ES2340767T5 - Alérgenos de ácaros del polvo doméstico - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:<br /><br /> a) polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1;<br /><br /> b) polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1; y<br /><br /> c) polipéptidos constituidos por un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.
Description
Alérgenos de ácaros del polvo doméstico
La presente invención se refiere a novedosos alérgenos de ácaros del polvo doméstico, a polipéptidos derivados de dichos alérgenos y polinucleótidos que codifican los mismos. Además, la invención proporciona anticuerpos dirigidos contra los alérgenos y el uso de los polipéptidos, polinucleótidos y/o anticuerpos en el tratamiento y el diagnóstico de trastornos alérgicos.
Más del 25 % de la población sufre de alergias mediadas por IgE. Los pacientes alérgicos se caracterizan por un aumento en la producción de anticuerpos IgE contra antígenos per se inofensivos (es decir, alérgenos). Los síntomas inmediatos de la alergia tipo I (rinoconjuntivis alérgica, asma, dermatitis, shock anafiláctico) los causa la reticulación inducida por alérgenos de anticuerpos IgE ligados a células cebadas y la liberación de mediadores biológicamente activos (p. ej. histamina, leucotrienos).
Los ácaros del polvo doméstico (APD) representan una de las fuentes de alérgenos más importantes en todo el mundo. Casi el 10 % de la población y más del 50 % de los pacientes alérgicos están sensibilizados a los alérgenos de ácaros. El APD Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) representa la principal fuente de alérgenos de interiores en Europa Central (1). Los alérgenos de Der p comprenden más de 30 proteínas o glicoproteínas que presentan reactividad cruzada con alérgenos de otras especies de ácaros. Hasta la fecha se han caracterizado diecinueve grupos de alérgenos. Entre los 19 grupos de alérgenos de APD descritos, los grupos 1 y 2 (Der p 1 y Der p 2) constituyen los alérgenos más relevantes, pero se ha demostrado que también otros alérgenos de APD (p. ej. Der p 5 y Der p 7) representan alérgenos de Der p importantes que son reconocidos aproximadamente por el 50 % de los pacientes alérgicos a Der p (2).
Pittner et al. (2004) Clin. Exp. Allergy 34: 597 -603 describen estudios sobre diagnóstico de componentes alergénicos de la alergia a ácaros del polvo doméstico con alérgenos de ácaro naturales purificados y recombinantes.
Los extractos crudos de APD que se utilizan en la actualidad para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes alérgicos a APD están estandarizados sólo para Der p 1 y Der p 2, mientras que otros alérgenos importantes están presentes en los extractos de APD sólo en cantidades pequeñas. Por lo tanto, la inmunoterapia específica de APD parece ser menos eficiente que la inmunoterapia con alérgenos de polen. El uso de alérgenos recombinantes para el diagnóstico y el tratamiento podría soslayar este problema.
Por lo tanto, un problema técnico que subyace en la presente invención es identificar y aislar nuevos alérgenos responsables de la alergia o la sensibilización a APD.
La solución al anterior problema técnico la proporcionan las realizaciones de la presente invención, caracterizadas en las reivindicaciones.
En particular, los inventores han logrado la identificación de un nuevo alérgeno Der p que es útil para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes alérgicos a Der p. El ADNc que codifica este nuevo alérgeno de ácaros se aisló a partir de una biblioteca de ADNc de expresión de Der p, y se expresó en Escherichia coli (E. coli) como alérgeno recombinante. El nuevo alérgeno, con un peso molecular de 14,7 kDa, se une la IgE de aproximadamente el 30 % de los pacientes alérgicos a los ácaros. Se pudo encontrar una identidad de aproximadamente el 50 % entre las secuencias de aminoácidos del nuevo alérgeno Der p y de los alérgenos del grupo 5 de APD y ácaros de almacén (es decir, Der p, Lepidoglyphus destructor, Blomia tropicalis). Sin embargo, no pudo detectarse una reactividad cruzada entre el alérgeno recientemente descrito y el Der p 5, demostrando que este nuevo alérgeno representa un nuevo grupo de alérgenos de APD. Además, los inventores demuestran que el alérgeno recombinante es activo biológicamente. En particular, ya a concentraciones de 10 pg/ml el alérgeno liberaba cantidades máximas de histamina de los basófilos de los pacientes alérgicos a los ácaros y, en ciertos casos, pudo demostrarse que era incluso más activo que el principal alérgeno, el Der p 1, que liberaba cantidades máximas de histamina sólo a una concentración de 1 ng/ml.
Se describe en el presente documento un polipéptido que muestra reactividad cruzada con los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1, en particular los aminoácidos 20 a 140 de la misma. El término “reactividad cruzada” significa que una inmunoglobulina particular, preferentemente un anticuerpo IgE, o un fragmento o derivado de la misma que presenta propiedades de unión de la inmunoglobulina completa a epítopos que se unen a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID N.º 1, se une también al polipéptido en cuestión ya que dicho polipéptido en cuestión tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítopo o determinante que es reconocido por dicha inmunoglobulina particular (preferentemente IgE) en el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1. Esto viene a significar que el polipéptido con reactividad cruzada puede ser capaz de desencadenar la reacción alérgica, o al menos la sensibilización, en un individuo que esté expuesto al polipéptido con reactividad cruzada.
La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1. El polipéptido comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 75 %, más preferentemente una identidad de al menos el 80 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos el 90 % y de la manera más preferente una identidad de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1. Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” se refiere a proteínas y/o péptidos que tienen una longitud de al menos 7 aminoácidos.
El grado de identidad de una secuencia de aminoácidos con la SEC ID N.º 1 se determina comparando la secuencia de aminoácidos en cuestión y la SEC ID N.º 1 usando el programa “BLAST 2 SEQUENCES (blastp)” (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) con los siguientes parámetros: matriz BLOSUM62; penalizaciones de apertura de huecos 11 (open gap 11) y extensión de huecos 1 (extension gap 1); gap x_dropoff50; valor de E (expect) 10,0 tamaño de palabra 3; filtros: ninguno. De acuerdo con la presente invención, la comparación de secuencias abarca al menos 40 aminoácidos, preferentemente al menos 80 aminoácidos, más preferentemente al menos 100 aminoácidos y de la manera más preferente al menos 120 aminoácidos.
