JP2008507262A - 低下したアレルギー誘発性および維持されたｔ細胞反応性を有するイネ科からのｉ型のアレルゲンの変異体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低下したＩｇＥ反応性および同時に十分に維持されたＴリンパ球との反応性を特徴とする、イネ科（ドジョウツナギ）のＩ型のアレルゲンの変異体の調製および使用に関する。これらの低アレルギー誘発性のアレルゲンの変異体は、草花粉症を有する患者の特異的な免疫療法（減感作療法）に、または草花粉症の予防的免疫療法に用いることができる。
Description
本発明は、既知の野生型アレルゲンと比較して低下したＩｇＥ反応性を特徴とする、および同時に十分に維持されたＴリンパ球との反応性を特徴とする、イネ科(Poaceae)（ドジョウツナギ(sweet grasses)）のＩ型のアレルゲンの変異体の調製および使用に関する。
これらの低アレルギー誘発性のアレルゲンの変異体は、草花粉症の患者の特定の免疫療法（低感作）または草花粉症の予防的免疫療法のために用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ(timothy grass)(Phleum pratense)の花粉からの主要アレルゲンPhl p 1の変異体に関する。
これらの低アレルギー誘発性のアレルゲンの変異体は、草花粉症の患者の特定の免疫療法（低感作）または草花粉症の予防的免疫療法のために用いることができる。
本発明の好ましい態様は、オオアワガエリ(timothy grass)(Phleum pratense)の花粉からの主要アレルゲンPhl p 1の変異体に関する。
発明の背景
Ｉ型アレルギーは世界的な重要性を有する。先進工業国の人口の２０％までがアレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病訴にさいなまれている。これらのアレルギーは、植物の花粉、ダニ、イヌまたはネコなどの、さまざまな発生源により遊離する、空気中に存在するアレルゲン（アエロアレルゲン）により引き起こされる。４０％までのこれらのＩ型アレルギーの罹患者は同様に、草花粉アレルゲンで特異的なＩｇＥ反応性を示す(Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78: 1190-2002)。
Ｉ型アレルギーは世界的な重要性を有する。先進工業国の人口の２０％までがアレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病訴にさいなまれている。これらのアレルギーは、植物の花粉、ダニ、イヌまたはネコなどの、さまざまな発生源により遊離する、空気中に存在するアレルゲン（アエロアレルゲン）により引き起こされる。４０％までのこれらのＩ型アレルギーの罹患者は同様に、草花粉アレルゲンで特異的なＩｇＥ反応性を示す(Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78: 1190-2002)。
Ｉ型アレルギーの誘発となる物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を介する吸収ののちに、これらのアレルゲンは感作されたヒトのマスト細胞の表面に結合したＩｇＥ分子と反応する。アレルゲンにより２つのＩｇＥがお互いに架橋することにより、エフェクター細胞により媒介（例えば、ヒスタミン、ロスタグランジン）およびサイトカインの放出が結果として起こり、このようにして対応する臨床徴候が結果として起こる。
個々のアレルゲン分子がアレルギー罹患者のＩｇＥ抗体と反応する相対的な頻度に依存して、主要アレルゲンおよびマイナーアレルゲンとの間の識別がなされる。
オオアワガエリ(Phleum pratense)の場合、Phl p 1(Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796)、Phl p 5(Matthiesen and Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109)、Phl p 6(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54)、Phl p 2/3(Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304)、Phl p 4(Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198)およびPhl p 13(Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)が今までに主要アレルゲンとして同定されてきている。
オオアワガエリ(Phleum pratense)の場合、Phl p 1(Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796)、Phl p 5(Matthiesen and Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109)、Phl p 6(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54)、Phl p 2/3(Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304)、Phl p 4(Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198)およびPhl p 13(Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)が今までに主要アレルゲンとして同定されてきている。
オオアワガエリ(Phleum pratense)の優勢な主要アレルゲンは、Phl p 1およびPhl p 5である。イネ科からの草の主要アレルゲンは大いに互いに相同であり、結果として非常に類似した生化学的よび遺伝学的特性を有し、これらの関連するタンパク質はＩ型およびＶ型のアレルゲンとしてグループ化される。Ｉ型のアレルゲンは草花粉症罹患者の９５％より多くにおいてＩｇＥ抗体とともに反応し、それゆえ草花粉の優勢な主要アレルゲンである。
Ｉ型のアレルゲンは３２ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質であり、花粉粒の細胞質に局在する。花粉粒の上気道粘膜との接触ならびに雨による花粉粒の浸潤は、急速なこれらのアレルゲンの放出を導く。急速なＩ型のアレルゲンの放出は、細胞より小さい微粒子の形でもまた下気道内部への浸入を可能とし、結果として重篤な喘息の発作の誘発となりうる。
Phleum pratense(Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94: 689-698)、Lolium perenne(Perez et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16210-16250)、Holcus lanatus(Schramm et al., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 1999:781-787)、Poa pratensis(Sturaro u. Viotti, 1998, NCBI GenBank, Acc. No. AJ 131850)、Cynodon dactylon(Smith et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98 : 331-343)、Phalaris aquatica(Suphioglu et al., 1995, Clin. Exp. Allergy 25 : 853-865)およびOryza sativa(Xu et al., 1995, Gene 164: 255-259)からのＩ型アレルゲンのｃＤＮＡが同定されている。
これらの配列のはじめの記載に加えて、個々の部位で原型の配列と異なる、さらなるＩ型のアレルゲン配列がデータベースで発表されてきている。かかるアイソフォームはまた、他の草花粉アレルゲンとして知られている。
相同性のために、ドジョウツナギ（イネ科）のＩ型のアレルゲンは、ヒトＩｇＥ抗体との高い交差反応性を有する(Laffer et al., 1996, Mol. Immunology 33: 417-426)。この免疫学的交差反応性は、図１で選択された種からのＩ型分子と非常に類似した、Phleum pratense(Phleum pratense)のＩ型のアレルゲンであるPhl p 1との配列の比較により示される、アミノ酸配列を基にしている。
