ES2209563B1 - Produccion en la levadurapipchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias. - Google Patents
Produccion en la levadurapipchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias.Info
- Publication number
- ES2209563B1 ES2209563B1 ES200001919A ES200001919A ES2209563B1 ES 2209563 B1 ES2209563 B1 ES 2209563B1 ES 200001919 A ES200001919 A ES 200001919A ES 200001919 A ES200001919 A ES 200001919A ES 2209563 B1 ES2209563 B1 ES 2209563B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- seq
- ole
- recombinant
- polypeptides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 230000007815 allergy Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title claims description 24
- 241000795633 Olea <sea slug> Species 0.000 title description 2
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 claims abstract description 47
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000735235 Ligustrum vulgare Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 claims description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 claims 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims 2
- 102100028169 BET1-like protein Human genes 0.000 claims 1
- 101710138653 BET1-like protein Proteins 0.000 claims 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 241001104043 Syringa Species 0.000 abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 241000270728 Alligator Species 0.000 abstract description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 229940046536 tree pollen allergenic extract Drugs 0.000 description 5
- 241000735234 Ligustrum Species 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000207834 Oleaceae Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 102000006392 myotrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010058605 myotrophin Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Producción en la levadura Pichia pastoris y sistema de purificación del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias. Se ha clonado y expresado el DNA recombinante que codifica los alergenos Ole e 1 de polen de olivo (Olea europaea), Syr v 1 de polen de lila (Syringa vulgaris) y Lig v 1 de polen de aligustre (Ligustrum vulgare). Estos alergenos poseen una gran similitud estructural entre ellos y con otros alergenos de polen de otras Oleaceas. Las proteínas recombinantes producidas en la levadura (Pichia pastoris) se aíslan con gran rendimiento, están correctamente plegadas y exhiben propiedades inmunológicas equivalentes a las de los alergenos naturales por lo que pueden ser empleadas en protocolos de diagnosis e inmunoterapia.
Description
Producción en la levadura Pichia pastoris
y sistema de purificación del alergeno recombinante de Olea
europaea Ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de
alergias.
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a uno de los
alergenos del polen de olivo (Olea europaea), la proteína
Ole e 1, y a epítopos alergénicos presentes en la proteína. La
invención también hace referencia a los DNA recombinantes que
codifican tanto a las proteínas completas como a fragmentos que
incluyen uno o más epítopos de la molécula, y a moléculas homólogas
de Ole e 1 con capacidad alergénica en otras especies, como Lig v 1
de polen de aligustre (Ligustrum vulgare) y Syr v 1 de polen
de lila (Syrínga vulgaris) El objeto de la invención
consiste, además, en la producción de las proteínas Ole e 1, Syr v
1 y Lig v 1 mediante tecnología recombinante en la levadura
Pichia pastoris, que implica el uso de las secuencias
nucleotídicas SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8 o de otras secuencias
nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de las secuencias SEQ ID
NO:1,2,3,4,5,6,7,8.
La invención proporciona un eficaz método de
aislamiento para estas proteínas con un alto rendimiento.
La alergia tipo I es una enfermedad que afecta a
más del 20% de la población de los países industrializados. Esta
afección es ocasionada por los alergenos, presentes tanto en
organismos y productos biológicos -alimentos, ácaros, venenos de
insectos, pólenes, hongos, epitelios de mamíferos-, como en
materiales de síntesis. En la mayor parte de las fuentes biológicas
alergénicas, los alergenos son proteínas de masas moleculares
comprendidas entre 5 y 70 kDa. Los síntomas que se derivan de la
alergia, tales como rinitis, conjuntivitis, o asma, son provocados
por la liberación de mediadores celulares, como la histamina,
desde basófilos y mastocitos, células del sistema inmune. Dicha
liberación viene inducida por el entrecruzamiento de anticuerpos
IgEs unidos a los receptores de alta afinidad FcCRI, los cuales se
encuentran a su vez anclados a basófilos y mastocitos. El
entrecruzamiento de las IgE es provocado por la unión del
correspondiente alergeno, o un fragmento suyo, a través de un
epítopo IgE (contenido en dicho alergeno, o en su fragmento). La
terapia que actualmente se viene utilizando para tratar la alergia
implica la hiposensibilización del paciente mediante la
administración por vía parental u oral de dosis adecuadas del
propio alergeno, o alergoides relacionados. En la práctica
totalidad de los casos se administra un extracto alergénico
obtenido, mediante una mínima manipulación, de la fuente biológica
natural, lo que implica a una mezcla muy compleja de proteínas y
otras sustancias, en la cual, el alergeno -o alergenos- puede
representar una parte ínfima del producto total utilizado.
