PT2035457E - Transportador de vacina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Transportador de vacina" 0 presente invento refere-se a novas moléculas hipoalergénicas e suas utilizações.

Alergia do tipo I é uma doença de hipersensibilidade mediada por IgE que afeta quase 25% da população. É baseada no reconhecimento de alergénios inofensivos aerotransportadas, insetos, venenos, alergénios alimentares e alergénios de contato, antigénios derivados de fontes de antigénio per se inofensivos, tais como proteínas do pólen, insetos, bolores e animais, por imunoglobulina E específica. A ligação cruzada de anticorpos IgE ligados a células efetoras conduz a uma libertação de mediadores inflamatórios (por exemplo, histamina, leucotrienos) e assim aos sintomas imediatos de alergia (e.g., rinoconjuntivite, asma, dermatite, anafilaxia). A ativação de células T através de mecanismos dependentes de IgE e também independentes de IgE contribui para a inflamação alérgica crónica.

Provavelmente a única forma causal de tratamento da alergia é a imunoterapia específica de alergénio, que é baseada na administração repetida de quantidades crescentes de extratos de alergénios para a maioria das fontes. Numerosos estudos clínicos têm documentado a eficácia clínica de imunoterapia de injeção e existe evidência de vários mecanismos imunológicos subjacentes a este tratamento. Devido à dificuldade em preparar extratos de alergénio de alta qualidade para certas fontes de alergénios e o facto de a administração de alergénios a pacientes poder causar efeitos secundários graves, a imunoterapia específica de alergénio apenas pode ser recomendada para certos grupos de pacientes e manifestações de doença. É especialmente difícil tratar pacientes com cossensibilizações a várias fontes de alergénio diferentes e pacientes que sofrem de manifestações de doença graves, tais como a asma alérgica. A asma alérgica é uma das manifestações mais vigorosas de alergia, porque afeta gravemente a qualidade de vida diária, causa uma elevada taxa de admissões hospitalares e pode manifestar-se em formas graves, com risco de vida, requerendo cuidados intensivos do paciente.

Extratos de alergénios preparados a partir de fontes naturais de alergénios são de natureza não purificada, e é impossível influenciar a qualidade e as quantidades de alergénios individuais nestas preparações por meios técnicos. Contêm também numerosos componentes não-alérgicos indefinidos, e vários estudos recentes indicam a má qualidade destes extratos e documentam a sua grande heterogeneidade.

Na última década, foram feitos grandes progressos no campo da caracterização molecular de alergénios utilizando tecnologia de ADN recombinante. Um grande número dos alergénios causadores de doenças mais importantes tem sido caracterizado até ao nível molecular, e têm sido produzidos alergénios recombinantes que mimetizam a complexidade epitópica de extratos de alergénios naturais. Além disso, vários grupos de investigação têm usado o conhecimento sobre estruturas de alergénio para desenvolver novas vacinas definidas contra a alergia. A engenharia genética, a química de síntese de péptidos e a conjugação de alergénios com sequências de ADN imunoestimulantes têm sido utilizadas para reduzir a atividade alergénica das novas vacinas e assim a taxa de efeitos secundários induzidos pela terapia. Estudos clínicos iniciais promissores foram conduzidas com tais derivados de alergénios. Interessantemente, constatou-se que embora a reatividade de IgE de alergénios recombinantes geneticamente modificadas e de péptidos contendo epítopos de célula T sintéticos derivados do alergénio possa ser fortemente reduzida ou mesmo suprimida, estes derivados ainda podiam induzir efeitos secundários sistémicos que se manifestavam várias horas após a injeção. Por exemplo, foi reportado que péptidos de epítopo de célula T do alergénio principal de gato, Fel d 1, induziram asma e hiperreatividade brônquica várias horas após injeção intracutânea, e existe uma forte evidência de que este efeito é mediado por células T e restringido por MHC.

Estes resultados indicam que a supressão da reatividade de IgE diminui os efeitos secundários mediados por IgE uma vez que não foram registadas quaisquer reações imediatas no decurso destes estudos de imunoterapia. No entanto, os epítopos de célula T específicos de alergénio que foram preservados nos derivados de alergénio recombinantes, bem como nas misturas de péptidos, são responsáveis pelos efeitos secundários tardios (por exemplo, dermatite muito problemática ou atópica, manifestações alérgicas cutâneas crónicas mediadas por células T) . Os efeitos secundários causados no caso de derivados de alergénio recombinantes eram relativamente suaves e no caso das vacinas de péptido de célula T podem ser superados pela dosagem adequada. Ambas as duas novas abordagens parecem por isso ser muito promissoras para imunoterapia de rinoconjuntivite alérgica, mas podem ter limitações no que se refere ao tratamento de formas graves de asma alérgica, onde a indução de efeitos secundários tardios no pulmão pode ser bastante problemática.

De modo a administrar e consequentemente provocar uma resposta imunitária eficaz contra péptidos, polipéptidos e proteínas, utilizam-se regularmente adjuvantes e/ou transportadores. 0 adjuvante completo de Freund, por exemplo, é um dos adjuvantes mais potentes disponíveis. No entanto, devido aos seus efeitos secundários, a sua utilização não está aprovada para seres humanos. Por conseguinte, existe uma necessidade de composições de vacina capazes de induzir respostas imunitárias fortes contra péptidos e polipéptidos derivados de alergénios e claro de outros antigénios, evitando a utilização de adjuvante completo de Freund. Além disso, embora a BSA tenha sido utilizada com sucesso como transportador em modelos animais pode não ser apropriada para utilização em composições de vacina para humanos por causa do risco de reações adversas, tais como o risco de transmissão de doença do prião (variante da doença de Creutzfeldt-Jakob). Um desafio adicional ao desenvolvimento de uma vacina eficaz contra alergénios é a necessidade de uma resposta imunitária capaz de diminuir rapidamente os alergénios num indivíduo ou animal. Por conseguinte, são necessárias concentrações elevadas no sangue de anticorpos específicos de alergénio, que são principalmente do subtipo IgG. Em superfícies mucosas, os anticorpos IgA são o subtipo principal. A toxina da cólera, uma proteína transportadora conhecida na especialidade, é também utilizada regularmente como adjuvante, eliminando a necessidade de adjuvante completo de Freund numa composição de vacina. No entanto, a toxina da cólera aumenta os níveis de anticorpos IgE totais e específicos e conduz a reações inflamatórias associadas a IgE.

Devido aos efeitos secundários provocados pela maioria das proteínas transportadoras utilizadas para vacinação, existe uma necessidade de sistemas de transporte que sejam capazes de estimular respostas imunitárias contra alergénios ou outros antigénios, sem utilizar adjuvantes tóxicos, sem utilizar proteínas transportadoras mal toleradas e, em certas situações, sem estimulação de respostas imunitárias potencialmente patológicas. Novos sistemas de transportador que satisfazem estas especificações podem ser utilizados para a formação de novos conjugados e composições adequadas para o tratamento ou prevenção de doenças tais como doenças alérgicas.

Em Bohle B. et al. (J. Immunol. 172 (11) (2004): 6642-6648) descreve-se uma proteína de fusão recombinante que compreende uma porção de proteína de camada S e uma porção Bet v 1. Esta molécula compreende a proteína Bet v 1 hipoalergénica nativa. A WO 2004/004761 refere-se a partículas semelhantes a vírus que são fundidas a um imunogénio e que podem ser utilizadas para imunização.

Na WO 2004/003143 é revelada a utilização de proteínas de fusão compreendendo uma partícula semelhante a vírus e uma molécula hipoalergénica como imunogénio para vacinação. A WO 03/072601 A refere-se a um método para a produção de alergénios hipoalergénicos por aplicação de um esquema de purificação específico. O alergénio hipoalergénico de acordo com este documento pode ser Bet v 1 recombinante que pode compreender modificações adicionais (por exemplo, substituições de aminoácidos, deleções, etc.) e pode estar fundido com outras proteínas ou péptidos. A WO 02/40676 A refere-se a alergénios recombinantes compreendendo mutações múltiplas e exibindo uma afinidade reduzida de ligação a IgE. As propriedades hipoalergénicas de Bet v 1 podem ser conseguidas por introdução de mutações na sequência de Bet v 1. A Bet v 1 de tipo selvagem e a Bet v 1 mutante podem estar fundidas com uma molécula adicional de uma fonte não-alergénica que pode ser uma porção de proteína de ligação a maltose. A WO 2006/058359 A refere-se a um método para a produção de proteínas hipoalergénicas por divisão de uma proteína do tipo selvagem em duas partes e reunião dos fragmentos resultantes na orientação inversa. Para a purificação de proteína, a molécula hipoalergénica de acordo com este documento é fundida com um marcador His.

Breitweiser et al. , Protein Eng., 15 (3) (2002) : 243-249, descrevem uma proteína de fusão de superfície celular bacteriana recombinante (camada S)-alergénio principal de pólen de bétula.

Em Elfman et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 117 (3) (1998): 167-173, descrevem-se proteínas de fusão que compreendem uma porção GST fundida a fragmentos do alergénio Lep d 2 que exibem afinidade de ligação a IgE reduzida.

Bauer et al., J. Allergy and Clin. Immunol., 118 (2006) : 269-276, referem-se a geração de vacinas de ADN hipoalergénicas codificando o alergénio principal de pólen de bétula Bet v 1 ligado estavelmente a ubiquitina que é um marcador bem conhecido numa célula eucariótica e que dá o sinal para degradar o polipéptido marcado. A WO 2004/092210 A refere-se a proteínas de fusão do polipéptido Fve (compreendendo atividade imunomoduladora) e de um alergénio como parceiro de fusão. Este documento revela péptidos hipoalergénicos derivados do alergénio principal de pólen de gramínea Phi p 1, que são acoplados à proteína transportadora não alergénica KLH.

Na WO 02/12503 A são reveladas proteínas de fusão que compreendem entre outras moléculas hipoalergénicas. A WO 2006/008018 A revela proteínas de fusão com marcador de His que compreendem moléculas hipoalergénicas.

Em Gonzalez et al., Mol. Immunol, 43 (6) (2006) : 570-578, são reveladas proteínas de fusão de GST que consistem de uma porção GST e de péptidos derivados do alergénio Ole e 1.

Na WO 2005/085278 A são reveladas proteínas de fusão que compreendem alergénios hipoalergénicos fundidos com outro alergénio.

Na US 2006/088549 são reveladas composições imunogénicas compreendendo um rinovírus de humano quimérico, que consistem de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de capsídeo de rinovírus de humano fundida com uma sequência de ácido nucleico heterólogo codificando um antigénio.

Na WO 02/04007 é revelada a utilização de proteínas de capsídeo virai recombinantes como vacinas, agentes terapêuticos e de diagnóstico. A EP 0 358 485 refere-se a péptidos antigénicos derivados de proteínas de rinovírus de humano que podem ser utilizados em vacinação. É um objetivo do presente invento proporcionar medicamentos e transportadores que superam os inconvenientes anteriormente mencionados e permitem uma vacinação de alergénio com efeitos secundários reduzidos.

Por conseguinte, o presente invento refere-se a uma proteína hipoalergénica para utilização no tratamento ou prevenção de uma alergia num humano ou animal consistindo de pelo menos uma molécula hipoalergénica derivada de um alergénio, que está fundida com pelo menos uma segunda proteína não alergénica, onde a pelo menos uma molécula hipoalergénica derivada de um alergénio exibe uma capacidade de ligação de IgE pelo menos 50% reduzida e uma reatividade de célula T pelo menos 30% reduzida em comparação com o alergénio do tipo selvagem e onde a pelo menos uma segunda proteína é uma proteína virai.

De modo a provocar uma resposta imunitária melhorada contra uma molécula, em particular uma molécula hipoalergénica de acordo com o presente invento, a referida molécula é fundida (por engenharia genética) com um transportador. A segunda proteína (o "transportador" ou "proteína transportadora") a ser fundida com uma molécula hipoalergénica do invento não é derivada de um alergénio ("não alergénica"). No entanto, a proteína transportadora utilizada no presente invento pode exibir reatividade de célula T e/ou provocar uma resposta imunitária contra ela própria e contra a molécula hipoalergénica fundida ou conjugada com a mesma quando administrada a um organismo animal ou humano. Consequentemente, se a proteína transportadora é derivada de um patogénio (e.g. vírus, bactéria etc.), são produzidos anticorpos (protetores) dirigidos contra o referido transportador e patogénios.

Como aqui utilizado, "proteína hipoalergénica" significa uma proteína/polipéptido de fusão de um transportador de uma fonte não alergénica com uma molécula hipoalergénica. Adicionalmente, pretende-se também que uma "proteína hipoalergénica" seja um produto de conjugação (e.g. acoplamento químico, adsorção) de um transportador com uma molécula hipoalergénica. "Hipoalergénico" como aqui utilizado refere-se a moléculas com potencial alergénico reduzido. Estas moléculas têm capacidade diminuída para provocar reações alérgicas num indivíduo em comparação com a proteína do tipo selvagem a partir da qual estas moléculas são derivadas. A pelo menos uma molécula hipoalergénica derivada de um alergénio e fundida com uma segunda proteína está preferivelmente truncada terminalmente em C e/ou N. A "truncagem C e/ou N-terminal", como aqui utilizada, significa que resíduos aminoácido quer a partir do terminal N quer a partir do terminal C quer a partir de ambos os terminais N e C do alergénio do tipo selvagem são removidos por deleção de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30 resíduos aminoácido.

As moléculas hipoalergénicas, i.e. péptidos/polipéptidos, compreendem preferivelmente 10 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente 15 a 40 aminoácidos, em particular 20-30 aminoácidos e exibem reatividade de IgE reduzida. Estas moléculas são desenhadas para excluir epitopos de célula T que podem causar efeitos secundários mediados por célula T. Epitopos de célula T e moléculas exibindo resposta de célula T reduzida podem ser determinados e identificados por métodos conhecidos dos peritos na especialidade (e.g., Bercovici N. et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2000) 7:859-864) .

Constatou-se que é possível desenhar vacinas de péptido derivadas de alergénios tais como os alergénios principais de pólen de gramínea, e.g., Phi p 1, e o alergénio principal de pólen de bétula, Bet v 1, utilizando péptidos expostos na superfície. Os dados obtidos mostram que tais vacinas de péptido podem ser produzidas para qualquer alergénio cuja estrutura primária é conhecida de acordo com o mapeamento epitópico de IgE, dados de estrutura tridimensional ou previsão assistida por computador de domínios expostos à superfície. No entanto, a seleção de péptidos adequados que podem ser utilizados para vacinação permanece crucial, porque nem todos os péptidos identificados com estes métodos podem ser utilizados em vacinação. Os péptidos adequadamente utilizados para efeitos de vacinação exibem capacidade de ligação de IgE reduzida e - de modo a reduzir ou evitar efeitos secundários tardios - exibem reatividade de célula T reduzida. O termo "derivado de um alergénio", como aqui utilizado, significa que as moléculas hipoalergénicas de acordo com o presente invento são obtidas diretamente a partir de um alergénio por fragmentação ou truncagem. As sequências de aminoácidos das moléculas hipoalergénicas do presente invento são preferivelmente pelo menos 80% idênticas, mais preferivelmente pelo menos 90% idênticas, muito preferivelmente pelo menos 95% idênticas, em particular 100% idênticas, à extensão da sequência de aminoácidos do alergénio do tipo selvagem, a partir da qual a molécula hipoalergénica é derivada. No entanto, as moléculas que não são 100% idênticas aos fragmentos de alergénio do tipo selvagem deverão ser capazes de se ligarem com uma força de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, muito preferivelmente pelo menos 90%, a um anticorpo ou a anticorpos, preferivelmente a anticorpos IgG, que são dirigidos aos referidos fragmentos de alergénio do tipo selvagem. 0 grau de identidade de uma primeira sequência de aminoácidos em relação a uma segunda sequência de aminoácidos pode ser determinada por comparação direta entre ambas as sequências de aminoácidos utilizando certos algoritmos. Tais algoritmos, por exemplo, estão incorporados em vários programas de computador (e.g. "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-25; Corpet F., Nucl. Acids Res. (1988) 16:10881-10890).

As moléculas truncadas de acordo com o presente invento podem ser definidas como sendo partes do alergénio completo que induzem menos ativação de células T especificas de alergénio do que o alergénio do tipo selvagem completo (uma redução de pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, muito preferivelmente pelo menos 70%), exibem uma atividade alergénica reduzida mais do que 50% (preferivelmente mais do que 70%) conforme avaliada por ensaios de ligação de IgE e pela capacidade de induzir ativação celular mediada por IgE e quando acopladas a um transportador conforme descrito induzem anticorpos IgG que inibem a ligação de IgE policlonal a partir de pacientes alérgicos ao alergénio do tipo selvagem completo.

Os péptidos deverão conter sequências a partir dos alergénios para evitar sobreposições com os mimotopos. Os mimotopos, porém, que são mímicos de péptido pequeno (menos do que 15 aminoácidos) de pedaços de antigénio e são obtidos a partir de bibliotecas de péptidos aleatórios, não representam moléculas originais derivadas de alergénio como aqui definidas. Não podem ser utilizados de acordo com o invento porque são demasiado pequenos para induzir uma resposta de IgG bloqueante robusta.

As moléculas hipoalergénicas de acordo com o presente invento podem ser obtidas por métodos recombinantes ou por síntese química. Alternativamente, claro que também é possível obter as moléculas por clivagem enzimática ou química do alergénio do tipo selvagem ou de um polipéptido/proteína albergando a molécula de interesse. A molécula hipoalergénica pode compreender preferivelmente pelo menos duas moléculas de alergénio truncadas derivadas de pelo menos um alergénio, onde a ordem dos fragmentos de alergénio truncados difere da ordem dos fragmentos no alergénio do tipo selvagem se as pelo menos duas moléculas são derivadas do mesmo alergénio. A molécula hipoalergénica de acordo com o presente invento pode compreender uma ou mais (preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3) moléculas hipoalergénicas como aqui definidas, resultando assim numa proteína de fusão. As moléculas hipoalergénicas individuais da proteína de fusão, que obviamente também estão desprovidas de capacidade de ligação a IgE e desprovidas de epítopos de célula T, podem ser derivadas de alergénios da mesma origem e/ou de origens diferentes. Se as moléculas são derivadas do mesmo alergénio, a ordem na proteína de fusão hipoalergénica não deverá ser idêntica à ordem no alergénio do tipo selvagem (isto impede a reconstituição e formação de sítios de ligação de IgE) (ver, e.g.f WO 2004/065414, Linhart B. e Valenta R. (Int. Arch. Allergy Immunol. (2004) 134:324-31)).

De acordo com uma concretização preferida do presente invento a pelo menos uma molécula hipoalergénica é fundida ao terminal N e/ou ao terminal C da referida pelo menos uma segunda proteína ou seu fragmento. O alergénio ou seus fragmentos podem ser conjugados quimicamente, e.g., ou por métodos recombinantes, uns aos outros. Se o alergénio ou seu fragmento for conjugado quimicamente a um transportador, o referido alergénio ou fragmento deverá ser proporcionado com um resíduo cisteína terminal (resultando num grupo sulfidrilo livre) . Qualquer proteína transportadora ativada por maleimida pode ser conjugada com o referido resíduo cisteína terminal (N ou C-terminal), criando assim um complexo de imunogénio/transportador. Se o alergénio ou seu fragmento não possui um grupo sulfidrilo num terminal, pode-se utilizar química de EDC (cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida) de modo a acoplar aminas (lisina) ou ácidos carboxílicos (ácido glutâmico, aspártico ou 5'-fosfato) à proteína transportadora.

Se a molécula hipoalergénica for fundida com o terminal N ou C do transportador, utilizam-se métodos recombinantes. A pelo menos uma segunda proteína é uma proteína virai, em particular uma proteína de vírus de ARN ou ADN. A pelo menos uma segunda proteína ("transportador") pode ter qualquer das origens acima mencionadas. No entanto, é particularmente preferido utilizar proteínas que provocam uma resposta imunitária contra a própria proteína e a molécula hipoalergénica fundida ou conjugada com a mesma. Devido à indução da formação de anticorpos (protetores) dirigidos também à pelo menos uma segunda proteína, a proteína hipoalergénica de acordo com o presente invento pode também ser utilizada como vacina para a referida segunda proteína e a sua fonte de origem (e.g. vírus). A proteína virai de acordo com o presente invento é preferivelmente uma proteína de capsídeo.

As proteínas de capsídeo virai são especialmente adequadas porque induzem atividade antiviral, provocam a formação de anticorpos que bloqueiam a adesão de vírus, e.g. rinovírus, a células epiteliais, exibem uma atividade imunomoduladora em relação a uma resposta de Thl, aumentam a imunogenicidade do péptido (i.e., antipéptido mais elevado e assim níveis mais elevados de anticorpos IgG protetores), são adequadas e comprovadas para vacinação profilática (vacinação por vírus) e são seguras, quando se utilizam proteínas de capsídeo de vírus aos quais os humanos estão continuamente expostos (e.g. rinovírus).

De acordo com outra concretização preferida do presente invento a pelo menos uma proteína de capsídeo virai é derivada de um vírus patogénico de humano, preferivelmente um vírus da família dos picornaviridae. 0 vírus da família de picornaviridae é preferivelmente do género rinovírus, preferivelmente da espécie de rinovírus de humano, em particular rinovírus de humano 89 e 14. A proteína de capsídeo pode ser VP1, VP2, VP3 e/ou VP4. 0 alergénio a ser fundido com uma proteína de capsídeo virai é preferivelmente selecionado entre o grupo consistindo de alergénios principais de pólen de bétula, em particular Bet v 1 e Bet v 4, alergénios principais de pólen de timóteo, em particular Phi p 1, Phi p 2, Phi p 5, Phi p 6 e Phl p 7, alergénios principais de ácaros da poeira doméstica, em particular Der pie Der p 2, alergénio principal de gato Fel d 1, alergénios principais de abelha, alergénios principais de vespa, profilinas, especialmente Phl p 12, e alergénios de ácaros de armazenamento, especialmente Lep d 2.

Outros alergénios apropriados para serem utilizados de acordo com o presente invento podem ser obtidos a partir da tabela seguinte.

ALERGÉNIOS

Nome da espécie

Nome do ID Bioquímica ou nome PM ADNc (C) ou Referência, N.2 alergénio obsoleto proteína (P) Acesso

Ambrosia artemisiifolia tasneira pequena

Amb a 1 antigénio E 8 C 8, 20

Amb a 2 antigénio K 38 C 8, 21

Amb a 3 Ra3 11 C 22

Amb a5Ra5 5C 11,23

Amb a 6 Ra 6 10C 24,25

Amb a7Ra7 12P 26

Ambrosia trifida tasneira gigante

Amb t 5 Ra5G 4,4 C 9, 10, 27

Artemisia vulgaris artemísia

Art v 1 27-29C 28

Art v 2 35 P 28A

Art v 3 proteína de transferência 12 P 53 de lípido

Art v 4 profilina 14 C 29

Helíanthus annuus girassol

Hei a 1 34 29A

Hei a 2 profilina 15,7 C Y15210

Mercurialis annua

Mer a 1 profilina 14-15C Y13271

Caryophyllales Chenopodium album ansarina-branca, fedegosa

Che a 1 17 C AY049012, 29B pata-de-ganso branca

Che a 2 profilina 14 C AY082337

Che a 3 polcalcina 10 C AY082338

Salsola kali Cardo russo

Sal k 1 43 P 29C

Rosales

Humulus japonicus lúpulo japonês

Hum j 4w C AY33 518 7

Parietaria judaica

Par j 1 proteína de transferência 15 C ver lista de de lrpido 1 isoalergénios

Par j 2 proteína de transferência C ver lista de de lrpido 2 isoalergénios

Par j 3 profilina C ver lista de isoalergénios

Parietaria officinalis

Par ο 1 proteína de transferência 15 29D de lrpido B. Gramineas Poales

Cynodon dactylon Relva Bermuda

Cyn d 1 32 C 30, S83343

Cyn d 7 C 31, X91256

Cyn d 12 profilina 14 C 31a, Y08390

Cyn d 15 9 C AF517685

Cyn d 22w enolase dados pendentes

Cyn d 23 Cyn d 14 9 C AF517685

Cyn d 24 p. relacionado com 21 P pendente patogénese

Dactylis glomerata dact ila

Dac g 1 AgDgl 32 P 32

Dac g 2 11 C 33, S45354

Dac g 3 C 33A, U25343

Dac g 5 31 P 34

Festuca pratensis festuca do prado

Fes p 4w 60 -

Holcus lanatus relva veludo

Hoi 11 C Z27084

Lolium perenne azevém

Lol p 1 grupo I 27 C 35, 36

Lol p 2 grupo II 11 P 37, 37A, X73363

Lol p 3 grupo III 11 P 38

Lol p 5 Lol p IX, Lol p lb 31/35C 34, 39

Lol p 11 inibidor de tripsina hom. 16 39A

Phalaris aquatica erva amarela

Pha a 1 C 40, S80654

Phleum pratense timóteo

Phi pi 27 C X78813

Phi p 2 C X75925, 41

Phi p 4 P 41A

Phi p 5 Ag25 32 C 42

Phi p 6 C Z27082, 43

Phi p 11 inibidor de tripsina hom. 20 C AF521563, 43A

Phi p 12 profilina C X77583, 44

Phi p 13 poligalacturonase 55-60C AJ238848

Poa pratensis

Erva azul do Kentucky

Poa p 1 grupo I 33 P 46

Poa p 5 31/34 C 34, 47

Sorghum halepense relva Johnson

Sor hl C 48 C. Árvores Arecales

Phoenix dactylifera tamareira

Pho d 2 profilina 14,3 C Asturias p.c.