相同性のために、ドジョウツナギ（イネ科）のＩ型のアレルゲンは、ヒトＩｇＥ抗体との高い交差反応性を有する(Laffer et al., 1996, Mol. Immunology 33: 417-426)。この免疫学的交差反応性は、図１で選択された種からのＩ型分子と非常に類似した、Phleum pratense(Phleum pratense)のＩ型のアレルゲンであるPhl p 1との配列の比較により示される、アミノ酸配列を基にしている。
イネ科の他のＩ型のアレルゲンにおける相同な配列の領域は、低アレルギー誘発性変異体の構築においてここに記述するPhl p 1アミノ酸配列欠失の配列領域に対して、ならびに該フランキング配列領域に対して存在する。さらに、イネ科のＩ類のアレルゲンのシステインの数、ならびに取り囲む配列領域もまた保持されている。配列の相同性のために、イネ科のＩ型のアレルゲンはβ−エクスパンシンのタンパク質ファミリーに分類されている(Cosgrove D.J., 2000 Nature 407: 321-6)。
アレルギーの効果的な治療的な処置に対する古典的な手段は、特異的な免疫療法または減感作であり(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339: Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562)、天然のアレルゲン抽出物を増量した用量で患者の皮下へ注入する。しかしながら、この方法にはアレルギー反応のリスク、またはアナフィラキシーショックのリスクさえもある。これらのリスクを最小化するために、アレルゴイドの形式の革新的な調製物を用いる。これらは、明らかに低下したＩｇＥ反応性ではあるが、非処理の抽出物と比較して独自のＴ細胞反応性を有する、化学的に修飾したアレルゲン抽出物である。これらのＴ細胞のエピトープは、減感作におけるアレルゲンの調製の治療的な行為に対して、決定的に重要である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382)。
より大きい程度の治療的な最適化が、組換えの方法により調製したアレルゲンで可能になるであろう。組換えの方法により、所望ならば患者の個々の感作パターンに適合させて調製された高純度のアレルゲンの定義されたカクテルが、天然のアレルゲンの起源からの抽出物に取って変わるであろう。なぜなら後者はさまざまなアレルゲンに加えて、比較的多数の免疫原性であるが非アレルギー性を伴うタンパク質を含むからである。
組換え発現産生物で安全な減感作が結果として起こるかもしれないという現実的な展望が、治療に必須なＴ細胞エピトープが損傷されることなくＩｇＥエピトープが特異的に削除された、特異的に変異した組換えアレルゲンにより提供されている(Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414)。
減感作に対する異なる概念は、防御免疫反応は特に、ＩｇＧ４抗体により作用が阻害されることで誘発されるという事実に基づいている。この仮説に基づき、組換えPhl p 1断片は防御的ＩｇＧ４反応の誘発に適合すると言われていると記述されてきた(Ball et al., 1999, FASEB J. 13:1277-1290)。この概念は低下したＩｇＥ反応性および維持されたＴ細胞反応性を有する低アレルギー誘発性のアレルゲンの変異体の概念と完全に異なる。
減感作に対する異なる概念は、防御免疫反応は特に、ＩｇＧ４抗体により作用が阻害されることで誘発されるという事実に基づいている。この仮説に基づき、組換えPhl p 1断片は防御的ＩｇＧ４反応の誘発に適合すると言われていると記述されてきた(Ball et al., 1999, FASEB J. 13:1277-1290)。この概念は低下したＩｇＥ反応性および維持されたＴ細胞反応性を有する低アレルギー誘発性のアレルゲンの変異体の概念と完全に異なる。
治療的な方法によりアレルギー罹患者において支障をきたすＴヘルパー細胞バランスに影響する他の可能性は、関連したアレルゲンをエンコードする発現ＤＮＡでの治療（免疫療法のＤＮＡワクチン接種）である。免疫反応に対するアレルゲン特異的な実験的な効果の確証が、げっ歯類におけるアレルゲンをエンコードするＤＮＡの注射により得られてきた(Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544)。
本発明が基とする目的は、十分に維持されたＴ細胞反応性を伴う低下したＩｇＥ活性により区別され、それゆえ治療的および予防的な特異的免疫療法および免疫療法のＤＮＡワクチン接種に好適な、タンパク質およびＤＮＡレベルでのイネ科のＩ型のアレルゲンの新規の変異体を提供することにある。
図
図１は、イネ科種：Poa pratensis (Poa p)、Holcus lanatus (Hol l)、Lolium perenne (Lol p)、Cynodon dactylon (Cyn d)、Oryza sativa (Ory s)およびPhalaris aquatica (Pha a)のPhl p 1相同性アミノ酸配列（ｃＤＮＡ配列から推定した成熟タンパク質の配列）の構造であり、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI, Bethesda, USA)の"GenBank"データベースからのｃＤＮＡ配列から推定したタンパク質配列であり、番号は成熟タンパク質のアミノ酸部位であり、下線で強調するのはPhl p 1の配列と異なるアミノ酸であり、四角囲みはシステインであることを示す図である。
図１は、イネ科種：Poa pratensis (Poa p)、Holcus lanatus (Hol l)、Lolium perenne (Lol p)、Cynodon dactylon (Cyn d)、Oryza sativa (Ory s)およびPhalaris aquatica (Pha a)のPhl p 1相同性アミノ酸配列（ｃＤＮＡ配列から推定した成熟タンパク質の配列）の構造であり、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI, Bethesda, USA)の"GenBank"データベースからのｃＤＮＡ配列から推定したタンパク質配列であり、番号は成熟タンパク質のアミノ酸部位であり、下線で強調するのはPhl p 1の配列と異なるアミノ酸であり、四角囲みはシステインであることを示す図である。
図２は、加工されたPhl p1野生型タンパク質および変異体Phl p1 NoCysの配置であり、Phl p1 Wt(野生型)はｃＤＮＡ配列から推定したタンパク質配列（全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI), Bethesda, USAの"GenBank"データベースエントリーZ27090）であり、番号は成熟タンパク質のアミノ酸部位であり、四角囲みはPhl p 1 NoCysにおけるセリンによるシステインの置換アミノ酸置換であることを示す図である。
図３は、低アレルギー誘発性の変異体Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のアミノ酸配列の配置であり、例示の目的で示すものであり、番号はアミノ酸部位であり、下線により強調するのは欠失であることを示す図である。
図３は、低アレルギー誘発性の変異体Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のアミノ酸配列の配置であり、例示の目的で示すものであり、番号はアミノ酸部位であり、下線により強調するのは欠失であることを示す図である。
図４は、組換え変異体Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび同一性の確認を示す図である。
Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｂ：aPhl p 1抗体(Allergopharma)でのウェスタンブロット
１．マーカータンパク質
２．nPhl p 1＊
３．rPhl p 1 Wt (ヒスチジンタグなし)＊
４．マーカータンパク質
５．Phl p 1 NoCys (ヒスチジンタグ付加)
６．Phl p 1 NoCys Δ213-220 (ヒスチジンタグ付加)
７．Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220 (ヒスチジンタグ付加)
８．マーカータンパク質
＊ 低下したサンプル(ジチオトレイトール)
Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｂ：aPhl p 1抗体(Allergopharma)でのウェスタンブロット