En efecto, en la actualidad, los protocolos
utilizados para la diagnosis de casos de alergia y su posterior
inmunoterapia implican el uso de extractos alergénicos que
frecuentemente no están caracterizados, ni siquiera estandarizados
respecto a los alergenos más importantes que pueden contener. A
menudo, su administración no proporciona una diagnosis completa,
sobre todo cuando la hipersensibilidad del paciente se refiere a
alergenos presentes en baja concentración en dichos extractos. Por
otro lado, la inmunoterapia realizada con estas preparaciones es
frecuentemente ineficaz y origina en ocasiones efectos secundarios
indeseables que pueden llegar a ser más graves que la propia
afección alérgica que se pretende resolver. Una alternativa a la
utilización de estos extractos es la preparación de mezclas de los
alergenos más significativos, obtenidos por aislamiento de su
fuente natural. Sin embargo, esta vía presenta dos importantes
barreras. Por un lado, implica un buen conocimiento de los
componentes alergénicos del material que provoca la alergia, al
menos de todos sus alergenos principales, y este dato,
frecuentemente, no esta disponible. Por otro lado, el proceso de
aislamiento de los alergenos conocidos, a partir del material
biológico, es a menudo difícil y no proporciona las cantidades
necesarias o la calidad requerida para un posterior empleo, debido
fundamentalmente a los bajos niveles en los cuales se encuentra.
Todos estos problemas se acentúan cuando el material alergénico es
el polen de una especie vegetal. La gran cantidad de pigmentos,
carbohidratos, lípidos y componentes insolubles hacen muy difícil
su manipulación. Ni que decir tiene que su disponibilidad es,
además, muy reducida y de alto coste económico, debido a la
dificultad de su recolección. Por todo lo expuesto, se hace
necesario el diseño de procedimientos para la producción de
alergenos a utilizar en los protocolos de diagnosis e inmunoterapia
de la alergia. La producción de DNA recombinante se prevé como la
forma más reproducible y eficaz de obtención de polipéptidos
alergénicos bien definidos, no sólo para uso clínico, sino incluso
para investigación.
La polinosis a olivo es una de las más
importantes causas de alergia en países del área mediterránea,
donde la aceituna es intensamente cultivada. En la actualidad, se
conocen varios alergenos del polen de olivo, siendo Ole e 1 el que
muestra una mayor incidencia entre los pacientes alérgicos a olivo
ya que afecta a más del 70% de éstos. Ole e 1 es una glicoproteína
constituida por 145 aminoácidos -que corresponde a 16.:3 kDa- y
una fracción de carbohidrato de 1.5 kDa [Villalba, M, et al.Eur. J.
Biochem. 216, 863-869 (1993)]. El DNA que codifica
a Ole e 1 ha sido clonado, secuenciado y expresado en E.
coli, por los inventores [Villalba, M.,et al. J. Biol. Chem.
269, 15217-15222, 1994], habiéndose determinado que
se presenta en el polen con un alto grado de polimorfismo. Así
mismo, se han caracterizado las propiedades antigénicas de la
fracción glicosídica [Batanero, E., et al.J. Allergy Clin. Immunol.
97, 1264-71, 1996; Batanero, E., et al. J. Allergy
Clin. Immunol. 103, 147-53, 1999], y su
localización tisular [Martín-Orozco, E.,et al. Int.
Arch. Allergy Immunol. 104, 160-170, 1994]. Por
otro lado, Las proteínas homólogas de Ole e 1 en polen de aligustre
(Ligustrum vulgare), Lig v 1, y en polen de lila (Syringa
vulgaris), Syr v 1, se han aislado de su fuente natural, y han
originado una reacción alergénica cruzada con Ole e 1, frente a los
sueros de pacientes alérgicos al polen de olivo. El cDNA específico
que codifica estas proteínas ha sido clonado, secuenciado, y
expresado en E. coli [Batanero E.,et al Clin. Exp. Allergy
26, 1401-1410, 1996; Batanero E., et al. Eur. J.
Biochem. 221, 187-193, 1994].
La presente invención se refiere a la producción
en la levadura Pichia pastoris y purificación del alergeno
recombinante de Olea europaea Ole e 1.
