidina (Amersham Pharmacia Biotech) foi adicionado e 16 horas depois disso incorporado a radioatividade ser medida pela contagem de cintilação líquida usando um contador de cintilação de microbeta (Wallac ADL, Germany). O meio cpm foi calculado a partir do triplicados, e o índice de estimulação (SI) foi calculado como o quociente do cpm obtido por antígeno ou estimulação de Interleucina 2 e os controles não estimulados.
Os PBMCs a partir dos pacientes alérgicos a pólen de capim- rabo-de-rato foram estimulados com concentrações diferentes de petídeos sintéticos. Os índices de estimulação com peptídeos foram significantemente inferiores do que com IL2. Os peptídeos derivados de Phl ρ 5 induz as respostas linfoproliferativa específica baixa. A resposta inferior foi vista com peptídeo 5 seguido pelo peptídeo 4.
Exemplo 19: Características dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1
A fim de obter os peptídeos adequados para vacinação de alergia de gato, cinco peptídeos que são 30 a 36 aminoácidos longos e cobre a molécula total que são designadas de acordo com à seqüência de aminoácido conhecido de Fel d 1.
Os peptídeos foram sintetizados usando uma estratégia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil) com ativação de HBTU (2-(lH-benzotriazol-l-il) 1,1,3,3 hexafluorofosfato de tetrametilurônio) (0,1 mmol dos ciclos de escala menores) no modelo de sintetizador de peptídeo de Biosystems Applied 433A (USA). As resinas PEG-PS pré-carregadas (polietilenoglicol poli-estireno) (carregando 0,15 a 0,2 mmol/g) (PerSeptive Biosystems, UK) foram usados como fase sólida para construir os peptídeos. As químicas foram adquiridas de Applied Biosystems. A ligação de aminoácidos foi confirmado pelo monitoramento da condutividade em um sistema de controle de resposta. Um resíduo de cisteína foi adicionado aos polipeptídeos 1, 3, 4, e 5 para facilitar a ligação aos carreadores (Tabela 7). Os peptídeos foram clivados a partir de resinas com uma mistura de 250 μl de água destilada, 250 μl de triisopropilsilano (Fluka, Switzerland), 9,5 ml de TFA por 2 horas e precipitado em terc-butilmetiletílico (Fluka, Switzerland) (Focke 2001). A identidade dos peptídeos foi checada pela espectrometria de massa e peptídeos foram purificados a > 90 % de pureza pelo HPLC preparativo (PiChem, Áustria).
Tabela 7: Características moleculares dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1. A posição dentro da molécula do Fel d 1 natural, seqüência de aminoácido, diversos aminoácidos, calculados por peso molecular (MW) e ponto isoelétrico teórico (pi) dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 são mostrados. Todos os peptídeos são solúveis em água.
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Os cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 tem pesos moleculares na faixa de 3246 a 4083 Dalton e tem calculado ponto isoelétrico a partir de 4,30 a 4,93. Todos os cinco peptídeos são solúveis em água e os peptídeos 1, 2 e 3 podem conter epítopos das células T humanas (Tabela 7). Tabela 8. IgE de reatividade reduzida dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 comparado aos rFel d 1
<table>table see original document page 85</column></row><table>4 <table>table see original document page 86</column></row><table>
Exemplo 20: Peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 tem IgE de reatividade reduzida comparado aos rFel d 1 e peptídeos sintéticos derivados da atividade alergênica da falta de Fel d 1.
O IgE de reatividade de soro aos peptídeos sintéticos derivados de Fel dia fim de identificar os peptídeos hipoalergênicos adequado para a vacinação foi investigado.
A diagnose da alergia de gato mediado por IgE foi baseado na anamnésia, teste da picada da pele (Allergopharma, Reinbek, Germany) e medido do IgE de soro total bem como do IgE do soro específico de cólera de gato (CAP-FEIA, Pharmacia Diagnósticos, Sweden). As pessoas não alérgicas foram incluídas para os propósitos de controle.
20.1. Capacidade de ligação de IgE medido nos ensaios por ELISA.
A capacidade da ligação IgE dos cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foram comparados com que o alergeno rFel d 1 completo usando o soro de 14 pacientes alérgicos a gato. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Denmark) foram cobertas com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 ou rFel d 1 como controle (0,5 μg/reservatório), lavado e bloqueado. As placas foram então incubados durante a noite a 4o C com 1:5 diluído de soro de pacientes alérgicos a gato e de um indivíduo não atópico. Os anticorpos IgE ligados foram detectados com um peroxidase de rábano silvestre 1:2500 diluído com anticorpo de IgE anti-humano rotulado (KPL, USA).
O soro a partir de 7 fêmeas e 7 machos de pacientes alérgicos a gato na idade de 22 a 75 anos foram submetidos à determinações CAP-FEIA. Medido os níveis IgE totais varia de 122 a > 4000 kU/1 e níveis IgE específico de cólera de gato de 1,99 a > 100 kUA/1 (Tabela 7). No ensaio ELISA a reatividade IgE de todos os soros 14 testados ao alergeno maior do gato Fel d 1 foi confirmado. Os resultados foram obtidos como densidades ópticas (OD) e varia de 0,178 a 2,838 OD unidades. A reatividade IgE do soro 14 a peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foi medido no mesmo ensaio por ELISA. Foi observado que a ligação IgE foi retida por peptídeos 1, 2, 3, e 5. A ligação IgE foi observada pelo soro 6/14 ao Peptídeo 1, pelo soro 3/14 ao peptídeo 2, pelo soro 1/14 ao peptídeo 3 e pelo soro 10/14 ao peptídeo 5. As unidades OD medidas foram entre 0,051 e 1,998 pelo peptídeo 1, entre 0,060 e 0,123 para o peptídeo 2, 0,186 para peptídeo 3 e entre 0,056 e 0,677 para peptídeo 5. Em resumo, todas as unidades OD medidas foram consideravelmente inferiores do que os valores respectivos medidos para o alergeno Fel d 1 total.
Este demonstra que os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 tem uma IgE de reatividade reduzida comparado aos alergenos Fel d 1 totais. Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 podem ser portanto considerados hipoalergênicos, fornecendo uma vantagem dos efeitos colaterais mediados por IgE reduzido, quando usado em SIT.
20.2. Indução especifica da expressão dos marcadores de superfície CD203c e CD63 em basófilo humanos (Fig. 17)
Visto que a ligação IgE é um pré-requisito mas não amplo para indução do tipo 1 de reações alérgicas que também são requeridas reticuladas de IgE específico de ligação celular de efeito, a atividade alergênica atual dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foi investigado em ativação de ensaios de Basófilo. Estes ensaios detectam uma sub-regulação específica alergênica de marcadores de superfície CD203c e CD63, ambos reconhecidos como marcadores pela ativação basófilo (Hauswirth et al. J Allergy Clin Immunol. (2002) 110:102-109).
As amostras de sangue heparinizadas foram retiradas de 5 pacientes alérgicos a gatos após informado ser dado permissão. As alíquotas de sangue (100 μl) foram incubadas com diluições em série de rFel d 1, peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes simples ou como mistura equimolar, anticorpo anti-IgE ou tampão (PBS) por 15 minutos a 37° C. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS contendo 20 mM de EDTA. As células foram então incubadas com 10 μl de CD203c conjugado por PE mAb 97A6 e 20 μl de CD63 mAb CLB-granl2 conjugado por FITC por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, as amostras foram submetidas à Iise eritrócito com 2 ml de solução FACS™ Lysing. As células foram então lavadas, recolocadas em suspensão em PBS, e analisadas pela citometria de fluxo de duas cores em um FACScan (Becton Dickinson, USA), usando software Paint-a-Gate. A sub-regulação induzida por alergeno de CD203c e CD63 foi calculado dos meios de intensidade de fluorescência (MFIs) obtido com células estimulada (MFlstim) e não estimulada (MFlcontrol), e expressadas como índice de estimulação (MFlstim : MFlcontrol). Um SI de mais do que 2,0 (isto é mais do que a sub-regulação de 2 bocas) foi considerado indicativo de uma resposta (diagnóstico) específico.
Em basófilo de todos os cinco estudos da estimulação de pacientes alérgicos a gatos (RR, EB, KC, MG e SM) com rFel d 1 induzido uma sub-regulação específica de alergeno de marcadores de superfície CD203c e CD63. A super-regulação de CD203c e CD63 foi observado a ser dependente da dose por pacientes 4/5 (RR, KC, MG e SM). Para estes pacientes CD203c os índices de estimulação varia de 1,1 (SM) a 3,2 (RR) para a concentração inferior testada de 0,001 μg rFel d l/ml e de 3,6 (KC) a 6,2 (RR) para a concentração maior testada de 10 μg rFel d l/ml. CD63 os índices de estimulação determinados no mesmo ensaio varia de 1,1 (RR) a 2,0 (MG) para a concentração inferior rFel d testada de 0,001 μg/ml e de 3,9 (RR) a 7,3 (MG) para a concentração maior rFel d 1 testada de 10 μg/ml. Para o paciente EB 0,001 μg/ml Fel d 1 já foram suficiente induzir uma sub- regulação de alto nível de marcadores de superfície CD203c e CD63 prevenindo uma observação da dependência da dose da sub-regulação do marcador de superfície.