１．マーカータンパク質
２．nPhl p 1＊
３．rPhl p 1 Wt (ヒスチジンタグなし)＊
４．マーカータンパク質
５．Phl p 1 NoCys (ヒスチジンタグ付加)
６．Phl p 1 NoCys Δ213-220 (ヒスチジンタグ付加)
７．Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220 (ヒスチジンタグ付加)
８．マーカータンパク質
＊ 低下したサンプル(ジチオトレイトール)
図５は、非変性条件下でのPhl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のＩｇＥ結合能を確認するためのストリップ試験を示す図である。
１）rPhl p 1 Wt
２）Phl p 1 NoCys
３）Phl p 1 NoCys Δ213-220
４）Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220
５）rPhl p 1 Wt
ＴＰ：総タンパク質着色
Ｐ：臨床的に決定した草花粉症罹患者の血清
１）rPhl p 1 Wt
２）Phl p 1 NoCys
３）Phl p 1 NoCys Δ213-220
４）Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220
５）rPhl p 1 Wt
ＴＰ：総タンパク質着色
Ｐ：臨床的に決定した草花粉症罹患者の血清
図６は、草花粉症罹患者（Ｐ）からの４つの代表する血清でのＥＡＳＴ阻害試験によるPhl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-22の低下したＩｇＥ反応性の決定を示す図である。
図７は、４人の草花粉症罹患者（Ｐ）からの好塩基球での好塩基球活性化試験によるPhl p 1 NoCysの低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
図７は、４人の草花粉症罹患者（Ｐ）からの好塩基球での好塩基球活性化試験によるPhl p 1 NoCysの低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
図８は、４人の草花粉症罹患者（P)からの好塩基球での好塩基球活性化試験によるPhl p 1 NoCys Δ213-220の低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
図９は、４人の草花粉症罹患者（Ｐ）からの好塩基球での好塩基球活性化試験によるPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
図９は、４人の草花粉症罹患者（Ｐ）からの好塩基球での好塩基球活性化試験によるPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の低アレルギー誘発性の決定を示す図である。
変異体の土台を導く研究は、Phl p 1をモデルアレルゲンとして用いて実施された。図１で示される配列構造より、Ｉ型内での高い相同性のために、開始点が他のＩ型のアレルゲンの場合でも同様の結果が得られるということが明らかになった。
このようにして、このＩ型のアレルゲンの配列はいまだに未知ではあるが、上記および下記で得られる結果はSecale cereale由来のSec c 1でもまた適用することができ、または、Sec c 1を用いて得られるであろうこともまた仮定できるに違いない。
このようにして、このＩ型のアレルゲンの配列はいまだに未知ではあるが、上記および下記で得られる結果はSecale cereale由来のSec c 1でもまた適用することができ、または、Sec c 1を用いて得られるであろうこともまた仮定できるに違いない。
それゆえ、本発明は既知の野生型アレルゲンと比較して低下したＩｇＥ反応性および維持されたＴリンパ球との反応性を特徴とする、イネ科のＩ型のアレルゲンの変異体に関する。これらのＩ型のアレルゲンは、好ましくは、Phleum pratense、Lolium perenne、Poa pratensis、Holcus lanatus、Cynodon dactylon、Oryza sativaおよびPhalaris aquatica由来のPhl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1、Cyn d 1、Ory s 1およびPha a 1である。より好ましいのは、Phl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1またはPha a 1であり、非常に特に好ましいのは、Phl p 1である。
Ｉ型のアレルゲンの低アレルギー誘発性の変異体の構築のための開始点は、野生型Phl p 1のｃＤＮＡであり、これは、Phleum pratenseの花粉の総ｃＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により特異的なプライマーを用いて単離された("GenBank" entry Z27090; NCBI, Bethesda, USA) (配列番号１)。
配列番号２のアミノ酸配列を、野生型Phl p 1のｃＤＮＡ配列から推測した。
Phl p 1は２４０個のアミノ酸からなっていて、天然形態ではグリコシル化されており、−全てのＩ型のアレルゲンのように(図１参照)−成熟分子中の７つのシステインの存在を特徴とする。Cyn d 1およびOry s 1を除外すると、これらのアミノ酸の位置は全てのＩ型のアレルゲン中の４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９番である(Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol 95: 987-994)。
配列番号２のアミノ酸配列を、野生型Phl p 1のｃＤＮＡ配列から推測した。
Phl p 1は２４０個のアミノ酸からなっていて、天然形態ではグリコシル化されており、−全てのＩ型のアレルゲンのように(図１参照)−成熟分子中の７つのシステインの存在を特徴とする。Cyn d 1およびOry s 1を除外すると、これらのアミノ酸の位置は全てのＩ型のアレルゲン中の４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９番である(Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol 95: 987-994)。
Phl p 1は大腸菌において非グリコシル化タンパク質として発現してきた。組換え野生型タンパク質(rPhl p 1 wt)は、天然の精製したPhl p 1 (nPhl p 1)との反応性を有する、草花粉症罹患者からのＩｇＥ抗体と反応する(Petersen et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 315-321)。
発明の詳細な説明
低アレルギー誘発性のPhl p 1変異体の調製および特徴化
前述のrPhl p 1 wtのｃＤＮＡから始まり、遺伝子技術により修飾されたPhl p 1の組換え変異体が調製された。
低アレルギー誘発性のPhl p 1変異体の調製および特徴化
前述のrPhl p 1 wtのｃＤＮＡから始まり、遺伝子技術により修飾されたPhl p 1の組換え変異体が調製された。
野生型で存在する７つのシステインの代わりに、組換え変異体Phl p 1 NoCys （配列番号４）のアミノ酸配列は７つのセリン残基を有する（図２）。変異体Phl p 1 NoCysはさまざまな欠失変異体の構築のための開始点としての役割をした。これらにおいて、それぞれの場合、Phl p 1 NoCysをエンコードする１５から９０ｂｐの長さを有する個々のセクションまたはこれらのセクションの組み合わせが削除され、結果として大腸菌で発現されるタンパク質のポリペプチド鎖においてアミノ酸１〜６、１〜３０、９２〜１０４、１１５〜１１９、１７５〜１８５および２１３〜２２０に対応する欠失が起こる：Phl p 1 NoCys Δ1-6（配列番号５および６）、Phl p 1 NoCys Δ1-30（配列番号７および８)、Phl p 1 NoCys Δ92-104（配列番号９および１０)、Phl p 1 NoCys Δ115-119（配列番号１１および１２)、Phl p 1 NoCys Δ175-185（配列番号１３および１４)、Phl p 1 NoCys Δ213-220（配列番号１５および１６)、ならびにPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220（配列番号１７および１８)。
