ES2328050T3 - Variantes de alergenos del grupo 1 de poaceae con alergenicidad reducida y una reactividad mantenida a las celulas t. - Google Patents
Variantes de alergenos del grupo 1 de poaceae con alergenicidad reducida y una reactividad mantenida a las celulas t. Download PDFInfo
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Abstract
Variantes de Phl p 1, caracterizadas porque presentan una reactividad IgE reducida del alérgeno natural, así como una reactividad con linfocitos T ampliamente conservada y porque faltan las cisteínas de las posiciones de aminoácido 41, 57, 69, 72, 77, 83 y 139 correspondientes a la proteína madura Phl p 1.
Description
Variantes de alérgenos del grupo 1 de
Poaceae con alergenicidad reducida y una reactividad
mantenida a las células T.
La presente invención se refiere a la
preparación y al uso de variantes de Phl p 1 del polen de la hierba
timotea (Phleum pratense), que se caracterizan por una
reactividad IgE reducida frente al alérgeno natural conocido y al
mismo tiempo por una reactividad con linfocitos T ampliamente
conservada.
Estas variantes hipoalergénicas de alérgenos se
pueden emplear para la inmunoterapia específica
(hiposensibilización) de pacientes con alergia al polen de
gramíneas o para la inmunoterapia preventiva de las alergias al
polen de gramíneas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las alergias de tipo 1 tienen importancia en
todo en mundo. Hasta un 20% de la población de los países
industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica,
conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son ocasionadas por
alérgenos que se encuentran en el aire (aeroalérgenos), que son
liberados por fuentes de origen diverso, como el polen vegetal, los
ácaros, los gatos o los perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de
tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del
polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin.
Immunol. 78: 1190-
2002).
2002).
Las sustancias desencadenantes de alergias tipo
1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. Tras la absorción a
través de las mucosas, estos alérgenos reaccionan con las moléculas
IgE unidas a la superficie de los mastocitos en personas
sensibilizadas. Si dos moléculas IgE se enlazan entre sí a través de
un alérgeno, esto conduce a la secreción de mediadores (p. ej.,
histamina, prostaglandina) y citoquinas a través de las células
efectoras, conduciendo de este modo a los correspondientes síntomas
clínicos.
Dependiendo de la frecuencia relativa con la que
las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los
anticuerpos IgE de los alérgicos, se distingue entre alérgenos
mayores y menores.
En el caso de la hierba timotea (Phleum
pratense), hasta ahora se han identificado como alérgenos
mayores Phl p 1 (Petersen y col., 1993, J. Allergy Clin. Immunol.
92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen y Löwenstein,
1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen y
col., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98:
105-109), Phl p 6 (Petersen y col., 1995, Int.
Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phl p 2/3
(Dolecek y col., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl
p 4 (Haavik y col., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78:
260-268; Valenta y col., 1992, Int. Arch. Allergy
Immunol. 97: 287-294, Fischer y col., 1996, J.
Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) y Phl p 13
(Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332;
Suck y col., 2000, Clin. Exp. Allergy 30:
1395-1402).
Los alérgenos mayores dominantes de la hierba
timotea (Phleum pratense) son Phl p 1 y Phl p 5. Como los
alérgenos mayores de las gramíneas de la familia Poaceae son
muy similares entre sí y, como consecuencia de esto, poseen
propiedades bioquímicas e inmunológicas muy similares, estas
proteínas relacionadas se agrupan en los alérgenos del grupo 1 y
del grupo 5.
Los alérgenos del grupo 1 reaccionan con los
anticuerpos IgE de más del 95% de los alérgicos al polen de
gramíneas y por tanto son alérgenos mayores dominantes del polen de
gramíneas.
Los alérgenos del grupo 1 son glicoproteínas con
una masa molecular de aproximadamente 32 kDa y se localizan en el
citoplasma de los granos de polen. Tanto el contacto de los granos
de polen con las mucosas de las vías respiratorias superiores como
la humectación de los granos de polen por la lluvia conducen a una
rápida liberación de estos alérgenos. Esta rápida liberación de los
alérgenos del grupo 1, también en forma de
micro-partículas subcelulares, permite la
penetración en las vías respiratorias inferiores, lo que puede
desencadenar graves ataques de asma.
Se han identificado los ADNc de los alérgenos
del grupo 1 de Phleum pratense (Laffer y col., 1994, J.
Allergy Clin. Immunol. 94: 689-698), Lolium
perenne (Perez y col., 1990, J. Biol. Chem. 265:
16210-16250), Holcus lanatus (Schramm y
col., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 1999:781-787),
Poa pratensis (Sturaro u. Viotti, 1998, NCBI GenBank, Acc.