Fagales

Alnus glutinosa amieiro

Betula verrucosa bétula

Ain g 1 17 C S50892

Bet v 1 17 C ver lista de isoalergénios

Bet v 2 profilina 15 C M65179

Bet v 3 C X79267

Bet v 4 8 C X87153, S54819

Bet v 5 h: isoflavona-redutase 33,5 C ver lista de isoalergénios

Bet v 7 ciclofilina 18 P P81531

Carpinus betulus choupo-branco

Car b 1 17 C ver lista de isoalergénios

Castanea sativa castanheiro

Cas sl 22 p 52

Cas s 5 quitinase

Cas s 8 proteína de transferência 9, 7 P 53 de lípido

Corylus avellana aveleira

Cor al 17 C ver lista de isoalergénios

Cor a 2 profilina 14 C

Cor a 8 proteína de transferência 9 C de lípido

Cor a 9 proteína tipo globulina 40/? C Beyer p.c.

11S

Cor a 10 prot. de ligação a luminal 70 C AJ295617

Cor a 11 prot. tipo vicilina 7S 48 C AF441864

Quercus alba carvalho-branco

Que a 1 17 P 54

Lamiales

Oleaceae

Fraxinus excelsior freixo

Fra e 1 20 P 58A, AF526295

Ligustrum vulgare alfeneiro

Lig v 1 20 P 58A 01ea europea oliveira

Ole e 1 16 C 59, 60

Ole e 2 profilina 15-18C 60A

Ole e 3 9,2 60B

Ole e 4 32 P P80741

Ole e 5 superóxido-dismutase 16 P P80740

Ole e 6 10 C 60C, U86342

Ole e 7 ? P 60D, P81430

Ole e 8 proteína de ligação a Ca2+ 21 C 60E, AF078679

Ole e 9 beta-1,3-glucanase 46 C AF249675

Ole e 10 glicosil-hidrolase hom. 11 C 60F, AY082335

Syringa vulgaris lilás

Syr v 1 20 P 58A

Plantaginaceae

Plantago lanceolata língua-de-ovelha

Pla 11 18 P P842242

Pinales

Cryptomeria japonica criptoméria japónica

Cry j 1 41-45 C 55, 56

Cry j 2 C 57, D29772

Cupressus arisonica cipreste

Cup a 1 43 C A1243570

Cupressus sempervirens cipreste comum

Cup si 43 C ver lista de isoalergénios

Cup s 3w 34 C ref. pendente

Juniperus ashei zimbro

Jun a 1 43 P P81294

Jun a 2 C 57A, AJ404653

Jun a 3 30 P 57B, P81295

Juniperus oxycedrus cedro-de-espanha

Jun o 4 hom: calmodulina 29 C 57C, AF031471

Juniperus sabinoides cedro da montanha

Jun si 50 P 58

Juniperus virginiana cedro-vermelho

Jun v 1 43 P P81825, 58B

Platanaceae Platanus acerifolia plátano

Pia a 1 18 P P82817

Pia a 2 43 P P82967

Pia a 3 proteína de transferência 10 P íris p.c. de lípido D. Ácaros

Acarus síro artrópode ácaro

Aca s 13 prot. de ligação de ácido 14* C AJ006774 gordo

Blomia tropicalis ácaro

Blo t 1 cisteína-protease 39 C AF277840

Blo t 3 tripsina 24* C Cheong p.c.

Blo t 4 alfa-amilase 56 C Cheong p.c.

Blo t 5 C U59102

Blo t 6 quimiotripsina 25 C Cheong p.c.

Blo t 10 tropomiosina 33 C 61

Blo t 11 paramiosina 110 C AF525465, 61A

Blo t 12 Btlla C U27479

Blo t 13 Bt6, prot. de ligação de C U58106 ácido gordo

Blo t 19 pep. hom. antimicrobiano 7,2 C Cheong p.c.

Dermatophagoides farínae ácaro de poeira doméstica americano

Der f 1 cisteína-protease 25 C 69

Der f 2 14 C 70, 70A, ver lista de isoalergénios

Der f 3 tripsina 30 C 63

Der f 7 24-31C SW:Q26456, 71

Der f 10 tropomiosina C 72

Der f 11 paramiosina 98 C 72A

Der f 14 mag3, apolipoforina C D17686

Der f 15 98k quitinase 98 C AF178772

Der f 16 gelsolina/vilina 53 C 71A

Der f 17 proteína EF de ligação a 53 C 71A

Ca

Der f 18w quitinase 60k 60 C Weber p.c.

Dermatophagoides microceras ácaro de poeira doméstica

Der m 1 cisteína-protease 25 P 68

Dermatophagoides pteronyssinus ácaro de poeira doméstica europeu

Der p 1 antigénio Pl, cisteína- 25 C 62, ver lista de protease isoalergénios

Der p 2 14 C 62A-C, ver lista de isoalergénios

Der p 3 tripsina 2&/30C 63

Der p 4 amilase 60 P 64

Der p 5 14 C 65

Der p 6 quimiotripsina 25 P 66

Der p 7 22/28 C 67

Der p 8 glutationa-transferase C 67A

Der p 9 pro. serina colagenolítica P 67B

Der p 10 tropomiosina 36 C Y14906

Der p 14 prot. tipo apolipoforina C Epton p.c.

Euroglyphus maynei ácaro

Eur m2 C ver lista de isoalergénios

Eur m 14 apolipoforina 177 C AF149827

Glycyphagus domesticus ácaro de armazenamento

Gly d 2 C 72B, ver lista de isoalergénios

Lepidoglyphus destructor ácaro de armazenamento

Lep d 2 Lep dl 15 C 73, 74, 74A, ver lista de isoalergénios

Lep d 5 C 75, AJ250278

Lep d 7 C 75, AJ271058

Lep d 10 tropomiosina C 75A, AJ250096

Lep d 13 C 75, AJ250279

Tyrophagus putrescentíae ácaro de armazenamento

Tyr p 2 C 75B, Y12690 E. Animais

Bos domesticus bovino domésticos

Bos d 2 Ag3, lipocalina 20 C 76, ver lista de isoalergénios (ver também alimentos)

Bos d 3 horn. S100 ligação a Ca 11 C L39834

Bos d 4 alfa-lactalbumina 14,2 C M18780

Bos d 5 beta-lactoglobulina 18,3 C X14712

Bos d 6 albumina de soro 67 C M73993

Bos d 7 imunoglobulina 160 77

Bos d 8 caseínas 20-30 77

Canis familiar is {Canis domesticus) cão

Can f 1 25 C 78, 79

Can f 2 27 C 78, 79

Can f 3 albumina C S72946

Can f 4 18 P A59491

Equus caballus cavalo

Equ c 1 lipocalina 25 C U70823

Equ c 2 lipocalina 18,5 P 79A, 79B

Equ c 3 Ag3 - albumina 67 C 79C, X74045

Equ C 4 17 P 79D

Equ c 5 AgX 17 P Goubran Botros p.c.

Felis domesticus gato (saliva)

Fel d 1 cat-1 38 C 15

Fel d 2 albumina C 79E, X84842

Fel d 3 cistatina 11 C 79F, AF238996

Fel d 4 lipocalina 22 C AY497902

Fel d 5w imunoglobulina A 400 Adedoyin p.c.

Fel d 6w imunoglobulina M 800- Adedoyin p.c 1000

Fel d 7w imunoglobulina G 150

Cavia porcellus porquinho-da-índia

Cav p 1 homólogo de lipocalina 20 P SW:P83507, 80

Cav p 2 17 P SW:P83508

Mus musculus ratinho (urina)

Mus m 1 MUP 19 C 81, 81A

Rattus norvegius rato (urina)

Rat η 1 17 C 82, 83 F. Fungos (bolores) 1. Ascomycota 1.1 Dothideales Alternaria alternata

Alt a 1 28 C U82633

Alt a 2 25 C 83A, U62442

Alt a 3 prot. de choque térmico 70 C U87807, U87808

Alt a 4 prot. dissulfureto- 57 C X84217 isomerase

Alt a 6 prot. ribossómica ácida P2 11 C X78222, U87806

Alt a 7 proteína YCP4 22 C X78225

Alt a 10 aldeido-desidrogenase 53 C X78227, P42041

Alt a 11 enolase 45 C U82437

Alt a 12 prot. ribossómica ácida Pill C X84216

Cladosporium herbarum

Cla hi 13 838, 83C

Cla h 2 23 83B, 83C

Cla h 3 aldeido-desidrogenase 53 C X78228

Cla h 4 prot. ribossómica ácida P2 11 C X78223

Cla h 5 proteína YCP4 22 C X78224

Cla h 6 enolase 46 C X78226

Cla h 12 prot. ribossómica ácida Pill C X85180 1.2 Eurotiales Aspergillus flavus

Asp fl 13 serina-protease alcalina 34 84

Aspergillus fumigatus

Asp f 1 18 C M83781, S39330

Asp f 2 37 C U56938

Asp f 3 proteína peroxissómica 19 C U20722

Asp f 4 30 C AJ001732

Asp f 5 metaloprotease 40 C Z30424

Asp f 6 Mn superóxido-dismutase 26,5 C U53561

Asp f 7 12 C AJ223315

Asp f 8 proteína ribossómica P2 11 C AJ224333

Asp f 9 34 C AJ223327

Asp f 10 aspártico-protease 34 C X85092

Asp f 11 peptidil-prolil-isomerase 24 84A

Asp f 12 prot. de choque térmico 90 C 85 P 90

Asp f 13 serina-protease alcalina 34 84B

Asp f 15 16 C AJ002026

Asp f 16 43 C g3643813

Asp f 17 C AJ224865

Asp f 18 serina-protease vacuolar 34 84C

Asp f 22w enolase 46 C AF284645

Aspergillus niger

Asp f 23 proteína ribossómica L3 44 C 85A, AF464911

Asp η 14 beta-xilosidase 105 C AF108944

Asp n 18 serina-protease vacuolar 34 C 84B

Asp n 25 3-ftase B 66- C 85B, P34754 100

Asp n ? 85 C Z84377

Aspergillus oryzae

Asp o 13 serina-protease alcalina 34 C X17561

Asp o 21 TAKA-amilase A 53 C D00434, M33218

Penicillium brevicompactum

Pen b 13 serina-protease alcalina 33 86A

Penicillium chrysogenum (anteriormente P. notatum)

Pen ch 13 serina-protease alcalina 34 87

Pen ch 18 serina-protease vacuolar 32 87

Pen ch 20 N-acetil-glucosaminidase 68 87A

Penicillium citrinum

Pen c 3 prot. mem. peroxissómica 18 86B

Pen c 13 serina-protease alcalina 33 86A

Pen c 19 prot. de choque térmico 70 C U64207 P70

Pen c 22w enolase 46 C AF254643

Pen c 24 fator de elongação 1 beta C AY363911

Penicillium oxalicum

Pen o 18 serina-protease vacuolar 34 87B 1.3 Hypocreales Fusarium culmorum

Fus c 1 proteína ribossómica P2 11* C AY077706

Fus c 2 prot. tipo tio-redoxina 13* C AY077707 1.4 Onygenales Trichophyton rubrum

Tri r 2 C 88

Tri r 4 serina-protease C 88

Trichophyton tonsurans

Tri t 1 30 P 88A

Tri t 4 serina-protease 83 C 88 1.5 Saccharomycetales Candida albicans

Cand a 1 40 C 89

Cand a 3 proteína peroxissómica 29 C AY136739

Candida boidinii 2. Basidiomycotina

Cand b 2 20 C J04984, J04985 2.1 Hymenomycetes Psilocybe cubensis

Psi c 1

Psi c 2 ciclofilina 16 89A

Coprinus comatus setas

Cop c 1 proteína de fecho de 11 C AJ132235 leucina

Cop c 2 AJ2427 91

Cop c 3 AJ2427 92

Cop c 5 AJ242793

Cop c 7 AJ2427 94 2.2 Urediniomycetes Rhodotorula mucilaginosa

Rho m 1 enolase 47 C 89B

Rho m 2 serina-protease vacuolar 31 C AY547285 2.3 Ustilaginomycetes Malassezia furfur

Mala f 2 MF1, proteína de membrana 21 C AB011804, 90 peroxissómica

Mala f 3 MF2, proteína de membrana 20 C AB011805, 90 peroxissómica

Mala f 4 malato-desidrogenase 35 C AF084828, 90A mitocôndrica

Malassezia sympodialis

Mala si C X96486, 91

Mala s 5 18* C AJ011955

Mala s 6 17* C AJ011956

Mala s 7 C AJ011957, 91A

Mala s 8 19* C AJ011958, 91A

Mala s 9 37* C AJ011959, 91A

Mala s 10 prot. de choque térmico 7086 C AJ428052

Mala s 11 Mn superóxido-dismutase 23 C AJ548421 3. Deuteromycotina 3.1 Tuberculariales

Epicoccum purpurascens (anteriormente E. nigrum)

Epi p 1 serina-protease 30 P SW:P83340, 91B G. Insetos

Aedes aegyptii mosquito

Aed a 1 apirase 68 C L12389

Aed a 2 37 C M33157

Apis mellifera abelha

Api m 1 fosfolipase A2 16 C 92

Api m 2 hialuronidase 44 C 93

Api m 4 melitina 3 C 94

Api m 6 7-8 P Kettner p.c.

Api m 7 CUB serina-protease 39 C AY127579

Bombus pennsylvanicus abelhão (bumblebee)

Bom p 1 fosfolipase 16 P 95

Bom p 4 protease P 95

Blattella germanlca barata-germânica

Bla g 1 Bd90k C

Bla g 2 aspártico-protease 36 C 96

Bla g 4 calicina 21 C 97

Bla g 5 glutationa-transferase 22 C 98

Bla g 6 troponina C 27 C 98

Períplaneta americana barata-americana

Per a 1 Cr-PII C

Per a 3 Cr-PI 72-78C 98A

Per a 7 tropomiosina 37 C Y14854

Chironomus kiiensis mosquito

Chi k 10 tropomiosina 32, 5*C AJ012184

Chironomus thummi mosquito thummi

Chi t 1-9 hemoglobina 16 C 99

Chi t 1.01 componente III 16 C P02229

Chi t 1.02 componente IV 16 C P02230

Chi t componente I 16 C P02221 2.0101

Chi t componente IA 16 C P02221 2.0102

Chi t 3 componente II-beta 16 C P02222

Chi t 4 componente IIIA 16 C P02231

Chi t 5 componente VI 16 C P02224

Chi t 6.01 componente VIIA 16 C P02226

Chi t 6.02 componente IX 16 C P02223

Chi t 7 componente VIIB 16 C P02225

Chi t 8 componente VIII 16 C P02227

Chi t 9 componente X 16 C P02228

Ctenocephalides fells felis pulga de gato

Cte f 1

Cte f 2 Mlb 27 C AF231352

Cte f 3 25 C

Thaumetopoea pityocampa traça processionária do pinheiro

Tha pi 15 P PIR:A59396, 99A

Leplsma saccharlna peixinho-de-prata

Lep s 1 tropomiosina 36 C AJ309202

Dolichovespula maculata vespão white-face

Dol m 1 fosfolipase A1 35 C 100

Dol m 2 hialuronidase 44 C 101

Dol m 5 antigénio 5 23 C 102, 103

Dolichovespula arenaria vespão amarelo

Dol a 5 antigénio 5 23 C 104

Polistes annularies vespa

Pol a 1 fosfolipase A1 35 P 105

Pol a 2 hialuronidase 44 P 105

Pol a 5 antigénio 5 23 C 104

Polistes dominulus vespa do papel europeia

Pol d 1 Hoffman p.c.

Pol d 4 serina-protease 32-34C Hoffman p.c.

Pol d 5 P81656

Polistes exclamans vespa

Pol e 1 fosfolipase A1 34 P 107

Pol e 5 antigénio 5 23 C 104

Polistes fuscatus vespa

Pol f 5 antigénio 5 23 C 106

Polistes gallicus vespa

Pol g 5 antigénio 5 24 C P83377

Polistes metricus vespa

Vespa crabo vespão europeu

Pol m 5 antigénio 5 23 C 106

Vesp c 1 fosfolipase 34 P 107

Vesp c 5 antigénio 5 23 C 106

Vespa mandarins vespão gigante asiático

Vesp m 1 Hoffman p.c.

Vesp m 5 P81657

Vespula flavopilosa yellowjacket

Ves f 5 antigénio 5 23 C 106

Vespula germanica yellowjacket

Ves g 5 antigénio 5 23 C 106

Vespula maculifrons yellowjacket

Ves m 1 fosfolipase A1 33,5 C 108

Ves m 2 hialuronidase 44 P 109

Ves m 5 antigénio 5 23 C 104

Vespula pennsylvanica yellowjacket

Ves p 5 antigénio 5 23 C 106

Vespula squamosa yellowjacket

Ves s 5 antigénio 5 23 C 106

Vespula vidua vespa

Ves vi 5 antigénio 5 23 C 106

Vespula vulgaris vespa vulgar

Ves v 1 fosfolipase A1 35 C 105A

Ves v 2 hialuronidase 44 P 105A

Ves v 5 antigénio 5 23 C 104

Myrmecia pilosula formiga saltadora australiana

Myr pi C X70256

Myr p 2 C S81785

Solenopsis geminata formiga-de-fogo tropical

Sol g 2 Hoffman p.c.

Sol g 4 Hoffman p.c.

Solenopsis invicta formiga-de-fogo

Sol i 2 13 C 110, 111

Sol i 3 24 C 110

Sol i 4 13 C 110

Solenopsis saevissima formiga-de-fogo brasileira

Sol s 2 Hoffman p.c.

Triatoma protracta percevejo sugador da Califórnia

Tria p 1 procalina 20 C AF179004, 111A. H. Alimentos

Gadus callarias bacalhau

Gad c 1 alergénio M 12 C 112, 113

Salmo salar Salmão do Atlântico

Sal s 1 parvalbumina 12 C X97824

Bos domesticus bovino doméstico

Bos d 4 alfa-lactalbumina 14,2 C M18780 (leite) Bos d 5 beta-lactoglobulina 18,3 C X14712 ver também animais

Bos d 6 albumina de soro 67 C M73993

Bos d 7 imunoglobulina 160 77

Bos d 8 casernas 20-30 77

Cyprinus carpio (Carpa comum)

Cyp c 1 parvalbumina 12 C 129

Gallus domesticus galináceos

Gal d 1 ovomucóide 28 C 114, 115

Gal d 2 ovalbumina 44 C 114, 115

Gal d 3 Ag22, conalbumina 78 C 114, 115

Gal d 4 lisozima 14 C 114,115

Gal d 5 albumina de soro 69 C X60688

Metapenaeus ensis camarão

Met e 1 tropomiosina C U08008

Penaeus aztecus camarão

Pen a 1 tropomiosina 36 P 116

Penaeus indicus camarão

Pen i 1 tropomiosina 34 C 116A

Penaeus monodon camarão-t igre

Pen m 1 tropomiosina 38 C

Pen m 2 arginina-quinase 40 C AF479772, 117

Todarodes pad ficus lula

Tod p 1 tropomiosina 38 P 117A

Helix aspersa caracoleta

Hel as 1 tropomiosina 36 C Y14855, 117B

Haliotis midae haliote

Hal ml 49 117C

Rana esculents rã comestível

Ran e 1 parvalbumina alfa 11, 9*C AJ315959

Ran e 2 parvalbumina beta 11, 7*C AJ414730

Brassica juncea mostarda oriental

Bra j 1 albumina 2S 14 C 118

Brassica napus colza

Bra η 1 albumina 2S 15 P 118A, P80208

Brassica rapa nabo-ordinário

Bra r 2 horn: pro-heveina 25 P81729

Hordeum vulgare cevada

Hor v 15 BMAI-1 15 C 119

Hor v 16 alfa-amilase

Hor v 17 beta-amilase

Hor v 21 hordeina gama-3 34 C 119A, SW:P80198

Secale cereale centeio

Sec c 20 secalina ver lista de isoalergénios

Triticum aestivum trigo

Tri a 18 aglutinina

Tri a 19 gliadina omega-5 65 P PTR:A59156

Zea mays milho

Zea m 14 prot. de transferência de 9 P P19656 lipido

Oryza sativa arroz

Apium graveolens aipo

Ory si C 119B, U31771

Api g 1 hom: Bet v 1 16* C Z48967

Api g 4 profilina AF129423

Api g 5 55/58P P81943

Daucus carota cenoura

Dau c 1 hom: Bet v 1 16 C 117D, ver lista de isoalergénios

Dau c 4 profilina C AF456482

Corylus avellana avelã

Cor a 1.04 hom: Bet v 1 17 C ver lista de isoalergénios

Cor a 2 profilina 14 C AF327622

Cor a 8 proteína de transferência 9 C AF329829 de lípido

Malus domestica maçã

Mal d 1 hom: Bet v 1 C ver lista de isoalergénios

Mal d 2 hom: taumatina C AJ243427

Mal d 3 proteína de transferência 9 C Pastorello p.c. de lípido

Mal d 4 profilina 14,4*C ver lista de isoalergénios

Pyrus communis pera

Pyr c 1 hom: Bet v 1 18 C AF05730

Pyr c 4 profilina 14 C AF129424

Pyr c 5 hom: isoflavona-redutase 33,5 C AF071477

Persea americana abacate

Pers a 1 endoquitinase 32 C Z78202

Prunus armeniaca damasco

Pru ar 1 hom: Bet v 1 C U93165

Pru ar 3 proteína de transferência 9 P de lípido

Prunus avium cereja doce

Pru av 1 hom: Bet v 1 C U66076

Pru av 2 hom: taumatina C U32440

Pru av 3 proteína de transferência 10 C AF221501 de lípido

Prunus domestica

Pru av 4 profilina 15 C AF129425 ameixa europeia

Pru d 3 proteína de transferência 9 P 119C de lípido

Prunus pérsica pêssego

Pru p 3 proteína de transferência 10 P P81402 de lípido

Pru p 4 profilina 14 C ver lista de isoalergénios

Asparagus officinalis Espargos

Aspa o 1 proteína de transferência 9 P 119D de lípido

Crocus sativus açafrão

Cro s 1 21 Varasteh A-R p.c.

Lactuca sativa alface

Lac s 1 proteína de transferência 9 Vieths p.c. de lípido

Vitis vinifera uva

Vit v 1 proteína de transferência 9 P P80274 de lípido

Musa x paradisíaca banana

Mus xp 1 profilina 15 C AF377948

Ananas comosus ananás

Ana c 1 profilina 15 C AF377949

Ana c 2 bromelaína 22, 8*C 119E-G, D14059

Citrus limon limão

Cit 1 3 proteína de transferência 9 P Torrejon p.c. de lípido

Citrus sinensis laranja

Cit s 1 proteína tipo germina 23 P Torrejon p.c.

Cit s 2 profilina 14 P Torrejon p.c.