該組換えタンパク質は、大腸菌においてヒスチジン融合タンパク質として発現した。該免疫学的特徴付けは、この種の融合タンパク質とともに実施された。
該組換えタンパク質は、大腸菌においてヒスチジン融合タンパク質として発現した。該免疫学的特徴付けは、この種の融合タンパク質とともに実施された。
はじめに、ニトロセルロース膜上に固定化したのちに、代表的な血清プールのＩｇＥ抗体により、および草花粉症罹患者からの個々の血清のＩｇＥ抗体により、結合能に関して組換え変異体を調査した（ストリップ試験(strip test)）。この方法において、ＩｇＥ抗体のPhl p 1 NoCysへの低下した結合が驚異的に観察された。この結果により溶液における固定化されていないタンパク質のＩｇＥ抗体へのＩｇＥ結合能を調べる、ＩｇＥ阻害試験（ＥＡＳＴ）により確認された。
それゆえ、本発明は特に、対応する成熟Phl p 1タンパク質のアミノ酸部位４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインが除去されたか、もしくは他のアミノ酸によって置換されたＩ型のアレルゲンの変異体に関する。ここで特に好ましいのは、Phl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1またはPha a 1、特にPhl p 1に対応する変異体である。
低下したＩｇＥ抗体の結合は、７つのシステインのうち少なくとも２つが置換されずに除去される、もしくは他のアミノ酸によって置換された場合に得られた。しかしながら、好ましくは、７つ全てのシステインがセリンにより置換される場合である。
低下したＩｇＥ抗体の結合は、７つのシステインのうち少なくとも２つが置換されずに除去される、もしくは他のアミノ酸によって置換された場合に得られた。しかしながら、好ましくは、７つ全てのシステインがセリンにより置換される場合である。
エフェクター細胞の膜結合ＩｇＥの架橋期間の機能的作動に対するPhl p 1 NoCysの低下したＩｇＥ結合能の影響、およびin vitroにおけるその活性化を、草花粉症罹患者由来の好塩基球の活性化試験により調査した。Phl p 1 NoCysはrPhl p 1 wtと比較して顕著に低い好塩基球の活性化、およびこのようにして機能的に低下したアレルギー誘発性を示した。
Phl p 1 NoCysを基にして調製されたさまざまな欠失変異体を、ＩｇＥ結合能（ストリップ試験、およびＥＡＳＴ）および機能的作動（塩基性活性化）に関して同様の方法により調査した。驚くことに、欠失変異体は特別に強い低アレルギー誘発性の特性を示した。
Phl p 1 NoCysを基にして調製されたさまざまな欠失変異体を、ＩｇＥ結合能（ストリップ試験、およびＥＡＳＴ）および機能的作動（塩基性活性化）に関して同様の方法により調査した。驚くことに、欠失変異体は特別に強い低アレルギー誘発性の特性を示した。
それゆえ本発明はさらに、Ｉ型のアレルゲンの変異体に関するものであり、−任意にシステインが除去もしくは置換された上記の変異体に加えて−、成熟Phl p 1タンパク質の本来の配列の１〜６、１〜３０、９２〜１０４、１１５〜１１９、１７５〜１８５および２１３〜２２０のアミノ酸に対応する少なくとも１つの領域または領域の組み合わせが野生型のアレルゲンと比較して欠失している。
ここで特に好ましいのは、Ｉ型のアレルゲンPhl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1およびPha a 1の対応する欠失変異体である。非常に特に好ましいのは、対応するPhl p 1変異体である。
ここで特に好ましいのは、Ｉ型のアレルゲンPhl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1およびPha a 1の対応する欠失変異体である。非常に特に好ましいのは、対応するPhl p 1変異体である。
特に好ましいのは、特に、対応する成熟Phl p 1の配列の２１３〜２２０のアミノ酸、または同時に１〜６および１１５〜１１９のアミノ酸が欠失しているＩ型のアレルゲンの変異体であり、それゆえ本発明は同様にそれに関する。ここでより好ましいのは、再びPhl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1およびPha a 1アレルゲンであり、Phl p 1が非常に特別に好ましい。
特異的な免疫療法の基盤を形成する低アレルギー誘発性Phl p 1変異体のＴ細胞の反応性をin vitroにおいて草花粉症罹患者由来のPhl p 1特異的Ｔリンパ球を用いた増殖試験(proliferation test)で調べた。修飾されたアレルゲンは十分に維持されたＴ細胞反応性を示し、低アレルギー誘発性Phl p 1変異体の免疫療法での使用を可能にした。
本発明によりアレルゲンの変異体は、遺伝子工学を用いてクローン化したＤＮＡ配列から開始して調製することができる。しかしながら、原則として、天然のアレルゲン抽出物の化学的な修飾もまた関連してもよい(Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382)。異なる部位のさらなる修飾−例えば、低アレルギー誘発性を増加させるために−もまた、もちろん、本特許出願記載のＩ型のアレルゲンの変異体を超えて可能である。これらの修飾は、例えば、アミノ酸の挿入、削除および置換、タンパク質の断片への切断、タンパク質および断片それ自体の他のタンパク質またはペプチドとの融合であることができる。本発明はさらに、上記のアレルゲンの変異体、このＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター、ならびに前記ＤＮＡ分子または前記発現ベクターで形質転換された宿主有機体をエンコードするＤＮＡ分子に関する。好適な宿主有機体は、バクテリアまたは酵母などの原核または真核の、単細胞または多細胞有機体であることができる。本発明に従い好ましい宿主有機体は、大腸菌である。
本発明はさらに、前記宿主有機体を培養し、対応するアレルゲンの変異体を培養物から単離することにより、本発明によるアレルゲンの変異体を調製する方法に関する。
加えて、本発明は薬剤としての特性のある、上記のアレルゲンの変異体、ＤＮＡ分子および発現ベクターに関する。
加えて、本発明は薬剤としての特性のある、上記のアレルゲンの変異体、ＤＮＡ分子および発現ベクターに関する。
本発明はさらに、イネ科のＩ型のアレルゲンが誘発に関与するアレルギーの処置のための、またはイネ科のＩ型のアレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的なワクチン接種のための、および／またはかかるアレルギーの予防のための、少なくとも１つのこれらのアレルゲンの変異体または対応するＤＮＡ分子または対応する発現ベクター、および任意にさらに活性分子および／またはアジュバントを含む医薬組成物に関する。
医薬組成物がセカンドタイプである場合（少なくとも１つのＤＮＡ分子または発現ベクターを含む）、これらの組成物は好ましくはさらに、水酸化アルミニウム、オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激的ＣｐＧまたは前記の２つの組み合わせを、アジュバントとして含む。
医薬組成物がセカンドタイプである場合（少なくとも１つのＤＮＡ分子または発現ベクターを含む）、これらの組成物は好ましくはさらに、水酸化アルミニウム、オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激的ＣｐＧまたは前記の２つの組み合わせを、アジュバントとして含む。
本発明の目的のために、医薬組成物はヒト医学のまたは獣医学において治療剤として用いることができる。好適な賦活剤は、非経口の投与に適合し本発明によるＩ型のアレルゲンの変異体と反応しない、有機物および無機物である。非経口の使用に適合するのは、特に溶液、好ましくは油性または水性の溶液、さらには懸濁液、乳液またはインプラントである。本発明によるアレルゲンの変異体はまた、凍結乾燥されていてもよく、得られる凍結乾燥物は例えば注射製剤の調製のために用いられる。指示したところの組成物は、滅菌してもよく、ならびに／あるいは潤滑剤、保存料、安定剤および／または湿潤剤などのアジュバント、乳化剤、浸透圧を加減するための塩、バッファー物質および／または多数のさらなる活性化合物を含んでもよい。
さらに、遅延放出製剤は、本発明によるアレルゲンの変異体の適切な剤により、例えば水酸化アルミニウム上に吸収させることにより得ることができる。
さらに、遅延放出製剤は、本発明によるアレルゲンの変異体の適切な剤により、例えば水酸化アルミニウム上に吸収させることにより得ることができる。