No. AJ 131850), Cynodon dactylon (Smith y col., 1996, J.
Allergy Clin. Immunol. 98: 331-343), Phalaris
aquatica (Suphioglu y col., 1995, Clin. Exp. Allergy 25:
853-865) y Oryza sativa (Xu y col., 1995,
Gene 164: 255-259).
Aparte de estas primeras descripciones de la
secuencia, en las bases de datos se han publicado otras secuencias
de alérgenos del grupo 1, que se diferencian de las secuencias
originales en posiciones individuales. Dichas isoformas también se
conocen en otros alérgenos de polen de gramíneas.
Los alérgenos del grupo 1 de gramíneas
(Poaceae), debido a su homología, presentan una elevada
reactividad cruzada con los anticuerpos IgE humanos (Laffer y col.,
1996, Mol. Immunology 33: 417-426). Esta reactividad
cruzada inmunológica se basa en una secuencia de aminoácidos muy
similar, como muestra la comparación de la secuencia de Phl p 1, el
alérgeno del grupo 1 de la hierba timotea (Phleum pratense),
con las moléculas del grupo 1 de especies seleccionadas de la
Figura 1.
Tanto para los intervalos de secuencia de las
deleciones de la secuencia de aminoácidos de Phl p 1 descritas aquí
para la construcción de variantes hipoalergénicas, como para los
intervalos de secuencia que los flanquean, existen intervalos de
secuencia homólogos en los restantes alérgenos del grupo 1 de
Poaceae.
Además, se conservan tanto el número como los
intervalos de secuencia circundantes de la cisteína de los alérgenos
del grupo 1 de Poaceae. A causa de las homologías de
secuencia, los alérgenos del grupo 1 de Poaceae se asignan a
la familia de proteínas de la \beta-expansina
(Cosgrove D.J., 2000 Nature 407: 321-6).
La inmunoterapia específica o
hiposensibilización representa un enfoque clásico para el
tratamiento eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6):
336-339: Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin.
Immunol. 102 (4): 558-562). Así, se inyectan a los
pacientes de forma subcutánea extractos naturales de alérgenos en
dosis crecientes. Sin duda, con este método existe el riesgo de
reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para
minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma
de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados
químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida,
aunque presentan idéntica reactividad con las células T en
comparación con el extracto no tratado. Estos epítopos de células T
tienen una importancia decisiva en el efecto terapéutico de los
preparados de alérgeno para la hiposensibilización (Fiebig, 1995,
Allergo J. 4 (7):
377-382).
377-382).
Sería posible una optimización posterior de la
terapia con alérgenos preparados de forma recombinante. Mezclas
definidas, dado el caso determinadas por el patrón de
sensibilización individual del paciente, de alérgenos recombinantes
de elevada pureza podrían dar lugar a extractos de fuentes
alergénicas naturales, ya que éstos, aparte de los diferentes
alérgenos, presentan un mayor número de proteínas acompañantes
inmunogénicas, pero no alergénicas.
Perspectivas realistas, que podrían conducir a
una hiposensibilización segura con productos de expresión
recombinantes, ofrecen alérgenos recombinantes con mutaciones
dirigidas, en los que se han eliminado específicamente epítopos de
IgE, sin afectar a los epítopos de células T esenciales para la
terapia (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162:
2406-2414).
Un concepto diferente para una
hiposensibilización parte del supuesto que se induce una respuesta
inmune protectora, en particular mediante anticuerpos IgG4
bloqueantes. Conforme a esta hipótesis, se describen fragmentos
recombinantes de Phl p 1 que pueden ser apropiados para la
inducción de una respuesta IgG4 protectora (Ball y col.,1999, FASEB
J. 13:1277-1290). Este concepto se diferencia
completamente del concepto de las variantes hipoalergénicas de
alérgenos con reactividad IgE reducida y reactividad con células T
conservada.