Por medio del procedimiento, objeto de la
invención, se obtienen moléculas de DNA recombinante que codifican
polipéptidos que exhiben la antigenicidad de Ole e 1, un alergeno
de olivo (Olea europaea) y de otras plantas (lila y
aligustre) que poseen alergenos homólogos de Ole e 1, así como para
polipéptidos que contengan al menos un epítopo de Ole e 1 en su
estructura. La invención dispone de secuencias polinucleotídicas de
DNA que hibriden en condiciones restrictivas con las descritas
antes -lo que implica un nivel de identidad de al menos un 60%
entre sus secuencias de nucleotidos-, o bien sean derivadas de
ellas por degeneración del código genético o mutagénesis.
El procedimiento de obtención del alergeno
recombinante de ``lea europea Ole e 1'', incluye vectores de
expresión y células huésped que contengan una secuencia de
nucleotidos como las descritas en SEQ N°1,2,3,4,5,6,7, codificantes
de Ole e 1, proteínas homólogas o fragmentos suyos.
Mediante el procedimiento objeto de esta
invención se obtienen polipéptidos que poseen la actividad
antigénica del alergeno Ole e 1 de olivo o de fragmentos suyos, así
como de alergenos homólogos de Ole e 1 -principalmente en especies
relacionadas con el olivo, como son todas las Oleaceae- que,
dada la similitud estructural, al menos un 60%, presenten
reactividad alergénica cruzada con Ole e 1 o con una parte de
él.
Estos polipéptidos pueden contener la secuencia
antigénica unida a otros polipéptidos (por ejemplo como proteínas
de fusión), o haber sido modificados química o enzimáticamente.
Los métodos de preparación de estos polipéptidos
implican su producción recombinante a partir de las moléculas
polinucleotídicas arriba mencionadas, en un sistema de cultivo de
células eucarióticas que contienen como vehículo de esos DNA los
vectores de expresión descritos. Una vez producida la molécula
polipeptídica con actividad antigénica de Ole e 1 o epítopos suyos,
ésta es aislada del medio extracelular del cultivo en forma soluble
mediante cromatografías de penetrabilidad e intercambio fónico,
según se describe detalladamente más adelante.
Los productos obtenidos mediante el procedimiento
objeto de la invención presentan la capacidad de unión de
anticuerpos IgE del suero de pacientes alérgicos a olivo, sensibles
a Ole e 1 o segmentos antigénicos suyos.
Hasta la fecha, no se ha descrito la preparación
del alergeno Ole e 1, con un rendimiento comparable al que se
ofrece con esta invención. La obtención de proteína de su fuente
natural proporciona rendimientos insuficientes y una estructura
altamente polimórfica. Por otro lado, la expresión en E.
coli del alergeno Ole e 1 [Villalba, M., et al. J. Biol. Chem.
269, 15217-15222, 1994; Asturias, J.A., et al. J.
Allergy Clin. Immunol. 100, 365-372, 1997], produce
cantidades escasísimas de proteína y en condiciones de muy baja
solubilidad debido, fundamentalmente, a un incorrecto plegamiento
durante la síntesis proteica, con lo que su uso posterior se hace
prácticamente imposible. Con el procedimiento descrito en esta
invención se producen niveles de proteína de un orden de magnitud
superior: decenas de miligramos de proteína (alrededor de 60) por
litro de cultivo.
Finalmente, con el procedimiento objeto de la
invención, se dispondrá de Ole e 1 -un alergeno del polen de olivo
de suma importancia clínica- inmunológicamente activo, además de
fragmentos antigénicos de este alergeno, y de proteínas homólogas
de él, que servirán para ser incorporados en las pruebas ``in
vivo'' e ``in vitro'' a realizar para la fiel diagnosis
de la hipersensibilidad a este polen, y a otros pólenes
relacionados filogenéticamente con él. También podrán ser empleados
en las preparaciones de alergenos que se utilicen para llevar a
cabo la inmunoterapia correspondiente para el tratamiento de la
alergia al polen de olivo.
Para el diagnóstico y la terapia de la alergia al
polen de olivo se utilizan actualmente extractos proteicos
obtenidos a partir del polen. Esto implica una escasa
reproducibilidad y un alto contenido en moléculas contaminantes, de
origen proteico y no proteico, que pueden originar efectos
secundarios adversos en los pacientes tratados. El disponer de
moléculas homogéneas obtenidas por las técnicas del DNA
recombinante, en cantidades ilimitadas, perfectamente
cuantificables y estandarizadas, rebajará considerablemente todos
los inconvenientes citados. Esta tecnología permite disponer de
esas moléculas y además de péptidos o formas modificadas de las
mismas que contienen al menos uno de los epítopos alergénicos.