Cit s 3 proteína de transferência 9 P Torrejon p.c. de lípido

Litchi chinensis lichia

Sinapis alba mostarda amarela

Lit c 1 profilina 15 C AY049013

Sin a 1 albumina 2S 14 C 120

Glycine max so ja

Gly m 1 HPS 7 P 120A

Gly m2 8 P A57106

Gly m 3 profilina 14 C ver lista de isoalergénios

Gly m 4 prot. PR-10 (SAM22) 17 C X60043, 120B

Vigna radiata feijão-mungo

Vig r 1 proteína PR-10 15 C AY792956

Arachis hypogaea amendoim

Ara h 1 vicilina 63,5 C L34402

Ara h 2 conglutina 17 C L77197

Ara h 3 glicinina 60 C AF093541

Ara h 4 glicinina 37 C AF086821

Ara h 5 profilina 15 C AF059616

Ara h 6 horn: conglutina 15 C AF092846

Ara h 7 horn: conglutina 15 C AF091737

Ara h 8 proteína PR-10 17 C AY328088

Lens culinaris lentilha

Len c 1 vicilina 47 C ver lista de isoalergénios

Len c 2 prot. de semente 66 P 120C biotinilada

Pisum savitum ervilha

Pis s 1 vicilina 44 C ver lista de isoalergénios

Pis s 2 convicilina 63 C pendente

Actinidia chinensis kiwi

Act c 1 cistelna-protease 30 P P00785

Act c 2 proteína tipo taumatina 24 P SW:P81370, 121

Capsicum annuum pimento

Cap a lw proteína tipo osmotina 23 C AJ297410

Cap a 2 profilina 14 C AJ417552

Lycopersicon esculentum tomate

Lyc e 1 profilina 14 C AJ417553

Lye e 2 b-frutofuranosidase 50 C ver lista de isoalergénios

Lyc e 3 prot. de transferência de 6 C U81996 lrpido

Solanum tuberosum batata

Sola t 1 patatina 43 P P15476

Sola t 2 inibidor de catepsina D 21 P P16348

Sola t 3 inibidor de cisterna- 21 P P20347 protease

Sola t 4 inibidor de aspártico- 16+4 P P30941 protease

Bertholletia excelsa castanha-do-brasil

Ber e 1 albumina 2S 9 C P04403, M17146

Ber e 2 proteína de armazenamento 29 C AY221641

de sementes globulina 11S

Juglans nigra noz preta

Jug η 1 albumina 2S 19* C AY102930

Jug n 2 prot. tipo vicilina 56* C AY102931

Juglans regia noz comum

Jug r 1 albumina 2S C U66866

Jug r 2 vicilina 44 C AF066055

Jug r 3 proteína de transferência 9 P Pastorello de lrpido

Anacardium occidentale ca ju

Ana ο 1 proteína tipo vicilina 50 C ver lista de isoalergénios

Ana o 2 proteína tipo legumina 55 C AF453947

Ana o 3 albumina 2S 14 C AY081853

Ricinus communis semente de rícino

Ric c 1 albumina 2S C P01089

Sesamum indicum sésamo

Ses i 1 albumina 2S 9 C 121A, AF240005

Ses i 2 albumina 2S 7 C AF091841

Ses i 3 globulina tipo vicilina 7S45 C AF240006

Ses i 4 oleosina 17 C AAG23840

Cucumis melo melão

Ses i 5 oleosina 15 C AAD42942

Cue m 1 serina-protease 66 C D32206

Cue m 2 profilina 14 C AY271295

Cue m 3 patogénese-rel p. PR-1 16* P P83834 I. Outros

Anisakis simplex nemátodo

Ani si 24 P 121B, A59069

Ani s 2 paramiosina 97 C AF173004

Ani s 3 tropomiosina 41 C 121C, Y19221

Ani s 4 9 P P83885

Argas reflexus piolho do pombo

Arg r 1 17 C AJ697694

Ascaris suum verme

Asc si 10 P 122

Carica papaya papaia

Car p 3w paparna 23,4*C 122A, M15203

Dendronephthya nipponica coral mole

Den η 1 53 P 122B

Hevea brasiliensis borracha (látex)

Hev b 1 fator de elongação 58 P 123, 124

Hev b 2 1,3-glucanase 34/36C 125

Hev b 3 24 P 126, 127

Hev b 4 componente de micro- 100- P 128 hélice, complexo 115

Hev b 5 16 C U42640

Hev b 6.01 precursor de heverna 20 C M36986, p02877

Hev b 6.02 heverna 5 C M36986, p02877

Hev b 6.03 fragmento C-terminal 14 C M36986, p02877

Hev b 7.01 horn: patatina de soro B 42 C U80598

Hev b 7.02 horn: patatina de soro C 44 C AJ223038

Hev b 8 profilina 14 C ver lista de isoalergénios

Hev b 9 enolase 51 C AJ132580

Hev b 10 Mn superóxido-dismutase 26 C ver lista de isoalergénios

Hev b 11 quitinase classe 1 C ver lista de isoalergénios

Hev b 12 proteína de transferência 9,3 C AY057860 de lrpido

Hev b 13 esterase 42 P P83269

Homo sapiens autoalergénios de humano

Horn s 1 73* C Y14314

Horn s 2 10, 3* C X80909

Horn s 3 20, 1* C X8 9985

Horn s 4 36* C Y17711

Horn s5 42,6*C P02538

Triplochiton scleroxylon obeche

Trip s 1 quitinase classe 1 38,5 P Kespohl p.c.

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No entanto, na proteína hipoalergénica de acordo com o presente invento, podem-se também utilizar fragmentos de alergénio compreendendo pelo menos um epítopo de célula T. "Exibindo capacidade de ligação de IgE reduzida", como aqui utilizado, significa que as moléculas de acordo com o presente invento apresentam capacidade ou atividade de ligação de IgE significativamente reduzida (pelo menos 50% menos, preferivelmente pelo menos 70% menos, mais preferivelmente pelo menos 80% menos, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% menos, muito preferivelmente pelo menos 95% menos, atividade de ligação em comparação com o alergénio do tipo selvagem) ou mesmo ausência total das mesmas. A atividade/capacidade de ligação de IgE de moléculas do tipo péptidos e proteínas pode ser determinada, por exemplo, por um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) utilizando, por exemplo, soro obtido a partir de um sujeito (i.e., um sujeito alérgico) que esteve anteriormente exposto ao alergénio do tipo selvagem. Resumidamente, um péptido a ser testado é revestido sobre poços de uma placa de microtitulação. Após lavagem e bloqueio dos poços, uma solução de anticorpo consistindo do plasma de um sujeito alérgico, que esteve exposto ao péptido a ser testado ou à proteína a partir da qual este é derivado, é incubada nos poços. Adiciona-se aos poços um anticorpo secundário marcado e incubam-se. A quantidade de ligação de IgE é depois quantificada e comparada com a quantidade de IgE ligada por um alergénio do tipo selvagem purificado.

Alternativamente, a atividade de ligação de um péptido pode ser determinada por análise Western blot. Por exemplo, um péptido a ser testado é ensaiado num gel de poliacrilamida utilizando SDS-PAGE. 0 péptido é depois transferido para nitrocelulose e subsequentemente incubado com soro de um sujeito alérgico. Após incubação com o anticorpo secundário marcado, determina-se e quantifica-se a quantidade de IgE ligada.

Outro ensaio que pode ser utilizado para determinar a atividade de ligação de IgE de um péptido é um ensaio ELISA de competição. Resumidamente, uma fração agrupada de anticorpos IgE é gerada combinando plasma de sujeitos alérgicos que por ELISA direto mostraram ter reação de IgE com alergénio do tipo selvagem. Esta fração agrupada é utilizada em ensaios de ELISA de competição para comparar a ligação de IgE ao alergénio do tipo selvagem com o péptido testado. Determina-se e quantifica-se a ligação de IgE ao alergénio do tipo selvagem e ao péptido testado.

Um "epítopo de célula T" significa uma proteína (e.g., alergénio) ou seu fragmento, para o qual uma célula T tem um sítio de ligação de antigénio específico, o resultado da ligação ao referido sítio de ligação ativa a célula T. 0 termo "exibindo reatividade de célula T reduzida", como aqui utilizado, refere-se a moléculas que exibem uma reatividade de célula T que é significativamente reduzida em comparação com a estimulação induzida pelo alergénio do tipo selvagem a partir do qual a molécula hipoalergénica é derivada, utilizando quantidades equimolares em ensaios padrão conhecidos na especialidade (reatividade de célula T reduzida significa pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, muito preferivelmente pelo menos 90%, menos estimulação de moléculas hipoalergénicas em comparação com o alergénio do tipo selvagem para quantidades equimolares) . Numa concretização preferida particular deste invento, Podem "faltar" às moléculas epítopos de célula T e assim a molécula apresenta reatividade de célula T reduzida no(s) indivíduo (s) a ser(em) tratado (s) (i.e., que vão receber uma molécula de plataforma de valência de apresentação de epítopo). Por exemplo, é provável que a uma molécula derivada de alergénio possam faltar um ou mais epítopos de célula T em relação a um indivíduo, ou um grupo de indivíduos, ao mesmo tempo que possuem um ou mais epítopos de célula T em relação a outro(s) indivíduo(s) . Métodos para detetar a presença de um epítopo de célula T são conhecidos na especialidade e incluem ensaios que detetam a proliferação de células T (tais como incorporação de timidina). Imunogénios que não conseguem induzir incorporação de timidina estatisticamente significativa acima do valor residual (i.e., geralmente p menor do que 0,05 utilizando métodos estatísticos padrão) são geralmente considerados como desprovidos de epítopos de célula T, ainda que possa ser reconhecido que a quantidade quantitativa de incorporação de timidina possa variar, dependendo do imunogénio que está a ser testado (ver, e.g., Zhen L. et al. (Infect. Immun. (2003) 71:3920-3926)). Geralmente, um índice de estimulação abaixo de cerca de 2-3, mais preferivelmente inferior a cerca de 1, indica ausência de reatividade e epítopos de célula T. A presença de epítopos de célula T pode também ser determinada por medição da secreção de linfoquinas derivadas de célula T de acordo com métodos padrão. O índice de estimulação (SI) pode ser calculado dividindo a taxa de proliferação (incorporação de timidina) de células estimuladas pela taxa de proliferação de células não estimuladas em meio sozinho. SI=1 significa nenhuma estimulação, SI<1 indica efeitos tóxicos e SI>1 indica estimulação de células. A localização e conteúdo de epítopos de célula T, se presentes, podem ser determinados empiricamente.

Para além da estimulação de células T, pode-se a secreção de citoquina. Por exemplo, o IFN-gama tem sido reconhecido como uma citoquina nociva. Outros exemplos podem ser TNF-alfa, IL-5, IL-4, IL-8 etc. O fragmento de alergénio é preferivelmente composto dos aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 ou 212 a 241 de Phl p 1, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a 162, 217 a 246, 252 a 283 ou 176 a 212 de Phl p 5, aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 da cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 da cadeia 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79 ou 75 a 104 de Bet v 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1-35, 36-70, 71-110, 111- 145, 140-170, 175-205, 210-250 ou 250-284 de Der p 10, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou seus fragmentos ou variações de sequência.

As sequências de aminoácido especificas das moléculas derivadas de alergénio acima identificadas são:

Os termos "seus fragmentos" e "suas variações de sequência" referem-se a péptidos que são deduzidos a partir das moléculas derivadas de alergénio aqui reveladas e exibem propriedades bioquímicas (e.g. a capacidade para impedir a ligação de IgE ao alergénio a partir do qual essas moléculas são derivadas) que são comparáveis ou idênticas às referidas moléculas derivadas do alergénio. Os fragmentos do presente invento compreendem pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 10 resíduos aminoácido

sucessivos e/ou um máximo de 95%, preferivelmente um máximo de 90%, mais preferivelmente um máximo de 80% dos resíduos aminoácido da molécula derivada de alergénio. O termo "variação de sequência" inclui modificações dos péptidos tais como fragmentação (ver acima), substituições (e.g. por outros aminoácidos naturais ou não naturais ou derivados de aminoácido), deleções ou adições de aminoácidos. "Variação de sequência" refere-se também às referidas moléculas de alergénio derivadas da tabela acima, onde pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2, mais preferivelmente pelo menos 3, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 (5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20) resíduos aminoácido estão adicionados ao terminal C e/ou N. É de notar que o alergénio clone 30 é um alergénio derivado do ácaro de poeira doméstica Dermatophagoides pteronyssinus e consiste da sequência seguinte: MANDNDDDPTTTVHPTTTEQPDDKFECPSRFGYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCPGN-TRWNEDEETCT (SEQ ID No. 140; ver também AT A 733/2006) .

De acordo com o presente invento são também abrangidos péptidos que são pelo menos 80% idênticos, preferivelmente 90% idênticos, às sequências de aminoácido acima reveladas. A proteína hipoalergénica fundida de acordo com o presente invento pode ser codificada por uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico pode estar compreendida num vetor. O referido vetor é preferivelmente um vetor de expressão. O vetor alojando a molécula de ácido nucleico pode ser utilizado para propósitos de clonagem ou para a produção de vetores de expressão. O referido vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou qualquer outro vetor habitualmente utilizado em engenharia genética e pode incluir, para além da molécula de ácido nucleico do invento, elementos eucarióticos ou procarióticos para o controlo da expressão, tais como sequências reguladoras para iniciação e terminação da transcrição e/ou tradução, intensificadores, promotores, sequências de sinal e outras. 0 vetor pode ser um vetor bacteriano, fúngico, de inseto, virai ou de mamífero. 0 vetor pode ser preferivelmente utilizado para propósitos de clonagem e expressão em vários hospedeiros. Deste modo, o referido vetor compreende, para além de um ácido nucleico codificando uma molécula ou proteína de fusão hipoalergénica de acordo com o presente invento, sequências reguladoras específicas do hospedeiro. A molécula de ácido nucleico ou o vetor podem estar compreendidos num hospedeiro. A molécula de ácido nucleico e o vetor podem ser introduzidos num hospedeiro adequado. A referida molécula pode ser incorporada no genoma do hospedeiro. 0 vetor pode existir extracromossomicamente no citoplasma ou incorporada no cromossoma do hospedeiro. A proteína hipoalergénica de acordo com o presente invento pode estar compreendida numa formulação de vacina. A formulação de vacina pode ser formulada como conhecido na especialidade e necessariamente adaptada ao modo de administração da referida formulação de vacina.

Modos de administração preferidos da formulação de vacina incluem todos os regimes de administração padrão descritos e sugeridos para vacinação em geral e especificamente para imunoterapia de alergia (oralmente, transdermicamente, intravenosamente, intranasalmente, via mucosa, rectalmente, etc.). No entanto, é particularmente preferido administrar as moléculas e proteínas de acordo com o presente invento subcutaneamente ou intramuscularmente. A formulação de vacina pode apenas compreender uma proteína de capsídeo virai ou seus fragmentos de um membro do género de rinovírus. A referida formulação compreende ainda preferivelmente pelo menos um adjuvante, excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou conservante.

De modo a aumentar a imunogenicidade das moléculas hipoalergénicas de acordo com o presente invento, podem-se utilizar num medicamento, por exemplo, adjuvantes. Um adjuvante é um agente auxiliar que, quando administrado em conjunto ou em paralelo com um antigénio, aumenta a sua imunogenicidade e/ou influencia a qualidade da resposta imunitária. Deste modo, o adjuvante pode, e.g., influenciar consideravelmente a extensão da resposta imunitária humoral ou celular. Adjuvantes habituais são, e.g., compostos de alumínio, compostos contendo lípido ou micobactérias inativadas.

Geralmente, os adjuvantes podem ser de formas diferentes, desde que sejam adequados para administração a seres humanos. Exemplos adicionais destes adjuvantes são as emulsões oleosas de origem mineral ou vegetal, compostos minerais tais como fosfato ou hidróxido de alumínio, ou fosfato de cálcio, produtos bacterianos e derivados, tais como P40 (derivado da parede celular de Corynebacterium granulosum), monofosforil-lípido A (MPL, derivado de LPS) e derivados de péptido de muramilo e seus conjugados (derivados de componentes de micobactéria), alúmen, adjuvante de Freund incompleto, liposina, saponina, esqualeno, etc. (ver, e.g., Gupta R. K. et al. (Vaccine 11:293-306 (1993) e Johnson A. G. (Clin. Microbiol. Rev. 7:277-289)). A formulação pode compreender 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 yg a 200 yg da referida molécula hipoalergénica.

Outro aspeto do presente invento refere-se à utilização de uma proteína hipoalergénica de acordo com o presente invento para fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma alergia num humano ou animal. O referido medicamento compreende ainda preferivelmente pelo menos um adjuvante, excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou conservante. 0 medicamento pode ser utilizado para imunização ativa (administração da proteína hipoalergénica e/ou moléculas do invento) bem como para imunização passiva (anticorpos dirigidos contra a proteína hipoalergénica e/ou moléculas do invento). 0 referido medicamento pode compreender 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 pg a 200 pg da referida molécula hipoalergénica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo. O medicamento é preferivelmente administrado a um indivíduo numa quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal. O regime de dosagem particular, i.e., dose, temporização repetição, dependerão do indivíduo particular e da história médica desse indivíduo. Considerações empíricas, tais como a meia-vida, contribuirão geralmente para a determinação da dosagem. A frequência de administração pode ser determinada e ajustada no decurso da terapia. O indivíduo a quem o medicamento de acordo com o presente invento é administrado é preferivelmente um indivíduo ou animal que está em risco de alergia.

Sujeitos com ou em risco de vir a ter uma condição alérgica, perturbação ou doença incluem indivíduos com uma condição alérgica existente ou uma predisposição conhecida ou suspeita para o desenvolvimento de um sintoma associado a ou causado por uma condição alérgica. Assim, o sujeito pode ter uma condição, perturbação ou doença alérgica crónica ativa, um episódio alérgico agudo, ou uma condição, perturbação ou doença alérgica latente. Certas condições alérgicas estão associadas a fatores ambientais sazonais ou geográficos. Assim, sujeitos em risco incluem aqueles em risco de sofrer de uma condição com base numa história pessoal ou familiar anterior, e na estação do ano ou localização física, mas em que a condição ou um sintoma associado à condição podem não se manifestar presentemente no sujeito. A administração do medicamento de acordo com o presente invento, que compreende pelo menos uma molécula hipoalergénica como aqui descrita, a um indivíduo pode prevenir a sensibilização do referido indivíduo ou pode induzir uma resposta imunitária apropriada a alergénios. Se o medicamento do presente invento é utilizado para prevenir a sensibilização, deverá ser administrado a um indivíduo antes do primeiro contacto com o referido alergénio. Por conseguinte, prefere-se administrar o medicamento de acordo com o presente invento a recém-nascidos e crianças. Constatou-se também que a administração do medicamento de acordo com o presente invento a mulheres grávidas induzirá a formação de anticorpos dirigidos contra alergénios na criança por nascer. É especialmente benéfico utilizar moléculas hipoalergénicas de acordo com o presente invento para estas terapias porque, devido à ausência de epítopos de célula T, os efeitos colaterais que ocorrem no decurso da imunoterapia com alergénio podem ser significativamente reduzidos ou mesmo ser completamente evitados. A proteína hipoalergénica de acordo com o presente invento pode ser utilizada para o diagnóstico de uma alergia e/ou de uma infeção virai num indivíduo.

Pode-se utilizar uma proteína de capsídeo virai a partir de um vírus da família de picornaviridae como um transportador em medicamentos ou vacinas ou para diagnóstico de uma infeção virai, em particular a constipação comum.

Como valiosa alternativa à proteína transportadora KLH amplamente divulgada, podem-se utilizar proteínas de capsídeo virai de vírus da família de picornaviridae. 0 transportador pode ser conjugado quimicamente ou fundido por técnicas recombinantes a péptidos, proteínas e polipéptidos ou outros antigénios. Adicionalmente, a proteína de capsídeo virai pode ser utilizada para detetar, e.g., anticorpos dirigidos contra a referida proteína de capsídeo no soro de um indivíduo.

Uma das vantagens de um tal transportador é que não apenas o antigénio fundido ou conjugado com o mesmo pode ser exposto ao sistema imunitário, mas também é induzida uma resposta imunitária contra a proteína de capsídeo de um rinovírus. Consequentemente, uma tal vacinação conduz à prevenção e/ou tratamento de doenças causadas por rinovírus. 0 vírus é preferivelmente da espécie rinovírus de humano, em particular rinovírus de humano 89 e 14.

Uma molécula hipoalergénica derivada de Phl p 5 (Genbank N.2 X7435) pode ter uma truncagem C e/ou N-terminal e estar substancialmente desprovida de capacidade de ligação de IgE. 0 pólen de gramínea é um das fontes sazonais ao ar livre mais potente de alergénios transportados pelo ar responsáveis por febre-dos-fenos e asma alérgica.

Mais de 40% dos indivíduos alérgicos apresentam reatividade de IgE com alergénios de pólen de gramínea, que estão divididos em mais de 11 grupos. Mais de 80% dos pacientes alérgicos a pólen de gramínea reagem a alergénios do grupo 5.

Os alergénios do grupo 5 são proteínas altamente homólogas, não glicosiladas, com uma gama de massa molecular de 25-33 kD. Vários alergénios do grupo 5 têm sido clonados e/ou caracterizados imunologicamente. A tentativa para reduzir a atividade alergénica por introdução de mutações pontuais, mutações de vários aminoácidos em linha ou deleções não mostrou qualquer efeito (Schramm G., et al. J. Immunol. 1999; 162: 2406-1435) . As regiões de Phl p 5 de ligação de IgE (Flicker S., et al. J. Immunol. 2000; 165: 3849-3859) já foram descritas e a estrutura tridimensional solucionada (Maglio O., et al. 2002. Protein Eng. 15:635-642).

Em particular, constatou-se que os péptidos Phl p 5 de acordo com o presente invento, que estão truncados C e/ou N-terminalmente e desprovidos de capacidade de ligação de IgE, podem ser utilizados para a vacinação ativa de indivíduos.

De acordo com uma concretização preferida do presente invento, a molécula truncada está desprovida de epítopos de célula T.

Como já foi sublinhado acima, efeitos secundários tardios da imunoterapia de alergénio podem ser significativamente reduzidos ou mesmo evitados se as moléculas hipoalergénicas estiverem substancialmente desprovidas de epítopos de células T.

Moléculas Phl p 5 truncadas desprovidas de epitopos de célula T são compostas dos aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58 ou 252 a 283 de Phl p 5 ou seus fragmentos ou variações de sequência.

Em particular estas moléculas truncadas não exibem substancialmente quaisquer epitopos de célula T e, apesar disso, são capazes de provocar uma resposta imunitária apropriada dirigida contra o alergénio do tipo selvagem. 0 hipoalergénico truncado Phl p 5 pode ser composto dos aminoácidos 132 a 162, 217 a 246 ou 176 a 212 de Phl p 5 ou suas variações de sequência.

Estas moléculas hipoalergénicas compreendem um ou mais epitopos de célula T mas estão desprovidas de capacidade de ligação de IgE.

Uma molécula hipoalergénica derivada de Fel d 1 (N.2 Genbank X62477 e X62478) pode ter uma truncagem C e/ou N-terminal e estar desprovida de capacidade de ligação de IgE.

As alergias a animais afetam até 40% dos pacientes alérgicos. No ambiente doméstico, as alergias aos animais de estimação mais populares, gatos e cães, são particularmente prevalentes e estão relacionadas com sintomas perenes. Alergénios de animais estão presentes na pelagem, epitélio, saliva, soro ou urina. A exposição aos alergénios pode ocorrer quer por contacto direto com a pele quer por inalação de partículas portadoras dos alergénios. Mostrou-se que alergénios principais de gato e cão estão presentes de modo generalizado e podem mesmo ser detetados em agregados familiares e em locais públicos, e.g., escolas, sem animais de estimação. Isto pode ser atribuído ao número elevado e crescente de agregados familiares mantendo animais de estimação em países industrializados (cerca de 50%) e à elevada estabilidade dos alergénios, que são retirados e distribuídos. O Fel d 1 foi identificado como o principal alergénio de gato, que é reconhecido por mais de 90% dos pacientes alérgicos a gatos. O Fel d 1 representa uma glicoproteína ácida de 38 kDa de função biológica conhecida. Consiste de dois heterodímeros idênticos ligados não covalentemente que, por sua vez, são compostos de duas cadeias de polipéptido ligadas de modo antiparalelo por três ligações de dissulfureto. A cadeia 1 e a cadeia 2 estão codificadas em genes diferentes, cada um consistindo de 3 exões. O Fel d 1 recombinante (rFel d 1), expresso como uma proteína de fusão da cadeia 2 à cadeia 1, foi gerado em E. coli. Este Fel d 1 recombinante é capaz de mimetizar completamente as propriedades imunológicas do alergénio do tipo selvagem. Péptidos derivados do alergénio principal de gato Fel d 1, e desprovidos de capacidade de ligação de IgE são adequados, e.g.r para imunoterapia e vacinação profilática contra a alergia. Estes péptidos podem estar compreendidos num polipéptido maior ou ser acoplados a uma proteína transportadora adequada tal como hemocianina de lapa Fissurella (KLH, "keyhole limpet hemocyanin"). Os péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 - tais como os péptidos derivados de Phl p 5 e de alergénio aqui revelados - são capazes de induzir uma resposta de IgG, i.e., a produção dos assim chamados "anticorpos bloqueantes" ou "anticorpos protetores". Estes anticorpos impedem a ligação de IgE ao alergénio Fel d 1. Pode assim ser conseguida uma redução significativa nos sintomas alérgicos.