最終的に、本発明はさらに、イネ科のＩ型のアレルゲンが関連する引き金におけるアレルギーの処置のための、またはイネ科のＩ型のアレルゲンが関連する引き金におけるアレルギーを有する患者の免疫治療的なワクチン接種のための、ならびに／あるいはかかるアレルギーの予防のための、少なくとも１つの本発明によるアレルゲンの変異体、または本発明によるＤＮＡ分子、または本発明による発現ベクターの使用に関する。
変異体Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220（図３）の調製およびその免疫学的特徴化を、上記の遺伝子工学修飾のある低アレルギー誘発性Phl p 1 変異体の例証として、以下に述べる。
変異体Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220（図３）の調製およびその免疫学的特徴化を、上記の遺伝子工学修飾のある低アレルギー誘発性Phl p 1 変異体の例証として、以下に述べる。
組換えPhl p 1変異体の発現および精製
組換えタンパク質は、大腸菌（JM109株）でヒスチジン融合タンパク（発現ベクターpProExHT；Invitrogen, Carlsbad, USA）として発現した。rPhl p 1 wtおよび該変異体を、はじめはＮ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレート基質（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ）への特異的な結合により、それに続き調製ゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）により精製した。溶出した精製タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣによりモニターした（図４Ａ）。精製したタンパク質の同一性はPhl p 1特異的モノクローナル抗体の結合により実証された（図４Ｂ）。
組換えタンパク質は、大腸菌（JM109株）でヒスチジン融合タンパク（発現ベクターpProExHT；Invitrogen, Carlsbad, USA）として発現した。rPhl p 1 wtおよび該変異体を、はじめはＮ末端ヒスチジン残基のＮｉ２＋キレート基質（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ＩＭＡＣ）への特異的な結合により、それに続き調製ゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）により精製した。溶出した精製タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣによりモニターした（図４Ａ）。精製したタンパク質の同一性はPhl p 1特異的モノクローナル抗体の結合により実証された（図４Ｂ）。
組換えPhl p 1変異体の低下したＩｇＥ結合の実証
膜結合性試料タンパク質での、アレルギー罹患者からの血清からの特異的なＩｇＥ反応性の決定のための単純な試験的方法は、ストリップテストである。
本目的のために、試験物質を同濃度および同量でニトロセルロース膜のストリップ上に非変性状態下で互いに平行に結合させる。一連のかかる膜ストリップは平行にアレルギー罹患者からの異なる血清とともに培養することができる。洗浄段階ののちに、抗ヒトＩｇＥ／アルカリフォスファターゼ接合により進められた呈色反応により、特異的に結合したＩｇＥ抗体は膜上で可視となる。
膜結合性試料タンパク質での、アレルギー罹患者からの血清からの特異的なＩｇＥ反応性の決定のための単純な試験的方法は、ストリップテストである。
本目的のために、試験物質を同濃度および同量でニトロセルロース膜のストリップ上に非変性状態下で互いに平行に結合させる。一連のかかる膜ストリップは平行にアレルギー罹患者からの異なる血清とともに培養することができる。洗浄段階ののちに、抗ヒトＩｇＥ／アルカリフォスファターゼ接合により進められた呈色反応により、特異的に結合したＩｇＥ抗体は膜上で可視となる。
個々の草花粉症罹患者からの血清を用いたPhl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220に対するストリップテストの結果を、上述の修飾Phl p 1分子の例証としてここで描く（図５）。
天然のPhl p 1に対して強いＩｇＥ力価を有するアレルギー罹患者からの血清のみを用いた。これらの患者からのＩｇＥ抗体は同様に組換えの同等なrPhl p 1 wtと反応する。
全ての患者の血清のPhl p 1特異的なＩｇＥ抗体が、組換え変異体Phl p 1 NoCysに低下した程度で結合するが、野生型アレルゲンPhl p 1にはしないことが明らかとなった。
天然のPhl p 1に対して強いＩｇＥ力価を有するアレルギー罹患者からの血清のみを用いた。これらの患者からのＩｇＥ抗体は同様に組換えの同等なrPhl p 1 wtと反応する。
全ての患者の血清のPhl p 1特異的なＩｇＥ抗体が、組換え変異体Phl p 1 NoCysに低下した程度で結合するが、野生型アレルゲンPhl p 1にはしないことが明らかとなった。
ＩｇＥ結合能におけるさらに大きな減少が、付加的なある配列部位の除去により達成され、変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220を参照として描く。変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220は、非修飾の野生型タンパク質と比較して、全ての試験したアレルギー罹患者からの血清との非常に大きく低下したＩｇＥ結合能を示す。ある血清からのＩｇＥ抗体へのPhl p 1のＩｇＥ結合能のさらなる減少は多くの欠失の組み合わせにより達成でき、このことは変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の草花粉症罹患者血清P14との試験結果から明らかである（図５）。
このようにして、システインの置換ならびに特異的な配列部位の欠失の両方が、Phl p 1分子のＩｇＥ結合能を低下させることが明らかになる。
このようにして、システインの置換ならびに特異的な配列部位の欠失の両方が、Phl p 1分子のＩｇＥ結合能を低下させることが明らかになる。
ストリップテストと対照的に、ＥＡＳＴ阻害試験（enzyme allergosorbent test）は溶液中のアレルゲン／ＩｇＥ相互作用の調査を可能にし、膜上への固定化により基本的に除外された試験物質のエピトープのマスキングの干渉を除外することができる。
ＥＡＳＴ阻害試験は、以下のように実行する。マイクロタイタープレートをアレルゲン、ここではnPhl p 1で被覆する。非結合アレルゲンを洗浄により除去した後に、後の非特異的な結合を防ぐためにウシ血清アルブミンを用いてプレートをブロックする。アレルギー罹患者からのＩｇＥ抗体を、個々の血清の提示プール（血清プール）として、または個々の血清として、好適な希釈でアレルゲンコートしたマイクとタイタープレートとともに培養する。アレルゲン結合ＩｇＥ抗体の量は、色の付いた最終生成物にする基質の反応により共役した抗ｈＩｇＥ／アルカリフォスファターゼを介して光学的に定量化する。
ＥＡＳＴ阻害試験は、以下のように実行する。マイクロタイタープレートをアレルゲン、ここではnPhl p 1で被覆する。非結合アレルゲンを洗浄により除去した後に、後の非特異的な結合を防ぐためにウシ血清アルブミンを用いてプレートをブロックする。アレルギー罹患者からのＩｇＥ抗体を、個々の血清の提示プール（血清プール）として、または個々の血清として、好適な希釈でアレルゲンコートしたマイクとタイタープレートとともに培養する。アレルゲン結合ＩｇＥ抗体の量は、色の付いた最終生成物にする基質の反応により共役した抗ｈＩｇＥ／アルカリフォスファターゼを介して光学的に定量化する。
ＩｇＥ抗体の結合は、溶解性アレルゲンまたは試験物質（組換え修飾アレルゲン）により、濃縮に応じて、物質特異的に阻害される。
Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の試験結果は、ここで参照nPhl p 1分子と比較して記述する修飾Phl p 1分子の例証として示す。
Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の試験結果は、ここで参照nPhl p 1分子と比較して記述する修飾Phl p 1分子の例証として示す。
草花粉症罹患者からの４つの個々の血清での図６に示す代表的なＩｇＥ阻害試験により、高濃度の変異体Phl p 1 NoCys（５μｇ／ｍｌまで）でさえ非修飾天然型アレルゲンnPhl pの最大阻害作用のおよそ２０〜５０％しか達成しないことを示す。より低い最大阻害作用は、ＩｇＥエピトープの欠失を示唆する。