De acuerdo con una realización preferente, el polipéptido de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SED ID NO 1, preferentemente los residuos 20 a 140 de la secuencia mostrada en SEC ID N.º 1.
Además, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1. La longitud del fragmento es preferentemente de al menos 21 aminoácidos, más preferentemente de al menos 25 aminoácidos, todavía más preferentemente de al menos 35 aminoácidos y de la manera más preferente de al menos 50 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1.
Otra realización más de la presente invención es un polipéptido que consiste en al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1. Preferentemente la longitud de dicho polipéptido es de al menos 10 aminoácidos, más preferentemente de al menos 15 aminoácidos, todavía más preferentemente de al menos 25 aminoácidos y de la manera más preferente de al menos 35 aminoácidos. En otras realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención consiste en al menos 8 o al menos 9 o al menos 11 o al menos 12 o al menos 13 o al menos 14 o al menos 18 o al menos 21 o al menos 30 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1. En otras realizaciones más, la longitud del polipéptido no es superior a 100 o 50 o 30 aminoácidos. Los polipéptidos que consisten en al menos 7 aminoácidos pueden ser reconocidos por linfocitos T (epítopos de los linfocitos T).
Se describe en el presente documento, además, un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1, siendo dicho fragmento capaz de unirse a anticuerpos IgE procedentes de un individuo que es alérgico o está sensibilizado frente a los ácaros del polvo doméstico. El término anticuerpos “IgE” significa una preparación de anticuerpos que se puede obtener mediante procedimientos conocidos per se. En los seres humanos susceptibles, la exposición a alérgenos conduce a una respuesta alérgica (mediada por la IgE) de tipo inmediato, que comprende dos etapas:
- (i)
- En la primera exposición, las proteínas alergénicas inducen en los linfocitos B la síntesis de IgE (Vercelli and Geha (1989), J. Allergy Clin. Immunol. 9, 75-83). Estos anticuerpos IgE específicos se unen entonces a la superficie de las células cebadas y de los basófilos a través de receptores Fcε de alta afinidad (FcεRI).
- (ii)
- En la exposición posterior, los alérgenos se unen a estos anticuerpos IgE específicos y los reticulan, dando lugar a la liberación de mediadores inflamatorios preformados y recién sintetizados (p. ej. histamina) y sustancias quimiotácticas (p. ej. factor activador de las plaquetas).
En la etapa (i) anterior, la producción de IgE específica del alérgeno por parte de los linfocitos B requiere la “ayuda” de los linfocitos T (v. Vercelli and Geha (1989), supra), que son activados por fragmentos de péptido lineal del alérgeno. Mediante el procesamiento del antígeno, las células que presentan antígeno crean estos péptidos y los exteriorizan sobre la superficie de la célula mediante moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), donde quedan disponibles para el reconocimiento y la unión al receptor de la célula T (Schwartz (1985), Annu. Rev. Immunol. 3, 237255; Rothbart et al. (1989) Int. Immunol. 1, 479-486). En la etapa (ii) anterior, los anticuerpos IgE específicos del alérgeno producidos por las células B circulan y se unen a receptores Fcε de las células cebadas y de los basófilos, sirviendo de este modo como receptores para el alérgeno. La reticulación de estos anticuerpos IgE fijados a la superficie de la célula por parte de los alérgenos constituye la señal para la liberación de mediadores inflamatorios preformados y recién sintetizados y de sustancias quimiotácticas, dando lugar a la típica reacción inflamatoria alérgica.
Un “individuo sensibilizado frente a los ácaros del polvo doméstico” es un individuo que presenta anticuerpos IgE específicos que reconocen proteínas de los ácaros del polvo doméstico. Un “individuo que es alérgico a los ácaros del polvo doméstico” presenta además síntomas alérgicos (mediados por IgE), tales como síntomas inmediatos de la alergia tipo I mencionada con anterioridad, cuando queda expuesto a APD. Tal como se ha mencionado ya con anterioridad, las reacciones alérgicas de este tipo, o al menos la sensibilización, se pueden desencadenar al quedar expuestos a polipéptidos homólogos que muestran reactividad cruzada con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1. Los pacientes que son alérgicos a APD presentan típicamente una prueba de punción en piel (SPT) positiva y una prueba de radioalergoadsorción (RAST) superior a 0,35 kUA/L.
Un polipéptido es “capaz de unirse a un anticuerpo” si su afinidad hacia el anticuerpo es significativamente superior a la de una composición de referencia que no se une al anticuerpo. La unión de anticuerpos IgE específicos a un polipéptido o alérgeno particulares se puede determinar mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, p. ej. RAST, immunoblot o ELISA, usando sueros de referencia procedentes de individuos no alérgicos sanos (tal como se determina mediante una SPT negativa o una RAST negativa) que no presenten anticuerpos IgE específicos del alérgeno.
La presente invención proporciona novedosas estructuras alergénicas encontradas en Dermatophagoides pteronyssinus y otros APD. La identificación de estas estructuras es particularmente útil para la selección y la producción de alérgenos recombinantes que se pueden usar en el diagnóstico y el tratamiento de la sensibilización y la alergia a los ácaros del polvo doméstico.
La presente invención proporciona además derivados, análogos y fragmentos del polipéptido de acuerdo con la SEC ID N.º 1. Los derivados de este tipo se pueden sintetizar por medios químicos o de ingeniería genética y se generan, p. ej., mediante adición, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos en la secuencia que se muestra en la SEC ID N.º 1. De acuerdo con una realización preferente, los derivados, análogos y fragmentos del polipéptido de acuerdo con la SEC ID N.º 1 muestran propiedades hipoalergénicas en comparación con la secuencia de aminoácidos originaria. Los polipéptidos de este tipo se generan preferentemente mediante el uso de un ácido nucleico, p. ej. un ADNc o ARNm, que codifica el polipéptido respectivo. Los ácidos nucleicos de este tipo (polinucleótidos) tienen una secuencia de nucleótidos que se deriva de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SED ID N.º 2 por medio de adición, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos.