Basófilo de todos os cinco pacientes alérgicos a gatos foram sondados com cinco concentrações aumentadas (0,005, 0,05, 0,5, 5 e 50 μg/ml) de uma mistura equimolar de cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1. Basófilo de paciente RR foram adicionalmente sondados com cinco concentrações aumentadas de cinco peptídeos sintéticos simples derivados de Fel d 1 (0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10 μg/ml). Os peptídeos foram observados a ser deficientes na sub-regulação dos marcadores de superfície basófilo CD203c e CD63. Os peptídeos foram incapazes de induzir qualquer expressão aumentada de CD203c e CD63 nas células de pacientes RR, KC e SM. Uma sub-regulação insignificante de CD203c (SI=2,3) e de CD63 (SI=2,5) pode ser detectado pelo paciente MG mas apenas para a concentração maior testada de 50 μg da mistura de peptídeo/ml, enquanto as concentrações inferiores aplicadas também não tem efeito na estimulação. A sub-regulação mais pronunciada de CD203c (SI=4,2) e CD63 (SI=4,3) foi observado pelo paciente EB mas, novamente, apenas para a concentração da mistura de peptídeo maior testada. Em ambos casos, o paciente MG e EB, a taxa de sub- regulação após a estimulação com peptídeos foi de consideravelmente inferior do que os valores correspondentes para estimulação com o alergeno Fel d 1 total.
Este demonstra que os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 fornece as vantagens de propriedade a uma atividade alergênica inferior do que o alergeno Fel d 1 total. Este é relevante para um risco de diminuição dos efeitos colaterais mediados por IgE quando os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 são usados em SIT.
Exemplo 21: Imunização com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 que induz anticorpos IgG reativo com o alergeno rFel d 1 total.
Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 foram mostrados serem deficientes na ligação IgE. As moléculas candidatas para a vacinação, que ajudam na indução dos anticorpos IgG específicos de alergeno, os peptídeos que mais retém estruturas alergenos específicos e ainda podem ser capazes de induzir uma resposta específica imune IgG para o alergeno total. A fim de observar se os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 executam estes requerimentos, os experimentos da imunização em coelhos foram realizados.
Os coelhos foram imunizados com rFel d 1 não ligados e peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 ligados por KLH. Os peptídeos purificados por HPLC foram ligados ao KLH por intermédio de seus resíduos de cisteína, usando um kit de conjugação de Imject Maleimide Activated Immunogen (Pierce, USA Rabbits (New Zealand White Rabbits) foram imunizados com os imunogênios (200 μg/injeção) usando CFA (primeira imunização) e IFA (primeiro a incentivar a injeção após 4 semanas; um segundo incentivo para a injeção com adjuvante incompleto foi dado após 7 semanas) (Charles River Breeding Laboratories, Germany). Os coelhos foram sangrados 8 semanas após a primeira imunização e em intervalos de quatro semanas depois disso.
A indução de peptídeo e anticorpos específicos rFel d Ifoi monitorado por ensaios ELISA. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Denmark) foram cobertas com rFel d 1 (0,5 μg/reservatório), lavado e bloqueado. O rFel d 1 ligando a placa foi então sondado para duplicar com 1:1000 de anti-soro de coelho diluído e o soro pré-imune de coelho correspondente, e o IgG ligado foi ligado com um anti-soro de anti-coelho de cabra de peroxidase de rábano silvestre 1:2000 diluído (Jackson ImmunoResearch Inc., USA). Os meios de duplicar foram calculados e mostraram erros de menos do que 5 %.
A imunização com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 que induz Fel d 1 dos anticorpos IgG reativos. Oito semanas após a primeira imunização com cada um dos cinco peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1, os anticorpos IgG reativo pelo alergeno Fel d 1 total pode ser detectado em cada um dos cinco anti-soro de coelho. Os níveis do anticorpo IgG permaneceram em níveis comparáveis no sangramento subseqüente (Fig. 16).
O soro de coelho do anti-peptídeo 1, anti-peptídeo 2, anti- peptídeo 4 e anti-peptídeo 5 mostraram reatividades IgG por Fel d 1 em cerca da mesma magnitude do que o anti-soro de coelho anti-Fel d 1. Também o anti-soro de coelho anti-peptídeo 3 mostra uma distinta mais uma reatividade IgG um pouco menor por Fel d 1.
Este indica que todos os cinco 5 peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 são moléculas candidatas para induzir uma resposta de anticorpo Fel d 1 IgG específico.
Exemplo 22: Peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 induz respostas linfoproliferativa enfraquecida por Fel d 1.
As moléculas candidatas desejadas para SIT melhorado não apenas oferecem as vantagens dos efeitos colaterais mediados por IgE reduzido mas também de efeitos colaterais mediados por células T reduzidas. A fim de investigar as propriedades de ativação de célula T dos peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1, os ensaios linfoproliferativos foram realizados.
Os PBMCs foram isolados de 7 pacientes alérgicos a gatos pela centrifugação gradiente de densidades Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, UK). O PBMC (2 χ 10^5) foi cultivado e triplicado em placas de 96 reservatórios (Nunclone, Nalgene Nunc International, Denmark) em 200 μl de meio de cultura de soro livre Ultra (Cambrex, Belgium) suplementado com 2 mM de glutamina L (Sigma, USA), 50 μΜ (3-mercaptoetanol (Sigma) e 0,1 mg de gentamicina por ml (Sigma) a 37°C usando 5 % de CO2 em uma atmosfera umidificada. As células foram estimuladas com concentrações diferentes (5, 2,5, 1,25 e 0,6 μg/reservatório) de peptídeos sintéticos derivados de rFel d 1 e Fe d 1 como componentes simples ou como mistura equimolar e, para os propósitos de controle, com 4U de Interleucina 2 ou com meio sozinho. Após 6 dias de cultura, 0,5 μCi por reservatório 3H-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) foi adicionado e 16 horas depois disso, incorporado a radioatividade foi medida pela contagem de cintilação líquida usando um contador de cintilação microbeta (Wallac ADL, Germany), e o meio cpm foi calculado para triplicar. O índice de estimulação (SI) foi calculado como o quociente do cpm obtido por antígeno ou estimulação de Interleucina 2 e a não estimulada do meio de controle.
A proliferação IL-2 estimulada de PBMC de todos os 7 pacientes alérgicos a gatos testados, resultando nos índices de estimulação de 9,8 por RR, 5,2 por EB, 3,2 por KC, 6,7 por MG, 6,3 por SM, 15,7 por RA e de 13,9 por AR.
Os peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 induzido menores índices de estimulação (Tabela 9).
Tabela 9: Peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 que em uma base equimolar induz um pouco as respostas linfoproliferativas do que Fel d 1 podem ser identificados. Os PBMCs de 7 pacientes alérgicos a gatos foram estimulados com diluições em série de rFel d 1 ou peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes simples. As respostas linfoproliferativas específicas são mostrados como nos índices de estimulação.
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Exemplo 23: Anticorpos IqG induzidos pela imunização com peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 inibem a ligação de pacientes alérgicos a gatos IqE ao alergeno Fel d 1 total.
A capacidade do coelho Ig induzido por peptídeo para induzir a ligação dos anticorpos IgE de pacientes alérgicos para completar rFel d 1 foi examinado no ensaio de competição ELISA. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Denmark) foram cobertas com rFel d 1 (0,05 μg/reservatório), lavado e bloqueado. O rFel d 1 ligado por placa foi então pré-incubado com 1:100 diluído de anti-soro de peptídeo anti-coelho (anti-soro de anti-peptídeo simples bem como uma mistura de anti-soro de anti-peptídeo que foi usado), o anti-soro anti-rFel d 1 de coelho, e para os propósitos de controle também com o soro de coelho pré-imune respectivo. Após as placas serem lavadas, estas foram incubadas com 1:5 diluído de soro humano de pacientes alérgicos a gatos. Os anticorpos IgE ligados foram detectados com a 1:2500 diluído de anticorpo IgE anti-humano rotulado de peroxidase de rábano silvestre (KPL, USA). A inibição da porcentagem da ligação IgE atingida pela pré-incubação com o anti-soro de anti-peptídeo foi calculado como seguintes: % de inibição de ligação IgE = 100 - O.D.i / O.D.p χ 100, com O.D.z tendo a densidade óptica medida após a pré-incubação com o soro imune de coelho e O.D.p com soro pré-imune de coelho.
A pré-incubação da placa de ELISA ligada a Fel d 1 com o anti-soro anti-peptídeo 5 de coelho resultando nas origens da inibição que varia entre 14 soro de pacientes alérgicos a gatos testados diferentes. O anti- soro anti-peptídeo 1 de coelho de ligação IgE de pacientes bloqueados por Fel d 1 pelo soro de pacientes 13/14 testados, anti-soro anti-peptídeo 2 de coelho por 8/14, anti-soro anti-peptídeo 3 por 13/14, anti-soro anti-peptídeo 4 de coelho por 9/14 e anti-soro anti-peptídeo 5 de coelho por 5/14.