De acordo com uma concretização preferida do presente invento a molécula truncada exibe reatividade de célula T reduzida.

De modo a evitar ou reduzir significativamente os efeitos secundários tardios a molécula hipoalergénica derivada de Fel d 1 exibe reatividade de célula T reduzida como definido o presente invento. 0 Fel d 1 truncado é composto preferivelmente de aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 da cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 da cadeia 2 de Fel d 1 ou suas variações de sequência.

Moléculas hipoalergénicas podem ser compostas de ou compreender os aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, 121 a 160 de Alt a 2 ou seus fragmentos ou variações de sequência. A proteína de fusão hipoalergénica pode compreender pelo menos duas moléculas hipoalergénicas de acordo com o presente invento exibindo capacidade de ligação de IgE reduzida e exibindo opcionalmente reatividade de célula T reduzida.

As moléculas hipoalergénicas do presente invento que são derivadas de um alergénio e desprovidas de capacidade de ligação a IgE podem ser fundidas de modo recombinante ou conjugadas quimicamente uma à outra. Tal como os componentes individuais (fragmentos de alergénio) da proteína/polipéptido de fusão também a referida proteína/polipéptido de fusão está desprovida de capacidade de ligação de IgE. A proteína de fusão de acordo com o presente invento pode compreender pelo menos duas, preferivelmente pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro, ainda mais preferivelmente pelo menos cinco, moléculas hipoalergénicas de acordo com o presente invento. Claro que é também possível fundir as moléculas hipoalergénicas a outros péptidos, polipéptidos e proteínas não derivados dos alergénios. Quando administrados a um indivíduo, estes péptidos, polipéptidos e proteínas podem também induzir uma reação imunológica ou podem atuar como um transportador ou exibir atividades enzimáticas. As moléculas hipoalergénicas na proteína de fusão de acordo com o presente invento podem ser acopladas diretamente uma à outra ou através de um ligador que é preferivelmente composto de resíduos aminoácido. Métodos para a produção de proteínas de fusão são bem conhecidos na especialidade e podem ser encontradas em referências padrão de biologia molecular tais como Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) e Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3.a ed., Wiley and Sons, 1995) . Em geral, uma proteína de fusão é produzida construindo primeiramente um gene de fusão que é inserido num vetor de expressão adequado que, por sua vez, é utilizado para transfetar uma célula hospedeira adequada. Em geral, construções de fusão recombinantes são produzidas por uma série de digestões com enzimas de restrição e reações de ligação que resultam na incorporação das sequências desejadas num plasmídeo. Se não estiverem disponíveis sítios de restrição adequados, podem-se utilizar adaptadores ou ligadores de oligonucleótidos sintéticos como é conhecido pelos peritos na especialidade e descrito nas referências citadas acima. As sequências de polinucleótido codificando alergénios e proteínas nativas podem ser montadas antes da inserção num vetor adequado ou a sequência codificando o alergénio pode ser inserida adjacente a uma sequência codificando uma sequência nativa já presente num vetor. A inserção da sequência no vetor deverá ser em quadro de leitura (in frame) tal que a sequência possa ser transcrita numa proteína. Será evidente para as pessoas competentes na especialidade que as enzimas de restrição, ligadores e/ou adaptadores exatos requeridos bem como as condições de reação exatas variarão com as sequências e os vetores de clonagem utilizados. A montagem das construções de ADN, no entanto, é rotina na especialidade e pode ser facilmente levada a cabo por uma pessoa perita na especialidade.

As moléculas podem ser fundidas umas às outras numa ordem diferente da ordem dos fragmentos no alergénio do tipo selvagem e as pelo menos duas moléculas são derivadas do mesmo alergénio. A proteína de fusão de acordo com o presente invento pode compreender pelo menos duas moléculas hipoalergénicas que são derivadas do mesmo alergénio do tipo selvagem. Neste caso, as moléculas individuais (fragmentos de alergénio) são fundidas umas às outras numa ordem diferente da ordem no alergénio do tipo selvagem. Uma tal abordagem impede a reformação de sitios/epitopos potenciais de ligação de IgE na proteína de fusão hipoalergénica. A molécula hipoalergénica e a proteína de fusão de acordo com o presente invento podem ser utilizadas para vacinação de um indivíduo. Esta vacinação pode reduzir ou prevenir a resposta alérgica causada por um alergénio do tipo selvagem.

De acordo com uma concretização preferida do presente invento o referido medicamento compreende adicionalmente pelo menos um adjuvante, excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou conservante. 0 medicamento de acordo com o presente invento compreende preferivelmente 10 ng a 1 g, preferivelmente 100 ng a 10 mg, especialmente 0,5 pg a 200 pg da referida molécula imunogénica, molécula de ácido nucleico, vetor, hospedeiro ou anticorpo.

De acordo com outra concretização preferida do presente invento o medicamento é administrado a um indivíduo na quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.

De acordo com uma concretização preferida do presente invento o referido indivíduo está em risco de apanhar uma alergia. A molécula hipoalergénica ou proteína de fusão de acordo com o presente invento pode ser utilizada para diagnóstico de uma alergia ou monitorização do progresso de uma terapia de alergia num indivíduo. A molécula hipoalergénica ou proteína de fusão de acordo com o presente invento não apenas pode ser utilizada em medicamentos mas também pode ser adequadamente empregue para várias finalidades de diagnóstico. Por exemplo, estas moléculas e proteínas de fusão podem ser utilizadas para diagnóstico de uma alergia por exposição, e.g., de uma amostra de um indivíduo compreendendo células de libertação de histamina ao referido polipéptido (ver, e.g., Purohit et al., Clin. Exp. Allergy 35 (2005) : 186-192) . Adicionalmente, estas moléculas, proteínas de fusão e anticorpos podem ser imobilizados sobre uma superfície de modo a formar um arranjo/chip de polipéptido. Estes arranjos podem ser utilizados, e.g., num rastreio de elevado rendimento de modo a diagnosticar uma alergia em várias amostras colhidas de vários indivíduos. O presente invento é adicionalmente ilustrado pelas figuras e exemplos seguintes, no entanto, sem estar restringidos aos mesmos. A Fig. IA mostra uma vista geral esquemática do vetor p8 9VP1. A Fig. 1B mostra a sequência de ADN do sítio de clonagem múltipla do vetor pET-17b e do gene codificando 89VP1. A Fig. 1C mostra a representação esquemática de três possibilidades para criação de fusões de ácido nucleico. A Fig. 2 mostra um gel SDS-PAGE a 12% corado com azul de Coomassie contendo proteína 89VP1 purificada marcada com his (Pista 1: marcador molecular 5 pg; Pistas 2-5: amostras de eluição de 89VP1 de 10 μΐ). A Fig. 3 mostra o reconhecimento de IgG de 14VP1: Immunoblotting de 14VP1 e controlos. Os pontos são visualizados por autorradiografia (Pistas 1-6: Incubação com antissoro de coelho anti-14VPl diluído 1:500-1:16000; Pistas 7-12: Incubação com soro pré-imune diluído 1:500-1:16000) . A Fig. 4 mostra a resposta de IgGl específica de 89VP1 em ratinhos. Grupos de ratinhos foram imunizados com diferentes antigénios como indicado no topo de cada caixa. Os títulos de IgGl específicos de 89VP1 foram medidos por ELISA e estão expressos como valores de OD no eixo dos y. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa, onde 50% dos valores estão dentro das caixas e os valores não anómalos entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos. A Fig. 5 mostra a resposta de IgGl específica de Phi p 1 em ratinhos. Grupos de ratinhos foram imunizados com diferentes antigénios como indicado no topo de cada caixa. Os títulos de IgGl específicos de rPhl p 1 foram medidos por ELISA e estão expressos como valor ótico (OD 405 nm) no eixo dos y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo IgGl nos soros de ratinho. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa onde 50% dos valores estão dentro das caixas e os valores não anómalos entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos. A Fig. 6 mostra a resposta de IgGl específica de extrato de pólen de timóteo em ratinhos imunizados. Grupos de ratinhos foram imunizados com diferentes antigénios como indicado no topo de cada caixa. Os títulos de IgGl específica de extrato de pólen de timóteo foram medidos por ELISA e estão expressos como o valor ótico (OD 405 nm) no eixo dos y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo IgGl nos soros de ratinho. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa, onde 50% dos valores estão dentro das caixas e os valores não anómalos entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos. A Fig. 7 mostra a média da % de inibição da ligação de IgE do paciente a rPhl p 1 por pré-incubação com antissoros contra rPhl p 1, r89P5 e KLHP5 de todos os 19 pacientes. A % de inibição é apresentada no eixo dos y. Os resultados são mostrados como barras. A Fig. 8 mostra a proliferação de células de baço de ratinhos imunizados. Células T de ratinhos imunizados com diferentes antigénios como indicado no topo de cada caixa foram estimuladas com péptido 5, 89VP1(89) e KLH. Utilizou-se meio como referência. No eixo dos y mostra-se o indice de estimulação. Os resultados são mostrados em barras. A Fig. 9 mostra as respostas de IgGl, IgG2, IgG4 e IgA a 14VP1, 89VP1 e rPhl p 1 detetadas em soros de humano por medição por ELISA. Testaram-se os soros de 10 pacientes em relação a quatro anticorpos específicos de 89VP1, 14VP1 e rPhl p 1 como indicado no topo de cada caixa. Soros colhidos no outono e inverno são mostrados no lado esquerdo e do lado direito de cada "par de barras", respetivamente. Os títulos foram medidos por ELISA e estão expressos como valor ótico (OD 405 nm) no eixo dos y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo nos soros de humano. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa, onde 50% dos valores estão dentro das caixas e os valores não anómalos entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos. A Fig. 10 mostra a deteção de anticorpos anti-89VPl e anti-rPhl p 1 em soros de pacientes alérgicos. Testaram-se soros de 5 pacientes alérgicos a Phi p 1 em relação a sete anticorpos específicos de 89VP1 (barra esquerda de cada par) e rPhl p 1 (barra direita de cada par) . Os títulos foram medidos por ELISA e estão expressos como valor ótico (OD 405 nm) no eixo dos y. O valor ótico corresponde ao nível de anticorpo nos soros de humano. Os resultados são mostrados como gráficos de caixa, onde 50% dos valores estão dentro das caixas e os valores não anómalos entre as barras. A linha dentro das caixas indica os valores medianos. A Fig. 11 mostra a ligação de IgG anti-14VPl a extrato de proteína HRV14 e 14VP1 purificada (Pistas 1 e 4: marcador de 5 pg; pistas 2 e 4: extrato de vírus; pistas 2 e 5: 14VP15 pg). As blots A e B foram incubadas com soro imune anti-14VPl e com soro pré-imune, respetivamente. A IgG ligada foi detetada por Western blotting e visualizada por autorradiografia. A Fig. 12 mostra a neutralização de HRV14 (Pista A (controlo de células) : Células após pré-incubação de HRV14 com uma diluição de soro imune anti-14VPl 1 : 102 — 1 : 108 (linha Al-A6) ; Pista B: células após pré-incubação de HRV14 com uma diluição de soro pré-imune 1 : 102—1 : 108 (linha B1-B6); Pista C: células após incubação com HR-V14 10 TCD50-106 TCD50 (linha C1-C6); D5: células após incubação com soro pré-imune; D6: células após incubação com soro imune) . As células foram plaqueadas em todos os poços e coradas com violeta de cristal após três dias. A Fig. 13 mostra a reatividade de IgG de antissoros antipéptido com o alergénio Phl p 5 completo. As reatividades de IgG (valores de OD) em relação a Phl p 5 são apresentadas para 3 amostras de soro (sangria 1: soro pré-imune; sangrias 2-3: amostras de soro colhidas com intervalos mensais) obtidas a partir de 6 coelhos, cada um dos quais foi imunizado com um dos péptidos conjugados com KLH. A Fig. 14 mostra a atividade alergénica de rPhl p 5 e da mistura de péptidos conforme detetada por expressão de CD203c. Amostras de sangue heparinizado a partir de três pacientes alérgicos a Phl p 5 foram incubadas com diluições em série de lCh4 a 10 pg/mL de alergénio recombinante, uma mistura equimolar de péptidos derivados de Phl p 5, anti-IgE ou tampão de controlo (co, eixo dos x). As células foram depois coradas com mAb CD203c e analisadas quanto à expressão de CD203c num FACScan. O indice de estimulação (SI) é mostrado no eixo dos y · A Fig. 15 mostra a identificação de péptidos derivados de Phl p 5 que induzem respostas linfoproliferativas baixas. PBMC a partir de pacientes alérgicos a pólen de timóteo foram estimulados com diferentes concentrações de péptidos e, para efeitos de controlo, com interleucina-2 (eixo dos x) . Os indices de estimulação (SI) estão indicados no eixo dos y. A Fig. 16 mostra péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 que induzem respostas imunitárias de IgG especificas de Fel d 1 em coelhos. Seis coelhos foram imunizados com os péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 conjugados com KLH ou rFel d 1 não conjugado e 3-4 sangrias foram retiradas com intervalos mensais. As reatividades de IgG dos soros pré-imunes e do antissoro para rFel d 1 ligado à placa de ELISA são apresentadas como densidades óticas (valores de OD, eixo dos y) · A Fig. 17 mostra a baixa atividade alergénica de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 conforme determinada por expressão de CD63 e CD203c em basófilos de pacientes alérgicos. PBMC a partir de 5 pacientes alérgicos a gato foram incubados com diluições em série de Fel d 1 (caixas fechadas) ou uma mistura de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 (caixas abertas) (eixo dos x). Para o paciente RR os PBMC foram também sondados com diluições em série de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes individuais. A indução da expressão de marcadores de superfície CD203c e CD63 foi medida como intensidades de fluorescência médias, e os índices de estimulação calculados são mostrados no eixo dos y. A Fig. 18 mostra gue um tratamento com péptidos derivados de Bet v 1 acoplados a KLH reduz as respostas linfoproliferativas a rBet v 1 em ratinhos sensibilizados. A proliferação de células T foi medida em culturas de células de baço após estimulação in vitro com o alergénio de pólen de bétula Bet v 1 recombinante (barras a branco), KLH (barras preto) ou a mistura de péptidos (barras a cinzento). As barras representam os índices de estimulação médios (SI±SD) para os diferentes grupos de ratinhos. A Fig. 19 mostra a vacinação profilática de ratinhos naifs com péptidos derivados de Bet v 1 acoplados a KLH gue reduz as respostas linfoproliferativas a rBet v 1 após sensibilização. A Fig. 20 mostra gue a vacinação profilática de ratinhos naifs com péptidos derivados de Bet v 1 acoplados a KLH induz uma resposta de IgG específica de Bet v 1 e desencadeia a indução de respostas de IgG específicas de alergénio pelo alergénio completo. As respostas de IgG (valores de OD; eixo dos y) a Bet v 1 foram medidas nos guatro grupos de tratamento em pontos temporais diferentes (eixos dos x). A Fig. 21 mostra uma comparação de reatividade de IgE: determinou-se a capacidade de ligação de IgE de péptidos derivados de Phi p 5 (1, 2) e variantes (la, 2b) em ensaios dot-blot aplicando 0,2 gíót utilizando soros a partir de 7 pacientes alérgicos a pólen de graminea (pl-p7) e o soro a partir de um indivíduos não atópico (NHS) . 0 rPhl p 5 foi utilizado como controlo positivo e HSA como controlo negativo. A IgE ligada foi detetada com anti-IgE humano marcado com 125I. A Fig. 22 mostra as respostas linfoproliferativas de péptidos derivados de Phi p 5 (1, 2) e variantes (la, 2b) . PBMC a partir de pacientes alérgicos a pólen de graminea foram estimulados com diferentes concentrações de péptidos e, para efeitos de controlo, com concentrações eguimolares de rPhl p 5. Os índices de estimulação (SI) estão indicados no eixo dos y · A Fig. 23 mostra a proteção cruzada de anticorpos anti- VP1. EXEMPLOS:

Exemplo 1: Construção do vetor p89VPl

Prepararam-se amostras de reserva de vírus para RT-PCR por adição de 1 1 de inibidor de RNase (Boehringer GmbH,

Alemanha) até uma concentração final de 0,01 U/μΙ após extração de ARN a partir dos sobrenadantes de cultura de células pelo kit de ARN virai QIAamp (Qiagen, Alemanha). O plasmídeo p89VPl (Fig. IA) foi construído substituindo o fragmento Ndel/EcoRI do sítio de clonagem múltipla de pET-17b pela seguência de ADNc codificando a proteína VP1 de rinovírus de humano estirpe 89 (89VP1). Os sítios de restrição Ndel e EcoRI (no pET-17b) foram utilizados para inserção de 89VP1 ligada a Asel/EcoRI com ATG na extremidade 5', seis histidinas seguidas pelo codão de paragem TGA na extremidade 3' (Fig. 1B) . A inserção de 89VP1 em pET-17b foi confirmada por sequenciação de nucleótidos.

Após fusão de Ndel/Asel em vez do Ndel foi criado o sítio CATAAT e não podia ser cortado com qualquer enzima disponível. Por conseguinte, o sítio foi mutado para CTTAAG, o sítio de restrição de Afl II. Para inserir um fragmento de alergénio adicional, a sequência ACCGTT na extremidade 3' foi mutada para ACCGGT, o sitio de restrição de Agel. As sequências de aminoácidos são apresentadas por baixo das sequências de nucleótidos de 89VP1. Os sitios de restrição são mostrados sublinhados na Fig. 1B.

Os referidos sitios de restrição Afl II e Agel foram criados com o kit de mutagénese para alteração de sitios Quick (Stratagene). ADNc para fragmentos de gene podem assim ser inseridos para purificação fácil nos sitios de restrição restantes quer na extremidade 5' (utilizando Afl II) quer na extremidade 3' (utilizando Agel) de 89VP1 quer em ambos os sitios como indicado na Figura 1C. Fragmentos de alergénio recombinantes serão assim expressos no terminal N e/ou no terminal C do 89VP1.

Exemplo 2: Clonagem de uma construção exprimindo uma proteína de fusão 89VP1-fragmento de alergénio A abordagem descrita acima foi exemplificada para um fragmento de alergénio de Phi p 1 C-terminal, nomeadamente o péptido 5 (CVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTAYESK; M. Focke et al. FASEB J. (2001) 15:2042-4) . A sequência de ADN do péptido 5 foi amplificada por PCR utilizando o ADNc de Phi p 1 (GenBank: X78813) como modelo (Iniciadores: Phi p 1 direto 5'-CGCGCTTAAGATGGTCCGCTACACCACCGAGGGC-3' (SEQ ID No. 7); Phi p 1 reverso 5'-CGCGCTTAAGCTTGGACTCGTAGGCGGTGTCGGC-3' (SEQ ID No. 8)) . O produto de PCR foi inserido no sítio de restrição Afl II do vetor p89VPl, e a construção resultante é referida como vetor p89P5 e o produto génico r89P5.

Exemplo 3: Expressão e purificação de proteína de fusão 89VPl-péptido 5 e 89VP1

De modo a conseguir a expressão de 89VP1 ou r89P5 (proteína de fusão 89VPl-péptido 5 recombinante), utilizaram-se os plasmídeos para transformar E. coli BL21 (DE3). Células de E. coli transformadas foram cultivadas em 250 ml de meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina a 37°C até uma densidade ótica de (600 nm) de 0,4, e induziu-se a expressão de proteína por adição de isopropil-beta-D-tiogalactosidase (IPTG) até uma concentração final de 1 mM. Após 4 h colheram-se as células de E. coli por centrifugação a 3500 rpm a 4°C durante 10 min. Realizou-se a purificação com o protocolo da Qiagen utilizando Ni-NTA e colunas Qiagen. Ressuspendeu-se o sedimento celular sob condições desnaturantes em 5 ml de cloridrato de guanidínio 6 M durante 1 hora. Após centrifugação (20 min, 10000 x g) incubou-se o sobrenadante com 1 ml de Ni-NTA durante uma hora adicional. Carregou-se depois a suspensão numa coluna, lavou-se duas vezes com 5 ml de tampão de lavagem (ureia 8 M pH 6,3) e depois eluiu-se com 4 ml de tampão de eluição (ureia 8 M pH 3,5). A renaturação foi conseguida após diálise com molaridade de ureia decrescente. A pureza e o tamanho da proteína purificada foram analisados por SDS-PAGE como se mostra na Figura 2. As bandas de proteína estavam correlacionadas com o tamanho de proteína calculado de 33,6 kD. A integridade das proteínas foi também confirmada por análise Western blot, utilizando anticorpo anti-marcador de histidina.

Exemplo 4: Deteção de anticorpos de coelho específicos de 14VP1 por immunoblotting

Aplicaram-se por pontos 5 pg de 14VP1 (proteína VP1 do rinovírus de humano estirpe 14) e controlos (Bet v 1, Phl p 5, BSA) sobre tiras de membrana de nitrocelulose. Expuseram-se estas tiras a uma diluição de antissoro de coelho anti-14VPl (pista 1-6) e soro pré-imune (pista 8-12). Os anticorpos IgG de coelho ligados foram detetados com anticorpo de burro marcado com 125I anti-IgG de coelho 1:1000 e visualizados por autorradiografia (Fig. 3). A análise dot-blot de soro de coelho anti-14VPl mostra gue a 14VP1 é fortemente imunogénica. Detetaram-se ainda anticorpos IgG com uma diluição 1:16000 do antissoro em contraste com o soro pré-imune e os controlos de Bet v 1, Phl p 5 e BSA.

Exemplo 5: Resposta de anticorpo específico de 89VP1 em ratinhos imunizados determinada por ELISA

De modo a determinar a imunogenicidade de 89VP1 e a sua capacidade para atuar como um transportador para o péptido 5, grupos de ratinhos Balb/c fêmeas de seis semanas de idade (Charles River) foram imunizados com os antigénios seguintes: KLH, péptido 5 acoplado por maleimida a KLH (KLHP5) e péptido 5 acoplado por EDC a KLH (KLHP5edc). O acoplamento guímico foi realizado com os kits mcKLH ativado com maleimida Imject e EDC Immunogen Imject (Pierce). O grupo maleimida reage com grupos SH e o EDC reage com grupos carboxilo e amino para formar ligações estáveis. Grupos de 4 ratinhos foram imunizados com 89VP1, r89P5 e 89P5edc e 2 ratinhos foram imunizados apenas com péptido 5 (5 pg cada e misturados 1:2 com hidróxido de alumínio). Os ratinhos foram imunizados subcutaneamente com intervalos de aproximadamente três semanas e sangrados a partir das veias caudais. O nível de anticorpo IgGl específico de 89VP1 foi determinado por ELISA.

Revestiram-se placas de ELISA (Nunc) com 89VP1, 5 pg/ml. Os soros anti-89VPl, anti-r89P5 e péptido 5 de ratinho estavam diluídos 1:500. A IgGl ligada foi detetada com anticorpo de rato anti-IgGl de ratinho (BD Pharmingen) 1:1000 e depois com anticorpo de cabra anti-IgG de rato acoplado a POX (Amersham Bioscience) 1:2000. O valor ótico (OD 405 nm) é apresentado no eixo dos y e corresponde ao nivel de anticorpo IgGl nos soros de ratinho (Fig. 4).

Como controlos utilizaram-se KLHP5, KLHP5edc, KLH e péptido 5. Detetaram-se anticorpos IgGl com um titulo crescente durante a imunização em ratinhos injetados com 89VP1 (89VP1, 89P5edc e r89P5). Coelhos imunizados com 89VP1, r89P5 e KLHP5 mostraram o mesmo resultado.

Exemplo 6: Resposta de anticorpo específica de rPhl p 1 em ratinhos imunizados determinada por ELISA

Para avaliar se a imunização com r89P5 induzirá anticorpos IgG que reagem com Phi p 1 completo, utilizaram-se o mesmo método e os mesmos soros de ratinhos como descrito no Exemplo 5. Revestiram-se placas de ELISA com rPhl p 1, 5 pg/ml, e determinou-se o titulo de anticorpo IgGl (Fig. 5).

Todos os péptidos derivados de Phi p 1 acoplados quer a KLH quer a 89VP1 induziram anticorpos IgGl específicos de rPhl p 1 com respostas crescentes durante as imunizações. Coelhos imunizados com r89P5 e KLHP5 mostram o mesmo resultado.