De acuerdo con una realización preferente de la presente invención, los polipéptidos son polipéptidos aislados, es decir que están en una forma esencialmente pura. La expresión “esencialmente pura” significa que mediante la separación de los polipéptidos de los otros componentes, los polipéptidos son puros al menos en el 75 %, preferentemente al menos en el 90 % y más preferentemente al menos en el 95 %. La pureza de los polipéptidos la puede determinar una persona experta usando técnicas conocidas en la técnica, p. ej. mediante PAGE-SDS seguido de tinción de la proteína. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la espectrometría de masas son procedimientos adecuados para analizar tanto polipéptidos como también péptidos cortos.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de diversas maneras. Los polipéptidos se pueden preparar por medio de síntesis química, preferentemente aplicando procedimientos en fase sólida. Los procedimientos de síntesis química de péptidos son bien conocidos en la técnica (v. por ejemplo. Merrifield (1963) J. Am. Soc. 85, 2149; Stewart et al. (1984) “Solid Phase Peptide Synthesis”, 2ª edición, Pearce Chemical Co., Rockford, IL, EE.UU.; Bayer and Rapp (1986) Chem. Pept. Prot. 3, 3; Atherton et al. (1989) “Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach”, IRL Press, Oxford, R.U.). Estos procedimientos son particularmente apropiados para la preparación de polipéptidos cortos que tienen una longitud de, p. ej., 7 a 50 aminoácidos. Los polipéptidos más largos se pueden preparar mediante reticulación química o enzimática de fragmentos de péptido que se han preparado por medio de síntesis química. Tal como se señaló con anterioridad, los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar también mediante la expresión de secuencias de ácidos nucleicos, en particular de secuencias de ADN en células huésped o con la ayuda de extractos libres de células.
Por lo tanto, la presente invención se refiere también a polinucleótidos que codifican los polipéptidos mencionados con anterioridad. Los polinucleótidos pueden ser moléculas de ADN o de ARN de doble cadena o de cadena simple o bien ácidos nucleicos derivados de especies de ADN y/o ARN. Así pues, de acuerdo con una realización, los polinucleótidos de la presente invención codifican la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1. Debido a la degeneración del código genético, se pueden imaginar muchos polinucleótidos diferentes que codifiquen la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1.
Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para identificar secuencias similares en cualquier ácaro u otra especie relacionada con Der p y, por lo tanto, para identificar y aislar secuencias que tengan una homología suficiente para hibridar con, p. ej., ADN procedente de ácaros del polvo doméstico o ácaros de almacén. Esto se puede llevar a cabo, p. ej., en condiciones de baja rigurosidad que conducen a la hibridación con secuencias que tienen una homología suficiente (por lo general superior al 40 %), y que se pueden seleccionar para una evaluación más amplia. De manera alternativa se pueden aplicar condiciones de mayor rigurosidad. En general, las condiciones de alta rigurosidad se seleccionan para que sean de entre aproximadamente 5 ºC hasta aproximadamente 10 ºC por debajo de la temperatura de fusión (TM) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La TM es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida para dar una muestra de coincidencia perfecta.
Unas condiciones típicas de alta rigurosidad son aquellas en las que la concentración de sal es de hasta aproximadamente 15 mM Na+ (0,1 x SSC) a un pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 60 ºC.
De esta manera, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar para identificar en otras especies, en particular en otros tipos de APD o ácaros de almacén, secuencias que codifican péptidos o polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos similares a la del alérgeno de 14,7 kDa descrito en el presente documento y, de esta manera, para identificar alérgenos en otras especies de este tipo. Por lo tanto, la presente invención no sólo incluye la proteína de 14,6 kDa y otros alérgenos de ácaros codificados por los polinucleótidos que se han descrito en el presente documento, sino también otros alérgenos de ácaros codificados por polinucleótidos que se hibridan con el polinucleótido de la presente invención.
De acuerdo con una realización preferente de la presente invención, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID N.º 2, preferentemente los nucleótidos 24 a 434 y más preferentemente los nucleótidos 81 a 434. En otras realizaciones, el polinucleótido de la presente invención comprende al menos 50 nucleótidos contiguos, preferentemente al menos 100 nucleótidos, más preferentemente al menos 200 nucleótidos y de manera más preferente al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID N.º 2.
La invención comprende también polinucleótidos que se han degenerado para dar los polinucleótidos que se han descrito con anterioridad. Las respectivas cadenas complementarias de los polinucleótidos divulgados forman también parte de la presente invención.
Los polinucleótidos de la presente invención son preferentemente polinucleótidos aislados. Los polinucleótidos son preferentemente esencialmente puros, es decir, son al menos puros al 80 %, más preferentemente al menos puros al 90 % y de manera más preferente al menos puros al 95 %. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden preparar de diversas maneras (véase p. ej., Glick and Pasternack (1994) Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombination DNA, ASM Press, Washington D.C.; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53, 323-356; Climie et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 633-637). Los polinucleótidos se pueden sintetizar por medio de los procedimientos químicos que se usan habitualmente en la síntesis de oligonucleótidos. Para sintetizar los polinucleótidos de la presente invención, en particular las moléculas más grandes, se pueden usar procedimientos basados en la PCR (véase, p. ej., Lee et al. (1997) Nucleid Acid Amplification Tecnologies, Eaton Publishing, MA; EE.UU.; McPherson et al. (1996) PCR -A Practical Approach, vol. 2 y 2, IRL Press, Oxford, R.U.). Se pueden preparar también polinucleótidos más largos por medio de la reticulación química o enzimática de fragmentos que se hayan sintetizado usando procedimientos químicos.