El uso de Ole e 1 recombinante en diagnóstico
in vivo, mediante pruebas cutáneas, o in vitro,
mediante técnicas de inmunodetección (ELISA, RAST), permitirá
precisar qué alergenos son los responsables de la sintomatología
clínica de un individuo y reducir así el número de moléculas
necesarias para su inmunoterapia. Se originará, por tanto, una
inmunoterapia personalizada.
En el procedimiento de obtención de alergeno
recombinante de ``Olea europea'' Ole e 1, se utilizaron los
alergenos Ole e 1, Syr v 1 y Lig v 1 purificados a partir de polen
de olivo (Olea europaea)(Villalba, M., et al. Eur. J.
Biochem.216, 863-869, 1993), de lila (Syringa
vulgaris) (Batanero E.,et al. J. Biochem.221,
187-193, 1994) y de aligustre (Ligustrum
vulgare)(Batanero E.,et al. Clin. Exp. Allergy 26,
1401-1410, 1996). Los pólenes fueron suministrados
por la casa comercial Allergon AB. El conocimiento de la secuencia
de aminoácidos de la zona amino y carboxilo terminal de Ole e 1
permitió el diseño de los oligonucleótidos con los que se abordó su
clonación por PCR y expresión.
El procedimiento objeto de esta invención se
realiza mediante las siguientes fases:
Con este propósito se aisló el RNA total a partir
del polen de olivo siguiendo el protocolo publicado por Ullrich A,
et al. (Science 196, 1313-1318, 1977). En este
aislamiento se partió de 0.5 g de polen que se homogeneizó en un
tampón 0.1 M de Tris-HC1, pH 7.5 que contenía
tiocianato de guanidinio 4M y laurilsarcosinato sódico al 0.5% y
2-mercaptoetanol 0.14 M mediante un homogeneizador
Polytron. Se centrifugó esta suspensión a 5000 xg a 20°C en una
centrífuga Sorvall. Posteriormente se sometió al sobrenadante a una
centrifugación en gradiente de CsCl 5.7 M en 0.01 M EDTA a 40.000
rpm en un rotor SW 60 (Beckman) durante 12 horas. El mismo
procedimiento se llevó a cabo para aislar otros RNAs de diferentes
pólenes usados (maíz y abedul) y con los diferentes tejidos del
olivo empleados (tallo, hojas y frutos). Con estos últimos se
introdujo una etapa inicial adicional en la que fueron macerados en
presencia de nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y
homogéneo. A partir de 5 \mug de RNA total se llevó a cabo la
síntesis del DNA de doble cadena utilizando el ``kit'' de síntesis
de cDNA (Clontech).
Como ya se ha mencionado anteriormente, los
cebadores utilizados fueron diseñados teniendo en cuenta la
secuencia de la proteína obtenida por degradación de Edman. El
método utilizado se basó en una reacción de PCR en dos etapas. En
la primera de ellas, el cDNA específico de Ole e 1 que se ha usado
como molde y los cebadores degenerados, OL1, 5'
CARTTYCAYATZCARGGNCARGT3' y OL2, 5' ATCATTRTTNGGNGGRTACATNCC3',
correspondientes a la secuencia amino y carboxilo terminal de la
proteína, respectivamente, fueron disueltos en una mezcla de PCR
estándar (250µM de dNTPs, tampón estándar y 50 pmoles de los
cebadores). Después de una primera etapa de desnaturalización a
95°C durante 15 min, se llevaron a cabo 30 ciclos que incluían cada
uno de ellos una etapa de desnaturalización a 94°C durante 1 min,
hibridación a 42ºC durante 1 min 30 s y extensión a 72ºC durante 2
min en presencia de Taq DNA polimerasa (U.S.Biochemical
Corp.). Después de cortar la banda de 408 pb, ésta fue nuevamente
amplificada usando 5 ciclos de desnaturalización a 94°C (60s),
hibridación a 47°C (60s) y extensión a 72°C (90s) y 20 ciclos de
desnaturalización a 94°C (60s), hibridación 55°C (90 s) y extensión
72°C (90s). Después, y para terminar este ciclo de amplificación,
se incuban las muestras a 72°C durante 10 minutos. Los
oligonucleótidos utilizados en esta reacción fueron OL3
5'CCGGGATCCGAARGAYGTNCCNCA 3' y OL4 5'CGGAATTCTCACATGTTGGGCGGGTA 3'
El fragmento fue purificado usando el Magic PCR Prep kit (Promega),
fosforilado con la T4 polinucleotido quinasa (U.S.Biochemical
Corp.) e insertado en el sitio de restricción SmaI de un
plásmido pUC18 previamente digerido y desfosforilado. Con esta
construcción pUC18/Oleel, se transformaron células competentes
DH5\alphaF' y se seleccionaron los recombinantes y se llevó a
cabo la secuenciación de algunos de los clones seleccionados,
obteniéndose las secuencias dadas en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ
ID NO 3.