Exemplo 7: Deteção por ELISA de anticorpos IgGl específicos extrato de pólen de timóteo A imunização de ratinhos e a análise ELISA foram realizadas como descrito na secção 5. Utilizou-se extrato inteiro de pólen de timóteo (100 pg/ml) para revestir placas ELISA e determinou-se o título de anticorpos IgGl (Fig. 6).

Após três imunizações podiam ser detetados anticorpos IgGl específicos de extrato em ratinhos imunizados com péptido 5 .

Exemplo 8: Anticorpos de coelho ant±-r89P5 bloqueiam a ligação de IgE de paciente a rPhl p 1

Para determinar a capacidade de Ig de coelho induzida por péptido em inibir a ligação de anticorpos IgE de pacientes alérgicos a rPhl p 1, revestiram-se placas de ELISA com rPhl p 1, 1 pg/ml, lavaram-se e bloquearam-se. Pré-incubaram-se as placas com anticorpos diluídos 1:100 de coelho antipéptido (89P5, KLHP5), um de coelho anti-rPhl p 1 e, para efeitos de controlo, com os soros pré-imunes correspondentes. Após lavagem, incubaram-se as placas com soros humanos de pacientes alérgicos a Phi p 1 (diluídos 1:3) e detetou-se a IgE ligada com anticorpo de ratinho anti-IgE de humano (Pharmingen 1:1000) e depois com anticorpo de ovelha anti-IgG de ratinho acoplado a POX (Amersham Bioscience) 1:2000. A percentagem de inibição da ligação de IgE conseguida por pré-incubação com os antissoros antipéptido foi calculada como se segue: lOO-ODx/ODp x 100. OD± e ODp representam as extinções após pré-incubação com o soro imune e pré-imune de coelho, respetivamente. A Tabela 2 mostra a capacidade de anticorpos de péptido anti-Phl p 1 para inibir a ligação de IgE de 19 pacientes alérgicos a rPhl p 1 completo. A Figura 7 apresenta a inibição média (em %) de todos os soros imunes anti-rPhl p 1, anti-r89P5 e anti-KLHP5. Os soros antipéptido bloquearam a ligação de IgE muito melhor do que rPhl p 1. A capacidade para inibição com 89P5 e KLHP5 é quase igual. A Tabela 2 mostra a inibição (em %) de todos os 19 pacientes.

Tabela 2: % de inibição da ligação de IgE de 19 pacientes a rPhl p 1 após incubação com antissoros de coelho anti-rPhl p 1, r89P5 e anti-KLHP5

Exemplo 9: Proliferação de células T de células de baço de ratinho após estimulação de antigénio

Grupos de três ratinhos foram imunizados com KLH, KLHP5 e KLH-P5edc. Grupos de 4 ratinhos foram imunizados 4 vezes com 89VP1, r89P5 e 89P5edc, e 2 ratinhos foram imunizados apenas com péptido 5 sozinho (5 pg cada). Colheram-se as células de baço 10 dias após a última imunização e estimularam-se as culturas de células individuais em triplicado em placas de 96 poços com péptido 5 (P5), 89VP1, KLH, Con A e um meio como um controlo positivo e um controlo negativo, respetivamente. Após quatro dias adicionaram-se 0,5 pCi de [3H]timidina radioativa a cada poço. As células foram depois colhidas com um Packard Cell Harvester para placas Unifilter após 15 horas. Mediu-se a reatividade associada às células com um contador beta. Calcularam-se os indices de estimulação e apresentam-se no eixo dos y. No eixo dos x mostra-se o antigénio que foi utilizado para estimulação. Cada caixa representa os dados do antigénio que foi utilizado para imunização dos ratinhos (Fig. 8). Todos os valores acima de dois contam como positivos. Os ratinhos imunizados com KLH e KLHP5 apenas são positivos quando estimulados com KLH e os estimulados com o péptido 5 são completamente negativos. O grupo de KLHP5edc é também negativo o que corresponde aos resultados de ELISA. Células a partir de ratinhos imunizados com r89P5, 89P5edc e 89VP1 proliferaram apenas após estimulação com 89VP1. O ratinho de controlo naif não mostra qualquer proliferação em todos os casos. Estes resultados mostram que epítopos de célula T são proporcionados pelo transportador 89VP1 e não pelo péptido 5.

Exemplo 10: Deteção por ELISA de anticorpos específicos de 14VP1, 89VP1 e rPhl p 1 em soros de humanos obtidos no outono e no inverno

Cinco soros de humano de pessoas escolhidas aleatoriamente foram colhidos no outono e cinco no inverno. Determinaram-se por ELISA os níveis de anticorpos IgGl, IgG2, IgG4 e IgA contra 14VP1, 89VP1 e rPhl p 1 como descrito no

Exemplo 5. Os IgGl, IgG2, IgG4 e IgA de humanos foram detetados (BD Pharmingen) 1:1000 com anticorpo de ovelha anti-IgG de ratinho acoplado a POX (Amersham Bioscience) 1:2000. Pôde ser detetado um título de IgGl anti-14VPl e 89VP1 elevado nos soros colhidos no outono e inverno (Fig. 9) . O título de anticorpo IgGl anti-rPhl p 1 era muito mais baixo. Puderam ser detetados anticorpos IgG2, IgG4 e IgA em todos os casos com um nível muito baixo. As proteínas VP1 das diferentes estirpes de HRV estão estreitamente relacionadas e foi mostrada reatividade cruzada noutros estudos.

Exemplo 11: Anticorpos antl-89VPl e antl-rPhl p 1 de pacientes alérgicos a Phi p 1

Colheram-se soros de cinco pacientes alérgicos a Phi p 1 e realizou-se uma experiência de ELISA como descrito no Exemplo 5. Revestiram-se placas ELISA com rPhl p 1 e 89VP1 e determinaram-se os títulos de anticorpos específicos IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE (Fig. 10) . Puderam ser detetados mais anticorpos IgGl anti-89VPl do que anticorpos IgGl anti-rPhl p 1.

Exemplo 12: Deteção da ligação de anticorpo anti-14VPl ao virus inteiro por análise Western blot A ligação de anticorpo IgG de soros do coelho injetado com 14VP1 ao vírus inteiro foi confirmada utilizando o vírus inteiro HRV14 (pistas 2 e 5) e 5 yg de 14VP1 purificado (pista 3 e 6) como controlo. Separou-se o extrato de vírus por SDS-Page a 12% e manchou-se sobre membrana de nitrocelulose. Testou-se antissoro de coelho anti-14VPl (pista 1-3) 1:500 e soro pré-imune (pista 4-6) 1:500 quanto à ligação a HRV14 e 14VP1. A IgG ligada foi detetada com anticorpo de burro anti-coelho marcado com 125I e visualizada por autorradiografia (Fig. 11) . A ligação de antissoro 14VP1 podia ser detetada para o mesmo tamanho (33,6 kD) que 14VP1.

Exemplo 13: Neutralização de anticorpos anti-14VPl de rinovírus de humano 14 intacto

Determinou-se a dose de cultura de tecidos 50 (TCD50) de HRV14. Deste modo, realizaram-se diluições de virus de 1:102 — 1:108 em MEM-Eagle 1% de FCS e MgCÍ2 40 mM e incubaram-se em placas de 24 poços a 34°C numa atmosfera humidificada de 5% CO2 em conjunto com células HeLa Ohio durante três dias. Foi também espalhado um controlo sem o virus. O efeito citotóxico do virus foi visualizado com violeta de cristal após três dias e calculou-se a TCD50 (a diluição para a qual 50% das células são mortas).

Diluições de soro e virus (100TCD50) nas linhas A e B foram incubadas a 34°C. Após 2 horas espalharam-se células em todos os poços. D5 e D6 são controlos de soro. O esquema experimental é mostrado na Fig. 12. O efeito de neutralização dos anticorpos foi detetado após três dias com violeta de cristal (Fig. 12).

Exemplo 14: Características de péptidos sintéticos derivados de Phl p 5

Os péptidos foram sintetizados utilizando uma estratégia Fmoc com ativação por HBTU (ciclos em pequena escala de 0,1 mmol) no sintetizador de péptidos da Applied Biosystems Modelo 433A conforme descrito (Focke et al. FASEB J. (2001) 15:2042). Após análise aprofundada do alergénio Phl p 5 prepararam-se seis péptidos derivados de Phl p 5 variando desde 31 (Pl: 3026 dalton) a 38 (P6: 3853 dalton) aminoácidos de comprimento que são ricos em aminoácidos expostos a solvente (Tabela 3).

Estes péptidos têm pontos isoelétricos entre 4,32 e 8,98 e três deles (péptidos 3, 4 e 6) podem conter epítopos de células T de humano.

Tabela 3. Características de péptidos sintéticos derivados de Phl p 5 não alergénicos. Mostram-se a posição (em relação à molécula Phl p 5) , sequência, comprimento, peso molecular (MW), ponto isoelétrico (pi) e presença de epítopos de células T dos péptidos derivados de Phl p 5. 0 resíduo cisteína adicionado para facilitar o acoplamento está assinalado a negrito e sublinhado.

Exemplo 15: Péptidos derivados de Phl p 5 desprovidos de reatividade de IgE e atividade alergénica

15.1. Ausência de reatividade de IgE

Para analisar a reatividade de IgE dos seis péptidos derivados de Phl p 5, compararam-se os péptidos derivados de Phl p 5 isolados e também acoplados a KLH com rPhl p 5 completo no que se refere à capacidade de ligação de IgE por ELISA utilizando soros a partir de 29 pacientes alérgicos a pólen de graminea (Tabela 4).

Tabela 4: Caracterização sorológica de 29 pacientes alérgicos a pólen de graminea e um controlo não alergénico. Mostram-se sexo, idade, e os níveis totais de IgE no soro (kU/L), IgE específico de extrato de timóteo (kUA/L), anticorpos IgE específicos para rPhl p 5 e os 6 péptidos isolados (P1-P6) e acoplados a KLH (KLH-P1-KLH-P6) medidos por ELISA e as ODs (densidades óticas) . Os traços indicam a ausência de reatividade de IgE para os péptidos isolados e também para os péptidos acoplados a KLH.

Revestiram-se placas ELISA (Nunc Maxisorp, Dinamarca) com péptidos derivados de Phl p 5 (5 pg/ml) ou rPhl p 5 como controlo (5 pg/ml), lavaram-se e bloquearam-se. Subsequentemente, incubaram-se as placas com soros diluídos 1:3 a partir de 29 pacientes alérgicos a pólen de graminea e a partir de um indivíduo não atópico a 4°C. Pacientes alérgicos a pólen de graminea sofrendo de rinoconjuntivite alérgica e/ou asma foram selecionados de acordo com a história de casos indicativos de polinose de graminea sazonal e caracterizados por teste cutâneo com extrato de pólen de timóteo e teste sorológico CAP-FEIA (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suécia). Os niveis de IgE total nos soros foram determinados por medições CAP (Pharmacia). Os anticorpos IgE específicos para rPhl p 5 foram determinados por ELISA. Utilizaram-se soros a partir 29 pacientes alérgicos a pólen de graminea e de um indivíduo não atópico para estudos de competição de IgE. 0 grupo de pacientes alérgicos a pólen de graminea consistiu de 13 indivíduos do sexo masculino e 16 do sexo feminino com uma idade média de 35 anos (variando de 25-51 nos) (Tabela 4).

Anticorpos de IgE ligados foram detetados com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-IgE de humano acoplado a fosfatase alcalina diluído 1:1000 (Pharmingen, CA).

Os níveis de IgE total e de IgE específico de extrato de pólen de graminea variaram de 24,9-2000 kU/L (média: 262,7) e 2,2-100 kUA/L (média: 41,5), respetivamente. Todos os pacientes continham anticorpos IgE específicos de rPhl p 5 variando de 0,157-2,530 unidades de OD (média: 1,082 unidades de OD), mas nenhum dos 29 pacientes mostrou reatividade de IgE para qualquer dos péptidos (P1-P6) ou para uma mistura equimolar dos péptidos (OD < 0,08) . Este resultado demonstra que nenhum soro continha anticorpos IgE detetáveis com especificidade por qualquer dos seis péptidos derivados de Phl p 5 . 15.2. Atividade alergénica reduzida dos péptidos conforme detetada por expressão de CD203c em basófilos: Ativação de basófilos e citometria de fluxo: A regulação ascendente de CD203c tem sido descrita como um marcador indireto para ativação e desgranulação de basófilos induzidas por alergénio (Hauswirth et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 2002; 110:102). Por conseguinte, comparou-se a atividade alergénica de alergénio rPhl p 5 completo e de uma mistura equimolar de péptidos por medição da regulação ascendente de CD203c em basófilos de pacientes alérgicos a pólen de graminea.

Obtiveram-se células de sangue periférico a partir de 3 doadores alérgicos após ter sido dado consentimento informado. Aliquotas de sangue heparinizado (100 μΐ) foram incubadas com diluições em série de alergénios recombinantes (10~4 a 10 pg/ml), anticorpo anti-IgE (1 pg/ml) ou tampão de controlo (solução salina tamponada com fosfato = PBS) durante 15 minutos a 37°C. Após incubação, lavaram-se as células em PBS contendo EDTA 20 mM. Incubaram-se depois as células com 10 μΐ de mAb CD203c 97A6 conjugado com PE durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT). Depois, lisaram-se os eritrócitos com 2 mL de solução de lise FACS™. Lavaram-se depois as células, ressuspenderam-se em PBS e analisaram-se por citometria de fluxo de duas cores num FACScan (Becton Dickinson), utilizando o software Paint-a-Gate. A regulação ascendente de CD203c induzida por alergénio foi calculada a partir das intensidades de fluorescência média (MFIs) obtidas com células estimuladas (MFIstim) e não estimuladas (MFIcontrol), e expressa como índice de estimulação (MFIstim : MFIcontrol). Uma SI de > 2,0 (regulação ascendente > 2) foi considerada indicativa de uma resposta específica.

Como se mostra na Figura 14 constatou-se que o rPhl p 5 completo exibe um aumento dependente da dose (10~4 a 10 pg/mL) na expressão de CD203c em basófilos de sangue periférico num indivíduo sensibilizado, enquanto uma mistura equimolar dos péptidos não mostra qualquer efeito. A determinação da expressão de CD203c em basófilos de pacientes alérgicos a pólen de graminea mostra que não pode ser observada qualquer atividade alergénica com os péptidos derivados de Phl p 5.

Exemplo 16: A imunização com péptidos derivados de Phl p 5 induz anticorpos IgG reativos com rPhl p 5 e alergénios naturais a partir de diferentes espécies de graminea 16.1. Alergénios recombinantes e extratos de alergénio

Phl p 5 recombinante purificado foi expresso em E. coli como descrito (Vrtala et al. J. of Immunol. (1993) 151:4773-4781) . Pólenes de graminea a partir de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum foram obtidos na Allergon Pharmacia (Suécia), e preparou-se um extrato de pólen aquoso conforme descrito (Vrtala et al., Int. Arch. Allergy Immunol. (1993) 102:160-9.) . 16.2. Imunização de coelhos Péptidos purificados por HPLC foram acoplados a KLH (hemocianina de lapa Fissurella, MW 4,5 x 103 - 1,3 x 107, Pierce, E.U.A.) de acordo com as orientações do fabricante e purificados utilizando um kit de conjugação (Sigma, E.U.A.).

Imunizaram-se os coelhos com cada um dos péptidos conjugados com KLH (200 pg/injeção) e, para controlo, com rPhl p 5 utilizando adjuvante completo e incompleto de Freund (Charles River). As amostras de soro foram obtidas com intervalos de quatro semanas. 16.3. Reatividade de anticorpos de coelho com rPhl p 5 completo e alergénios naturais a partir de diferentes espécies de gramineas

Realizaram-se experiências de ELISA de modo a investigar se os anticorpos induzidos após imunização com péptidos acoplados a KLH reconheciam ou não rPhl p 5, Phl p 5 natural e alergénios de pólen de graminea relacionados com Phl p 5 a partir de pólen de graminea de outras espécies. Para deteção por ELISA, as placas (Nunc Maxisorp, Dinamarca) foram revestidas com extratos de alergénio de pólen (100 pg/ml: Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum) ou alergénio recombinante purificado (5 pg/ml: rPhl p 5) . Lavaram-se e bloquearam-se as placas de ELISA e subsequentemente incubaram-se com antissoros de coelho antipéptido e soro pré-imune correspondente diluídos 1:2500. Detetou-se a IgG de coelho ligada com um antissoro de cabra anti-Ig de coelho acoplado a HRP (Jackson Immunresearch, Pennsylvania). Os resultados representam médias de determinações em duplicado com um erro de <5% (Figura 13, Tabela 5).

Tabela 5: Reatividade cruzada de antissoros antipéptido Phl p 5 com rPhl p 5 e alergénios do grupo 5 naturais a partir de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Anthoxanthum odoratum. As reatividades de IgG (valores de OD) de antissoros de péptido (anti-Pl a anti-P6) para Phl p 5 e extratos de pólen a partir de pólen de gramíneas são apresentadas para 6 coelhos que foram imunizados com péptidos derivados de Phl p 5 (P1-P6) conjugados com KLH.

16.4. A imunização com péptidos derivados de Phl p 5 induz anticorpos IgG reativos de modo cruzado A imunização com cada um dos péptidos induziu uma resposta de IgG especifica de Phl p 5 robusta que se tornou detetável quatro semanas após a primeira imunização e aumentou após a segunda imunização (Figura 13) . A imunização com péptido 2 induziu a resposta de IgG especifica de Phl p 5 mais elevada seguindo-se os péptidos 6, 4, 5 e 1 que induziu a resposta mais baixa. Com a exceção de anticorpos antipéptido 1 que estavam desprovidos de reatividade com alergénios do grupo 5 em Lolium perenne, Poa pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale e Hordeum vulgare, os antissoros dos outros péptidos reagiram de modo cruzado com cada um dos extratos testados de pólen de graminea (Tabela 5).

Exemplo 17: A imunização com péptidos derivados de Phl p 5 induz anticorpos IgG que inibem a ligação de IgE de pacientes alérgicos a pólen de graminea a Phl p 5 17.1. Inibição da ligação de IgE de pacientes alérgicos a rPhl p 5a por IgG especifica de péptido A informação referente à capacidade dos péptidos para induzir anticorpos bloqueantes é importante uma vez que os anticorpos bloqueantes mostraram desempenhar um papel importante em imunoterapia.

De modo a examinar a capacidade de Ig de coelho induzida por péptido para inibir a ligação de IgE de pacientes alérgicos a rPhl p 5 completo, realizaram-se experiências de ELISA de competição utilizando soros a partir de 29 pacientes alérgicos a graminea.

Revestiram-se placas de ELISA com rPhl p 5 (1 pg/ml) e pré-incubaram-se quer com uma diluição 1:250 de cada um dos antissoros antipéptido (anti-Pl - anti-P6), uma mistura dos antissoros antipéptido, um antissoro anti-rPhl p 5 quer, para efeitos de controlo, com os soros pré-imunes correspondentes ou uma mistura dos soros pré-imunes. Após lavagem, incubaram-se as placas com soros diluídos 1:3 a partir de 29 pacientes alérgicos a pólen de graminea e detetaram-se os anticorpos IgE ligados com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-IgE de humano acoplado a fosfatase alcalina (Pharmingen). A percentagem de inibição de ligação de IgE conseguida por pré-incubação com os antissoros antipéptido foi calculada como se segue: % de inibição da ligação de IgE = lOO-ODx/ODp x 100. OD± e ODp representam as extinções após pré-incubação como o soro imune e pré-imune de coelho, respetivamente. A pré-incubação de Phl p 5 com IgG de coelho induzida por péptido inibiu a reatividade de IgE de pacientes alérgicos num grau variável. O grau médio de inibição da ligação de IgE variou desde 19,3% para IgG antipéptido 6 até 28,5% com IgG antipéptido 1. Anticorpos de coelho criados contra Phl p 5 completo induziram uma inibição média de ligação de IgE de 43,6%.

Tabela 6: Antissoros de coelho antipéptido Phl p 5 inibem a ligação de IgE no soro de pacientes alérgicos a pólen de timóteo a Phl p 5. A percentagem de inibição da ligação de IgE a Phl p 5 é apresentada para cada paciente após pré-incubação de Phl p 5 com antissoros antipéptido (anti-Pl - anti-P6), com uma mistura dos seis antissoros antipéptido (anti-Pl-P6) ou com um antissoro anti-rPhl p 5. A percentagem de inibição média é apresentada na linha de fundo, nd: não determinada.

Exemplo 18: Péptidos derivados de Phl p 5 induzem respostas linfoproliferativas específicas baixas. 18.1. Ensaios de linfoproliferação

De modo a identificar péptidos com a reatividade de célula T mais baixa possível para minimizar efeitos secundários relacionados com a terapia, examinou-se a reatividade de célula T por ensaios de linfoproliferação. Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de 2 pacientes alérgicos a pólen de gramínea por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, UK). Cultivaram-se os PBMC (2 x 105) em triplicado em placas de 96 poços (Nunclone; Nalge Nunc International, Dinamarca) em 200 μΐ de meio de cultura Ultra isento de soro (BioWhittaker, Rockland, ME) suplementado com L-glutamina 2 mM (SIGMA, E.U.A.), beta-mercaptoetanol 50 μΜ (SIGMA) e 0,1 mg de gentamicina por ml (SIGMA) a 37°C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Estimularam-se as células com diferentes concentrações de péptidos sintéticos (1,25, 0,6 e 0,3 pg por poço) e, para comparação, com 4 U de interleucina-2 por poço (Boehringer Mannheim, Alemanha) e com meio sozinho. Após 6 d de cultura adicionaram-se 0,5 pCi por poço de [3H]timidina (Amersham Pharmacia Biotech) e após 16 h mediu-se a radioatividade por contagem de cintilação de liquido utilizando um contador de cintilação Microbeta (Wallac ADL, Alemanha). Calcularam-se os cpm médios a partir dos triplicados, e calcularam-se os indices de estimulação (SI) como o quociente dos cpm obtidos por estimulação com antigénio ou interleucina-2 e do meio de controlo não estimulado.

Os PBMC a partir de pacientes alérgicos a pólen de timóteo foram estimulados com diferentes concentrações de péptidos sintéticos. Os indices de estimulação com péptidos eram significativamente mais baixos do que com IL2. Os péptidos derivados de Phl p 5 induziram respostas linfoproliferativas especificas baixas. A resposta mais baixa foi observada com péptido 5 seguido do péptido 4.

Exemplo 19: Características de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1

De modo a obter péptidos adequados para vacinação contra a alergia a gatos, desenharam-se cinco péptidos que têm 30 a 36 aminoácidos de comprimento e cobrem a molécula inteira de acordo com sequência de aminoácidos conhecida de Fel d 1.

Os péptidos foram sintetizados utilizando uma estratégia de Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) com ativação por HBTU (hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (ciclos de pequena escala de 0,1 mmol) no sintetizador de péptidos da Applied Biosystems Modelo 433A (E.U.A.). Utilizaram-se resinas de PEG-PS (polietilenoglicol-poliestireno) pré-carregadas (carga de 0,15-0,2 mmol/g) (PerSeptive Biosystems, Reino Unido) como fase sólida para construir os péptidos. Os produtos químicos foram comprados na Applied Biosystems. 0 acoplamento de aminoácidos foi confirmado por monitorização da condutividade num sistema de controlo de retroalimentação. Adicionou-se um resíduo cisteína aos péptidos 1, 3, 4 e 5 para facilitar o acoplamento aos transportadores (Tabela 7) . Os péptidos foram clivados a partir das resinas com uma mistura de 250 μΐ de água destilada, 250 μΐ de tri-isopropilsilano (Fluka, Suíça), 9,5 ml de TFA durante 2 h e precipitados em terc-butilmetiléter (Fluka, Suíça) (Focke 2001). Verificou-se a identidade dos péptidos foi espectrometria de massa e purificaram-se os péptidos até >90% de pureza por HPLC preparativa HPLC (PiChem, Áustria).

Tabela 7: Características moleculares de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1. Mostram-se a posição na molécula Fel d 1 nativa, sequência de aminoácidos, número de aminoácidos, peso molecular (MW) calculado e ponto isoelétrico (pi) teórico dos péptidos sintéticos derivados de Fel d 1. Todos os péptidos são solúveis em água.