Una realización adicional de la presente invención es un plásmido o vector que comprende el polinucleótido definido con anterioridad. Los plásmidos pueden contener secuencias reguladoras que facilitan la replicación de los plásmidos o la transcripción y/o traducción de las secuencias codificadas. Ejemplos de secuencias reguladoras de este tipo son promotores, secuencias de terminación, potenciadores (enhacers), etc. Los plásmidos pueden contener también secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos, facilitando la purificación de los polipéptidos codificados al expresarse en una célula huésped o en un sistema de expresión libre de células. Ejemplos de secuencias de este tipo son un fragmento marcador 6xHis, un fragmento marcador FLAG y secuencias que codifican proteínas bacterianas tales como GST. La purificación del polipéptido codificado se puede conseguir por medio de cromatografía de afinidad usando anticuerpos dirigidos contra las respectivas etiquetas o secuencias bacterianas. Otras matrices de afinidad (p. ej. para purificar polipéptidos que tienen un fragmento marcador 6xHis) contienen iones metálicos fijados tales como Ni2+, que son capaces de formar un complejo quelado con fragmento marcador de expresión. La persona experta en la materia conoce plásmidos y vectores adecuados que contienen secuencias reguladoras y de fragmento marcador o secuencias bacterianas.
La invención se refiere además a una célula que contiene el plásmido o vector definido con anterioridad y/o un polinucleótido de la presente invención, no siendo la célula una célula de un ser humano. Las células se pueden seleccionar de entre células vegetales, células bacterianas, células de levaduras y otras, p. ej. células de mamíferos. Se prefieren las células que permiten la expresión de los genes codificados por los polinucleótidos de la presente invención. Más preferentemente las células son células de E. coli. El plásmido, vector y/o polinucleótido conforme a la presente invención se puede introducir en las células por medio de procedimientos conocidos per se, p. ej. transformación, transfección, etc. Las células pueden contener las moléculas de ácido nucleico sólo de modo transitorio o integradas de forma estable en su genoma. En particular en este último caso, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden truncar o fragmentar debido al proceso de integración en el genoma. Las células que contienen versiones truncadas o fragmentadas de este tipo de las moléculas de ácido nucleico caen dentro del ámbito de la presente invención.
Las células de la presente invención se pueden usar para la expresión y la purificación de los polipéptidos de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona también un procedimiento para la preparación de un polipéptido descrito con anterioridad, que comprende la etapa de cultivar las células tal como se han definido con anterioridad en un medio bajo condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido y, opcionalmente, la posterior recuperación del polipéptido a partir de las células y/o el medio. Las células se cultivan de manera preferente en un medio líquido bajo agitación. Si es conveniente, la expresión del polipéptido diana se induce por medio de un agente inductor tal como IPTG. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonado e introducir ácidos nucleicos exógenos en diversas células huésped y las técnicas para transformar estas células huésped, y para la expresión de secuencias de nucleótidos extraños clonadas en ellas, son bien conocidas para la persona experta en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York, EE. UU.; Ausubel et al. (eds.) (1999) Current Protocols in Molecular Biology , 4ª edición, John Wiley & Sons, Nueva York, EE.UU.).
Tras el cultivo, las células se pueden desorganizar o, de otra forma, abrir, usando procedimientos establecidos y el polipéptido se puede recuperar por medio de cromatografía de afinidad. Se pueden usar también otros procedimientos conocidos de purificación de proteínas. Ejemplos de etapas de purificación pueden incluir hidroxilapatita, exclusión de tamaño, FPLC y HPLC de fase inversa. Entre los medios cromatográficos apropiados se incluyen dextranos, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales derivatizados y similares. En una realización preferente, el polipéptido de la invención se aísla por medio de un procedimiento que comprende una etapa de cromatografía de afinidad y/o una etapa de cromatografía de intercambio iónico. Para la cromatografía de afinidad se pueden inmovilizar en un soporte sólido uno
o más anticuerpos dirigidos contra el polipéptido de la invención. Preferentemente, el anticuerpo reconoce específicamente el polipéptido de la invención. Los procedimientos para unir las moléculas de anticuerpo a los medios de soporte son bien conocidos en la técnica. La elección de un procedimiento particular es una cuestión del diseño rutinario del experimento y viene determinada, en parte, por las propiedades del material de soporte elegido.
Otro procedimiento preferente de cromatografía de afinidad usa la adsorción de proteínas ricas en histidina, p. ej. aquellas que contienen fragmentos marcadores poli-His, sobre matrices que contienen iones metálicos ligados. En pocas palabras, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato. Las proteínas ricas en His se adsorberán en esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo de los iones metálicos que se usen, y se eluirán por medio de elución competitiva, disminuyendo el pH, o usando agentes quelantes fuertes. Dentro de otras realizaciones adicionales de la presente invención, se puede construir una fusión del polipéptido de interés y un fragmento marcador de afinidad para facilitar la purificación. Las proteínas de fusión se pueden preparar mediante procedimientos que conoce una persona experta en la técnica preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugando químicamente los componentes. De manera alternativa, usando procedimientos conocidos se puede generar un polinucleótido que codifica los componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura apropiado y se puede expresar por los procedimientos que se han descrito en el presente documento.
Otras etapas de purificación cromatográfica preferentes incluyen cromatografía de intercambio iónico, con preferencia cromatografía de intercambio aniónico. Entre los ejemplos de matrices de intercambio aniónico están celulosa, derivados de celulosa o matrices de dextrano que llevan grupos que se pueden cargar positivamente tales como dietilaminoetilo (DEAE). Estos y otros procedimientos de purificación de proteínas se describen, p. ej., en Deutscher, M.P. (1990) Protein Purification, Academic Press, Nueva York, EE.UU.; Scopes (1994) Protein Purification, Springer Verlag, Heidelberg, Alemania; Doonan, S. (1996) Protein Purification Protocols, Humana Press.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, como “alérgenos purificados”. Los alérgenos purificados de este tipo son útiles para la estandarización de extractos de alérgenos que sean reactivos clave para el diagnóstico y el tratamiento (o la prevención) de la alergia al polvo doméstico. Además, usando péptidos basados en fragmentos de la secuencia de aminoácidos que se muestran en la SEC ID N.º 1, se pueden generar antisueros antipéptido o anticuerpos monoclonales usando procedimientos estándar. Los sueros o anticuerpos monoclonales de este tipo, dirigidos contra la proteína de 14,7 kDa de la presente invención, se pueden usar para estandarizar extractos de alérgeno.