変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220に対する曲線は、これらのPhl p 1変異体のより低いＩｇＥ結合能を実証する。個々の種別の阻害作用は検出できないか、非常に小さな範囲（最大阻害作用の０〜２０％）であろう。
ストリップ試験の結果に相同して、付加的な特異的欠失の挿入によりPhl p 1のＩｇＥ結合能をさらに低下させることを確認することができる。
変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220に対する曲線は、これらのPhl p 1変異体のより低いＩｇＥ結合能を実証する。個々の種別の阻害作用は検出できないか、非常に小さな範囲（最大阻害作用の０〜２０％）であろう。
ストリップ試験の結果に相同して、付加的な特異的欠失の挿入によりPhl p 1のＩｇＥ結合能をさらに低下させることを確認することができる。
好塩基球活性試験による組換えPhl p 1変異体の低アレルギー誘発性の決定
アレルギー誘発性の機能的な低下は、in vitroにおいて好塩基球活性試験の手段により決定された。好塩基球活性化試験では、草花粉症罹患者からのヘパリン化された全血をさまざまな濃度の試験物質とともに培養する。アレルゲン性物質は特異的に好塩基球のFcεRI結合IgE抗体に結合し、結果としてFcεRI分子の架橋が起こる。
このアレルゲン誘発性、IgE推進性FcεRI架橋は、結果として好塩基球の活性化をもたらす。該活性化は、これらのエフェクター細胞のアレルギー性反応にける第１段階である。引き続くシグナル伝達は、結果としてエフェクター細胞の脱顆粒をもたらし、このようにしてin vivoにおけるアレルギー性反応の引き金をもたらす。
アレルギー誘発性の機能的な低下は、in vitroにおいて好塩基球活性試験の手段により決定された。好塩基球活性化試験では、草花粉症罹患者からのヘパリン化された全血をさまざまな濃度の試験物質とともに培養する。アレルゲン性物質は特異的に好塩基球のFcεRI結合IgE抗体に結合し、結果としてFcεRI分子の架橋が起こる。
このアレルゲン誘発性、IgE推進性FcεRI架橋は、結果として好塩基球の活性化をもたらす。該活性化は、これらのエフェクター細胞のアレルギー性反応にける第１段階である。引き続くシグナル伝達は、結果としてエフェクター細胞の脱顆粒をもたらし、このようにしてin vivoにおけるアレルギー性反応の引き金をもたらす。
In vitroにおいて、好塩基球性顆粒球のアレルゲン誘発性活性化は、ＩｇＥ受容体架橋のシグナル伝達に連動する表面タンパク質（ＣＤ２０３ｃ）の発現の量化により決定することができる(Kahlert et al., 2003, Cli., Exp. Allergy 33: 1266-72)。細胞上の発現したＣＤ２０３ｃタンパク質の数および細胞プール内の活性化した細胞のパーセンテージを、好感度で、蛍光ラベルしたモノクローナル抗体の表面マーカーへの結合および引き続く蛍光活性化フローサイトメトリーによる解析を介して測定した。試験物質と平行してここで用いた参照物質は、精製した天然Phl p 1(nPhl p 1)であった。Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の結果は、ここで上述の修飾Phl p 1分子の例証として示された。
４人の臨床的に決定されたアレルギー罹患者からの好塩基球との変異体Phl p 1 NoCysに対する代表的する試験結果を、図７におけるカーブとして示す。変異体Phl p 1 NoCysの野生型nPhl p 1に対するアレルゲン性有効性の減少は、活性化カーブの変移を通じて明らかとなる。
ストリップ試験およびIgE阻害試験からの結果と一致して、変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の試験結果は、図８および９において代表的なカーブとの比較で示されるように、相対的なアレルゲン有効性におけるさらに大幅な減少を示唆する。
ストリップ試験およびIgE阻害試験からの結果と一致して、変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の試験結果は、図８および９において代表的なカーブとの比較で示されるように、相対的なアレルゲン有効性におけるさらに大幅な減少を示唆する。
好塩基球の最大の割合が試験物質の１００〜１０００ｐＭの濃度範囲の天然のアレルゲンによりすでに活性化されているのに対して、修飾アレルゲンPhl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220を用いた場合は好塩基球の活性化はなかったか、もしくは非常に少しだけであった。
参照のnPhl p 1と比較して、Ａ５０価のカーブにより計算できる変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220のアレルゲン有効性は約１００〜１０００倍まで低下し、変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のアレルゲン有効性は1000倍以上低下した。（Ａ５０：活性化好塩基球最大数の５０％でのアレルゲン濃度）
参照のnPhl p 1と比較して、Ａ５０価のカーブにより計算できる変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220のアレルゲン有効性は約１００〜１０００倍まで低下し、変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のアレルゲン有効性は1000倍以上低下した。（Ａ５０：活性化好塩基球最大数の５０％でのアレルゲン濃度）
低アレルギー誘発性Phl p 1変異体のＴ細胞反応性
ヘルパーＴリンパ球はアレルゲンペプチド断片（約１２〜２５アミノ酸）と反応し、前記断片は抗原提示細胞(antigen-presenting cells)(APCs)において酵素変性により形成され、抗原提示細胞(APCs)表面でのＭＨＣクラスＩＩ分子への好適なペプチドの包含ののちにＴ細胞に提示される。Ｔヘルパーリンパ球のこのアレルギー特異的な活性化は、増殖および機能的分化（ＴＨ１およびＴＨ２）のための必要条件である。減感作中のアレルゲンまたはアレルゲン誘導体での処置によりアレルゲン特異的なＴリンパ球の影響は、治療的有効性の鍵とされる。
ヘルパーＴリンパ球はアレルゲンペプチド断片（約１２〜２５アミノ酸）と反応し、前記断片は抗原提示細胞(antigen-presenting cells)(APCs)において酵素変性により形成され、抗原提示細胞(APCs)表面でのＭＨＣクラスＩＩ分子への好適なペプチドの包含ののちにＴ細胞に提示される。Ｔヘルパーリンパ球のこのアレルギー特異的な活性化は、増殖および機能的分化（ＴＨ１およびＴＨ２）のための必要条件である。減感作中のアレルゲンまたはアレルゲン誘導体での処置によりアレルゲン特異的なＴリンパ球の影響は、治療的有効性の鍵とされる。
Ｔ細胞反応性を調査するために、草花粉症罹患者からのオリゴクローナルなＴ細胞株をnPhl p 1またはrPhl p 1 wt分子により刺激で従来の方法により成立させた。増殖試験において、さまざまなＴ細胞株を参照アレルゲンnPhl p 1およびrPhl p 1 wt、ならびに修飾組換えPhl p 1変異体で刺激させた。増殖率は従来の方法により［３Ｈ］−チミジンとの結合により決定した。
Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の増殖試験の結果は、前述の修飾Phl p 1分子の例証としてここに示す。
表１で示す８人の草花粉症罹患者からのＴ細胞株での結果は、組換えアレルゲンの変異体によりＴリンパ球を刺激して増殖させることはが可能であることを示した。Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のＴ細胞反応性は非修飾の天然および組換え野生型アレルゲンと比較してわずかしか低下しておらず、決定的なＴ細胞エピトープの保持を実証する。
表１で示す８人の草花粉症罹患者からのＴ細胞株での結果は、組換えアレルゲンの変異体によりＴリンパ球を刺激して増殖させることはが可能であることを示した。Phl p 1 NoCys、Phl p 1 NoCys Δ213-220およびPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220のＴ細胞反応性は非修飾の天然および組換え野生型アレルゲンと比較してわずかしか低下しておらず、決定的なＴ細胞エピトープの保持を実証する。
１ ［３Ｈ］測定価から計算した。（アレルゲン刺激細胞培養のｃｐｍ測定価）／（非刺激細胞培養のｃｐｍ測定価）
２ ドナー：臨床的に定められた草花粉症罹患者