Também a faixa da inibição mostrou variações entre os anti- soros diferentes. Entre o anti-soro anti-peptídeo de coelho simples testado, o anti-soro anti-peptídeo 1 de coelho mostrou mais taxas de inibição com inibições de 0 a 55% (média de 29%). Com as taxas de inibição de anti-soro anti-peptídeo 2 de coelho de 0 a 18% (média de 5%) será atingido, com anti- soro anti-peptídeo 3 de coelho de 0 a 29% (média de 11%), com anti-soro anti-peptídeo 4 de coelho de 0 a 24% (média de 8%) e com anti-soro anti- peptídeo 5 de coelho de 0 a 18% (média de 4%).
Uma mistura de toda a ligação IgE de pacientes que inibiram o anti-soro anti- peptídeo 5 de coelho por Fel d 1 mais eficientemente com inibições atingidas por soro de todos os pacientes e taxas de inibição de 25 a 84% (média de 59%). Estas inibições ainda foram mais pronunciadas do que atingidas pela pré-incubação com o anti-soro anti-Fel d 1 de coelho (Tabela 10).
Tabela 10: Anti-soro de coelho elevado contra peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 inibindo a ligação de IgE humano por Fel d 1. Uma inibição da porcentagem de ligação IgE por Fel d 1 atingido pela pré-incubação de Fel d 1 com anti-soro de coelho são mostrados por 14 pacientes e como significam. As pré-incubações foram realizadas com anti-soro 5 de coelho elevado contra os 5 peptídeos sintéticos derivados de Fel d 1 (anti-peptídeo 1 a 5), uma mistura de 5 anti-soro de anti-peptídeo (Mistura) em um anti-soro elevado contra Fel d 1 (anti-rFel d 1).
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Quando o anti-soro anti-peptídeo 1 de coelho foi combinado
com cada um dos outros anti-soros de anti-peptídeos, a inibição da ligação de pacientes alérgicos IgE foi substancialmente aumentada atingindo entre os valores (por exemplo anti-peptídeo 1 + 4:41 %, anti-peptídeo 1 + 5:42 %) obtido com anticorpos anti-rFel d 1 (67 %) (Tabela 11).
Tabela 11:
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Exemplo 24: Peptídeos derivados de Bet ν 1 que induz respostas IgG específicas de Bet ν 1 recebendo ajuda de célula T a partir dos epítopos das células T derivado de carreadores e reduz a proliferação de célula T específica por Bet ν 1.
O derivado de Bet ν 1, os peptídeos celulares B expostos a superfície já tem sido mostrados por induzir uma resposta Bet ν 1 protetora e IgG específico em um modelo de camundongo de vacinação terapêutica e profilática (Focke M et al. Clin Exp AUergy (2004) 34:1525-1533). Em Focke M et al. (2004), 6 peptídeos derivados de Bet ν 1 foram ligados à molécula de carreador KLH antes de uma imunização de camundongos. No presente exemplo é mostrado que a resposta Bet ν 1 IgG específica induzida com estes peptídeos (Tabela 1) é conduzida pela ajuda dos epítopos das células T derivados do carreador mas não de alergeno Bet ν 1. Foi surpreendentemente observado que nenhum dos peptídeos derivados de Bet ν 1 tem as seqüências LFPKV APQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF (SEQ ID N0. 20), GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN (SEQ ID N°. 21) e VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK (SEQ ID N°. 22) induzindo as respostas de células T relevantes, e pode ser demonstrado que a maioria das respostas das células T foi direta contra a molécula do carreador, KLH (Figuras. 18 e 19). Esta descoberta é mais importante para a redução dos efeitos colaterais durante a vacinação terapêutica e para a redução do risco de uma sensibilização potencial durante a vacinação profilática. Tem sido demonstrado no passado que os peptídeos derivados de alergenos necessitam de qualquer reatividade IgE mas contendo epítopos das células T derivados de alergenos induzindo efeitos colaterais devido a ativação da célula T. Os peptídeos derivados de alergeno necessitam de IgE e reatividade da célula T como exemplificado pelo peptídeos Bet ν 1, não induz IgE ou efeitos colaterais mediados por células T durante a vacinação terapêutica. Quando usado para a vacinação profilática, os peptídeos induzirão uma resposta IgG protetora específica de Bet ν 1 sem imprimação das células T específicas por Bet ν 1. Este deve minimizar o risco de pré-imprimação na resposta imune alérgica através da vacina que deve abrir caminho para uma sensibilização alérgica subseqüente.
Neste exemplo os alergenos e as respostas de células T específicas por carreadores em um modelo de camundongo de vacinação de alergeno terapêutica e profilática foram dessecadas. Os peptídeos derivados de Bet ν 1 2,3, e 6 (Focke M et al. (2004)) foram escolhidos e testados em se quer este que contém qualquer dos epítopos das células T específicos de Bet ν 1 conhecidos em camundongos BALB/c. Os camundongos foram imunizados como seguintes (Tabela 10 mostra um protocolo de sensibilização e tratamento): Os grupos de camundongos BALB/c (n=5) foram imunizados com 10 μg de Bet ν 1 recombinante (Biomay, Áustria) e/ou uma mistura de peptídeos sintéticos derivados de Bet ν 1 2, 3, e 6 (10 μg de cada). Os peptídeos foram ligados ao KLH como previamente descrito (Focke M et al. (2004)). Para a imunização, Bet ν 1 e a mistura dos peptídeos foram absorvidas por hidróxido de alumínio (Alu-Gel-S, Serva, Germany) em um volume total de 150 μΐ/camundongo.
Tabela 12: Protocolo de sensibilização e tratamento.
<table>table see original document page 97</column></row><table> O alergeno, peptídeo, e linfoproliferação específica do carreador foi analisado em um ensaio de proliferação de célula T. Os baços foram removidos sob condições estéreis e homogeneizadas. Após a Iise de eritrócitos, as células foram lavadas e recolocadas em suspensão em meio completo (RPMI, 10% de soro de bezerro fetal, 0,1 mg/ml de gentamicina, 2 mM de glutamina). As suspensões celulares simples foram recolocadas em placas fundas redondo de 96 reservatórios em uma concentração de 2 χ 10^5 células/reservatório e estimulada com concavalina A (0,5 μg/reservatório) como um controle positivo, rBet ν 1 (2 μg/reservatório), KLH (2 μg/reservatório), a mistura de peptídeo (0,34 μg de cada peptídeo/reservatório) ou o meio sozinho por 4 dias. As culturas foram pulsadas com 0,5 μC/reservatorio timidina tritiada por 16 horas e coletada. As resposta da proliferação foram medidos pela contagem de cintilação. A razão do meio de proliferação após a estimulação de antígeno e valores de meio de controle, isto é o índice de estimulação (SI), foi calculado.
Interessantemente, será mostrado que a vacinação terapêutica com peptídeos derivados de Bet ν 1 devem reduzir a proliferação específica de Bet ν 1 em camundongos sensibilizados por Bet ν 1 (grupo S+/T+) comparado aos sensibilizados mas grupos não tratados S+/T-. No grupo tratado e sensibilizado nenhuma proliferação específica de peptídeo será medido, mais de acordo com o efeito do carreador, uma proliferação específica KLH foi observada. A vacina de peptídeo sozinho (grupo S-/T+) induzido principalmente por células T específicas por KLH, mas não perto da resposta da célula T específica por Bet ν 1 (Figura 18).
A vacinação profilática com os peptídeos induzidos quase nenhuma proliferação específica por Bet ν 1 (grupo P+/S-) comparado aos grupos Bet ν lsensibilizados P-/S+ mas proliferação específica por KLH. Em camundongos profilaticamente vacinados e subseqüentemente sensibilizados (grupo P+/S+) a proliferação específica Bet ν 1 foi notavelmente reduzida, além disso, nenhuma resposta específica por peptídeo será observada em qualquer grupo de camundongo (Figura 19).
Deste modo, será mostrado em um modelo de camundongo alérgico que a vacinação profilática com peptídeos de célula B alergeno ligado por carreador não inicia as células T específicas por peptídeo, quase nenhum alergeno específico mas células T específicas de carreadores. A vacinação profilática precede a sensibilização alérgica mas também a vacinação terapêutica de camundongos sensibilizados que reduz a proliferação de célula T específica por alergeno.
O tratamento profilático com peptídeos derivados de Bet ν 1 induzido pela resposta Bet ν 1 IgG específicas sem a ajuda das células T específicas de Bet ν 1. Além disso, o tratamento profilático aumenta a resposta Bet ν 1 IgG específica induzida pelo alergeno Bet ν 1 já 20 e 40 dias após a primeira sensibilização (Figura 20).
Estes resultados demonstram que a vacina de peptídeo que induz uma resposta Bet ν 1 IgG específica pode ser auxiliada pela exposição do alergeno.
Exemplo 25: Peptídeos derivados de Der ρ 2 mostram a redução a capacidade de ligação de IgE.
A capacidade de ligação de IgE de peptídeos derivados de Der ρ 2 foi determinado como descrito no exemplos 15.1 e 20.1 utilizando os peptídeos de acordo com a Tabela 13 e usando e soro de indivíduos que sofre de alergia ao ácaro do pó doméstico.
Tabela 13: Peptídeos derivados por Der ρ 2
<table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table>
Os resultados claramente mostram que os peptídeos derivados de Der ρ 2 da presente invenção exibem significantemente redução da capacidade de ligação IgE.
Tabela 14: Resultados
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Exemplo 26: Variações no comprimento de peptídeos não tendo efeito na capacidade de ligação de peptídeos IgE, a reatividade da célula T e imunogenicidade.