Otra realización más de la presente invención es un anticuerpo dirigido contra el polipéptido descrito con anterioridad. El término “dirigido contra un polipéptido” significa que el anticuerpo es capaz de unirse al respectivo polipéptido, es decir, que el anticuerpo reconoce uno o más epítopos determinado por la secuencia de aminoácidos del polipéptido. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Además, el término “anticuerpo” comprende fragmentos o derivados de anticuerpos completos siempre que se mantenga la afinidad hacia el polipéptido diana. Ejemplos son fragmentos de anticuerpo preparados por vía enzimática así como especies obtenidas por ingeniería genética, tales como anticuerpos humanizados y anticuerpos de cadena simple, p. ej. constructos scFv. Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar con procedimientos conocidos en la técnica, p. ej. los divulgados en Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, EE.UU. En una realización preferente, el anticuerpo está en una forma esencialmente pura, es decir, al menor pura en el 80 %, preferentemente al menos pura en el 90 %. En el caso de los anticuerpos policlonales, la composición del anticuerpo contiene una pluralidad de especies diferentes de moléculas de anticuerpo.
El anticuerpo es preferentemente específico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1. De acuerdo con una realización preferente adicional, el anticuerpo de la presente invención está dirigido contra uno o más epítopos, determinado por los residuos 20 a 140 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1.
En una realización preferente particular de la presente invención, los epítopos de este tipo se usan para el tratamiento que provoca anticuerpos neutralizantes en el paciente al que hay que tratar. Los anticuerpos de este tipo protegen al paciente frente a reacciones alérgicas. Por lo tanto, en una primera etapa es posible identificar regiones del polipéptido que representan probablemente un epítopo, p. ej. usando transferencias de hidrofobicidad. Además, se ensaya si los epítopos de este tipo tienen un efecto protector en un panel de pacientes alérgicos.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar para aislar componentes alergénicos adicionales de los ácaros del polvo doméstico y especies relacionadas, tales como los ácaros de almacén. Los alérgenos adicionales de este tipo se pueden usar para definir más las características de esta familia de alérgenos. Además, los sueros antipéptidos o los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido de la presente invención se pueden usar para estandarizar y definir el contenido de los reactivos de las pruebas cutáneas.
Otra realización más de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un polipéptido y/o un polinucleótido y/o un anticuerpo y/o un vector o plásmido y/o una célula huésped de acuerdo con la invención, opcionalmente en combinación con excipientes y/o diluyentes y/o vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Por supuesto, la composición farmacéutica de la invención puede contener una o más de las anteriores moléculas/especies.
Los materiales proporcionados por la presente invención, así como las composiciones que contienen dichos materiales, se pueden usar en procedimientos de diagnóstico, tratamiento y prevención de la alergia a APD. Por lo tanto, se describe en el presente documento el uso de un polipéptido y/o un polinucleótido y/o un anticuerpo y/o un vector o plásmido y/o una célula huésped de acuerdo con la presente invención para el tratamiento o la prevención o el diagnóstico de un trastorno alérgico. Además, la invención comprende el uso de las realizaciones anteriores de la presente invención para la preparación de medicamentos para el tratamiento o la prevención o el diagnóstico de un trastorno alérgico. Los materiales de la presente invención se usan para el tratamiento y/o la prevención y/o el diagnóstico (o para la producción de un medicamento correspondiente) de la sensibilización o la alergia a ácaros del polvo doméstico o ácaros de almacén.
La composición farmacéutica o el medicamento de acuerdo con la invención se administra preferentemente a un individuo a desensibilizar.
Por medio del uso de los polipéptidos de la presente invención (así como de los polinucleótidos que codifican los correspondientes polipéptidos), se pueden hacer preparaciones de alérgeno de actividad biológica y composición constante y bien definida y administrarse para fines terapéuticos o preventivos (p. ej. para modificar la respuesta alérgica de un individuo que está sensibilizado frente a los ácaros del polvo doméstico y/o especies relacionadas). Los polipéptidos de este tipo o las versiones modificadas de los mismos, en particular los derivados hipoalergénicos (p. ej. mutantes que contienen una o más deleciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de tipo salvaje, así como derivados modificados químicamente) pueden, por ejemplo, modificar la respuesta de los linfocitos B y/o la respuesta de los linfocitos T frente a APD y especies relacionadas (p. ej. ácaros de almacén). Tal como se ha mencionado ya con anterioridad, se pueden usar también alérgenos purificados para diseñar derivados modificados o análogos que sean más útiles en la inmunoterapia que los péptidos o polipéptidos presentes de modo natural y sin modificar (naturales).
Las dosis altas de alérgenos producen por lo general un mejor alivio de los síntomas. Sin embargo, muchos pacientes no toleran dosis altas de alérgenos debido a reacciones alérgicas a los mismos. Por lo tanto, las modificaciones de los alérgenos presentes de modo natural se pueden diseñar de tal manera que se pueden producir polipéptidos que tienen las mismas o mayores propiedades terapéuticas que el correspondiente alérgeno natural pero con menores efectos secundarios, en especial propiedades hipoalérgicas tales como un potencial anafiláctico inferior o nulo. Alérgenos modificados de este tipo pueden ser, por ejemplo, un polipéptido de la presente invención o un análogo modificado (p. ej. un polipéptido en el que la secuencia de aminoácidos ha sido alterada para modificar la inmunogenicidad y/o reducir la alergenicidad o al que se le ha añadido un componente con los mismos fines). Por ejemplo, se pueden modificar los polipéptidos usando el procedimiento del polietilenglicol (PEG) de A. Sehon et al. La deleción de segmentos cortos o las sustituciones de aminoácidos de la secuencia del polipéptido dan como resultado una unión debilitada (es decir, reducida
o nula) al anticuerpo. Las modificaciones de este tipo conducen a una débil unión de la IgE y son muy útiles en inmunoterapia debido a los menores efectos secundarios.