Os cinco péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 têm pesos moleculares na gama de 3246 a 4083 dalton e têm pontos isoelétricos calculados de 4,30 a 4,93. Todos os cinco péptidos são solúveis em água e os Péptidos 1, 2 e 3 podem conter epítopos de célula T de humano (Tabela 7).

Tabela 8. Reatividade de IgE reduzida de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 em comparação com rFel d 1

Exemplo 20: Péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 têm reatividade de IgE reduzida em comparação com rFel d 1 e os péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 estão desprovidos de atividade alergénica

Investigou-se a reatividade de IgE de soro em relação aos péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 de modo a identificar péptidos hipoalergénicos adaptados para vacinação.

Um diagnóstico de alergia a gatos mediada por IgE foi baseada em anamnese, teste cutâneo (Allergopharma, Reinbek, Alemanha) e medição de IgE sérica total bem como de IgE sérica especifica de pelo (CAP-FEIA, Pharmacia Diagnostics, Suécia). Incluíram-se pessoas não alérgicas para efeitos de controlo.

20.1. Capacidade de ligação a IgE medida em ensaios ELISA A capacidade de ligação de IgE dos cinco péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 foi comparada com a do alergénio rFel d 1 completo utilizando 14 pacientes alérgicos a gato. Revestiram-se placas de ELISA (Nunc Maxisorb,

Dinamarca) com péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 ou rFel d 1 como controlo (0,5 pg/poço), lavaram-se e bloquearam-se. Incubaram-se depois as placas de um dia para o outro a 4°C com soros diluídos 1:5 a partir de pacientes alérgicos a gato e a partir de um indivíduo não atópico. Detetaram-se os anticorpos IgE ligados com um anticorpo anti-IgE de humano marcado com peroxidase de rábano diluído 1:2500 (KPL, E.U.A.).

Submeteram-se soros a partir de pacientes alérgicos a gatos 7 do sexo feminino e 7 do sexo masculino com as idades de 22 a 75 anos a determinações CAP-FEIA. Os níveis medidos de IgE total variaram de 122 a >4000 kU/1 e os níveis de IgE específica de pelo de gato de 1,99 a >100 kUA/1 (Tabela 7). Em ensaios ELISA confirmou-se reatividade de IgE de todos os 14 soros testados em relação ao alergénio principal de gato Fel dl. Os resultados foram obtidos como densidades óticas (OD) e variaram de 0,178 a 2,838 unidades de OD. Mediu-se a reatividade de IgE dos 14 soros em relação a péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 no mesmo ensaio ELISA. Constatou-se que a ligação d IgE foi mantida para os Péptidos 1, 2, 3 e 5. Observou-se ligação de IgE em 6/14 soros para o Péptido 1, em 3/14 soros para o Péptido 2, em 1/14 soros para o Péptido 3 e em 10/14 soros para o Péptido 5. As unidades de OD medidas estavam entre 0,051 e 1,998 para o Péptido 1, entre 0,060 e 0,123 para o Péptido 2, 0,186 para o Péptido 3 e entre 0,056 e 0,677 para o Péptido 5. Em resumo, todas as unidades de OD medidas foram consideravelmente mais baixas do que os valores respetivos medidos para o alergénio Fel d 1 inteiro.

Isto demonstra que péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 têm uma reatividade de IgE reduzida em comparação com o alergénio Fel d 1 inteiro. Os péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 podem por isso ser considerados hipoalergénicos, proporcionando a vantagem de efeitos secundários mediados por IgE reduzidos, quando utilizados em SIT. 20.2. Indução especifica de expressão de marcadores de superfície CD203c e CD63 em basófilos de humano (Fig. 17)

Uma vez que a ligação de IgE é um pré-requisito mas não suficiente para indução de reações alérgicas do tipo 1 que também requerem ligação cruzada de IgE especifica ligada a célula efetora, investigou-se a atividade alergénica real de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 em ensaios de ativação de basófilos. Estes ensaios detetam uma regulação ascendente, específica de alergénio, de marcadores de superfície CD203c e CD63, ambos reconhecidos como marcadores para ativação de basófilos (Hauswirth et al. J. Allergy Clin. Immunol. (2002) 110 :102-109) .

Colheram-se amostras de sangue heparinizado a partir de 5 pacientes alérgicos a gato após ter sido dado consentimento informado. Alíquotas de sangue (100 μΐ) foram incubadas com diluições em série de rFel d 1, péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes individuais ou como mistura equimolar, anticorpo anti-IgE ou tampão (PBS) durante 15 minutos a 37°C. Após incubação, lavaram-se as células em PBS contendo EDTA 20 mM. Incubaram-se depois as células com 10 μΐ de mAb CD203c 97A6 conjugado com PE e 20 μΐ de mAb CD63 CLB-granl2 conjugado com FITC durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois, submeteram-se as amostras a lise de eritrócitos com 2 ml de solução de lise FACS™. Lavaram-se depois as células, ressuspenderam-se em PBS e analisaram-se por citometria de fluxo de duas cores num FACScan (Becton Dickinson, E.U.A.), utilizando o software Paint-a-Gate. A regulação ascendente de CD203c e CD63 foi calculada a partir das intensidades de fluorescência média (MFIs) obtidas com células estimuladas (MFIstim) e não estimuladas (MFIcontrol), e expressa como índice de estimulação (MFIstim : MFIcontrol). Uma SI de mais do que 2,0 (i.e. regulação ascendente de mais de 2 vezes) foi considerada indicativa de uma resposta de (diagnóstico) específica.

Em basófilos de todos os cinco pacientes alérgicos a gato (RR, EB, KC, MG e SM), a estimulação com rFel d 1 induziu uma regulação ascendente específica de alergénio dos marcadores de superfície CD203c e CD63. Observou-se que a regulação ascendente de CD203c e CD63 era dependente da dose para 4/5 pacientes (RR, KC, MG e SM). Para estes pacientes os índices de estimulação de CD203c variaram desde 1,1 (SM) até 3,2 (RR) para a concentração testada mais baixa de 0,001 pg de rFel d 1/ml e desde 3,6 (KC) até 6,2 (RR) para a concentração testada mais elevada de 10 pg de rFel d 1/ml. Os índices de estimulação de CD63 determinados do mesmo modo variaram desde 1,1 (RR) até 2,0 (MG) para a concentração de rFel d 1 mais baixa testada de 0,001 pg/ml e desde 3,9 (RR) até 7,3 (MG) para a concentração de rFel d 1 mais elevada testada de 10 pg/ml. Para o paciente EB 0,001 pg/ml de Fel d 1 já eram suficientes para induzir uma regulação ascendente de nivel elevado de marcadores de superfície CD203c e CD63 impedindo uma observação da dependência da dose da regulação ascendente do marcador de superfície.

Basófilos a partir de todos os cinco pacientes alérgicos a gato foram sondados com cinco concentrações crescentes (0,005, 0,05, 0,5, 5 e 50 pg/ml) de uma mistura equimolar dos cinco péptidos sintéticos derivados de Fel dl. Os basófilos do paciente RR foram adicionalmente sondados com cinco concentrações crescentes dos cinco péptidos sintéticos individuais derivados de Fel d 1 (0,001, 0,01, 0,1, 1 e 10 pg/ml). Constatou-se que os péptidos eram deficientes na regulação ascendente dos marcadores de superfície de basófilos CD203c e CD63. Os péptidos foram incapazes de induzir qualquer expressão aumentada de CD203c e CD63 sobre células dos pacientes RR, KC e SM. Uma ligeira regulação ascendente de CD203c (SI =2,3) e de CD63 (SI = 2,5) podia ser detetada para 0 paciente MG mas apenas para a concentração testada mais elevada de 50 pg de mistura de péptido/ml, enquanto as concentrações mais baixas aplicadas também não tinham qualquer efeito estimulante. Observou-se uma regulação ascendente mais pronunciada de CD203c (SI = 4,2) e CD63 (SI = 4,3) para o paciente EB mas, outra vez, apenas para a concentração de mistura de péptidos testada mais elevada. Em ambos os casos, pacientes MG e EB, a taxa de regulação ascendente após estimulação com péptidos era consideravelmente mais baixa do que os valores correspondentes para estimulação com o alergénio Fel d 1 inteiro.

Isto demonstra que péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 proporcionam a vantagem de manter uma atividade alergénica mais baixa do que o alergénio Fel d 1 inteiro. Isto é relevante para um risco diminuído de efeitos secundários mediados por IgE quando se utilizam péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 em SIT.

Exemplo 21: A imunização com péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 induz anticorpos IgG reativos com o alergénio rFel d 1 inteiro

Os péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 mostraram ser deficientes na ligação de IgE. Como moléculas candidatas para vacinação, que visam a indução de anticorpos IgG específicos de alergénio, os péptidos têm de manter estruturas específicas de alergénio e têm ainda de ser capazes de induzir uma resposta imunitária de IgG específica para o alergénio inteiro. De modo a investigar se péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 satisfaziam ou não estes requisitos, realizaram-se experiências de imunização em coelhos.

Imunizaram-se os coelhos com rFel d 1 não acoplado e péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 acoplados a KLH. Os péptidos purificados por HPLC foram acoplados a KLH através dos seus resíduos cisteína, utilizando um kit de conjugação de imunogénio ativado por maleimida Imject (Pierce, E.U.A.).

Coelhos (coelhos brancos da Nova Zelândia) foram imunizados com os imunogénios (200 pg/injeção) utilizando CFA (primeira imunização) e IFA (primeira injeção de reforço após 4 semanas; uma segunda injeção de reforço com adjuvante incompleto foi dada após 7 semanas) (Charles River Breeding Laboratories, Alemanha). Os coelhos foram sangrados 8 semanas após a primeira imunização e depois com intervalos de quatro semanas. A indução de anticorpos específicos de péptido e de rFel d 1 foi monitorizada em ensaios ELISA. Revestiram-se placas de ELISA (Nunc Maxisorb, Dinamarca) com rFel d 1 (0,5 pg/poço), lavaram-se e bloquearam-se. Depois sondou-se o rFel d 1 ligado à placa em duplicado com antissoro de coelho diluído 1:1000 e com o soro pré-imune de coelho correspondente, e detetou-se a IgG ligada com um antissoro de cabra anti-coelho marcado com peroxidase de rábano diluído 1:2000 (Jackson ImmunoResearch Inc., E.U.A.). Calcularam-se as médias dos duplicados e mostraram erros inferiores a 5%. A imunização com péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 induz anticorpos IgG reativos com Fel d 1. Oito semanas após a primeira imunização com cada um dos cinco péptidos sintéticos derivados de Fel d 1, podiam ser detetados anticorpos IgG reativos com o alergénio Fel d 1 inteiro em cada um dos cinco antissoros de coelho. Os niveis de anticorpo IgG permaneceram em niveis comparáveis nas sangrias subsequentes (Fig. 16).

Os antissoros de coelho anti-Péptido 1, anti-Péptido 2, anti-Péptido 4 e anti-Péptido 5 mostraram reatividades de IgG em relação a Fel d 1 para aproximadamente a mesma ordem de grandeza do que o antissoro de coelho anti-Fel d 1. Também o antissoro de coelho anti-Péptido 3 mostrou uma reatividade de IgG distinta mas um pouco mais baixa em relação a Fel d 1.

Isto indica que todos os 5 péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 são moléculas candidatas para induzir uma resposta de anticorpo IgG especifica de Fel d 1.

Exemplo 22: Péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 induzem respostas linfoproliferativas mais fracas do que Fel d 1

Moléculas candidatas desejadas para SIT melhorado oferecem a vantagem não apenas de efeitos secundários mediados por IgE reduzidos mas também de efeitos secundários mediados por células T reduzidos. Realizaram-se ensaios linfoproliferativos de modo a investigar as propriedades de ativação de células T de péptidos sintéticos derivados de Fel d 1.

Isolaram-se PBMC a partir de 7 pacientes alérgicos a gato por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll (Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). Cultivaram-se os PBMC (2 x 105) em triplicado em placas de 96 poços (Nunclone, Nalgene Nunc International, Dinamarca) em 200 μΐ meio de cultura Ultra isento de soro (Cambrex, Bélgica) suplementado com L-glutamina 2 mM (Sigma, E.U.A.), -mercaptoetanol 50 μΜ (Sigma) e 0,1 mg de gentamicina por ml (Sigma) a 37°C utilizando 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Estimularam-se as células com diferentes concentrações (5, 2,5, 1,25 e 0,6 pg/poço) de rFel die péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes individuais ou como uma mistura equimolar e, para efeitos de controlo, com 4 U de interleucina-2 ou com meio sozinho. Após 6 dias de cultura, adicionaram-se 0,5 pCi por poço de 3H-timidina (Amersham Pharmacia Biotech) e 16 h depois, mediu-se a radioatividade incorporada por contagem de cintilação de liquido utilizando um contador de cintilação Microbeta (Wallac ADL, Alemanha), e calcularam-se os cpm médios a partir dos triplicados. Calculou-se o índice de estimulação (SI) como o quociente dos cpm obtidos por estimulação com antigénio ou interleucina-2 e do meio de controlo não estimulado. A IL-2 estimulou a proliferação de PBMC a partir de todos os 7 pacientes alérgicos a gato testados, resultando em índices de estimulação de 9,8 para RR, 5,2 para EB, 3,2 para KC, 6,7 para MG, 6,3 para SM, 15,7 para RA e de 13,9 para AR. Péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 induziram índices de estimulação mais baixos (Tabela 9).

Tabela 9: Podem-se identificar péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 que numa base equimolar induzem respostas linfoproliferativas mais fracas do que Fel d 1. PBMC a partir de 7 pacientes alérgicos a gato foram estimulados com diluições em série de rFel d 1 ou péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 como componentes individuais. As respostas linfoproliferativas específicas são mostradas como índices de estimulação.

Exemplo 23: Anticorpos IgG induzidos por imunização com péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 inibem a ligação de IgE de pacientes alérgicos a gato ao alergénio Fel d 1 inteiro

Examinou-se a capacidade de Ig de coelho induzida por péptido para inibir a ligação de anticorpos IgE de pacientes alérgicos a rFel d 1 completo em ensaios ELISA de competição. Revestiram-se placas ELISA (Nunc Maxisorb, Dinamarca) com rFel d 1 (0,05 yg/poço), lavaram-se e bloquearam-se. 0 rFel d 1 ligado à placa foi depois pré-incubado com antissoros de coelho antipéptido diluídos 1:1000 (utilizaram-se antissoros antipéptido individuais bem como uma mistura de antissoros antipéptido), antissoro de coelho anti-rFel die, para efeitos de controlo, também com os soros pré-imunes de coelho respetivos. Após as placas terem sido lavadas, incubaram-se com soros de humanos diluídos 1:5 dos pacientes alérgicos a gato. Detetaram-se os anticorpos IgE ligados com um anticorpo anti-IgE de humano marcado com peroxidase de rábano diluído 1:2500 (KPL, E.U.A.). A percentagem de inibição da ligação de IgE conseguida por pré-incubação com os antissoros antipéptido foi calculada como se segue: % inibição da ligação de IgE = 100 - ODx/ODp x 100, sendo OD± a densidade ótica medida após pré-incubação com soro imune de coelho e ODp com soros pré-imunes de coelho. A pré-incubação de Fel d 1 ligado à placa de ELISA com os 5 antissoros de coelho antipéptido resultou em padrões de inibição que variaram entre os 14 soros testados diferentes de pacientes alérgicos a gato. 0 antissoro de coelho anti-Péptido 1 bloqueou a ligação de IgE dos pacientes a Fel d 1 para 13/14 soros de pacientes testados, o antissoro de coelho anti-Péptido 2 para 8/14, antissoro de coelho anti-Péptido 3 para 13/14, antissoro de coelho anti-Péptido 4 para 9/14 e antissoro de coelho anti-Péptido 5 para 5/14.

Também o intervalo de inibição mostrou variações entre os diferentes antissoros. Entre os antissoros de coelho antipéptido individuais testados, o antissoro de coelho anti-Péptido 1 mostrou as melhores taxas de inibição com inibições de 0-55% (média 29%). Com o antissoro de coelho anti-Péptido 2 conseguiram-se taxas de inibição de 0-18% (média 5%), com o antissoro de coelho anti-Péptido 3 de 0-29% (média 11%), com o antissoro de coelho anti-Péptido 4 de 0-24% (média 8%) e com o antissoro de coelho anti-Péptido 5 de 0-18% (média 4%).

Uma mistura de todos os 5 antissoros de coelho antipéptido inibiu a ligação de IgE dos pacientes a Fel d 1 muito eficientemente com inibições conseguidas para todos os soros de pacientes e taxas de inibição de 25-84% (média 59%). Estas inibições foram ainda mais pronunciados do que as conseguidas por pré-incubação com o antissoro de coelho anti-Fel d 1 (Tabela 10).

Tabela 10: Antissoros de coelho criados contra péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 inibem a ligação de IgE de humano a Fel dl. As percentagens de inibição da ligação de IgE a Fel d 1 conseguidas por pré-incubação de Fel d 1 com antissoros de coelho são apresentadas para 14 pacientes e como médias. As pré-incubações foram realizadas com 5 antissoros de coelho criados contra os 5 péptidos sintéticos derivados de Fel d 1 (anti-Péptido 1-5), uma mistura dos 5 antissoros antipéptido (Mistura) e um antissoro criado contra Fel d 1 (anti-rFel d 1).

Quando se combinou o antissoro de coelho anti-Péptido 1 com cada um dos outros antissoros antipéptido, a inibição da ligação de IgE de pacientes alérgicos foi substancialmente aumentada atingindo guase os valores (e.g. anti-Péptido 1+4: 41%, anti-Péptido 1+5: 42%) com anticorpos anti-rFel d 1 (67%) (Tabela 11).

Exemplo 24: Péptidos derivados de Bet v 1 induzem respostas de IgG específicas de Bet v 1 recebendo auxilio de células T a partir de epítopos de célula T derivados de transportador e reduzem a proliferação de células T específicas de Bet v 1. Já foi anteriormente mostrado que péptidos de célula B, expostos à superfície, derivados de Bet v 1 induzem uma resposta de IgG específica de Bet v 1 protetora num modelo de ratinho de vacinação terapêutica e profilática (Focke M. et al. Clin. Exp. Allergy (2004) 34:1525-15.33). Em Focke M. et al. (2004), 6 péptidos derivados de Bet v 1 foram acoplados à molécula transportadora KLH antes da imunização de ratinhos. No presente exemplo mostra-se que a resposta de IgG específica de Bet v 1 induzida com estes péptidos (Tabela 1) é acionada pelo auxílio de epítopos de célula T derivados a partir do transportador mas não a partir do alergénio Bet v 1. Surpreendentemente, constatou-se que nenhum dos péptidos derivados de Bet v 1 possuindo as sequências LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISF (SEQ ID No. 20), GPGTIKKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTN (SEQ ID No. 21) e VDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK (SEQ ID No. 22) induziu respostas relevantes de célula T, e pôde ser demonstrado que a maioria das respostas de célula T era dirigida contra a molécula transportadora, KLH (Figs. 18 e 19). Esta constatação é de grande importância para a redução de efeitos secundários durante a vacinação terapêutica e para redução do risco de uma sensibilização potencial durante a vacinação profilática. Foi demonstrado no passado que péptidos derivados de alergénio desprovidos de qualquer reatividade de IgE mas contendo epítopos de célula T derivados de alergénio induziam efeitos secundários devido à ativação de células T. Péptidos derivados de alergénio desprovidos de reatividade de IgE e de célula T, conforme exemplificado por péptidos Bet v 1, não induzem efeitos secundários mediados nem por IgE nem por células T durante a vacinação terapêutica. Quando utilizados para vacinação profilática, os péptidos induzirão uma resposta de IgG protetora especifica de Bet v 1 sem induzirem células T especificas de Bet v 1. Isto deverá minimizar o risco de pré-induzir uma resposta imunitária alérgica através da vacina o que poderia abrir caminho para uma sensibilização alérgica subsequente.

Neste exemplo, dissecaram-se as respostas de célula T especificas de alergénio e especificas de transportador num modelo de ratinho de vacinação terapêutica e profilática com alergénio. Selecionaram-se péptidos 2, 3 e 6 derivados de Bet v 1 (Focke M. et ai. (2004)) e testaram-se para determinar se continham ou não quaisquer epitopos de célula T específicos de Bet v 1 conhecidos em ratinhos BALB/c. Imunizaram-se os ratinhos como se segue (a Tabela 12 mostra o protocolo de sensibilização e tratamento): Grupos de ratinhos BALB/c (n = 5) foram imunizados com 10 pg de Bet v 1 recombinante (Biomay, Áustria) e/ou uma mistura dos péptidos sintéticos 2, 3 e 6 derivados de Bet v 1 (10 pg de cada) . Os péptidos foram acoplados a KLH como anteriormente descrito (Focke M. et al. (2004) ) . Para imunização, Bet v 1 e a mistura de péptidos foram adsorvidos a hidróxido de alumínio (Alu-Gel-S, Serva, Alemanha) num volume total de 150 pl/ratinho.

Analisou-se a linfoproliferação específica de alergénio, de péptido e de transportador num ensaio de proliferação de células T. Removeram-se os baços sob condições estéreis e homogeneizaram-se. Após lise dos eritrócitos, lavaram-se as células e ressuspenderam-se em meio completo (RPMI, soro fetal de vitelo a 10%, 0,1 mg/ml de gentamicina, glutamina 2 mM) . Plaquearam-se as suspensões de células individuais em placas de 96 poços de fundo redondo numa concentração de 2 x 105 células/poço e estimularam-se com concavalina A (0,5 pg/poço) como um controlo positivo, rBet v 1 (2 pg/poço) , KLH (2 pg/poço), a mistura de péptidos (0,34 pg de cada péptido/poço) ou o meio sozinho durante 4 dias. Pulsaram-se as culturas com 0,5 pCi/poço de timidina tritiada durante 16 h e colheram-se. Mediram-se as respostas de proliferação por contagem de cintilação. Calculou-se a razão da proliferação média após estimulação de antigénio e valores de controlo médios, i.e. o índice de estimulação (SI).

Interessantemente, foi mostrado que a vacinação terapêutica com péptidos derivados de Bet v 1 podia reduzir a proliferação específica de Bet v 1 em ratinhos sensibilizados com Bet v 1 (grupo S+/T+) em comparação com o grupo sensibilizado mas não tratado S+/T-. No grupo sensibilizado e tratado, nenhuma proliferação específica de péptido foi medida mas, de acordo com o efeito de transportador, observou-se um efeito de proliferação específico de KLH. A vacina de péptido sozinha (grupo S-/T+) induziu principalmente células T específicas de KLH, mas quase nenhuma resposta de células T específica de Bet v 1 (Figura 18). A vacinação profilática com os péptidos induziu quase nenhuma proliferação especifica de Bet v 1 (grupo P+/S-) em comparação com o grupo sensibilizado com Bet v 1 P-/S+ mas proliferação especifica de KLH. Em ratinhos vacinados profilaticamente e subsequentemente sensibilizados (grupo P+/S+), a proliferação especifica de Bet v 1 foi acentuadamente reduzida e, para além disso, não podia ser observada qualquer resposta especifica de péptido em qualquer grupo de ratinhos (Figura 19).

Assim, pôde ser mostrado num modelo de alergia de ratinho que a vacinação profilática com péptidos de célula B derivados de alergénio ligados a transportador não induziram células T especificas de péptido, quase nenhumas células T especificas de alergénio mas especificas de transportador. A vacinação profilática precedendo a sensibilização alérgica mas também a vacinação terapêutica de ratinhos sensibilizados reduz a proliferação de células T especificas de alergénio. 0 tratamento profilático com péptidos derivados de Bet v 1 induziu respostas de IgG especificas de Bet v 1 sem auxilio por células T especificas de Bet v 1. Para além disso, o tratamento profilático aumentou respostas de IgG especificas de Bet v 1 já induzidas pelo alergénio Bet v 1 20 e 40 dias após a primeira sensibilização (Figura 20).

Estes resultados demonstram que a vacina de péptido induz uma resposta de IgG especifica de Bet v 1 que pode ser reforçada por exposição a alergénio.

Exemplo 25: Péptidos derivados de Der p 2 mostrando capacidade de ligação de IgE reduzida A capacidade de ligação de IgE de péptidos derivados de Der p 2 foi determinada como descrito nos Exemplos 15.1 e 20.1 utilizando os péptidos de acordo com Tabela 13 e utilizando soros de indivíduos sofrendo de alergia a ácaro de poeira doméstica.

Os resultados mostram claramente que os péptidos derivados de Der p 2 do presente invento exibem capacidade de ligação de IgE significativamente reduzida.