Siguiendo la misma estrategia se llevó a cabo el
clonaje del DNA que codifica las proteínas homólogas a Ole e 1, y
también alergénicas, en otros miembros de la familia de las
Oleaceas, como Syr v 1 de Syringa vulgaris y Lyg v 1 de
Lygustrum vulgare. Se secuenciaron tres clones de Syr v 1
(secuencias dadas en SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6) y dos
clones de Lyg v 1 (secuencias SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8). Las
secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por los
clones correspondientes al DNA específico de Ole e 1 son SEQ ID NO
9, SEQ ID NO 10 y SEQ ID NO 11, los correspondientes a Syr v 1, SEQ
ID NO 12, SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14 y los correspondientes a Lig
v 1, SEQ ID NO 15 y SEQ ID NO 16.
Para la producción de las formas recombinantes de
estas proteínas, la secuencia codificante de DNA fue ligada al
plásmido de expresión pPIC9 (Invitrogen Corp.). Las células
utilizadas fueron de la cepa GS115 de Pichia pastoris. La
inducción se llevó a cabo por metanol al 0.5% durante cuatro días,
creciendo las células a 30°C. Las células se sedimentaron
centrifugando a 5000 xg y los sobrenadantes se recogieron y una
muestra de los mismos se aplicó en un gel de poliacrilamida al 15%
en presencia de SDS. Una banda de 20.5 kDa, única, fue detectada
mediante tinción de los geles con Azul de Coomassie. La proteína es
reconocida por el anticuerpo policlonal específico de Ole e 1
natural (dilución 1:5000), por varios anticuerpos monoclonales y
por sueros de pacientes alérgicos a Ole e 1. La purificación de las
proteínas se llevó a cabo mediante dos etapas, una cromatografía de
intercambio fónico en DEAE-celulosa y una de
filtración en gel en Sephadex G-75, obteniéndose
tras esta. última el alergeno recombinante a una concentración de
15 a 35 mg/ml y con un grado de pureza del 99%. Se llevaron a cabo
con ellas estudios de caracterización estructural (espectros de
dicroismo en el UV próximo y lejano y de fluorescencia) e
inmunológica (con sueros individuales de pacientes alérgicos y con
9 anticuerpos monoclonales)y en todos los casos las
proteínas recombinantes se comportaron de manera equivalente a la
del alergeno natural.
Estos ejemplos son sólo ilustrativos y no
establecen los límites en cuanto a condiciones, eficacia o
aplicaciones de la invención que se definen en las correspondientes
reivindicaciones.
<110> Rodríguez, Rosalía; Villalba, Mayte;
Monsalve, Rafael Ignacio Batanero, Eva
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Producción en la levadura Pichia
pastoris y purificación de: alergeno recombinante de Olea
europaea Ole e 1 para uso el diagnosis y tratamiento de
alergias.