La administración de los (poli)péptidos o composiciones farmacéuticas (medicamentos) de la presente invención a un individuo, preferentemente un individuo al que hay de desensibilizar, se puede llevar a cabo usando procedimientos conocidos. A un individuo se le puede administrar un péptido o una combinación de diferentes péptidos en una composición que incluya, p. ej. un diluyente (tal como un tampón apropiado), un excipiente y/o un adyuvante. Una composición de este tipo se administrará por lo general mediante inyección, administración por vía oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración por vía rectal. Usando la información estructural que proporciona la presente invención es posible diseñar un polipéptido de ácaro que, que cuando se administra en cantidades suficientes a un individuo sensible a APD, modificará la respuesta alérgica del individuo a un alérgeno de ácaro. Esto se puede hacer, por ejemplo, examinando las estructuras de las proteínas de ácaro, produciendo péptidos que se examinarán para ver su capacidad de influir sobre las respuestas de los linfocitos B y/o linfocitos T en individuos sensibles a APD y seleccionando epítopos adecuados, reconocidos por las células. Se pueden usar asimismo secuencias de aminoácidos sintéticas que simulan los epítopos alergénicos y que son capaces de regular una respuesta alérgica a alérgenos de ácaro.
Los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención se pueden usar también para detectar y diagnosticar la alergia o la sensibilización a APD. Por ejemplo, combinando sangre o productos sanguíneos obtenidos de un individuo en el que hay que evaluar su sensibilidad frente a un alérgeno de APD con un péptido alergénico aislado de alérgeno de ácaro, en condiciones apropiadas para unir los componentes (tales como anticuerpos, células T, células B) de la sangre con el polipéptido y determinar el grado en que se produce tal unión.
También es posible diseñar un agente o un fármaco capaces de bloquear o inhibir la capacidad de los alérgenos de ácaro para inducir una reacción alérgica en individuos sensibles a los ácaros. Los agentes de este tipo se podrían diseñar, por ejemplo, de tal manera que se unieran a IgE antiácaros relevantes, impidiendo de este modo la unión IgE-alérgeno y la subsiguiente desgranulación de las células cebadas. De manera alternativa, los agentes de este tipo podrían unirse a componentes celulares del sistema inmunológico dando como resultado la supresión o la desensibilización de la respuesta alérgica a los alérgenos de ácaro. Un ejemplo no restrictivo de estas realizaciones de la presente invención es el uso de péptidos epítopos apropiados de linfocitos B y T, o modificaciones de los mismos, basados en las estructuras de ADNc/polipéptido de la presente invención para suprimir la respuesta alérgica a los alérgenos APD. Esto se puede llevar a cabo definiendo las estructuras de los péptidos epítopos de los linfocitos B y T que afectan al funcionamiento de los linfocitos B y T en los estudios in vitro con células sanguíneas procedentes de individuos sensibles a los ácaros.
Por último, la invención se refiere a kits que son útiles para el diagnóstico, el tratamiento y/o la prevención de un trastorno alérgico, que comprenden un polipéptido y/o un polinucleótido y/o un anticuerpo y/o un vector o plásmido y/o una célula huésped de acuerdo con la presente invención. Los materiales proporcionados por la presente invención, así como las composiciones y los kits que contienen estos materiales, se pueden usar en procedimientos de diagnóstico, tratamiento y prevención de la alergia o sensibilización frente a APD o especies relacionadas, tales como ácaros de almacén.
La presente invención se basa en una molécula de ADN recombinante o fragmentos de la misma que codifican un alérgeno de 14,7 kDa procedente del ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides pteronyssinus (Der p). El nuevo alérgeno de ácaro se puede usar para el diagnóstico de pacientes alérgicos a APD así como para el tratamiento. De acuerdo con la presente invención, se pudo demostrar que el nuevo alérgeno de ácaro induce una respuesta IgG intensa y específica en conejos, indicando que la inmunoterapia específica con este nuevo alérgeno de ácaro inducirá el bloqueo de los anticuerpos IgG en seres humanos. El uso de derivados hipoalergénicos, generados basándose en la secuencia de este nuevo alérgeno para inmunoterapia, podría reducir de manera adicional el riesgo de efectos secundarios anafilácticos (3).
Las figuras muestran:
Figura 1A muestra el ADNc (SEC ID N.º 2) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID N.º 1) del
alérgeno preferente de acuerdo con la invención. El codón de inicio, el codón de parada y la señal de
poliadenilación están subrayados. La secuencia que codifica para la secuencia señal (aminoácidos 1
a 19) comprende los nucleótidos 24 a 80. El sitio de escisión está entre los residuos de aminoácido
19 (G) y 20 (F) (en negrita). Los números a la izquierda de la secuencia indican las posiciones de los
nucleótidos y los situados a la derecha de la secuencia las posiciones de los aminoácidos.
- Figura 1B
- muestra un gel SDS-PAGE con tinción de azul de Coomassie y el resultado del análisis de
- espectrometría de masas del alérgeno identificado. Izquierda: gel SDS-PAGE con tinción de azul de
- Coomassie. En el carril 1 se muestra un marcador de masa y en el carril 2 3μg de alérgeno purificado.
- Derecha: análisis MS del alérgeno purificado de acuerdo con la invención. La proporción masa/carga se
- muestra en el eje X y la intensidad de la señal en el eje Y en forma del porcentaje de la señal más
- intensa obtenida en el intervalo de masas investigado. El pico en 14.724,9 corresponde a la masa
- calculada de la secuencia de aminoácidos deducida de 14.726,1.
- Figura 2A
- muestra la reactividad IgE del nuevo alérgeno de ácaro. El alérgeno identificado se transfirió sobre tiras
- de nitrocelulosa y se incubó con sueros procedentes de pacientes alérgicos a Der p. La IgE fijada se detectó con anticuerpos IgE humanos marcados con 125I.