２ ドナー：臨床的に定められた草花粉症罹患者
遺伝子工学による低アレルギー誘発性Phl p 1変異体の構築
例１：Phl p 1 NoCys
変異体Phl p 1 NoCys（配列番号３および４）のために、rPhl p 1 wt ("GenBank" entry Z27090; NCBI, Bethesda, USA)から開始して６段階のＰＣＲを実行した。システインの変わりにセリンをエンコードするコドンを含む特異的なＰＣＲのプライマーを用いて、点変異を導入した（プライマーの配列は表２を参照のこと）。
ステップ１−Ｎ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S] (bp 1-212)"の調製：ＰＣＲによる長い重複オリゴヌクレオチド(P 1-63、P 49-111、P 97-158およびP 144-212)の増幅によりC41S、C57S、C69S変異を含むＤＮＡ断片を産生した。
例１：Phl p 1 NoCys
変異体Phl p 1 NoCys（配列番号３および４）のために、rPhl p 1 wt ("GenBank" entry Z27090; NCBI, Bethesda, USA)から開始して６段階のＰＣＲを実行した。システインの変わりにセリンをエンコードするコドンを含む特異的なＰＣＲのプライマーを用いて、点変異を導入した（プライマーの配列は表２を参照のこと）。
ステップ１−Ｎ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S] (bp 1-212)"の調製：ＰＣＲによる長い重複オリゴヌクレオチド(P 1-63、P 49-111、P 97-158およびP 144-212)の増幅によりC41S、C57S、C69S変異を含むＤＮＡ断片を産生した。
ステップ２−Ｃ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 [C69S、C72S、C77S、C83S] (bp 193-720)"の調製：P 193-261およびP 703-720 HindIIIプライマーを伴ったPhl p 1 wt-cDNAのＰＣＲ。
ステップ３−"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S、C72S、C77S、C83S] (bp 1-720)"をエンコードするＤＮＡの調製：P 1-63およびP 703-720 HindIIIプライマーを伴った重複断片"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S] (bp 1-212)"および"Phl p 1 [C69S、C72S、C77S、C83S] (bp 193-720)" のＰＣＲ。
ステップ３−"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S、C72S、C77S、C83S] (bp 1-720)"をエンコードするＤＮＡの調製：P 1-63およびP 703-720 HindIIIプライマーを伴った重複断片"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S] (bp 1-212)"および"Phl p 1 [C69S、C72S、C77S、C83S] (bp 193-720)" のＰＣＲ。
ステップ４−Ｎ末端ＤＮＡ断片Phl p 1 [C41S、C57S、C69S、C72S、C77S、C83S、C139S] (bp 1-428)"の調製：P 1-63およびP 406-428 asプライマーを伴った"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S、C72S、C77S、C83S] (bp 1-720)"のｃＤＮＡのＰＣＲ。
ステップ５−Ｃ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 [C139S] (bp 406-720)"の調製：P 406-428sおよびP 703-720 HindIIIプライマーを伴ったrPhl p 1のｃＤＮＡのＰＣＲ。
ステップ５−Ｃ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 [C139S] (bp 406-720)"の調製：P 406-428sおよびP 703-720 HindIIIプライマーを伴ったrPhl p 1のｃＤＮＡのＰＣＲ。
ステップ６−Phl p 1 NoCysをエンコードする完全なＤＮＡの調製：P 1-63 およびP 703-720 HindIIIプライマーを伴った重複断片"Phl p 1 [C41S、C57S、C69S、C72S、C77S、C83S、C139S] (bp 1-428)"および"Phl p 1 [C139S] (bp 406-720)"のＰＣＲ。
Phl p 1 NoCysをエンコードするＤＮＡを制限酵素HindIIIを用いて分解し、制限部位EheIおよびHindIIIを介して発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)へと結合させ、それに引き続き完全に配列決定した。
Phl p 1 NoCysをエンコードするＤＮＡを制限酵素HindIIIを用いて分解し、制限部位EheIおよびHindIIIを介して発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)へと結合させ、それに引き続き完全に配列決定した。
例２：Phl p 1 NoCys Δ213-220
欠失変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220(配列番号15および16)をエンコードするDNAを５’プライマーP 1-18および３’プライマーP 613-720 (Δ637-660)を用いて、欠失すべき配列部位によりHindIII特異的に短縮することによりPhl p 1 NoCysのＤＮＡのＰＣＲにより産生した。
ｃＤＮＡを制限酵素HindIIIを用いて分解し、制限部位EheIおよびHindIIIを介して発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)へと結合させ、それに引き続き完全に配列決定した。
欠失変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220(配列番号15および16)をエンコードするDNAを５’プライマーP 1-18および３’プライマーP 613-720 (Δ637-660)を用いて、欠失すべき配列部位によりHindIII特異的に短縮することによりPhl p 1 NoCysのＤＮＡのＰＣＲにより産生した。
ｃＤＮＡを制限酵素HindIIIを用いて分解し、制限部位EheIおよびHindIIIを介して発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)へと結合させ、それに引き続き完全に配列決定した。
例３：遺伝子工学によるPhl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220の構築
欠失変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220 (配列番号5および6)をエンコードするＤＮＡ配列を、欠失すべき配列領域により特異的に短縮したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより３段階で産生した。
ステップ１−Ｎ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 NoCys Δ1-6 (bp 1-300)"の調製：プライマーP22-63 (Δ1-18)およびP 250-318を伴ったPhl p 1 NoCysのｃＤＮＡのＰＣＲ。
欠失変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220 (配列番号5および6)をエンコードするＤＮＡ配列を、欠失すべき配列領域により特異的に短縮したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより３段階で産生した。
ステップ１−Ｎ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 NoCys Δ1-6 (bp 1-300)"の調製：プライマーP22-63 (Δ1-18)およびP 250-318を伴ったPhl p 1 NoCysのｃＤＮＡのＰＣＲ。
ステップ２−Ｃ末端ＤＮＡ断片"Phl p 1 NoCys Δ115-119、213-220 (bp 283-663)"の調製：プライマーP 301-384 (Δ343-357)およびP 613-720 (Δ637-660) HindIIIを伴ったPhl p 1 NoCysのＰＣＲ。