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Olea europaea
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Villalba, M., Batanero, E., Monsalve,
R.I., González de la Peña, M.A., Lahoz, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Cloning and expression of Ole e I,
the major allergen from olive tree pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 15217-15222
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-05-27
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76395
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-11-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Olea europaea
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Villalba, M., Batanero, E., Monsalve,
R.I., González de la Peña, M.A., Lahoz, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Cloning and expression of Ole e I,
the major allergen from olive tree pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 15217-15222
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-05-27
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76397
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-11-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Olea europaea
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Villalba, M., Batanero, E., Monsalve,
R.I., González de la Peña, M.A., Lahoz, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Cloning and expression of Ole e I,
the major allergen from olive tree pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 15217-15222
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-05-27
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76396
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-11-26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Syringa vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., Villalba, M.,
López-Otín, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation and characterization of an
olive allergen-like protein from lilac pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> European journal of Biochemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 187-193
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-01-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76541
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-12-02
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Syringa vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., Villalba, M.,
López-Otín, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation and characterization of an
olive allergen-like protein from lilac pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> European journal of Biochemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 187-193
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-01-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76539
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-12-02
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Syringa vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., Villalba, M.,
López-Otín, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation and characterization of an
olive allergen-like protein from lilac pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> European journal of Biochemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 187-193
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-01-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76540
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-12-02
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ligustrum vulgare
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., González de la Peña,
M.A., Villalba, M., Monsalve, R.I., Martín-Esteban,
M., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation, cDNA cloning and
expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Clinical and Experimental Allergy
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 1401-1410
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1996-06-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X77787
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1994-02-22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ligustrum vulgare
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(435)
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., González de la Peña,
M.A., Villalba, M., Monsalve, R.I., Martín-Esteban,
M., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation, cDNA cloning and
expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Clinical and Experimental Allergy
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 1401-1410
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1996-06-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X77788
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1994-02-22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Olea europaea
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Villalba, M., Batanero, E., Monsalve,
R.I., González de la Peña, M.A., Lahoz, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Cloning and expression of Ole e I,
the major allergen from olive tree pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 15217-15222
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-05-27
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76395
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-11-26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Olea europaea
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Villalba, M., Batanero, E., Monsalve,
R.I., González de la Peña, M.A., Lahoz, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Cloning and expression of Ole e I,
the majar allergen from olive tree
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskippallen
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 15217-15222
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-05-27
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76397
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-11-26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Olea europaea
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Villalba, M., Batanero, E., Monsalve,
R.I., González de la Peña, M.A., Lahoz, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Cloning and expression of Ole e I,
the major allergen from olive tree pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 15217-15222
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-05-27
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76396
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-11-26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Syringa vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., Villalba, M.,
López-Otín, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation and characterization of an
olive allergen-like protein from lilac pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> European journal of Biochemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 187-193
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-01-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76541
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-12-02
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Syringa vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., Villalba, M.,
López-Otín, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation and characterization of an
olive allergen-like protein from lilac pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> European journal of Biochemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 187-193
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1994-01=24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76539
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-12-02
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Syringa vulgaris
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., Villalba, M.,
López-Otín, C., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation and characterization of an
olive allergen-like protein from lilac pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> European journal of Biochemistry
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 187-193
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1994-01-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X76540
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-12-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ligustrum vulgare
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., González de la Peña,
M.A., Villalba, M., Monsalve, R.I., Martín-Esteban,
M., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation, cDNA cloning and
expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Clinical and Experimental Allergy
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 1401-1410
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1996-06-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X77787
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1994-02-22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ligustrum vulgare
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Batanero, E., González de la Peña,
M.A., Villalba, M., Monsalve, R.I., Martín-Esteban,
M., Rodríguez, R.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Isolation, cDNA cloning and
expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Clinical and Experimental Allergy
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 1401-1410
\vskip0.400000\baselineskip
<307>
1996-06-24
\vskip0.400000\baselineskip
<308> X77788
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1994-02-22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO 1,2,3,4,5,6,7 y 8 que codifican
polipéptidos con actividad alergénica que poseen al menos un
epítopo alergénico común con el alergeno principal de Olea
europaea.
2. Moléculas de DNA recombinante, según
reivindicación 1, o modificaciones de las mismas, que codifican
polipéptidos con, al menos, un epítopo de Ole e 1 en su estructura,
unido a un polipéptido adicional, o modificado química o
enzimáticamente.
3. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por presentar, al menos, un 60% de identidad
con las descritas en SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO
4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6,SEQ Id NO 7 y SEQ ID NO 8, conteniendo
una secuencia de nucleotidos que codifica un polipéptido con
actividad alergénica idéntica o reducida (hipoalergénica) con
respecto a Ole e 1.
4. Polipéptidos recombinantes del alergeno Ole e
1 de Olea europaea, o fragmentos de dichos polipéptidos,
según reivindicación 1, caracterizados por las secuencias
dadas en SEQ ID NO 9,10,11, que presentan la antigenicidad de, al
menos, un epítopo de Ole e 1.
5. Polipéptidos recombinantes del alergeno
principal de Syringa vulgaris, o fragmentos de dichos
polipéptidos, según reivindicación 1, caracterizados por
las secuencias dadas en SEQ ID NO 12,13,14 que presentan la
antigenicidad de, al menos, un epítopo de Ole e 1.