- Figura 2B
- demuestra la inducción de la liberación de histamina desde los basófilos de un paciente alérgico a Der
- p. Los granulocitos de un paciente alérgico a Der p se incubaron con diversas concentraciones de nDer
- p 1, alérgeno de acuerdo con la invención y rDer p 5 (eje X). En el eje Y se muestra el porcentaje de
- histamina liberado en el sobrenadante del cultivo libre de células.
- Figura 3A
- muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos del alérgeno de acuerdo con la presente
invención (SEC ID N.º 1) con alérgenos de ácaros del polvo doméstico homólogos. La secuencia de aminoácidos del alérgeno de acuerdo con la invención se comparó con alérgenos del grupo 5 de Lepidoglyphus destructor (Lep d 5) (SEC ID N.º 3), Blomia tropicalis (Blo t 5) (SEC ID N.º 4) y Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 5) (SEC ID N.º 5). Los aminoácidos idénticos al alérgeno de la invención se indican con guiones y los puntos representan huecos introducidos para conseguir un máximo ajuste.
Figura 3B demuestra la falta de reactividad cruzada entre el nuevo alérgeno de ácaro y Der p 5. Los sueros procedentes de pacientes alérgicos a Der p (1-9) y un paciente no alérgico (10) se adsorbieron previamente de manera respectiva con BSA, rDer p 5 y el alérgeno de acuerdo con la invención. Se transfirieron sobre tiras de nitrocelulosa Der p 5 recombinante, el novedoso alérgeno de ácaro y BSA, se incubaron con los sueros adsorbidos previamente y las IgE fijadas se detectaron con anticuerpos IgE anti-humanos marcados con 125I.
Figura 4 muestra la reactividad IgG de un antisuero de conejo comparada con el nuevo alérgeno identificado con diferente alérgenos Der p. Se sometieron a ensayo el suero preinmune y el antisuero en busca de reactividad IgG a PBS (como control), rDer p 2, rDer p 5 y el alérgeno de la invención.
La presente invención se explica más a fondo mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión y purificación de un nuevo alérgeno recombinante de Dermatophagoides pteronyssinus
El clon 25 del ADNc (Fig. 1A) que codifica para el nuevo alérgeno maduro se clonó en el vector de expresión pET-17b (Novagene, Madison, WI) y se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) (Strategene, La Jolla, CA). Se cultivaron las células bacterianas con un OD600 de 0,6 a 0,8 en medio LB que contenía 100 mg/ml de ampicilina. Se indujo la expresión de la proteína recombinante añadiendo isopropil-β-tiogalactopiranosido (IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM y se cultivó durante 3 horas adicionales a 37 ºC. Las células de E. coli procedentes de un cultivo de 1 litro se recolectaron mediante centrifugación, se suspendieron de nuevo en 10 ml 25 mM de imidazol a pH 7,4, 0,1 % de Triton X 100 y se trataron con 100 μg de lisozima durante 20 minutos a temperatura ambiente. El lisado de células bacterianas se congeló en nitrógeno líquido y se descongeló en un baño de agua a 50 ºC. Se degradó el ADN mediante la adición de 1 μg de ADNasa durante 10 minutos a temperatura ambiente y se interrumpió la reacción con 200 μl 5M de NaCl. Después de la centrifugación de las células bacterianas lisadas a 18.000 rpm (Sorval RC5C, SS34) durante 20 minutos a 4 ºC, se obtuvo una fracción que contenía las proteínas solubles. La fracción soluble, que contenía el alérgeno derivado del clon 25, se dializó frente a tampón A (10 mM Tris-Cl pH 7,0, 4 % de isopropanol, 1 ml/l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, PMSF) y se aplicó a una columna DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences, Upsala, Suecia). Se diluyó el alérgeno derivado del clon 25 con un gradiente de 0-500 mM NaCl. Se agruparon las fracciones que contenían el alérgeno recombinante, se dializaron frente a tampón B (10 mM Na2HPO4 pH 4,0, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 ml/l de PMSF) y se aplicaron a una columna SP Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences). Se eluyó el alérgeno derivado del clon 25 mediante un gradiente combinado de pH 4,0-7,0 y 0-500 mM NaCl y se agruparon las fracciones que contenían más del 90 % de alérgeno puro codificado por el clon 25, se dializaron frente a 10 mM de Na2HPO4 pH 7,0 y se guardaron a -20 ºC. Se analizó la pureza de muestras de proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y tinción de la proteína con azul Coomassie (Fig. 1B).
Ejemplo 2: Capacidad de unión de IgE y actividad biológica del nuevo alérgeno Der p
(i) El nuevo alérgeno se une a la IgE de los sueros de pacientes alérgicos a los ácaros
Se analizó la capacidad de unión de la IgE del nuevo alérgeno Der p codificado por el clon 25 del ADNc mediante experimentos de transferencia por puntas (dot blot) usando sueros procedentes de 117 pacientes alérgicos a los ácaros. Se transfirió el nuevo alérgeno a tiras de nitrocelulosa (1 μg/punta) y se incubaron las tiras con sueros de pacientes alérgicos a Der p. Los anticuerpos IgE ligados se detectaron con anticuerpos IgE anti-humanos etiquetados con 125I.
Treinta de los 117 sueros (26 %) mostraron unión de la IgE al nuevo alérgeno Der p (Figura 2A).
(ii) El nuevo alérgeno Der p induce la liberación de histamina desde los basófilos de pacientes alérgicos a los ácaros
Se compararon el alérgeno mayor nDer p 1 (4) y el alérgeno menor rDer p 5 (5) del ácaro del polvo doméstico Der p con el nuevo alérgeno codificado por el clon 25 del ADNc para averiguar su capacidad de inducir la liberación de histamina desde los basófilos de un individuo alérgico a Der p.