Exemplo 26: Variações no comprimento de péptidos não têm qualquer efeito na capacidade de ligação de IgE, reatividade de célula T e Imunogenicidade dos péptidos. 26.1. Desenho de péptidos

Para estudar o efeito da variação do comprimento de péptidos na capacidade de ligação de IgE, reatividade de célula T e imunogenicidade, desenharam-se variantes de péptidos derivados de Phl p 5 aumentando o comprimento de péptido 1 (Pi) e diminuindo o comprimento de péptido 2 (P2) em alguns aminoácidos (Tabela 15).

Tabela 15: Posição, sequência, comprimento em número de aminoácidos e peso molecular de péptidos sintéticos derivados de Phl p 5 (1, 2) e suas variantes (la, 2b)

26.2. Ausência de reatividade de IgE

Para analisar a reatividade de IgE de péptidos 1, 2 derivados de Phl p 5 e suas variantes la, 2b, realizaram-se ensaios dot-blot aplicando 0,2 pg de péptido/dot e utilizando soros de 7 pacientes alérgicos a pólen de gramínea (pl-p7) e o soro de um indivíduo não atópico (NHS) . Detetou-se a IgE ligada com anticorpo anti-IgE de humano marcado com 125I (Phadia, Uppsala, Suécia). Usou-se rPhl p 5 como controlo positivo e HSA como controlo negativo. Os pacientes reagem com rPhl p 5 mas não com os péptidos e variantes de péptido (Fig. 21) . 26.3. Respostas linfoproliferativas PBMC a partir de 2 pacientes alérgicos a pólen de gramínea foram estimulados com diferentes concentrações de péptidos 1, 2 derivados de Phl p 5, suas variantes la, 2b e, para efeitos de controlo, com rPhl p 5. Os índices de estimulação obtidos com os péptidos eram significativamente mais baios do que os obtidos com rPhl p 5 (Fig. 22). 26.4. Imunogenicidade de variantes de péptido

Imunizaram-se coelhos com péptidos derivados de Phl p 5 e variantes acoplados a KLH. Utilizaram-se experiências de ELISA para medir a reatividade de IgG dos antissoros de coelho obtidos em relação a péptidos e suas variantes (Tabela 16). A imunização com péptidos e suas variantes induziu anticorpos IgG reativos de modo cruzado reconhecendo o péptido e a variante correspondente.

Tabela 16: Reatividade cruzada de antissoros antipéptido Phl p 5 criados em coelhos por imunização com péptidos conjugados com KLH. Mostram-se as reatividades de IgG de antissoros de péptido em relação a péptidos (1, 2) e variantes (la, 2b). Não se observou qualquer reatividade com soros pré-imunes (pre Pi, pre Pia, pre P2, pre P2b) a. Antissoro anti-Péptido 1 (anti Pi) reage de modo cruzado com variante de Péptido 1 (la) e antissoro anti-Péptido la (anti Pia) reage de modo cruzado com Péptido 1. b. Antissoro anti-Péptido 2 (anti P2) reage de modo cruzado com variante de Péptido 2 (2b) e antissoro anti-Péptido 2b (anti P2b) reage de modo cruzado com Péptido 2.

26.5. Antissoros de coelho induzidos por péptido inibem a ligação de IgE de pacientes alérgicos a pólen de graminea a rPhl p 5

Estudou-se a capacidade de IgG de coelho anti-Péptido 2 e 2b para inibir a ligação de IgE de humano a rPhl p 5 em ELISA de competição. rPhl p 5 ligado à placa de ELISA foi pré-incubado com anti P2, anti P2b e, para efeitos de controlo, com antissoros anti Phl p 5. Expuseram-se depois as placas a soros de 12 pacientes alérgicos a pólen de graminea. A percentagem de inibição de ligação de IgE a rPhl p 5 é apresentada na Tabela 17. Os antissoros anti-Péptido 2 e anti-Péptido 2b inibem a ligação de IgE de pacientes a rPhl p 5 na mesma extensão.

Realizaram-se também ELISA de competição com antissoros de coelho anti-Péptido 1 e la. No Exemplo 17 (A imunização com péptidos derivados de Phl p 5 induz anticorpos IgG que inibem a ligação de IgE de pacientes alérgicos a pólen de gramínea a Phl p 5) os anticorpos anti-Péptido 1 (Pi) inibiram a ligação de IgE de pacientes a Phl p 5 com uma taxa de inibição média de 28,5%. Obtiveram-se resultados similares com antissoro anti-Péptido la que deu uma taxa de inibição de 23,7%.

Tabela 17: Inibição da ligação de IgE de pacientes a rPhl p 5 por antissoros antipéptido. Antissoros anti-Péptido 2 e anti-Péptido 2b inibem a ligação de IgE de pacientes a rPhl p 5 na mesma extensão. rPhl p 5 ligado à placa de ELISA foi pré-incubado com anti P2, anti P2b e, para efeitos de controlo, com antissoros anti-Phl p 5. Expuseram-se depois as placas a soros de 12 pacientes alérgicos a pólen de graminea. Apresenta-se a percentagem de inibição da ligação de IgE a rPhl p 5.

Exemplo 27: Proteção cruzada de anticorpos anti-VPl

Os rinovirus de humano compreendem mais de cem estirpes diferentes. Neste teste de neutralização mostra-se que a infeção por rinovírus de uma estirpe pode também ser inibida por anticorpos específicos de VP1 de outra estirpe. Semearam-se células HeLa nos poços com igual densidade. HRV14 IOOTCD50 foi pré-incubado com diluições de anticorpos anti-14VPl e anti-89VP1 (não diluído; 1:2-1:32 poços 1-6) e adicionaram-se aos poços na pista A e D, respetivamente. Nas pistas B e C adicionaram-se às células HRV89 IOOTCD50 pré-incubado com diluições de anticorpos anti-14VPl e anti-89VPl, respetivamente. Após 3 dias as células vivas foram coradas de violeta. Os anticorpos anti-89VPl e os anticorpos anti-14VPl bloqueiam a infeção de HRV14 de um modo comparável. Os anticorpos criados contra 14VP1 e 89VP1 inibiram também a infeção de HRV89 até à mesma concentração.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Biomay AG <120> Transportador de vacina <130> R 49994 <150> AT A 994/2006 <151> 2006-06-09 <160> 142 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 50

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 1 50 cggaattcat taatatgaac ccagttgaaa attatataga tagtgtatta <210> 2 <211> 46 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 2 46 cgattaattc agtggtggtg gtggtggtgg acgtttgtaa cggtaa <210> 3 <211> 37

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 3 37 ctttaagaag gagatatact taagatgaac ccagttg <210> 4 <211> 37

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 4 37 caactgggtt catcttaagt atatctcctt cttaaag <210> 5 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 5 33 cctgatgttt ttaccggtac aaacgtccac cac <210> 6 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 6 33 gtggtggacg tttgtaccgg taaaaacatc agg <210> 7 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 7 34 cgcgcttaag atggtccgct acaccaccga gggc <210> 8 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 8 34 cgcgcttaag cttggactcg taggcggtgt cggc <210> 9 <211> 32

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phi p 5 <400> 9 cys Gly Ala Ala ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly Leu ser Gly Glu 1 S 10 15

Pro Lys Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr 5er Lys 20 25 30 <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phi p 5 <4 0 0> 10

Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 15 10 15

Tyr Thr pro Ala Thr Pro Ala Ala pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly 20 25 30

Lys cys <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 0 0> 11

Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala 15 10 15

Lys Tyr Asp Ala Tyr vai Ala Thr Leu Ser Glu Ala Leu Arg ile cys 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 0 0> 12

Cys Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala lie Lys Ala ser Thr Gly Gly Ala 15 10 15

Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe lie pro Ala Leu Glu Ala Ala Vai Lys 20 25 30 <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 Ο 0> 13

Thr val Ala Thr Ala pro Glu val Lys Tyr Thr val Phe Glu Thr Ala 15 10 15

Leu Lys Lys Ala He Thr Ala Met Ser Glu Ala Gin Lys Ala Ala Lys 20 25 30

Cys <210> 14 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phi p 5 <4 0 0> 14 cys Ala Glu Glu Val Lys Val lie pro Ala Gly Glu Leu Gin Val lie 15 10 15

Glu Lys val Asp Ala Ala Phe Lys val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala 20 25 30

Ala Pro Ala Asn Asp Lys 35 <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 1 <4 0 0> 15

Glu lie cys Pro Ala val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly 15 10 15

Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30

Val val Cys 35 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 1 <4 Ο 0> 16

Leu Glu Asti Ala Arg lie Leu Lys Asn cys val Asp Ala Lys Met Thr 1 5 10 15

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu 5er Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr 20 25 30 ser Pro Leu cys 35 <210> 17 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 1 <4 0 0> 17 val Lys Met Ala He Thr Cys pro lie Phe Tyr Asp Val phe Phe Ala 15 10 15

Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30

Asn Ala Cys 35 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 1 <4 0 0> 18

Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gin Asp Cys Tyr val 15 10 15

Glu Asn Gly Leu ile ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val cys 20 25 30 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 1 <4 0 0> 19 cys Met Thr Thr ile ser Ser ser Lys Asp cys Met Gly Glu Ala val 15 10 15

Gin Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Bet v 1 <400> 20

Leu Phe Pro Lys vai Ala Pro Gin Ala ile ser Ser Vai Glu Asn ile 15 10 15

Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr lie Lys Lys ile Ser Phe 20 25 30 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Bet v 1 <400> 21

Gly pro Gly Thr lie Lys Lys lie ser phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe 15 10 15

Lys Tyr Vai Lys Asp Arg Vai Asp Glu Vai Asp His Thr Asn 20 25 - 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Bet v 1 <400> 22 vai Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr ser vai ile Glu Gly Gly 15 10 15

Pro lie Gly Asp Thr Leu Glu Lys lie Ser Asn Glu lie Lys 20 25 30 <210> 23 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 1 <400> 23

Ala pro Leu Glu ser Arg Gin Asp Thr Ala ser cys Pro vai Thr Thr 1 5 10 15

Glu Gly Asp Tyr Vai Trp Lys lie Ser Glu Phe Tyr Gly Arg Lys pro 20 25 30

Glu Gly Thr Tyr Tyr Asn Ser Leu 35 40 <210> 24 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 1 <400> 24

Gly Phe Asn lie Lys Ala Thr Asn Gly Gly Thr Leu Asp Phe Thr cys 15 10 15 ser Ala Gin Ala Asp Lys Leu Glu Asp His Lys ~rrp Tyr ser cys Gly 20 25 30

Glu Asn Ser phe Met 35 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 1 <400> 25

Glu Asn Ser phe Met Asp Phe ser Phe Asp Ser Asp Arg ser Gly Leu 15 10 15

Leu Leu Lys Gin Lys Vai ser Asp Asp lie Thr Tyr Vai Ala 20 25 30 <210> 26 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 1 <400> 26

Thr Ala Thr Leu Pro Asn Tyr cys Arg Ala Gly Gly Asn Gly pro Lys 1 5 . 10 15

Asp Phe Vai Cys Gin Gly Vai Ala Asp Ala Tyr lie Thr Leu Vai Thr 20 25 30

Leu pro Lj/s ser ser <210> 27 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 2 <4Ο0> 27

Met His Ser ser Asn Asn Phe phe Lys Asp Asn lie Phe Arg Ser Leu 15 10 15

Ser Lys Glu Asp Pro Asp Tyr Ser Arg Asn lie Glu Gly Gin Vai lie 20 25 30

Arg Leu His Trp Asp Trp Ala Gin 35 40 <210> 28 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 2 <400> 28

Leu Leu Met Leu Ser Ala Lys Arg Met Lys vai Ala phe Lys Leu Asp 15 10 15 lie Glu Lys Asp Gin Arg Vai Trp Asp Arg Cys Thr Ala Asp Asp Leu 20 25 30

Lys Gly Arg Asn Gly Phe Lys Arg 35 40 <210> 29 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 2 <400> 29

Cys Leu Gin Phe Thr Leu Tyr Arg Pro Arg Asp Leu Leu Ser Leu Leu 15 10 15

Asn Glu Ala Phe Phe Ser Ala Phe Arg Glu Asn Arg Glu Thr lie Tie 20 25 30

Asn Thr Asp Leu Glu Tyr Ala Ala 35 40 <210> 30 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 2 <4Ο0> 30

Lys Ser lie Ser Met Ala Arg Leu Glu Asp Leu Trp Lys Glu Tyr Gin 15 10 15

Lys Xle Phe pro ser lie Gin val lie Thr Ser Ala Phe Arg Ser lie 20 25 30

Glu Pro Glu Leu Thr Val Tyr Thr 35 40 <210> 31 <211> 30

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 2 <400> 31

Cys Leu Lys Lys lie Glu Ala ser Phe Glu Leu lie Glu Glu Asn Gly 1 5 10 15

Asp pro Lys lie Thr ser Glu ile Gln Leu Leu Lys Ala Ser 20 25 30 <210> 32 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 32

Ret Thr lie Thr Lys lie His Ala Arg ser val Tyr Asp Ser Arg Gly 15 10 15

Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Ile Val Thr Glu Thr Gly Leu His Arg 20 25 30

Ala Ile <210> 33 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 33

Val Thr Glu Thr Gly Leu His Arg Ala lie Val Pro ser Gly Ala ser 15 10 15

Thr Gly Ser His Glu Ala Cys Glu Leu Arg Asp Gly Asp Lys Ser Lys 20 25 30

Trp Gly Gly Lys Gly val Thr Lys 35 40 <210> 34 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 34

Ala Pro Ala Leu lie Lys Glu Lys Leu Asp vai Lys Asp Gin Ser Ala 15 10 15

Vai Asp Ala Phe Leu Asn Lys Leu Asp Gly Thr rhr Asn Lys Thr Asn 20 25 30

Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Vai Ser 35 40 <210> 35 <211> 41

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 35

Glu Lys Gly Vai Pro Leu Tyr Ala His Ile ser Asp Leu Ala Gly Thr 1 5 10 15

Lys Lys Pro Tyr Vai Leu Pro Vai pro Phe Gin Asn Vai Leu Asn Gly 20 25 30

Gly ser His Ala Gly Gly Arg Leu Ala 35 40 <210> 36 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 36 cys Glu Ala pro Thr Phe Ser Glu Ala Met Arg Gin Gly Ala Glu vai 15 10 15

Tyr Gin Lys Leu Lys Ala Leu Ala Lys Lys Thr Tyr Gly Gin Ser Ala 20 25 30

Gly Asn vai Gly Asp Glu Gly Gly 35 40 <210> 37 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 37 lie tys lie Ala Met Asp vai Ala Ser Ser Glu Phe xyr Lys Ala Asp 15 10 15

Glu Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ser 20 25 30

Lys Trp Leu Thr Tyr Glu Gin Leu 35 40 <210> 38 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 38 vai ser He Glu Asp Pro phe Ala Glu Asp Asp Trp Glu Ala Trp ser 15 10 15

Tyr phe Phe Lys Thr Tyr Asp Gly Gin lie Vai Gly Asp Asp Leu Thr 20 25 30

Vai Thr Asn Pro Glu Phe lie Lys 35 40 <210> 39 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <400> 39

Ala Lys Asp Ala Phe Gly Ala Gly Trp Gly vai Met vai ser His Arg 15 10 15

Ser Gly Glu Thr Glu Asp Vai Thr lie Ala Asp ile vai Vai Gly Leu 20 25 30

Arg ser Gly Gin lie Lys Thr Gly 35 40 <210> 40 <211> 38

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Alt a 6 <4Ο0> 40

Ala Pro Ala Arg 5er Glu Arg Leu Ala Lys Leu Asn Gin lie Leu Arg 15 10 15

He Glu Glu Glu Leu Gly Asp Asn Ala Val Tyr Ala Gly Asn Asn Phe 20 25 30

Arg Thr Ala Val Asn Leu 35 <210> 41 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 41

Glu lie Leu pro Val Asn Glu Thr Arg Arg Leu Thr Thr Ser Gly Ala 15 10 15

Tyr Asn lie lie Asp Gly cys Trp Arg Gly Lys Ala Asp Trp Ala Glu 20 25 30

Asn Arg Lys Ala Leu Ala Asp Cys 35 40 <210> 42 <211> 41

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 42

Gly Gly Lys Asp Gly Asp lie Tyr Thr val Thr ser Glu Leu Asp Asp 15 10 15

Asp Val Ala Asn Pro Lys Glu Gly Thr Leu Arg phe Gly Ala Ala Gin 20 25 30

Asn Arg Pro Leu Trp lie lie Phe Glu 35 40 <210> 43 <211> 31

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 43 lie Arg Leu Asp Lys Glu Met val Val Asn ser Asp Lys Thr ile Asp 15 10 15

Gly Arg Gly Ala Lys val Glu lie Ile Asn Ala Gly Phe Thr Leu 20 25 30 <210> 44 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 44

Asn vai lie lie His Asn lie Asn Met His Asp Vai Lys Vai αξπ Pro 15 10 15

Gly Gly Leu lie Lys Ser Asn Asp Gly Pro Ala Ala Pro Arg Ala Gly 20 25 30

Ser Asp Gly Asp Ala lie Ser lie Ser 35 40 <210> 45 <211> 39

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 45

Gly Thr Thr Arg Leu Thr vai ser Asn Ser Leu Phe Thr Gin His Gin 15 10 15

Phe vai Leu Leu Phe Gly Ala Gly Asp Glu Asn lie Glu Asp Arg Gly 20 25 30

Met Leu Ala Thr Vai Ala Phe 35 <210> 46 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 46

Asn Thr Phe Thr Asp Asn vai Asp Gin Arg Met pro Arg cys Arg His 15 10 15

Gly Phe Phe Gin vai vai Asn Asn Asn Tyr Asp Lys Trp Gly ser Tyr 20 25 30

Ala lie Gly Gly Ser 35 <210> 47 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 47

Ile Leu Ser Girt Gly Asn Arg phe Cys Ala Pro Asp Glu Arg Ser Lys 15 10 15

Lys Asn vai Leu Gly Arg His Gly Glu Ala Ala Ala Glu Ser Met Lys Z0 25 30

Trp Asn Trp Arg Thr Asn Lys Asp Vai Leu Glu Asn Gly Ala 35 40 45 <210> 48 <211> 41

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Amb a 1 <400> 48

Gly Vai Asp pro vai Leu Thr Pro Glu Gin Ser Ala Gly Met lie Pro 15 10 15

Ala Glu Pro Gly Glu Ser Ala Leu Ser Leu Thr Ser ser Ala Gly Vai 20 25 30

Leu ser Cys Gin Pro Gly Ala Pro cys 35 40 <210> 49 <211> 44

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Art v 1 <400> 49 ser Lys Leu cys Glu Lys Thr ser Lys Thr Tyr ser Gly Lys Cys Asp 15 10 15

Asn Lys Lys cys Asp Lys Lys cys lie Glu Trp Glu Lys Ala Gin His 20 25 30

Gly Ala Cys His Lys Arg Glu Ala Gly Lys Glu Ser 35 40 <210> 50 <211> 31

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Art v 1 <4Ο0> 50

Ser Cys Phe cys Tyr Phe Asp cys Ser i_ys ser pro Pro Gly Ala Thr 1 5 10 15 pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala pro Pro Pro Ala Ala Gly Gly ser 20 25 30 <210> 51 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Art v 1 <400> 51

Ala pro pro Pro Ala Ala Gly Gly ser Pro Ser Pro Pro Ala Asp Gly 15 10 15

Gly ser Pro Pro Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Val Asp Gly 20 25 30

Gly ser Pro pro Pro Pro ser Thr His 35 40 <210> 52 <211> 38

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 1 <400> 52

Gin Asp Thr Pro Ala Leu Gly Lys Asp Thr Val Ala Val Ser Gly Lys 15 10 15

Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Ala Asp Gin Glu Val Pro Glu Lys Pro 20 25 30

Asp Ser Val Thr Pro Met 35 <210> 53 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 1 <400> 53

Asp ser Val Thr Pro Met lie Leu Lys Ala Gltl Lys Gly Gly Asn Leu 15 10 15

Glu Ala Lys lie Thr Met Leu Thr Asn Gly Gin Cys Gin Asn lie Thr 20 25 30

Val val Leu His Lys Thr ser Glu 35 40 <210> 54 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 1 <400> 54 cys Gin Asn lie Thr Vai Vai Leu His Lys Thr Ser Glu Pro Gly Lys 15 10 15

Tyr Thr Ala Tyr Glu Gly Gin Arg Vai Vai Phe He Gin Pro Ser Pro 20 25 30

Vai Arg Asp His Tyr lie Leu Tyr Cys 35 40 <210> 55 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 1 <400> 55

Gin Pro Ser pro Vai Arg Asp His Tyr Ile Leu Tyr Cys Glu Gly Glu 15 10 15

Leu His Gly Arg Gin lie Arg Met Ala Lys Leu Leu Gly Arg Asp Pro 20 25 30

Glu Gin Ser Gin Glu Ala Leu Glu 35 40 <210> 56 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 1 <400> 56

Arg Asp Pro Glu Gin ser Gin Glu Ala Leu Glu Asp Phe Arg Glu Phe 15 10 15 ser Arg Ala Lys Gly Leu Asn Gin Glu ile Leu Glu Leu Ala Gin ser 20 25 30

Glu Thr Cys Ser Pro Gly Gly Gin 35 40 <210> 57 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 2 <400> 57

Gin Glu Gly Asn His Glu Glu pro Gin Gly Gly teu Glu Glu Leu Ser 1 5 10 15

Gly Arg Trp His Ser Vai Ala Leu Ala ser Asn Lys ser Asp Leu lie 20 25 30

Lys pro Trp Gly His Phe Arg vai 35 40 <210> 58 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 2 <400> 58

Pro Trp Gly His Phe Arg Vai Phe ile His Ser Met ser Ala Lys Asp 15 10 15

Gly Asn Leu His Gly Asp lie Leu lie pro Gin Asp Gly Gin Cys Glu 20 25 30

Lys Vai Ser Leu Thr Ala Phe Lys 35 40 <210> 59 <211> 38

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 2 <400> 59 cys Glu Lys vai Ser Leu Thr Ala Phe Lys Thr Ala Thr ser Asn Lys 15 10 15

Phe Asp Leu Glu Tyr Trp Gly His Asn Asp Leu Tyr Leu Ala Glu Vai 20 25 30

Asp pro l^s Ser-Tyr Leu <210> 60 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 2 <4Ο0> 60

Asn Asp Leu Tyr Leu Ala Glu vai Asp Pro Lys ser Tyr Leu ile Leu 1 5 10 15

Tyr Met He Asn Gin Tyr Asn Asp Asp Thr ser Leu vai Ala His Leu 20 25 30

Met Vai Arg Asp Leu ser Arg 35 <210> 61 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Can f 2 <400> 61

Vai Arg Asp Leu Ser Arg Gin Gin Asp Phe Leu Pro Ala Phe Glu Ser 15 10 15

Vai Cys Glu Asp lie Gly Leu His Lys Asp Gin lie Vai Vai Leu Ser 20 25 30

Asp Asp Asp Arg Cys Gin Gly ser Arg Asp 35 40 <210> 62 <211> 34

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 62

Glu Ala His Gin Ser Glu lie Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15

Glu His Phe Arg Gly Leu Vai Leu Vai Ala Phe Ser Gin Tyr Leu Gin 20 25 30

Gin Cys <210> 63 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 63

Cys Thr Vai Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys 15 10 15

Cys gIu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin His Lys 20 25 30

Asp Asp Asn 35 <210> 64 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 64

Asn Glu Gin Arg phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg 15 10 15

Hi5 Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu 20 25 30 <210> 65 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 65

cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr ile cys Glu Asn-Gln 1 5 -10 IS

Asp ser lie Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro vai 20 25 30 <210> 66 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 6 6

Val Glu Asp Lys Glu Vai Cys Lys Asn Tyr Gin Glu Ala Lys Asp vai 15 10 15

Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr ser Arg Arg His pro 20 25 30 <210> 67 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <4Ο0> 67

Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys cys Cys Ala Thr Asp 15 10 15

Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala His Val phe Asp Glu Phe Lys 20 25 30 <210> 68 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 68

Glu Lys Gln lie Lys Lys Gin Ser Ala Leu val Glu Leu Leu Lys His 15 10 15

Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gin Leu Lys Thr Val Met Gly 20 25 30 <210> 69 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 6 9

Val Asp Lys cys Cys Ala Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Glu 15 10 15

Glu Gly pro Lys Leu val Ala Ala Ala Gin Ala Ala Leu Ala 20 25 30 <210> 70 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 70

Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu val Asn Glu Val Thr Glu phe 15 10 15