6.Polipéptidos recombinantes del alergeno
principal de Ligustrum vulgare, o fragmentos de dichos
polipéptidos, según reivindicación 1, caracterizados por las
secuencias dadas en SEQ ID NO 15 y 16 que presentan la
antigenicidad de, al menos, un epítopo de Ole e 1.
7. Polipéptidos o fragmentos de dichos
polipéptidos de polen de Olea europaea, Syringa vulgaris y
Ligustrum vulgare con, al menos, un epítopo de Ole e 1 según
reivindicaciones anteriores, que se produzcan recombinantes unidos
a un polipéptido adicional.
8. Polipéptidos de polen de Olea europaea,
Syringa vulgaris y Ligustrum vulgare, según reivindicaciones
anteriores, que estén modificados química o enzimáticamente.
9. Un vector de expresión eucariota, y
preferentemente pPIC9, que contenga las secuencias de nucleotidos
mencionadas en las reivindicaciones anteriores y que permita su
producción recombinante.
10. Un organismo hospedador eucariota,
transformado con la construcción formada por el vector de expresión
pPIC9 y las secuencias de DNA (SEQ N° 1,2,3,4,5,6,7,8) de las
reivindicaciones 1,2 y 3, que sirvan para producir los polipéptidos
indicados en las reivindicaciones 4,5,6 y 7.
11. Un método para producir las formas
recombinantes correspondientes a las secuencias polipeptídicas
mencionadas en la reivindicaciones 4,5,6 y 7, en el sistema
eucariótico de levadura Pichia pastoris y preferentemente de
la cepa GS15, caracterizado por una cromatografía de
intercambio iónico en DEAE-celulosa y una de
filtración en gel en Sephadex G-75.
12. Utilización de las moléculas según
reivindicaciones 1-9 en el diagnóstico ``in
vitro'' de la alergia.
13. Aplicación de las moléculas recombinantes de
las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7 para el diseño de
vacunas destinadas a la inmunoterapia de la alergia.
14. Aplicación de las moléculas recombinantes de
las reivindicaciones 4-7 para producir péptidos que
contengan al menos un epítopo T capaces de actuar como vacunas.
15. Aplicación de las moléculas recombinantes de
las reivindicaciones 4-7 para la producción de
isoformas recombinantes hipoalergénicas que tengan disminuida o
anulada su unión a IgE para el tratamiento de alergias.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200001919A ES2209563B1 (es) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | Produccion en la levadurapipchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias. |
| PCT/ES2001/000287 WO2002012503A1 (es) | 2000-07-28 | 2001-07-19 | Producción en la levadura pichia pastoris y sistema de purificación del alergeno recombinante de olea europaea olee 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias |
| AU2001272565A AU2001272565A1 (en) | 2000-07-28 | 2001-07-19 | Production in pichia pastoris yeast and system for purifying the recombinant allergen of olea europaea ole e 1 for utilization in the diagnosis and treatment of allergies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200001919A ES2209563B1 (es) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | Produccion en la levadurapipchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2209563A1 ES2209563A1 (es) | 2004-06-16 |
| ES2209563B1 true ES2209563B1 (es) | 2005-10-01 |
Family
ID=8494497
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200001919A Expired - Fee Related ES2209563B1 (es) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | Produccion en la levadurapipchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU2001272565A1 (es) |
| ES (1) | ES2209563B1 (es) |
| WO (1) | WO2002012503A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003080837A1 (es) * | 2002-03-22 | 2003-10-02 | Universidad Complutense De Madrid Rectorado | PRODUCCIÓN DEL ALERGENO RECOMBINANTE DE CHENOPODIUM ALBUM Che a 1, Y SISTEMA DE AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN |
| ES2199050B1 (es) * | 2002-03-22 | 2005-03-01 | Universidad Completense De Madrid | Produccion del alergeno recombinante de "chenopodium album" che a 1 y sistema de aislamiento y purificacion. |
| ES2293749B1 (es) * | 2003-06-06 | 2009-03-16 | Universidad Complutense De Madrid | Variante recombinante del alergeno frae 1 del polen de fresno "fraxinus excelsior", produccion en la levadura pichia pastoris y aplicaciones. |