Otra posibilidad para ejercer una influencia
terapéutica en el equilibrio alterado de las células T auxiliares
en los alérgicos es el tratamiento con ADN con capacidad de
expresión, que codifica para los alérgenos relevantes (vacunación
inmunoterapéutica con ADN). Se obtuvieron datos experimentales de la
influencia alergénica específica de la respuesta inmune en roedores
mediante inyección de ADN codificante de alérgenos (Hsu y col.,
1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
El objeto en que se basa la presente invención
consiste en la preparación de variantes novedosas de Phl p 1 a
nivel de proteínas y ADN, que se caracterizan por la amplia
conservación de la reactividad con células T mediante una actividad
IgE reducida y por tanto son adecuados para la inmunoterapia
específica curativa y preventiva, así como para la vacunación
inmunoterapéutica con ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Alineación de secuencias de
aminoácidos homólogos de Phl p 1 (secuencias de proteínas maduras
deducidas de secuencias de ADNc) de especies de Poaceae:
Poa pratensis (Poa p), Holcus lanatus (Hol l),
Lolium perenne (Lol p), Cynodon dactylon (Cyn d),
Oryza sativa (Ory s) y Phalaris aquatica (Pha a),
secuencias de proteínas deducidas de secuencias de ADNc de la base
de datos "GenBank" del National Center for Biotechnology
Information (NCBI, Bethesda, USA), numeración: posiciones de
aminoácido de proteínas maduras, marcadas con subrayado: para
diferentes aminoácidos de la secuencia de Phl p 1, enmarcado en
negro: cisteína.
Figura 2: Alineación de secuencias de
aminoácidos de la proteína natural Phl p1 procesada y de la variante
Phl p1 NoCys, Phl p1 Wt (natural): secuencia de proteínas deducida
de la secuencia de ADNc (registro Z27090 de la base de datos
"GenBank" del National Center for Biotechnology Information
(NCBI), Bethesda, USA), numeración: posiciones de aminoácido de la
proteína madura, enmarcado en negro: sustituciones del aminoácido
cisteína frente a serina en la proteína Phl p 1 NoCys.
Figura 3: Alineación de secuencias de
aminoácidos de las variantes hipoalergénicas presentadas a modo de
ejemplo, Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys
\Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220, numeración: posiciones de aminoácido,
marcadas con subrayado: deleciones.
Figura 4: SDS-PAGE y
comprobación de identidad de las variantes recombinantes Phl p 1
NoCys, Phl p 1 NoCys \Delta213-220 y Phl p 1
NoCys \Delta1-6, 115-119,
213-220
- A:
- SDS-PAGE
- B:
- Western Blot con anticuerpos aPhl p 1(Allergopharma)
- 1.
- Proteína marcadora
- 2.
- nPhl p 1*
- 3.
- rPhl p 1 Wt (- His-tag)*
- 4.
- Proteína marcadora
- 5.
- Phl p 1 NoCys (+ His-tag)
- 6.
- Phl p 1 NoCys D213-220 (+ His-tag)
- 7.
- Phl p 1 NoCys D1-6, 115-119, 213-220 (+ His-tag)
- 8.
- Proteína marcadora
- \text{*}
- muestras reducidas (Ditiotreitol).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5: Ensayo de tiras reactivas para la
comprobación de la capacidad de unión a IgE de Phl p 1 NoCys, Phl p
1 NoCys \Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 bajo condiciones no desnaturalizantes.
- 1)
- rPhl p 1 Wt
- 2)
- Phl p 1 NoCys
- 3)
- Phl p 1 NoCys D213-220
- 4)
- Phl p 1 NoCys D1-6, 115-119, 213-220
- 5)
- rPhl p 1 Wt
- TP:
- tinción completa de la proteína
- P:
- sueros de alérgicos al polen de gramíneas definidos clínicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: Prueba de la reactividad IgE reducida
de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys \Delta213-220 y
Phl p 1 NoCys \Delta1-6, 115-119,
213-220 mediante el ensayo de inhibición EAST con
cuatro sueros representativos de alérgicos al polen de gramíneas
(P).
Figura 7: Prueba de hipoalergenicidad de Phl p 1
NoCys mediante el ensayo de activación de basófilos con basófilos
de cuatro alérgicos al polen de gramíneas (P).
Figura 8: Prueba de hipoalergenicidad de Phl p 1
NoCys \Delta213-220 mediante el ensayo de
activación de basófilos con basófilos de cuatro alérgicos al polen
de gramíneas (P).
Figura 9: Prueba de hipoalergenicidad de Phl p 1
NoCys \Delta1-6, 115-119,
213-220 mediante el ensayo de activación de
basófilos con basófilos de cuatro alérgicos al polen de gramíneas
(P).
Los trabajos que condujeron a las variantes
encontradas se realizaron mediante Phl p 1.
Por consiguiente, son objeto de la presente
invención las variantes de Phl p 1 que se caracterizan por una
reactividad IgE reducida frente a los alérgenos naturales conocidos,
así como una reactividad con linfocitos T conservada.
El punto de partida para la construcción de las
variantes hipoalergénicas de Phl p 1 es el ADNc del Phl p 1
natural, que con ayuda de un cebador específico fue aislado mediante
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc
completo del polen de Phleum pratense (registro Z27090 de
"GenBank"; NCBI, Bethesda, USA) (ID SEC. Nº 1).