26.1. Projeto dos peptídeos
Para estudar os efeitos da variação no comprimento do peptídeo, na capacidade de ligação de IgE, na reatividade da célula T e variantes de imunogenicidade dos peptídeos derivados de Phl ρ 5 foram projetados pelo aumento do comprimento do peptídeo 1 (Pl) e diminuição do comprimento do peptídeo 2 (P2) por um pouco de aminoácido (Tabela 15).
Tabela 15: Posição, seqüência, comprimento de diversos aminoácidos e peso molecular dos peptídeos sintéticos derivados de Phl ρ 5 (1, 2) e variantes destes (la, 2b).
Tabela 15: Variantes de peptídeos sintéticos derivados de PHL ρ 5.
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26.2. Falta da reatividade IgE
Para analisar a reatividade IgE de peptídeos derivados de Phl ρ 5 1, 2 e suas variantes la, 2b ensaios dot-blot foram realizados aplicando 0,2 μg de peptídeo/e não usando soro de 7 pacientes alérgicos a pólen de capim (pl a p7) e o soro de um indivíduo não atópico (NHS). A ligação IgE foi ligada com IgE anti-humano rotulado por 125 I (Phadia, Uppsala, Sweden). O rPh1 ρ 5 foi usado como controle positivo e HSA como controle negativo. Os pacientes reagem com rPhl ρ 5 mas não com os peptídeos e variantes de peptídeos (Fig. 21).
26.3. Respostas linfoproliferativas
Os PBMCs de 2 pacientes alérgicos à pólen de capim foram estimulados com concentrações diferentes de peptídeos derivados de Phl ρ 5 1, 2, e suas variantes la, 2b e para os propósitos de controle com rPhl ρ 5. Os índices de estimulação obtido com os peptídeos foram significantemente inferiores do que aqueles obtidos com rPhl ρ 5 (Fig. 22).
26.4. Imunogenicidade de variantes de peptídeos
Os coelhos foram imunizados com peptídeos ligados por KLH derivados de Phl ρ 5 e variantes. Os experimentos por ELISA foram usados para medir a reatividade IgG do anti-soro de coelho obtido aos polipeptídeos e suas variantes (Tabela 16). A imunização com peptídeos e suas variantes induz os anticorpos reativos cruzados IgG que reconhecem o peptídeo e a variante correspondente.
Tabela 16: A reatividade cruzada do anti-soro de peptídeo anti-Phl ρ 5 elevado nos coelhos pela imunização com peptídeos conjugados por KLH. As reatividades IgG de anti-soro de peptídeo aos polipeptídeos (1, 2) e variantes (la, 2b) são exibidos. Nenhuma reatividade foi observada com soro pré-imune (pré P1, pré Pia, pré P2, pré P2b)
a. O anti-soro anti peptídeo 1 (anti P1) reage cruzado com a variante de peptídeo 1 (la) e anti-soro anti-peptídeo Ia (anti Pia) reage cruzado com peptídeo 1.
b. O anti-soro anti-peptídeo 2 (anti P2) reage cruzado com a variante de peptídeo 2 (2b) e o anti-soro anti-peptídeo 2b (anti P2b) reage cruzado com peptídeo 2.
Tabela 16: A reatividade cruzada de anti-soro de coelho
a) <table>table see original document page 102</column></row><table>
b) <table>table see original document page 102</column></row><table>
26.5. A ligação IgE de pacientes alérgicos à pólen de capim inibem o anti-soro de coelho induzido por peptídeo por rPhl ρ 5
A capacidade do anti-peptídeo 2 de coelho e 2b IgGs para inibir a ligação IgE humana por rPh1 ρ 5 foi estudada por competição por ELISAs. A placa de ELISA liga ao rPh1 ρ 5 e foi pré-incubada com anti P2, anti P2b e, para os propósitos de controle, com o anti-soro anti Phl ρ 5. As placas foram então expostas ao soro de 12 pacientes alérgicos à pólen de capim. A porcentagem da inibição de ligação IgE por rPhl ρ 5 é exibido na Tabela 17. O anti-soro anti-peptídeo 2 e anti-peptídeo 2b inibe a ligação IgE em pacientes por rPhl ρ 5 à mesma extensão.
As competições por ELISAs também foram realizadas com anti-peptídeo 1 de coelho e anti-soro 1 a. No exemplo 17 (Imunização com os peptídeos derivados de Phl ρ 5 que induz os anticorpos IgG que inibem a ligação do pacientes alérgicos à pólen de capim IgE por Phl ρ 5) os anticorpos de anti- peptídeo 1 (Pl) de pacientes que inibem a ligação IgE por Phl ρ 5 como uma taxa de meio de inibição de 28,5 %. Os resultados similares foram obtidos com anti-soro anti-peptídeo Ia que dão uma taxa de inibição de 23,7 Tabela 17: Inibição da ligação de pacientes IgE por rPhl ρ 5 pelo anti-soro anti- peptídeo. O anti-soro anti-peptídeo 2 e anti-peptídeo 2b inibe a ligação IgE dos pacientes por rPh1 ρ 5 à mesma extensão. A placa de ELISA liga-se ao rPhl ρ 5 e será pré-incubada com anti P2, anti P2b e, para os propósitos de controle, com anti-soro anti-Phl ρ 5. As placas foram então expostas ao soro de 12 pacientes alérgicos à pólen de capim. A porcentagem da inibição de ligação IgE por rPh1 ρ 5 é exibida.
Tabela 17: % da inibição da ligação IgE
<table>table see original document page 103</column></row><table>
Exemplo 27: Proteção cruzada de anticorpos anti-VPl
O rinovírus humano compreende em cem cepas diferentes. Neste teste de neutralização é mostrado que a infecção de rinovírus de uma cepa pode também ser exibida pelos anticorpos específicos VPl de uma outra cepa. As células HeLa foram semeadas nos reservatórios em densidade igual. O 100TCD5O HRV14 foi pré-incubado com diluições de anticorpos anti- 14VP1 e anti-89VPl (não diluídos; 1:2 a 1:32 reservatórios 1 a 6) e adicionados aos reservatórios na linha AeD, respectivamente. Nas linhas B e C 100TCD5O HRV 89 pré-incubadas com diluições de anticorpos anti-14VPl e anti-89VPl, respectivamente, foram adicionados à células. Após 3 dias vivas as células foram tingidas com violeta. Os anticorpos anti-89VPl e anti- 14VP1 bloqueiam a infecção de HRV14 em uma maneira comparável. Os anticorpos elevados contra 14VP1 e 89VP1 também inibem a infecção de HRV89 até a mesma concentração. LISTAGEM DH SEQÜÊNCIAS
<110> Biomay AG
<120> Carreador de vacina
<130> R 49994
<150> AT A 994/2006
<151> 2006-06-09
<160> 142
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 1
cggaattcat taatatgaac ccagttgaaa attatataga tagtgtatta 50
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 2
cgattaattc agtggtggtg gtggtggtgg acgtttgtaa cggtaa 4 6
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 3
ctttaagaag gagatatact taagatgaac ccagttg
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 4
caactgggtt catcttaagt atatctcctt cttaaag <210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 5
cctgatgttt ttaccggtac aaacgtccac cac
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 6
gtggtggacg tttgtaccgg taaaaacatc agg 33
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 7
cgcgcttaag atggtccgct acaccaccga gggc 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 8
cgcgcttaag cttggactcg taggcggtgt cggc 34
<210> 9
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 9
Cys Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly Leu Ser Gly Glu 15 10 15 Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Ser Lys 20 25 30
<210> 10
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 10
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 15 10 15
Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly 20 25 30
Lys Cys
<210> 11
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 11
Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala 15 10 15
Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu Arg Ile Cys 20 25 30
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 12
Cys Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala 15 10 15
Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys 20 25 30
<210> 13 <211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Phl ρ 5
<400> 13
Thr Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys Tyr Thr Val Phe Glu Thr Ala 1 5 10 15
Leu Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gln Lys Ala Ala Lys 20 25 30
Cys
<210> 14
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Phl ρ 5 <400> 14
Cys Ala Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile 1 5 10 15
Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala 20 25 30
Ala Pro Ala Asn Asp Lys 35
<210> 15
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 <400> 15
Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly 1 5 10 15
Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30
Val Val Cys 35 <210> 16
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 <400> 16
Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr 1 5 10 15
Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 20 25 30
Ser Pro Leu Cys 35
<210> 17
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 <400> 17
Val Lys Met Ala Ile Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala 1 5 10 15
Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30
Asn Ala Cys 35
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 <400> 18
Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val 1 5 10 15
Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Cys 20 25 30 <210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1
<400> 19
Cys Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val 15 10 15
Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 20 25 30
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Bet ν 1
<400> 20
Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile 15 10 15
Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe 20 25 30
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Bet ν 1
<400> 21
Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 15 10 15
Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn 20 25 30
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Bet ν 1
<400> 22 Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly 1 5 10 15
Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys 20 25 30
<210> 23
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 1
<400> 23
Ala Pro Leu Glu Ser Arg Gln Asp Thr Ala Ser Cys Pro Val Thr Thr 1 5 10 15
Glu Gly Asp Tyr Val Trp Lys Ile Ser Glu Phe Tyr Gly Arg Lys Pro 20 25 30
Glu Gly Thr Tyr Tyr Asn Ser Leu 35 40
<210> 24
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 1 <400> 24