| AT503690A1 (de) | 2006-06-09 | 2007-12-15 | Biomay Ag | Hypoallergene moleküle |
| CN110567787A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-13 | 浙江工商大学 | 一种快速纯化血清中IgG和IgE的方法 |
-
2000
- 2000-07-28 ES ES200001919A patent/ES2209563B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-07-19 AU AU2001272565A patent/AU2001272565A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-19 WO PCT/ES2001/000287 patent/WO2002012503A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BATANERO, E. et al. "Isolation and characterization of an olive allergen-like protein from lilac pollen". EUR. J. BIOCHEM., Vol. 221, 1994, páginas 187-193. Figura 5. * |
| BATANERO, E. et al. "Isolation, cDNA cloning and expression of Lig v1, the major allergen from privet pollen". CLINICAL AND EXPERIMENTAL ALLERGY, Vol. 26, 1996, páginas 1401-1410. Figura 4. * |
| HUECAS, S. et al. "Production and detailed characterization of biologically active olive pollen allergen Ole e 1 secreted by the yeast Pichia pastoris". EUR. J. BIOCHEM., Vol. 261, abril 1999, páginas 539-545. Todo el documento. * |
| VILLALBA, M. et al. "Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen". THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 269, nº 21, 27 de mayo de 1994, páginas 15217-15222. Figuras 3,4. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002012503A1 (es) | 2002-02-14 |
| ES2209563A1 (es) | 2004-06-16 |
| AU2001272565A1 (en) | 2002-02-18 |
| WO2002012503A8 (es) | 2002-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| van Ree et al. | Lol p XI, a new major grass pollen allergen, is a member of a family of soybean trypsin inhibitor-related proteins | |
| ES2144424T5 (es) | Vacuna que comprende parte de la region constante de ige para el tratamiento de reacciones alergicas inducidas por ige. | |
| Asturias et al. | Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree pollen | |
| Twaroch et al. | Carrier-bound, nonallergenic Ole e 1 peptides for vaccination against olive pollen allergy | |
| JPH08504177A (ja) | 免疫調節ペプチド | |
| US20110150920A1 (en) | Allergy Vaccines Containing Hybrid Polypeptides | |
| JPH08502244A (ja) | 免疫調節ペプチド | |
| ES2209563B1 (es) | Produccion en la levadurapipchia pastoris y sistema de purificacion del alergeno recombinante de olea europaea ole e 1 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias. | |
| EP0463059B1 (en) | Allergenic proteins from ragweed and uses therefor | |
| DE69833460T2 (de) | Rekombinantes allergen mit reduzierter enzymatischer aktivität | |
| ES2677020T3 (es) | Clonación de alérgeno de abeja melífera | |
| ES2354820T3 (es) | Proteínas de fusión que comprenden alérgenos modificados de la familia ns-ltps, utilización de las mismas y composiciones farmacéuticas que las comprenden. | |
| KR100465382B1 (ko) | 말라세지아에서 유래된 항원성 단백질 | |
| ES2494817T3 (es) | Nuevo alérgeno de ácaro | |
| DE60115475T2 (de) | VARIANTEN DES DERMATOPHAGOIDES-ALLERGENS DER p 2 | |
| ES2340767T5 (es) | Alérgenos de ácaros del polvo doméstico | |
| ES2318077T3 (es) | Polipeptidos hipoalergenicos basados en parvalbumina de peces. | |
| WO2002070716A1 (es) | Producción en la levadura pichia pastoris, y sistema de aislamiento y purificación, del alergeno recombianante de olea europaea ole e 9 para uso en diagnosis y tratamiento de alergias | |
| ES2255340B2 (es) | Produccion, sistema de aislamiento y purificacion del alergeno ole e 10. | |
| ES2396231T3 (es) | Complejo peptídico | |
| ES2293749B1 (es) | Variante recombinante del alergeno frae 1 del polen de fresno "fraxinus excelsior", produccion en la levadura pichia pastoris y aplicaciones. | |
| ES2270828T3 (es) | Secuencias de adn y produccion por recombinacion de un alergeno de la familia de las gramineas. | |
| WO2003080837A1 (es) | PRODUCCIÓN DEL ALERGENO RECOMBINANTE DE CHENOPODIUM ALBUM Che a 1, Y SISTEMA DE AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN | |
| ES2400181T3 (es) | Variantes del alérgeno mayor PHI P 1 de hierba timotea | |
| ES2291648T3 (es) | Alergeno del polen de la artemisa. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20040616 Kind code of ref document: A1 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20201105 |