Mediante sedimentación con dextrano se aislaron granulocitos de las muestras de sangre heparinizada de un individuo alérgico a Der p. Se incubaron las células con concentraciones crecientes (10-6 a 1 μg/ml) de nDer p 1, rDer p 5 y alérgeno derivado del clon 25 respectivamente. Se midió mediante radioinmunoensayo (Immunotech, Marsella, Francia) la histamina liberada en el sobrenadante libre de células y se indicó en forma del porcentaje de liberación total de histamina. Los resultados se representaron como valores medios de determinaciones por triplicado. Tal como se muestra en la Figura 2, tanto el nuevo alérgeno codificado por el clon 25 de ADNc como el rDer p 5 indujeron ya una liberación máxima de histamina a 10 pg/ml, mientras que el alérgeno mayor nDer p 1 indujo una liberación máxima de histamina sólo a una concentración de 1 ng/ml.
Ejemplo 3: El nuevo alérgeno recombinante no presenta reactividad cruzada con Der p 5
El nuevo alérgeno codificado por el clon 5 muestra homología con otros alérgenos de los ácaros del polvo (Fig. 3A), a saber con los alérgenos del grupo 5 de Lepidoglyphus destructor (Lep d 5), Blomia tropicalis (Blo t 5) y Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 5). Debido a la identidad de aminoácidos del 30 % entre el nuevo alérgeno y Der p 5, el alérgeno derivado del clon 25 pertenece a un nuevo grupo desconocido hasta la fecha de alérgenos de ácaros del polvo. Los experimentos de inhibición con transferencia por puntas (dot blot) demostraron que Der p 5 y el nuevo alérgeno no comparten epítopos de IgE. Se transfirió a tiras de celulosa un μg de Der p 5, del alérgeno derivado del clon 25 y de BSA. Se incubaron las tiras con sueros de nueve pacientes con reactividad frente a Der p 5 y al nuevo alérgeno y con un suero de un paciente no alérgico, que previamente habían sido adsorbidos con 10 μg/ml cada uno de rDer p 5, el alérgeno derivado del clon 5 y BSA. Los anticuerpos IgE fijados se detectaron con anticuerpos IgE anti-humanos marcados con 125I (Fig. 3B).
La adsorción previa de los sueros procedentes de pacientes alérgicos a ácaros con el nuevo alérgeno inhibe la unión de la IgE al nuevo alérgeno transferido y también la adsorción previa de los sueros con rDer p 5 inhibe la unión de la IgE al rDer p 5 transferido. Sin embargo, la adsorción previa de rDer p 5 no inhibió la unión de la IgE al nuevo alérgeno y viceversa, demostrando así la ausencia de reactividad cruzada entre rDer p 5 y el nuevo alérgeno.
Ejemplo 4: La inmunización con el nuevo alérgeno de ácaro induce en conejos anticuerpos IgG que reconocen el nuevo alérgeno
Con el fin de verificar si el nuevo alérgeno de ácaro es inmunogénico, se inmunizó a un conejo con el nuevo alérgeno usando adyuvante de Freund. Se inmunizó al conejo con 200 μg/inyección usando una vez adyuvante completo de Freund y dos veces el incompleto (Charles River, Kiβlegg, Alemania).
La inducción de anticuerpos IgG se estudió por medio de ELISA. Se recubrió con Der p 2, rDer p 5 y el alérgeno derivado del clon 25, cada uno de ellos a una concentración de 5 μg/ml, una placa ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante toda la noche a 4 ºC y después se incubó con el antisuero de alérgeno derivado del clon 25 diluido a 1:10.000 y un suero preinmune de conejo como control. Los anticuerpos de conejo fijados se detectaron con anticuerpos Ig anti-conejo de asno con HRP conjugado (Amersham).
Con el nuevo alérgeno de ácaros se indujeron títulos altos de anticuerpos IgG específicos. El anticuerpo inducido con el alérgeno derivado del clon 25 reacciona específicamente con el alérgeno derivado del clon 25 y no se pudo detectar ninguna reactividad cruzada con rDer p 2 y rDer p 5 (Figura 4).
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<120> Alérgeno de ácaros del polvo doméstico
<130> Alérgeno Der p
<160> 5
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 1
<210> 2
<211> 473
<212> ADN
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 2
<210> 3
<211> 110
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<213> Lepidoglyphus destructor
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<211> 134 10 <212> PRT
<213> Blomia tropicalis
<400> 4
<210> 5
5 <211> 132
<212> PRT
<213> Dermatophagoides pteronyssinus
<400> 5
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1. Un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:a) polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1;b) polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1; yc) polipéptidos que consisten en un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1.
-
- 2.
- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1.
-
- 3.
- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende los aminoácidos 20 a 140 que se muestran en la SEC ID N.º 1.
-
- 4.
- Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
a) polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID N.º 1;b) polinucleótidos que codifican un polipéptido tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.o la hebra complementaria de tal polinucleótido. -
- 5.
- El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Fig. 1A.
-
- 6.
- El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende los nucleótidos 81 a 434 de la secuencia que se muestra en la Fig. 1A.
-
- 7.
- Un plásmido o vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
-
- 8.
- Una célula que contiene el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que dicha célula no es una célula dentro de un ser humano.
-
- 9.
- La célula de acuerdo con la reivindicación 8, que está seleccionada del grupo que consiste en células vegetales, células bacterianas y células de levaduras.
-
- 10.
- Un procedimiento de preparación del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de cultivar células tal como se define en la reivindicación 8 o 9 en un medio en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido y opcionalmente la posterior recuperación del polipéptido desde las células y/o el medio.
-
- 11.
- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 en el que se rompen las células y se recupera el polipéptido usando cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de afinidad.
-
- 12.
- Un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
-
- 13.
- Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, opcionalmente en combinación con uno o más excipientes y/o diluyentes y/o vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
-
- 14.
- Un kit de diagnóstico que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12.
-
- 15.
- Uso del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención o el diagnóstico de un trastorno alérgico, en el que el trastorno alérgico es sensibilización o alergia a los ácaros del polvo doméstico o los ácaros de almacén. -
- 16.
- El uso de acuerdo con la reivindicación 15 en el que el medicamento es para administrar a un individuo a desensibilizar.
Figura 1AFigura 2A- Proteína recombinante
- Reactividad IgE delpaciente (n=117) Porcentaje de reactividad IgE
- Alérgeno derivado del clon 25
- 30 26
19 20Figura 3A21 22 23
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