Gly Phe Asn Ile Lys Ala Thr Asn Gly Gly Thr Leu Asp Phe Thr Cys 1 5 10 15
Ser Ala Gln Ala Asp Lys Leu Glu Asp His Lys Trp Tyr Ser Cys Gly 20 25 30
Glu Asn Ser Phe Met 35
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 1 <400> 25 Glu Asn Ser Phe Met Asp Phe Ser Phe Asp Ser Asp Arg Ser Gly Leu 1 5 10 15
Leu Leu Lys Gln Lys Val Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Val Ala 20 25 30
<210> 26
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 1
<400> 26
Thr Ala Thr Leu Pro Asn Tyr Cys Arg Ala Gly Gly Asn Gly Pro Lys 1 5 10 15
Asp Phe Val Cys Gln Gly Val Ala Asp Ala Tyr Ile Thr Leu Val Thr 20 25 30
Leu Pro Lys Ser Ser 35
<210> 27
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 2
<400> 27
Met His Ser Ser Asn Asn Phe Phe Lys Asp Asn Ile Phe Arg Ser Leu 1 5 10 15
Ser Lys Glu Asp Pro Asp Tyr Ser Arg Asn Ile Glu Gly Gln Val Ile 20 25 30
Arg Leu His Trp Asp Trp Ala Gln 35 40
<210> 28
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 2
<400> 28
Leu Leu Met Leu Ser Ala Lys Arg Met Lys Val Ala Phe Lys Leu Asp 1 5 10 15 Ile Glu Lys Asp Gln Arg Val Trp Asp Arg Cys Thr Ala Asp Asp Leu 20 25 30
Lys Gly Arg Asn Gly Phe Lys Arg 35 40
<210> 29
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 2
<400> 29
Cys Leu Gln Phe Thr Leu Tyr Arg Pro Arg Asp Leu Leu Ser Leu Leu 15 10 15
Asn Glu Ala Phe Phe Ser Ala Phe Arg Glu Asn Arg Glu Thr Ile Ile 20 25 30
Asn Thr Asp Leu Glu Tyr Ala Ala 35 40
<210> 30
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 2
<400> 30
Lys Ser Ile Ser Met Ala Arg Leu Glu Asp Leu Trp Lys Glu Tyr Gln 15 10 15
Lys Ile Phe Pro Ser Ile Gln Val Ile Thr Ser Ala Phe Arg Ser Ile 20 25 30
Glu Pro Glu Leu Thr Val Tyr Thr 35 40
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 2
<400> 31 Cys Leu Lys Lys Ile Glu Ala Ser Phe Glu Leu Ile Glu Glu Asn Gly 1 5 10 15
Asp Pro Lys Ile Thr Ser Glu Ile Gln Leu Leu Lys Ala Ser 20 25 30
<210> 32
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6 <400> 32
Met Thr Ile Thr Lys Ile His Ala Arg Ser Val Tyr Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15
Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Ile Val Thr Glu Thr Gly Leu His Arg 20 25 30
Ala Ile
<210> 33
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6 <400> 33
Val Thr Glu Thr Gly Leu His Arg Ala Ile Val Pro Ser Gly Ala Ser 1 5 10 15
Thr Gly Ser His Glu Ala Cys Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Lys 20 25 30
Trp Gly Gly Lys Gly Val Thr Lys 35 40
<210> 34
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6
<400> 34 Ala Pro Ala Leu Ile Lys Glu Lys Leu Asp Val Lys Asp Gln Ser Ala 1 5 10 15
Val Asp Ala Phe Leu Asn Lys Leu Asp Gly Thr Thr Asn Lys Thr Asn 20 25 30
Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser 35 40
<210> 35
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6 <400> 35
Glu Lys Gly Val Pro Leu Tyr Ala His Ile Ser Asp Leu Ala Gly Thr 1 5 10 15
Lys Lys Pro Tyr Val Leu Pro Val Pro Phe Gln Asn Val Leu Asn Gly 20 25 30
Gly Ser His Ala Gly Gly Arg Leu Ala 35 40
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6 <400> 36
Cys Glu Ala Pro Thr Phe Ser Glu Ala Met Arg Gln Gly Ala Glu Val 1 5 10 15
Tyr Gln Lys Leu Lys Ala Leu Ala Lys Lys Thr Tyr Gly Gln Ser Ala 20 25 30
Gly Asn Val Gly Asp Glu Gly Gly 35 40
<210> 37
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220> <223>
Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6 <400> 37
Ile Lys Ile Ala Met Asp Val Ala Ser Ser Glu Phe Tyr Lys Ala Asp 15 10 15
Glu Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ser 20 25 30
Lys Trp Leu Thr Tyr Glu Gln Leu 35 40
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6
<400> 38
Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Ala Glu Asp Asp Trp Glu Ala Trp Ser 15 10 15
Tyr Phe Phe Lys Thr Tyr Asp Gly Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Thr 20 25 30
Val Thr Asn Pro Glu Phe Ile Lys 35 40
<210> 39
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6
<400> 39
Ala Lys Asp Ala Phe Gly Ala Gly Trp Gly Val Met Val Ser His Arg 15 10 15
Ser Gly Glu Thr Glu Asp Val Thr Ile Ala Asp Ile Val Val Gly Leu 20 25 30
Arg Ser Gly Gln Ile Lys Thr Gly 35 40
<210> 40
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Alt a 6 <400> 40
Ala Pro Ala Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Leu Asn Gln Ile Leu Arg 1 5 10 15
Ile Glu Glu Glu Leu Gly Asp Asn Ala Val Tyr Ala Gly Asn Asn Phe 20 25 30
Arg Thr Ala Val Asn Leu 35
<210> 41
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1 <400> 41
Glu Ile Leu Pro Val Asn Glu Thr Arg Arg Leu Thr Thr Ser Gly Ala 1 5 10 15
Tyr Asn Ile Ile Asp Gly Cys Trp Arg Gly Lys Ala Asp Trp Ala Glu 20 25 30
Asn Arg Lys Ala Leu Ala Asp Cys 35 40
<210> 42
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1 <400> 42
Gly Gly Lys Asp Gly Asp Ile Tyr Thr Val Thr Ser Glu Leu Asp Asp 1 5 10 15
Asp Val Ala Asn Pro Lys Glu Gly Thr Leu Arg Phe Gly Ala Ala Gln 20 25 30
Asn Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Glu 35 40 <210> 43
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1
<400> 43
Ile Arg Leu Asp Lys Glu Met Val Val Asn Ser Asp Lys Thr Ile Asp 15 10 15
Gly Arg Gly Ala Lys Val Glu Ile Ile Asn Ala Gly Phe Thr Leu 20 25 30
<210> 44
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1
<400> 44
Asn Val Ile Ile His Asn Ile Asn Met His Asp Val Lys Val Asn Pro 15 10 15
Gly Gly Leu Ile Lys Ser Asn Asp Gly Pro Ala Ala Pro Arg Ala Gly 20 25 30
Ser Asp Gly Asp Ala Ile Ser Ile Ser 35 40
<210> 45
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1
<400> 45
Gly Thr Thr Arg Leu Thr Val Ser Asn Ser Leu Phe Thr Gln His Gln 15 10 15
Phe Val Leu Leu Phe Gly Ala Gly Asp Glu Asn Ile Glu Asp Arg Gly 20 25 30
Met Leu Ala Thr Val Ala Phe 35
<210> 46
<211> 37
<212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1 <400> 46
Asn Thr Phe Thr Asp Asn Val Asp Gln Arg Met Pro Arg Cys Arg His 1 5 10 15
Gly Phe Phe Gln Val Val Asn Asn Asn Tyr Asp Lys Trp Gly Ser Tyr 20 25 30
Ala Ile Gly Gly Ser 35
<210> 47
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1 <400> 47
Ile Leu Ser Gln Gly Asn Arg Phe Cys Ala Pro Asp Glu Arg Ser Lys 1 5 10 15
Lys Asn Val Leu Gly Arg His Gly Glu Ala Ala Ala Glu Ser Met Lys 20 25 30
Trp Asn Trp Arg Thr Asn Lys Asp Val Leu Glu Asn Gly Ala 35 40 45
<210> 48
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Amb a 1 <400> 48
Gly Val Asp Pro Val Leu Thr Pro Glu Gln Ser Ala Gly Met Ile Pro 1 5 10 15
Ala Glu Pro Gly Glu Ser Ala Leu Ser Leu Thr Ser Ser Ala Gly Val 20 25 30
Leu Ser Cys Gln Pro Gly Ala Pro Cys 35 40 <210> <211> <212> <213>
49 44 PRT
Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Art ν 1 <400> 49
Ser Lys Leu Cys Glu Lys Thr Ser Lys Thr Tyr Ser Gly Lys Cys Asp 1 5 10 15
Asn Lys Lys Cys Asp Lys Lys Cys Ile Glu Trp Glu Lys Ala Gln His 20 25 30
Gly Ala Cys His Lys Arg Glu Ala Gly Lys Glu Ser 35 40
<210> 50
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Art ν 1 <400> 50
Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser Pro Pro Gly Ala Thr 1 5 10 15
Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ala Gly Gly Ser 20 25 30
<210> 51
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Art ν 1 <400> 51
Ala Pro Pro Pro Ala Ala Gly Gly Ser Pro Ser Pro Pro Ala Asp Gly 1 5 10 15
Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Val Asp Gly 20 25 30
Gly Ser Pro Pro Pro Pro Ser Thr His 35 40
<210> 52 <211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 1
<400> 52
Gln Asp Thr Pro Ala Leu Gly Lys Asp Thr Val Ala Val Ser Gly Lys 15 10 15
Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Ala Asp Gln Glu Val Pro Glu Lys Pro 20 25 30
Asp Ser Val Thr Pro Met 35
<210> 53
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 1
<400> 53
Asp Ser Val Thr Pro Met Ile Leu Lys Ala Gln Lys Gly Gly Asn Leu 15 10 15
Glu Ala Lys Ile Thr Met Leu Thr Asn Gly Gln Cys Gln Asn Ile Thr 20 25 30
Val Val Leu His Lys Thr Ser Glu 35 40
<210> 54
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 1
<400> 54
Cys Gln Asn Ile Thr Val Val Leu His Lys Thr Ser Glu Pro Gly Lys 15 10 15
Tyr Thr Ala Tyr Glu Gly Gln Arg Val Val Phe Ile Gln Pro Ser Pro 20 25 30
Val Arg Asp His Tyr Ile Leu Tyr Cys 35 40 <210> 55
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 1
<400> 55
Gln Pro Ser Pro Val Arg Asp His Tyr Ile Leu Tyr Cys Glu Gly Glu 15 10 15
Leu His Gly Arg Gln Ile Arg Met Ala Lys Leu Leu Gly Arg Asp Pro 20 25 30
Glu Gln Ser Gln Glu Ala Leu Glu 35 40
<210> 56
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 1
<400> 56
Arg Asp Pro Glu Gln Ser Gln Glu Ala Leu Glu Asp Phe Arg Glu Phe 15 10 15
Ser Arg Ala Lys Gly Leu Asn Gln Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gln Ser 20 25 30
Glu Thr Cys Ser Pro Gly Gly Gln 35 40
<210> 57
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 2
<400> 57
Gln Glu Gly Asn His Glu Glu Pro Gln Gly Gly Leu Glu Glu Leu Ser 15 10 15
Gly Arg Trp His Ser Val Ala Leu Ala Ser Asn Lys Ser Asp Leu Ile 20 25 30 Lys Pro Trp Gly His Phe Arg Val 35 40
<210> 58
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 2
<400> 58
Pro Trp Gly His Phe Arg Val Phe Ile His Ser Met Ser Ala Lys Asp 15 10 15
Gly Asn Leu His Gly Asp Ile Leu Ile Pro Gln Asp Gly Gln Cys Glu 20 25 30
Lys Val Ser Leu Thr Ala Phe Lys 35 40
<210> 59
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 2
<400> 59
Cys Glu Lys Val Ser Leu Thr Ala Phe Lys Thr Ala Thr Ser Asn Lys 15 10 15
Phe Asp Leu Glu Tyr Trp Gly His Asn Asp Leu Tyr Leu Ala Glu Val 20 25 30
Asp Pro Lys Ser Tyr Leu 35
<210> 60
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 2
<400> 60
Asn Asp Leu Tyr Leu Ala Glu Val Asp Pro Lys Ser Tyr Leu Ile Leu 15 10 15 Tyr Met Ile Asn Gln Tyr Asn Asp Asp Thr Ser Leu Val Ala His Leu 20 25 30
Met Val Arg Asp Leu Ser Arg 35
<210> 61
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Can f 2
<400> 61
Val Arg Asp Leu Ser Arg Gln Gln Asp Phe Leu Pro Ala Phe Glu Ser 15 10 15