ステップ３−Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220をエンコードする完全形ＤＮＡの調製：プライマーP22-63 (Δ1-18)およびP 703-720 HindIIIを伴った重複断片"Phl p 1 NoCys Δ1-6 (bp 1-300)"および"Phl p 1 NoCys Δ115-119、213-220 (bp 283-663)"のＰＣＲ。
ステップ３−Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-220をエンコードする完全形ＤＮＡの調製：プライマーP22-63 (Δ1-18)およびP 703-720 HindIIIを伴った重複断片"Phl p 1 NoCys Δ1-6 (bp 1-300)"および"Phl p 1 NoCys Δ115-119、213-220 (bp 283-663)"のＰＣＲ。
Phl p 1 NoCys Δ1-6、115-119、213-22をエンコードするＤＮＡを制限酵素HindIIIを用いて分解し、制限部位EheIおよびHindIIIを介して発現ベクターpProExHT(Invitrogen, Carlsbad, USA)へと結合し、それに続き完全に配列決定した。
変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6（配列番号５および６）、Phl p 1 NoCys Δ1-30（配列番号７および８）、Phl p 1 NoCys Δ92-104（配列番号９および１０）、Phl p 1 NoCys Δ115-119（配列番号１１および１２）、Phl p 1 NoCys Δ175-185（配列番号１３および１４）を、同様に調製し、クローン化し、そして配列決定した。
変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6（配列番号５および６）、Phl p 1 NoCys Δ1-30（配列番号７および８）、Phl p 1 NoCys Δ92-104（配列番号９および１０）、Phl p 1 NoCys Δ115-119（配列番号１１および１２）、Phl p 1 NoCys Δ175-185（配列番号１３および１４）を、同様に調製し、クローン化し、そして配列決定した。
Claims (26)
- 既知の野生型アレルゲンと比較して低下したＩｇＥ反応性および十分に維持されたＴリンパ球の反応性を特徴とする、イネ科のＩ型のアレルゲンの変異体。
- Phleum pratense、Lolium perenne、Poa pratensis、Holcus lanatus、Cynodon dactylon、Oryza sativaおよびPhalaris aquaticaからなる群から選択した、請求項１に記載のアレルゲンの変異体。
- 成熟Phl p 1タンパク質に相当するアミノ酸部位４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインが欠失していることを特徴とする、請求項１または２に記載のアレルゲンの変異体。
- 成熟Phl p 1タンパク質に相当するアミノ酸部位４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインが他のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のアレルゲンの変異体。
- 成熟Phl p 1タンパク質に対応するアミノ酸部位４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインがセリンに置換されていることを特徴とする、請求項４に記載のアレルゲンの変異体。
- 請求項５に記載の配列の修飾が存在する、成熟Phl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1およびPha a 1からなる群から選択した、アレルゲンの変異体。
- 成熟タンパク質の４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインがセリンに置換されていることを特徴とする（配列番号４による変異体Phl p 1 NoCys）、請求項６に記載のPhl p 1変異体。
- 野生型アレルゲンと比較して、成熟Phl p 1タンパク質の一次配列の１〜６、１〜３０、９２〜１０４、１１５〜１１９、１７５〜１８６および２１３〜２２０のアミノ酸に対応する少なくとも１つの領域または領域の組み合わせが欠失していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のアレルゲンの変異体。
- 請求項１〜８のいずれかに記載のアレルゲンの変異体であり、成熟Phl p 1配列に対応する２１３〜２２０のアミノ酸が欠失している、前記アレルゲンの変異体。
- 成熟Phl p 1、Poa p 1、 Hol p 1、Lol p 1およびPha a 1からなる群から選択したアレルゲンの変異体であり、請求項８または９に記載の配列修飾が存在する前記アレルゲンの変異体。
- 成熟タンパク質の４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインがセリンにより置換され、２１３〜２２０のアミノ酸が欠失する（配列番号１６による変異体Phl p 1 NoCys Δ213-220）、請求項１０に記載のPhl p 1 変異体。
- 成熟Phl p 1配列に対応するアミノ酸１〜６、１１５〜１１９および２１３〜２２０が欠失する、請求項８に記載のアレルゲンの変異体。
- 成熟Phl p 1、Poa p 1、Hol p 1、Lol p 1およびPha a 1からなる群から選択したアレルゲンの変異体であり、請求項１２に記載の配列修飾が存在する前記アレルゲンの変異体。
- 成熟タンパク質の４１、５７、６９、７２、７７、８３および１３９のシステインがセリンにより置換され、１〜６、１１５〜１１９および２１３〜２２０のアミノ酸が欠失する（配列番号１８による変異体Phl p 1 NoCys Δ1-6、 115-119、213-220）、請求項１３に記載のPhl p 1 変異体。
- 組換え遺伝子工学の方法により得られることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のアレルゲンの変異体。
- 請求項１〜１５のいずれかに記載のアレルゲンの変異体をエンコードするＤＮＡ分子。
- 機能的に発現コントロール配列と結合する、請求項１６に記載のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクター。
- 請求項１６に記載のＤＮＡ分子または請求項１５に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主有機体。
- 請求項１８に記載の宿主有機体の培養および前記培養物からの対応するアレルゲンの変異体の単離による、請求項１〜１５のいずれかに記載のアレルゲンの変異体の調製方法。
- 薬剤としての、請求項１〜１５のいずれかに記載のアレルゲンの変異体。
- イネ科種が関連するＩ型のアレルゲンが誘発に関与するアレルギーの予防的および治療的な処置のための、請求項１〜１５のいずれかに対応する少なくとも１つのアレルゲンの変異体、ならびに任意にさらに活性化合物および／またはアジュバントを含む、医薬組成物。
- イネ科種からのＩ型のアレルゲンが誘発に関与するアレルギーの予防および治療のための薬剤の調製のための、請求項１〜１５のいずれかに記載の少なくとも１つのアレルゲンの変異体の使用。
- 薬剤としての、請求項１６に記載のＤＮＡ分子。
- 薬剤としての、請求項１７に記載の組換え発現ベクター。
- イネ科のＩ型のアレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫治療のＤＮＡワクチン接種のためのおよび／または該アレルギーの予防のための、少なくとも１つの請求項１６に記載のＤＮＡ分子または少なくとも１つの請求項２４に記載の発現ベクター、ならびに任意にさらに活性化合物および／またはアジュバント含む医薬組成物。
- イネ科のＩ型のアレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫治療的ＤＮＡワクチン接種および／または該アレルギーの予防のための薬剤の調製のための、請求項１６に記載の少なくとも１つのＤＮＡ分子または請求項２４に記載の少なくとも１つの発現ベクターの使用。
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