Ala Lys Gly Cys Val Ala Asp Gin Ser Ala Ala Asn Cys Glu Lys ser 20 ' 25 30

Leu His Glu Leu Leu Gly Asp Lys Leu cys 35 40 <210> 71 <211> 41

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 71

Cys phe Leu Gin His Lys Asp Asp aso Pro Gly Phe Gly Gin Leu Vai 1 5 .10 15

Thr pro Glu Ala Asp Ala Met cys Thr Ala phe His Glu Asn Glu Gin 20 25 30

Arg Phe Leu Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu 35 40 <210> 72 <211> 42

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 72

Glu Glu Tyr Lys Gly Vai Phe Thr Glu Cys cys Glu Ala Ala Asp Lys 15 10 15

Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Vai Asp Ala Leu Arg Glu Lys Vai Leu 20 25 30

Ala ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys 35 40 <210> 73 <211> 38

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 73 cys Ala ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp ser 15 10 15

Vai Ala Arg Leu Ser Gin Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu lie 20 25 30 ser Lys Leu vai Thr Asp 35 <210> 74 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <4Ο0> 74

Phe Ala Glu lie Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys lie His Lys 15 10 15

Glu cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp 20 25 30

Leu Ala Lys Tyr lie cys 35 <210> 75 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 75

Cys Gly Lys Pro val Leu Glu Lys ser His cys ile ser Glu val Glu 1 5 10 15

Arg Asp Glu Leu Pro Ala Asp Leu Pro Pro Leu Ala Val Asp Phe Val 20 25 30

Glu Asp Lys Glu val cys 35 <210> 76 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 76

Cys g1u Leu phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gin Asn Ala Leu 15 10 15

Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu 20 25 30 val Glu val ser Arg ser Leu Gly Lys val 35 40 <210> 77 <211> 39

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <4Ο0> 77

Cys Thr His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu 15 10 15

Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val 20 25 30 ser Glu Arg val Thr Lys cys 35 <210> 78 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Fel d 2 <400> 78

Cys Thr Glu ser Leu val Asn Arg Arg Pro cys phe Ser Ala Leu Gin 15 10 15

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe ser Ala Glu Thr Phe Thr 20 25 30

Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu 35 40 <210> 79 <211> 40

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Ole e 1 <400> 79

Glu Asp lie pro Gin Pro Pro val Ser Gin phe hís lie Gin Gly Gln‘ 15 10 15

Val Tyr Cys Asp Thr cys Arg Ala Gly Phe lie Thr Glu Leu Ser Glu 20 25 30

Phe lie Pro Gly Ala ser Leu Arg 35 40 <210> 80 <211> 31

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Ole e 1 <400> 80

Gly Ala Ser Leu Arg Leu Gin Cys Lys Asp Lys Glu Asn Gly Asp val 15 10 15

Thr Phe Thr Glu Val Gly Tyr Thr Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Ser 20 25. 30 <210> 81 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Ole e 1 <400> 81

Gly Leu Tyr ser Met Leu vai Glu Arg Asp His Lys Asn Glu phe cys 1 5 10 15

Glu lie Thr Leu lie Ser Ser Gly Arg Lys Asp Cys Asn Glu lie Pro 20 25 30

Thr Glu Gly Trp Ala 35 <210> 82 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Ole e 1 <400> 82

Gly Arg Lys Asp cys Asn Glu He Pro Thr Glu Gly Trp Ala Lys pro 1 5 10 15

Ser Leu Lys Phe Lys Leu Asn Thr Vai Asn Gly Thr Thr Arg Thr vai 20 25 30

Asn Pro Leu 35 <210> 83 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Ole e 1 <400> 83

Leu Asn Thr vai Asn Gly Thr Thr Arg Thr Vai Asn Pro Leu Gly Phe 1 5 10 15

Phe Lys Lys Glu Ala Leu Pro Lys Cys Ala Gin vai Tyr Asn Lys Leu 20 25 30

Gly Met Tyr Pro Pro Asn Met 35 <210> 84 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Par j 2 <400> 84

Gly Glu Glu Ala cys Gly Lys vai Vai Gin Asp lie Met pro cys Leu 15 10 15

His Phe Val Lys Gly Glu Glu Lys Glu Pro Ser Lys Glu Cys 20 25 30 <210> 85 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Par j 2 <400> 85 cys Leu His Pile Val Lys Gly Glu Glu Lys Glu pro ser Lys Glu cys 15 10 15 cys Ser Gly Thr Lys Lys Leu ser Glu Glu val Lys Thr Thr Glu Gin 20 25 30

Lys Arg Glu Ala 35 <210> 86 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Par j 2 <400> 86 cys cys ser Gly Thr Lys Lys Leu Ser Glu Glu val Lys Thr Thr Glu 15 10 15

Gin Lys Arg Glu Ala Cys Lys cys lie val Arg Ala Thr Lys Gly lie 20 25 30

Ser Gly lie Lys Asn 35 <210> 87 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Par j 2 <4Ο0> 87

Glu Leu Vai Ala Glu vai Pro lvs lvs Cys Asp lie Lys Ttir Thr Leu 15 10 15

Pro Pro lie Thr Ala Asp Phe Asp Cys Ser Lys lie Gin Ser Thr lie 20 25 30

Phe Arg Gly Tyr Tyr 35 <210> 88 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 88

Thr Asn Ala cys ser lie Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu lie Asp Leu 1 5 10 15

Arg Gin Met Arg Thr Vai Thr Pro lie Arg Met Gin Gly Gly 20 25 30 <210> 89 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 89

Asn Gin ser teu Asp teu Ala Glu Gin Glu Leu vai Asp cys Ala ser 15 10 15

Gin His Gly cys His Gly Asp Thr lie pro Arg Gly lie Glu Tyr ile 20 25 30

Gin <210> 90 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 90

His Asn Gly Vai Vai Gin Glu ser Tyr Tyr Arg Tyr vai Ala Arg Glu 1 5 10 15

Gin Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly Ile ser Asn 20 25 30 <210> 91 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 91

Arg Glu Gin ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gin Arg Phe Gly lie Ser 15 10 15

Asn Tyr Cys Gin lie Tyr Pro pro Asn Vai Asn Lys Ile Arg Glu Ala 20 25 30

Leu Ala Gin Thr His 35 <210> 92 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 92

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile ile Gin 15 10 15

Arg Asp Asn Gly Tyr Gin Pro Asn Tyr His Ala vai Asn ile vai 20 25 30 <210> 93 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 93

Gly Arg Thr lie lie Gin Arg Asp Asn Gly Tyr Gin- pro Asn Tyr His 15 10 15

Ala vai Asn ile vai Gly Tyr ser Asn Ala Gin Gly vai Asp ryr Trp 20 25 30

Ile <210> 94 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <4Ο0> 94

Vai Gly Tyr Ser Asn Ala Gin Gly vai Asp Tyr Trp ile vai Arg Asn 15 10 15 ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala 20 25 30

Asn lie <210> 95 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 1 <400> 95 vai Arg Asn ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr 15 10 15

Phe Ala Ala Asn Tie Asp Leu Met Met lie Glu Glu Tyr Pro Tyr Vai 20 25 30

Vai lie Leu 35 <210> 96 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 2 <400> 9 6

Asp Gin Vai Asp Vai Lys Asp cys Ala Asn His Glu lie Lys Lys vai 15 10 15

Leu Vai Pro Gly Cys His Gly Ser Glu pro Cys lie lie His Arg Gly 20 25 30

Lys <210> 97 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 2 <400> 97

Cys His Gly ser Glu pro cys lie rle His Arg Gly Lys Pro phe Gin 15 10 15

Leu Glu Ala Vai Phe Glu Ala Asn Gin Asn Ser Lys Thr Ala Lys 20 25 30 <210> 98 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 2 <400> 98

Glu Ala Asn Gin Asn ser Lys Thr Ala Lys ile Glu ile Lys Ala ser 1 5 10 15 lie Glu Gly Leu Glu Vai Asp Vai Pro Gly lie Asp pro Asn Ala Cys 20 25 30 <210> 99 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 2 <400> 99

Glu val Asp vai pro Gly lie Asp Pro Asn Ala cys Hi5 Tyr Met Lys 1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gin Gin Tyr Asp lie Lys Tyr Thr Trp lie 20 25 30 val pro Lys lie Ala pro Lys ser Glu Asn 35 40 <210> 100 <211> 32

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 2 <4 0 0> 100

Ala Pro Lys Ser Glu Asn val val Val Thr Val Lys Val Met Gly Asp 15 10 15

Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala lie Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp 20 25 30 <210> 101 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 5 <4 Ο 0> 101

Met Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gin Asn Glu phe Asp Phe Leu Leu 15 10 15

Met Glu Arp lie His Glu Gin XIe Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe 20 25 30

Tyr Leu Gin 35 <210> 102 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 5 <4 0 0> 102

Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu phe Tyr Leu Gin Glu Gin lie Asn His 15 10 15

Phe Glu Glu Lys Pro Thr Lys Glu Met Lys Asp Lys Ile Vai Ala Glu 20 25 30

Met Asp Thr lie 35 <210> 103 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 5 <4 0 0> 103

Asp Gly Vai Arg Gly vai Leu Asp Arg Leu Met Gin Arg Lys Asp Leu 15 10 15

Asp lie Phe Glu Gin Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly 20 25 30 <210> 104 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 5 <4 0 0> 104

Asp Leu Asp lie Phe Glu Gin Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys ser 15 10 15

Gly Asp ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg vai Lys 20 25 30

Lys Ile Glu Vai 35 <210> 105 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 7 <4 0 0> 105

Asp pro lie Hi5 Tyr Asp Lys ile Thr Glu Glu ile Asn Lys Ala vai 15 10 15

Asp Glu Ala val Ala Ala lie Glu Lys ser Glu Thr Phe Asp 20 25 30 <210> 106 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 7 <4 0 0> 106

Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr phe Asp pro Met Lys Val pro 15 10 15

Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His ile Gly Ile ile Asp Leu 20 25 30 <210> 107 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 7 <4 0 0> 107

Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn ile Gin Val Arg Gly Leu Lys 15 10 15

Gin Met Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys Ser Glu Asp Gly 20 25 30 <210> 108 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 7 <4 Ο 0> 108 val His Asp Asp Val val Ser Met gIu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu 15 10 15

Gly Asp Leu His Pro Asn Thr His val lie Ser Asp lie Gin Asp Phe 20· 25 30

Val Val Glu Leu 35 <210> 109 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 7 <4 0 0> 109

Leu ser Leu Glu val ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr ser Phe 1 5 10 15

Glu Val Arg Gin Pbe Ala Asn Val Val Asn His Xle Gly Gly Leu 20 25 30 <210> 110 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 7 <4 0 0> 110

Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala lie Phe Gin Asp Thr val Arg Ala Glu 15 10 15

Met Thr Lys Val Leu Ala Pro Ala Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn 20 25 30

Asn Gin <210> 111 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <400> 111

Met Glu Ala lie Lys Lys Lys Met Gin Ala Met Lys Leu Glu Lys Asp 1-5 10 15

Asn Ala lie Asp Arg Ala Glu lie Ala Glu Gin Lys Ala Arg Asp Ala 20 25 30

Asn Leu Arg 35 <210> 112 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 0 0> 112

Ala Glu Lys Ser Glu Glu Glu vai Arg Ala Leu Gin Lys Lys lie Gin 15 10 15

Gin lie Glu Asn Glu Leu Asp Gin Vai Gin Glu Gin Leu Ser Ala Ala 20 25 30

Asn Thr Lys 35 <210> 113 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 0 0> 113

Leu Glu Glu Lys Glu Lys Ala Leu Gin Thr Ala Glu Gly Asp vai Ala 15 10 15

Ala Leu Asn Arg Arg lie Gin Leu IIe Glu Glu Asp Leu Glu Arg Ser 20 25 30

Glu Glu Arg Leu Lys lie Ala Thr 35 40 <210> 114 <211> 35

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 Ο 0> 114

Ala Lys Leu Glu Glu Ala ser Gin Ser Ala Asp Glu ser Glu Arg Met 15 10 15

Arg Lys Met Leu Glu His Arg Ser lie Thr Asp Glu Glu Arg Met Glu 20 25 30

Gly Leu Glu 35 <210> 115 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 0 0> 115

Arg Met Glu Gly Leu Glu Asn Gin Leu Lys Glu Ala Arg Met Met Ala 1 5 10 15

Glu Asp Ala Asp Arg Lys Tyr Asp Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala 20 25 30 <210> 116 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 0 0> 116

Asp Leu Glu Arg Ala Glu Glu Arg Ala Glu Tfir Gly Glu ser Lys ile 15 10 15

Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys 20 25 30 <210> 117 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 0 0> 117 ser Glu Glu Lys Ala Gin Gin Arg Glu Glu Ala His Glu Gin Gin lie 1 5 10 15

Arg lie Met Thr Thr Lys Leu Lys Glu Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe 20 25 30

Ala Glu Arg ser Val Gin Lys Leu Gin 35 40 <210> 118 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 10 <4 0 0> 118

Gin Lys Glu Vai Asp Arg Leu gIu Asp Glu Leu Vai His Glu Lys Glu 15 10 15

Lys Tyr Lys Ser Ile Ser Asp Glu Leu Asp Gin Thr Phe Ala Glu Leu 20 25 30

Thr Gly Tyr 35 <210> 119 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 21 <4 0 0> 119

Met Phe lie Vai Gly Asp Lys Lys Glu Asp Glu Trp Arg Met Ala Phe 1 5 10 .15

Asp Arg Leu Met Met Glu Glu Leu Glu Thr Lys Ile Asp Gin Vai Glu 20 25 30

Lys Gly Leu 35 <210> 120 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 21 <4 0 0> 120

Leu His Leu ser Glu Gin Tyr Lys Glu Leu Glu Lys Thr Lys Ser Lys 1 5 10 15

Glu Leu Lys Glu Gin lie Leu Arq Glu Leu Thr ile Gly Glu Asn Phe 20 25 30

Met Lys Gly Ala Leu 35 <210> 121 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 21 <4 0 0> 121

Gly Ala Leu Lys Phe Phe Glu Met Glu Ala Lys Arg Thr Asp Leu Asn 1 5 10 15

Met Phe Glu Arg Tyr Asn Tyr Glu phe Ala Leu Glu Ser lie Lys 20 25 30 <210> 122 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Der p 21 <4 0 0> 122

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu ser lie Lys Leu Leu lie Lys Lys 15 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Vai Lys Ala Vai Asn Pro Asp Glu Tyr 20 25 30

Tyr <210> 123 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Clone 30 <4 0 0> 123

Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp pro Thr Thr· Thr Vai His pro Thr 15 10 15

Thr Thr Glu Gin Pro Asp Asp Lys Phe Glu cys pro ser Arg Phe Gly 20 25 30 <210> 124 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Clone 30 <4 0 0> 124 pro Thr Thr Thr Glu Gin pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro ser Arg 15 10 15

Phe Gly Tyr Phe Ala Asp pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr ile cys 20 25 30

Ser Asn <210> 125 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Clone 30 <4 0 0> 125

Gly Tyr Phe Ala Asp pro uys Asp pro his Lys Phe Tyr lie cys Ser 15 10 15

Asn Trp Glu Ala val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn 20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr cys Thr 35 <210> 126 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Bet v 1 <4 0 0> 126

Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro Gin Ala lie Ser Ser val Glu Asn ile 15 10 15

Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Thr lie Lys Lys lie ser Phe 20 25 30 <210> 127 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Bet v 1 <4 0 0> 127

Gly Pro Gly Thr lie Lys Lys lie ser Phe pro Glu Gly Phe pro Phe 1 5 10 15

Lys Tyr Val Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn 20 25 30 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Bet v 1 <4 Ο 0> 128

Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr ser Val lie Glu Gly Gly 15 10 15

Pro lie Gly Asp Ttir leu Glu Lys He ser Asn Glu lie Lys 20 25 30 <210> 129 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de cadeia 1 de Fel d 1 <4 0 0> 129

Glu lie Cys pro Ala Val Lys Arg Asp val Asp Leu Phe Leu Thr Gly 1 5 10 15

Thr Pro Asp Glu Tyr val Glu Gin Val Ala Gin Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30 val val cys 35 <210> 130 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de cadeia 1 de Fel d 1 <4 0 0> 130

Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn cys Val Asp Ala Lys Met Thr 15 10 15

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys He Tyr Thr 20 25 30

Ser Pro Leu Cys 35 <210> 131 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de cadeia 2 de Fel d 1 <4 Ο 0> 131

Val Lys Met Ala lie Thr cys pro lie phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala 15 10 15

Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val 20 25 30

Asn Ala cys 35 <210> 132 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de cadeia 2 de Fel d 1 <4 0 0> 132

Thr Glú Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gin Asp cys Tyr Val 1 5 10 15

Glu Asn Gly Leu ile Ser Arg val Leu Asp Gly Leu Val Cys 20 25 30 <210> 133 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de cadeia 2 de Fel d 1 <4 0 0> 133

Cys Met Thr Thr lie ser Ser ser Lys Asp cys Met Gly Glu Ala val 1 5 10 15

Gin Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 20 25 30 <210> 134 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 0 0> 134

Cys Gly Ala Ala ser Asn Lys Ala Phe Ala Glu Gly Leu ser Gly Glu 1 5 10 15

Pro Lys Gly Ala Ala Glu 5er Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr ser Lys 20 25 30 <210> 135 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phi p 5 <4 0 0> 135

Ala Asp Leu Qly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 15 10 15

Tyr Thr Pro Ala Thr pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala pro Ala Gly 20 25 30

Lys cys <210> 136 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 0 0> 136

Ala Tyr Lys Leu Ala Tyr Lys Thr Ala Glu Gly Ala Thr Pro Glu Ala 15 10 15

Lys Tyr Asp Ala Tyr vai Ala Thr Leu 5er Glu Ala Leu Arg lie Cys 20 25 30 <210> 137 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 0 0> 137

Cys Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala ser Thr Gly Gly Ala 1 5 10 15

Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe lie Pro Ala Leu Glu Ala Ala Vai Lys 20 25 30 <210> 138 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phl p 5 <4 Ο 0> 138

Thr val Ala Thr Ala Pro Glu val l_ys Tyr Thr val Phe Glu Thr Ala 1 5 10 15

Leu Lys Lys Ala lie Thr Ala Met ser Glu Ala Gin Lys Ala Ala Lys 20 25 30

Cys <210> 139 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Molécula hiperalergénica derivada de Phi p 5 <4 0 0> 139

Cys Ala Glu Glu val Lys Val lie Pro Ala Gly Glu Leu Gin val lie 15 10 15

Glu Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala 20 25 30

Ala Pro Ala Asn Asp Lys 35 <210> 140 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Alergénio de Dermatophagoides pteronyssinus Clone 30 <4 0 0> 140

Met Ala Asn aso Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr val His pro Thr 1 5 10 15

Thr Thr Glu Gin pro Asp Asp Lys Phe Glu cys pro Ser Arg phe Gly 20 25 30

Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp pro His Lys Phe Tyr lie cys Ser Asn 35 40 45

Trp Glu Ala Val His Lys Asp cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu 50 55 60

Asp Glu Glu Thr Cys Thr 65 70 <210> 141 <211> 37

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido derivado de Phl p 5 <4 Ο 0> 141

Cys Phe Val Ala Thr phe Gly Ala Ala ser Asn Lys Ala phe Ala Glu 15 10 15

Gly Leu Ser Gly Glu pro Lys Gly Ala Ala Glu ser Ser ser Lys Ala 20 25 30

Ala Leu Thr ser Lys 35 <210> 142 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido derivado de Phi p 5 <4 0 0> 142

Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala pro Ala Ala Gly 15 10 15

Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Cys 20 25

Lisboa, 2015-06-18

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína hipoalergénica para utilização no tratamento ou prevenção de uma alergia num humano ou animal consistindo de pelo menos uma molécula hipoalergénica derivada de um alergénio, que está fundida com pelo menos uma segunda proteína não alergénica, onde a pelo menos uma molécula hipoalergénica derivada de um alergénio exibe uma capacidade de ligação de IgE pelo menos 50% reduzida e uma reatividade de célula T pelo menos 30% reduzida em comparação com o alergénio do tipo selvagem e onde a pelo menos uma segunda proteína é uma proteína virai.
2. 2. Proteína hipoalergénica para utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a proteína virai ser uma proteína de capsídeo.
3. 3. Proteína hipoalergénica para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a pelo menos uma proteína virai ser derivada de um vírus patogénico de humano, preferivelmente um vírus da família de picornaviridae.
4. 4. Proteína hipoalergénica para utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o vírus da família de picornaviridae ser género rinovírus, preferivelmente da espécie rinovírus de humano, em particular rinovírus de humano 89 ou 14.
5. 5. Proteína hipoalergénica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por o alergénio ser selecionado entre o grupo consistindo de alergénios principais de pólen de bétula, em particular Bet v 1 e Bet v 4, alergénios principais de pólen de timóteo, em particular Phi p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6 e Phl p 7, alergénios principais de ácaro de poeira doméstica, em particular Der p 1, Der p 2, Der p 5, Der p 7, Der p 10, Der p 21 e clone 30, alergénios principais de gato Fel die Fel d 2, alergénios principais de abelha, alergénios principais de vespa, profilinas, especialmente Phl p 12, alergénios de oliveira, especialmente Ole e 1, alergénios de Parietaria judaica, especialmente Par j 2, alergénios de tasneira, especialmente Amb a 1, alergénios de pólen de artemísia, especialmente Art v 1, alergénios de ácaro de armazenamento, especialmente Lep d 2, Alt a 1, Alt a 2, Alt a 6, Can f 1, Can f 2.
6. 6. Proteína hipoalergénica para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a pelo menos uma molécula hipoalergénica derivada de um alergénio ser um fragmento de alergénio composto dos aminoácidos 151 a 177, 87 a 117, 1 a 30, 43 a 70 ou 212 a 241 de Phl p 1, aminoácidos 93 a 128, 98 a 128, 26 a 53, 26 a 58, 132 a 162, 217 a 246, 252 a 283 ou 176 a 212 de Phl p 5, aminoácidos 1 a 34 ou 35 a 70 da cadeia 1 de Fel d 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 63 ou 64 a 92 da cadeia 2 de Fel d 1, aminoácidos 30 a 59, 50 a 79 ou 75 a 104 de Bet v 1, aminoácidos 1 a 33, 21 a 51, 42 a 73, 62 a 103 ou 98 a 129 de Der p 2, aminoácidos 1 a 30, 20 a 50, 50 a 80, 90 a 125, 125 a 155 ou 165 a 198 de Der p 7, aminoácidos 1-35, 36-70, 71-110, 111- 145, 140-170, 175-205, 210-250 ou 250-284 de Der p 10, aminoácidos 1 a 35, 35 a 72, 70 a 100 ou 90 a 122 de Der p 21, aminoácidos 1 a 32, 15 a 48 ou 32 a 70 de Clone 30, aminoácidos 19 a 58, 59 a 95, 91 a 120 ou 121 a 157 de Alt a 1, aminoácidos 31 a 60, 45 a 80, 60 a 96 ou 97 a 133 de Par j 2, aminoácidos 1 a 40, 36 a 66, 63 a 99, 86 a 120 ou 107 a 145 de Ole e 1, aminoácidos 25 a 58, 99 a 133, 154 a 183, 277 a 307, 334 a 363, 373 a 402, 544 a 573, 579 a 608, 58 a 99, 125 a 165, 183 a 224, 224 a 261, 252 a 289, 303 a 340, 416 a 457, 460 a 500 ou 501 a 542 de Fel d 2, aminoácidos 19 a 58, 52 a 91, 82 a 119, 106 a 144 ou 139 a 180 de Can f 2, aminoácidos 19 a 56, 51 a 90, 78 a 118, 106 a 145 ou 135-174 de Can f 1, aminoácidos 27 a 70, 70 a 100 ou 92 a 132 de Art v 1, aminoácidos 31 a 70, 80 a 120, 125 a 155, 160 a 200, 225 a 263, 264 a 300 305 a 350 ou 356 a 396 de Amb a 1, aminoácidos 1 a 34, 35 a 74, 74 a 115, 125 a 165, 174 a 213, 241 a 280, 294 a 333, 361 a 400 ou 401 a 438 de Alt a 6, aminoácidos 1 a 40, 41 a 80, 81 a 120, ou 121 a 160 de Alt a 2.
7. 7. Proteína hipoalergénica para a utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a proteína hipoalergénica ser administrada a um indivíduo na quantidade de 0,01 mg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferivelmente 0,1 mg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal. Lisboa, 2015-06-18