Val Cys Glu Asp Ile Gly Leu His Lys Asp Gln Ile Val Val Leu Ser 20 25 30
Asp Asp Asp Arg Cys Gln Gly Ser Arg Asp 35 40
<210> 62
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 62
Glu Ala His Gln Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu 15 10 15
Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln 20 25 30
Gln Cys
<210> 63
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 63 Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 1 5 10 15
Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys 20 25 30
Asp Asp Asn 35
<210> 64
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 64
Asn Glu Gln Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg 1 5 10 15
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu 20 25 30
<210> 65
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 65
Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln 1 5 10 15
Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro Val 20 25 30
<210> 66
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 66
Val Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val 1 5 10 15
Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro 20 25 30 <210> 67
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 67
Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Thr Asp 15 10 15
Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu Phe Lys 20 25 30
<210> 68
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 68
Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His 15 10 15
Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly 20 25 30
<210> 69
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 69
Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu 15 10 15
Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ala 20 25 30
<210> 70
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2 <400> 70
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe 1 5 10 15
Ala Lys Gly Cys Val Ala Asp Gln Ser Ala Ala Asn Cys Glu Lys Ser 20 25 30
Leu His Glu Leu Leu Gly Asp Lys Leu Cys 35 40
<210> 71
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2 <400> 71
Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Gly Gln Leu Val 1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His Glu Asn Glu Gln 20 25 30
Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu 35 40
<210> 72
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2 <400> 72
Glu Glu Tyr Lys Gly Val Phe Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys 1 5 10 15
Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala Leu Arg Glu Lys Val Leu 20 25 30
Ala Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys 35 40
<210> 73
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 73
Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser 15 10 15
Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile 20 25 30
Ser Lys Leu Val Thr Asp 35
<210> 74
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 74
Phe Ala Glu Ile Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ile His Lys 15 10 15
Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp 20 25 30
Leu Ala Lys Tyr Ile Cys 35
<210> 75
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2
<400> 75
Cys Gly Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ser Glu Val Glu 15 10 15
Arg Asp Glu Leu Pro Ala Asp Leu Pro Pro Leu Ala Val Asp Phe Val 20 20 25
Glu Asp Lys Glu Val Cys 35
<210> 76 <211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2 <400> 76
Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu 1 5 10 15
Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu 20 25 30
Val Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val 35 40
<210> 77
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2 <400> 77
Cys Thr His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu 1 5 10 15
Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val 20 25 30
Ser Glu Arg Val Thr Lys Cys 35
<210> 78
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 2 <400> 78
Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gln 1 5 10 15
Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Ser Ala Glu Thr Phe Thr 20 25 30
Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu 35 40 <210> 79
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ole e 1 <400> 79
Glu Asp Ile Pro Gln Pro Pro Val Ser Gln Phe His Ile Gln Gly Gln 1 5 10 15
Val Tyr Cys Asp Thr Cys Arg Ala Gly Phe Ile Thr Glu Leu Ser Glu 20 25 30
Phe Ile Pro Gly Ala Ser Leu Arg 35 40
<210> 80
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ole e 1
<400> 80
Gly Ala Ser Leu Arg Leu Gln Cys Lys Asp Lys Glu Asn Gly Asp Val 1 5 10 15
Thr Phe Thr Glu Val Gly Tyr Thr Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Ser 20 25 30
<210> 81
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ole e 1 <400> 81
Gly Leu Tyr Ser Met Leu Val Glu Arg Asp His Lys Asn Glu Phe Cys 1 5 10 15
Glu Ile Thr Leu Ile Ser Ser Gly Arg Lys Asp Cys Asn Glu Ile Pro 20 25 30
Thr Glu Gly Trp Ala 35 <210> 82
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ole e 1
<400> 82
Gly Arg Lys Asp Cys Asn Glu Ile Pro Thr Glu Gly Trp Ala Lys Pro 15 10 15
Ser Leu Lys Phe Lys Leu Asn Thr Val Asn Gly Thr Thr Arg Thr Val 20 25 30
Asn Pro Leu 35
<210> 83
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ole e 1
<400> 83
Leu Asn Thr Val Asn Gly Thr Thr Arg Thr Val Asn Pro Leu Gly Phe 15 10 15
Phe Lys Lys Glu Ala Leu Pro Lys Cys Ala Gln Val Tyr Asn Lys Leu 20 25 30
Gly Met Tyr Pro Pro Asn Met 35
<210> 84
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Par j 2
<400> 84
Gly Glu Glu Ala Cys Gly Lys Val Val Gln Asp Ile Met Pro Cys Leu 15 10 15
His Phe Val Lys Gly Glu Glu Lys Glu Pro Ser Lys Glu Cys 20 25 30 <210> 85
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Par j 2 <400> 85
Cys Leu His Phe Val Lys Gly Glu Glu Lys Glu Pro Ser Lys Glu Cys 1 5 10 15
Cys Ser Gly Thr Lys Lys Leu Ser Glu Glu Val Lys Thr Thr Glu Gln 20 25 30
Lys Arg Glu Ala 35
<210> 86
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Par j 2 <400> 86
Cys Cys Ser Gly Thr Lys Lys Leu Ser Glu Glu Val Lys Thr Thr Glu 1 5 10 15
Gln Lys Arg Glu Ala Cys Lys Cys Ile Val Arg Ala Thr Lys Gly Ile 20 25 30
Ser Gly Ile Lys Asn 35
<210> 87
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Par j 2 <400> 87
Glu Leu Val Ala Glu Val Pro Lys Lys Cys Asp Ile Lys Thr Thr Leu 1 5 10 15
Pro Pro Ile Thr Ala Asp Phe Asp Cys Ser Lys Ile Gln Ser Thr Ile 20 25 30 Phe Arg Gly Tyr Tyr 35
<210> 88
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1
<400> 88
Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu 15 10 15
Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly 20 25 30
<210> 89
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1
<400> 89
Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser 15 10 15
Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile 20 25 30
Gln
<210> 90
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1
<400> 90
His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu 15 10 15
Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn 20 25 30 <210> 91
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1 <400> 91
Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser 1 5 10 15
Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys Ile Arg Glu Ala 20 25 30
Leu Ala Gln Thr His 35
<210> 92 <211> 31 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1 <400> 92
Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln 1 5 10 15
Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val 20 25 30
<210> 93
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1 <400> 93
Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His 1 5 10 15
Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp 20 25 30
Ile <210> 94
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1 <400> 94
Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn 1 5 10 15
Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala 20 25 30
Asn Ile
<210> 95
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1 <400> 95
Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr 1 5 10 15
Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val 20 25 30
Val Ile Leu 35
<210> 96
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 2 <400> 96
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val 1 5 10 15
Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly 20 25 30 Lys
<210> 97
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 2
<400> 97
Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln 15 10 15
Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys 20 25 30
<210> 98
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 2
<400> 98
Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser 15 10 15
Ile Glu Gly Leu Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys 20 25 30
<210> 99
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 2
<400> 99
Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys 15 10 15
Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile 20 25 30
Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn 35 40 <210> 100
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 2 <400> 100
Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly Asp 1 5 10 15
Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 25 30
<210> 101
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 5 <400> 101
Met Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu 1 5 10 15
Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe 20 25 30
Tyr Leu Gln 35
<210> 102
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 5 <400> 102
Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Glu Gln Ile Asn His 1 5 10 15
Phe Glu Glu Lys Pro Thr Lys Glu Met Lys Asp Lys Ile Val Ala Glu 20 25 30
Met Asp Thr Ile 35
<210> 103 <211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 5
<400> 103
Asp Gly Val Arg Gly Val Leu Asp Arg Leu Met Gln Arg Lys Asp Leu 15 10 15
Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly 20 25 30
<210> 104
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 5
<400> 104
Asp Leu Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser 15 10 15
Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys 20 25 30
Lys Ile Glu Val 35
<210> 105
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 7
<400> 105
Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val 15 10 15
Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp 20 25 30
<210> 106
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 7 <400> 106
Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Pro Met Lys Val Pro 15 10 15
Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His Ile Gly Ile Ile Asp Leu 20 25 30
<210> 107
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 7
<400> 107
Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln Val Arg Gly Leu Lys 15 10 15
Gln Met Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys Ser Glu Asp Gly 20 25 30
<210> 108
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 7
<400> 108
Val His Asp Asp Val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu 15 10 15
Gly Asp Leu His Pro Asn Thr His Val Ile Ser Asp Ile Gln Asp Phe 20 25 30
Val Val Glu Leu 35
<210> 109
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 7
<400> 109
Leu Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr Ser Phe 15 10 15 Glu Val Arg Gln Phe Ala Asn Val Val Asn His Ile Gly Gly Leu 20 25 30
<210> 110
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 7
<400> 110
Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala Ile Phe Gln Asp Thr Val Arg Ala Glu 15 10 15
Met Thr Lys Val Leu Ala Pro Ala Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn 20 25 30
Asn Gln
<210> 111
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10
<400> 111
Met Glu Ala Ile Lys Lys Lys Met Gln Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 15 10 15
Asn Ala Ile Asp Arg Ala Glu Ile Ala Glu Gln Lys Ala Arg Asp Ala 20 25 30
Asn Leu Arg 35
<210> 112
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10
<400> 112
Ala Glu Lys Ser Glu Glu Glu Val Arg Ala Leu Gln Lys Lys Ile Gln 15 10 15 Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asp Gln Val Gln Glu Gln Leu Ser Ala Ala 20 25 30
Asn Thr Lys 35
<210> 113
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10 <400> 113
Leu Glu Glu Lys Glu Lys Ala Leu Gln Thr Ala Glu Gly Asp Val Ala 1 5 10 15
Ala Leu Asn Arg Arg Ile Gln Leu Ile Glu Glu Asp Leu Glu Arg Ser 20 25 30
Glu Glu Arg Leu Lys Ile Ala Thr 35 40
<210> 114
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10 <400> 114
Ala Lys Leu Glu Glu Ala Ser Gln Ser Ala Asp Glu Ser Glu Arg Met 1 5 10 15
Arg Lys Met Leu Glu His Arg Ser Ile Thr Asp Glu Glu Arg Met Glu 20 25 30
Gly Leu Glu 35
<210> 115
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10
<400> 115 Arg Met Glu Gly Leu Glu Asn Gln Leu Lys Glu Ala Arg Met Met Ala 15 10 15
Glu Asp Ala Asp Arg Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala 20 25 30
<210> 116
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 1
<400> 116
Asp Leu Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Thr Gly Glu Ser Lys Ile 15 10 15
Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys 20 25 30
<210> 117
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10
<400> 117
Ser Glu Glu Lys Ala Gln Gln Arg Glu Glu Ala His Glu Gln Gln Ile 15 10 15
Arg Ile Met Thr Thr Lys Leu Lys Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe 20 25 30
Ala Glu Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln 35 40
<210> 118
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 10
<400> 118
Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu Glu Asp Glu Leu Val His Glu Lys Glu 15 10 15 Lys Tyr Lys Ser Ile Ser Asp Glu Leu Asp Gln Thr Phe Ala Glu Leu 20 25 30
Thr Gly Tyr 35
<210> 119
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 21 <400> 119
Met Phe Ile Val Gly Asp Lys Lys Glu Asp Glu Trp Arg Met Ala Phe 1 5 10 15
Asp Arg Leu Met Met Glu Glu Leu Glu Thr Lys Ile Asp Gln Val Glu 20 25 30
Lys Gly Leu 35
<210> 120 <211> 37 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 21 <400> 120
Leu His Leu Ser Glu Gln Tyr Lys Glu Leu Glu Lys Thr Lys Ser Lys 1 5 10 15
Glu Leu Lys Glu Gln Ile Leu Arg Glu Leu Thr Ile Gly Glu Asn Phe 20 25 30
Met Lys Gly Ala Leu 35
<210> 121
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 21
<400> 121 Gly Ala Leu Lys Phe Phe Glu Met Glu Ala Lys Arg Thr Asp Leu Asn 15 10 15
Met Phe Glu Arg Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys 20 25 30
<210> 122
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Der ρ 21
<400> 122
Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys 15 10 15
Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr 20 25 30
Tyr
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Clone 30
<400> 123
Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr Val His Pro Thr 15 10 15
Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly 20 25 30
<210> 124
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica
<400> 124
Pro Thr Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg 15 10 15 Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys 20 25 30
Ser Asn
<210> 125
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Clone 30 <400> 125
Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser 1 5 10 15
Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn 20 25 30
Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr 35
<210> 126
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Bet ν 1 <400> 126
Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile 1 5 10 15
Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe 20 25 30
<210> 127
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Bet ν 1 <400> 127
Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 1 5 10 15
Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn 20 25 30 <210> 128
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Bet ν 1
<400> 128
Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly Gly 15 10 15
Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys 20 25 30
<210> 129
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 de cadeia 1
<400> 129
Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly 15 10 15
Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30
Val Val Cys 35
<210> 130
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 de cadeia 1
<400> 130
Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr 15 10 15
Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr 20 25 30
Ser Pro Leu Cys 35 <210> 131
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 de cadeia 2 <400> 131
Val Lys Met Ala Ile Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala 1 5 10 15
Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30
Asn Ala Cys 35
<210> 132
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 de cadeia 2
<400> 132
Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val 1 5 10 15
Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Cys 20 25 30
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Fel d 1 de cadeia 2
<400> 133
Cys Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val 1 5 10 15
Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 20 25 30
<210> 134
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 134
Cys Gly Ala Ala Ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly Leu Ser Gly Glu 15 10 15
Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Ser Lys 20 25 30
<210> 135
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 135
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 15 10 15
Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly 20 25 30
Lys Cys
<210> 136
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 136
Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala 15 10 15
Lys Tyr Asp Ala Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu Arg Ile Cys 20 25 30
<210> 137
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Ph1 ρ 5
<400> 137 Cys Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala 1 5 10 15
Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys 20 25 30
<210> 138
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Phl ρ 5 <400> 138
Thr Val Ala Thr Ala Pro Glu Val Lys Tyr Thr Val Phe Glu Thr Ala 1 5 10 15
Leu Lys Lys Ala Ile Thr Ala Met Ser Glu Ala Gln Lys Ala Ala Lys 20 25 30
Cys
<210> 139
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Molécula hiperalergênica derivada de Phl ρ 5 <400> 139
Cys Ala Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile 1 5 10 15
Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala 20 25 30
Ala Pro Ala Asn Asp Lys 35
<210> 140
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Alergeno de Dermatophagoides pteronyssinus de clone 30
<400> 140 Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr Val His Pro Thr 1 5 10 15
Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly 20 25 30
Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn 35 40 45
Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu 50 55 60
Asp Glu Glu Thr Cys Thr 65 70
<210> <211> <212> <213> 141 37 PRT Artificial <220> <223> Peptideo derivado de Phl P 5 <400> 141 Cys Phe 1 Val Ala Thr Phe Gly 5 Ala Ala Ser 10 Asn Lys Ala Phe Ala 15 Glu Gly Leu Ser Gly 20 Glu Pro Lys Gly Ala 25 Ala Glu Ser Ser Ser 30 Lys Ala
Ala Leu Thr Ser Lys 35
<210> 142
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptideo derivado de Phl ρ 5 <400> 142
Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 1 5 10 15
Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Cys 20 25

Claims (57)

1. Proteína hipoalergênica, caracterizada pelo fato de que consiste de pelo menos uma molécula hipoalergênica derivada de um alergeno, que é fundido ou conjugado a pelo menos uma segunda proteína não alergênica ou fragmento desta.
2. Proteína hipoalergênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula hipoalergênica é fundida ao terminal N e/ou terminal C da dita pelo menos uma segunda proteína ou fragmento desta.
3. Proteína hipoalergênica de acordo com a reivindicação 1 ou -2, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma segunda proteína é uma proteína viral, em particular RNA ou DNA viral, bacteriana, fungica ou de protozoário.
4. Proteína hipoalergênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a proteína viral é uma proteína de capsídeo.
5. Proteína hipoalergênica de acordo com a reivindicação 3 ou -4, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína viral é derivada de um vírus patogênico humano, preferivelmente um vírus da família de pi- cornaviridae.
6. Proteína hipoalergênica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o vírus da família de picornaviridae é do gênero de rinovírus, preferivelmente das espécies de rinovírus humanos, em particular rinovírus humano de 89 ou 14.
7. Proteína hipoalergênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o alergeno é selecionado do grupo selecionado do grupo que consiste de alergenos de pólen de bétula principal, em particular Bet ν 1 e Bet ν 4, alergenos de pólen de capim-rabo-de-rato principal, em particular Phl ρ 1, Ph1 ρ 2, PH1 ρ 5, Ph1 ρ -6 e PH1 ρ 7, alergenos de ácaro do pó doméstico, em particular Der ρ 1 e Der ρ - 2, alergeno de gato principal Fel d 1 e Fel d 2, alergenos de abelha principais, alergenos de vespa principais, profilinas, especialmente Phl ρ 12, alergenos de oliva, especialmente Ole e 1, alergenos de Parietaria judaica, especialmente Par j 2, alergenos de erva-de-santiago, especialmente Amb a 1, alergenos de pólen de absinto, especialmente Art ν 1 e alergenos de ácaro de armazenagem, especialmente Lep d 2.
8. Proteína hipoalergênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a molécula hipoalergênica apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida.
9. Proteína hipoalergênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que molécula hipoalergênica apresenta reatividade de célula T reduzida.
10. Proteína hipoalergênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o fragmento de alergeno é composto de aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 ou - 212 a 241 de Phl ρ 1, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a - 162, 217 a 246, 252 a 283 ou 176 a 212 de Phl ρ 5, aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 de cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 de cadeia - 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79 ou 75 a 104 de Bet ν 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der ρ 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der ρ 7, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der ρ 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Parj 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a - 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a - 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art ν 1, aminoácidos 31 a 70, - 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a - 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou fragmentos ou variações de seqüência destes.
11. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína hipoalergênica fundida como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico como definida em reivindicação 11.
13. Vetor de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor de expressão.
14. Vetor de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor bacteriano, fungico, de inseto, viral ou mamífero.
15. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 11 ou um vetor como definido em qualquer um de acordo com as reivindicações de 12 a 14.
16. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é direcionado contra uma proteína hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.
17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.
18. Formulação de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um complexo hipoalergênico como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 ou um anticorpo como definido na reivindicação - 16 ou 17.
19. Formulação de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita formulação ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
20. Formulação de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que dita a formulação compreende 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita proteína hipoalergênica ou anticorpo.
21. Uso de uma proteína hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 ou um anticorpo como definido na reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de ser para fabricar um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral e/ou uma alergia em um ser humano ou animal.
22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
23. Uso de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é usado para a imunização ativa ou passiva.
24. Uso de acordo com as reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento compreende 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita proteína hipoalergênica ou anticorpo.
25. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado a um indivíduo na quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.
26. Uso de um complexo hipoalergênico como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 ou um anticorpo como definido na reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de ser para o diagnóstico de uma alergia e/ou uma infecção viral em um individual.
27. Uso de uma proteína de capsídeo viral de um vírus da família de picornaviridae, caracterizado pelo fato de ser como um carreador em medicamentos ou vacinas ou para o diagnóstico de uma infecção viral, em particular, resfriado comum.
28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vírus é da espécie de rinovírus humano, em rinovírus humano particular de 89 ou 14.
29. Molécula hipoalergênica derivada de Ph1 ρ 5, caracterizada pelo fato de que tem uma truncação de terminal C e/ou N e apresentando capacidade de ligação de IgE reduzida em comparação com o Ph1 ρ 5 do tipo selvagem.
30. Molécula de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a molécula truncada apresenta reatividade de célula T reduzida.
31. Molécula de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o dito Ph1 ρ 5 truncado é composto de aminoácidos 93 a 128, -98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 252 a 283 de Ph1 ρ 5 ou variações de seqüência destes.
32. Molécula de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o dito Ph1 ρ 5 truncado é composto de aminoácidos 132 a -162, 217 a 246, 176 a 212 de Ph1 ρ 5 ou variações de seqüência destes.
33. Molécula hipoalergênica derivada de Fel d 1, caracterizada pelo fato de ter uma truncação de terminal C e/ou N e que apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida.
34. Molécula de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a molécula truncada apresenta reatividade de célula T reduzida.
35. Molécula de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que o dito Fel d 1 truncado é composto de aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 de cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 de cadeia 2 de Fel d 1 ou sua variação de seqüência.
36. Molécula hipoalergênica derivada de Der ρ 2, caracterizada pelo fato de que tem uma truncação de terminal C e/ou terminal N e que apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida.
37. Molécula de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a molécula trancada apresenta reatividade de célula T reduzida.
38. Molécula de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o dito Der ρ 2 truncado é composto de aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103, 98 a 129 de Der ρ 2 ou variações de seqüência destes.
39. Molécula hipoalergênica derivada de Der ρ 7, Der ρ 21, Clone 30, Alt a 1, Parj 1, Ole e 1, Fel d 2, Can f 1, Can f 1, Art ν 1, Amb a 1, Alt a 2 ou Alt a 6, caracterizada pelo fato de ter uma truncação de terminal C e/ou terminal N e que apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida e opcionalmente apresenta reatividade de célula T reduzida, sendo preferivelmente composta de aminoácidos 1 a 30, 20 to 50, 50 a 80, 90 a 125, - 125 a 155 ou 165 a 198 de Der ρ 7, aminoácidos 1-35, 36-70, 71-110, 111- - 145, 140-170, 175-205, 210-250 ou 250-284 de Der ρ 10, aminoácidos 1 a 35, a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der ρ 21, aminoácidos 1 a 32, 15 to 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 to 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, - 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, - 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a - 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a - 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, - 70 a 100 ou 92 a 132 de Art ν 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, - 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a - 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a - 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou fragmentos ou variações de seqüência destes.
40. Proteína hipoalergênica de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos duas moléculas como definidas em qualquer uma das reivindicações de 29 a 39 que apresenta capacidade de ligação de IgE reduzida e opcionalmente apresenta reatividade de célula T reduzida.
41. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que as moléculas são fundidas umas às outras em uma ordem que difere da ordem dos fragmentos no alergeno do tipo selvagem se as pelo menos duas moléculas forem derivadas do mesmo alergeno.
42. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica quanto a uma molécula hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 39 ou uma proteína como definida na reivindicação 40 ou 41.
43. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 42.
44. Vetor de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor de expressão.
45. Vetor de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor bacteriano, fúngico, de inseto, viral ou de mamífero.
46. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 18 ou um vetor como definida em qualquer uma das reivindicações de 43 a 45.
47. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é direcionado contra uma molécula hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 39 ou uma proteína de fusão como definida na reivindicação 40 ou 41.
48. Anticorpo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal.
49. Formulação de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 39, uma proteína de fusão como definida na reivindicação 40 ou 41 ou um anticorpo como definido na reivindicação 46 ou -47.
50. Formulação de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que dita formulação ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
51. Formulação de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracterizado pelo fato de que dita formulação compreende 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula hipoalergênica ou anticorpo.
52. Uso de uma molécula hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 39, uma proteína de fusão como definida na reivindicação 40 ou 41, uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 42, um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações de 43 a 45 ou um anticorpo como definido na reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de ser para fabricar um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma alergia em um indivíduo.
53. Uso de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento ainda compreende pelo menos um adjuvante, excipiente e/ou conservante farmaceuticamente aceitáveis.
54. Uso de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento compreende 10 ng a 1 g, preferivelmente - 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 μg a 200 μg da dita molécula imunogênica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo.
55. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 52 a 54, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado a um indivíduo em uma quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.
56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 52 a 55, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo está em risco de pegar uma alergia.
57. Uso de uma molécula hipoalergênica como definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 39, uma proteína de fusão como definida na reivindicação 40 ou um anticorpo como definido na reivindicação - 47 ou 48, caracterizado pelo fato de ser para diagnosticar uma alergia ou monitorar o progresso de uma terapia contra alergia em um indivíduo.
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