De la secuencia de ADNc de Phl p 1 natural se
dedujo la secuencia de aminoácidos según la ID SEC. Nº 2.
Phl p 1, formado por 240 aminoácidos y
glicosilado en su forma natural, como todos los alérgenos del grupo
1 (véase Fig. 1), está caracterizado por la existencia de siete
cisteínas de la molécula madura. Con la excepción de Cyn d 1 y Ory
s 1, en todos los alérgenos del grupo 1 estas posiciones de
aminoácido tienen los números 41, 57, 69, 72, 77, 83 y 139
(Petersen y col., 1995, J. Allergy Clin. Immunol 95:
987-994).
Phl p 1 se pudo expresar en E. coli como
proteína no glicosilada. La proteína natural recombinante (rPhl p 1
wt) reaccionó con anticuerpos IgE de alérgicos al polen de
gramíneas, que presentan reactividad con Phl p 1 natural purificado
(nPhl p 1) (Petersen y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:
315-321).
\vskip1.000000\baselineskip
Partiendo del ADNc de rPhl p 1 wt descrito se
prepararon variantes recombinantes de Phl p 1 modificadas con
técnicas genéticas.
La secuencia de aminoácidos de la variante
recombinante Phl p 1 NoCys (ID. SEC. Nº 4) presenta, en lugar de
las siete cisteínas existentes en el tipo natural, siete restos
serina (Fig. 2). La variante Phl p 1 NoCys sirvió como punto de
partida para la construcción de diferentes mutantes de deleción. En
estos se eliminaron secciones individuales de 15 a 90 pb de
longitud o combinaciones de estas secciones de ADNc que codifican
para Phl p 1 NoCys, por lo que las correspondientes deleciones de
los aminoácidos 1-6, 1-30,
92-104, 115-119,
175-185 y 213-220 dieron como
resultado las cadenas de polipéptidos de las proteínas expresadas en
E. coli: Phl p 1 NoCys \Delta1-6 (ID. SEC.
Nº 5 y 6), Phl p 1 NoCys \Delta1-30 (ID. SEC. Nº 7
y 8), Phl p 1 NoCys \Delta92-104 (ID. SEC. Nº 9 y
10), Phl p 1 NoCys \Delta115-119 (ID. SEC. Nº 11 y
12), Phl p 1 NoCys \Delta175-185 (ID. SEC. Nº 13
y 14), Phl p 1 NoCys \Delta213-220 (ID. SEC. Nº 15
y 16), así como Phl p 1 NoCys \Delta1-6,
115-119, 213-220 (ID. SEC. Nº 17 y
18).
La expresión de las proteínas recombinantes se
realizó como proteínas de fusión con histidina en Escherichia
coli. La caracterización inmunológica se realizó con dichas
proteínas de fusión.
En primer lugar se estudió la capacidad de las
variantes recombinantes, tras inmovilización en membrana de
nitrocelulosa, de unirse a anticuerpos IgE de un acervo de suero
representativo y a anticuerpos IgE de sueros individuales de
alérgicos al polen de gramíneas (ensayo de tiras reactivas).
Sorprendentemente, con este procedimiento se observó una unión
reducida de anticuerpos IgE a Phl p 1 NoCys. Este resultado se
confirmó mediante un ensayo de inhibición de IgE (EAST), en el que
se estudia la capacidad de unión a IgE de una proteína no
inmovilizada en anticuerpos IgE en solución.
Por consiguiente, son objeto de la presente
invención en particular aquellas variantes de alérgenos del grupo 1
en las que las cisteínas de las posiciones de aminoácidos 41, 57,
69, 72, 77, 83 y 139 correspondientes a la proteína Phl p 1 madura
se eliminan o se sustituyen por otro aminoácido.
Entonces se obtiene un enlace reducido de
anticuerpos IgE cuando al menos dos de las 7 cisteínas se eliminan
sin ser sustituidas o se sustituyen por otro aminoácido. Sin
embargo, preferiblemente se sustituyen las 7 cisteínas por
serina.
Mediante un ensayo de activación de granulocitos
basófilos de alérgicos al polen de gramíneas se estudiaron los
efectos de la capacidad de unión reducida a IgE de Phl p 1 NoCys en
la acción funcional para la ramificación de IgE unidas a la
membrana de las células efectoras y su activación in vitro.
Phl p 1 NoCys mostró aquí una activación de granulocitos basófilos
claramente inferior en comparación con rPhl p 1 wt y por tanto una
alergenicidad reducida funcionalmente.
Los diferentes mutantes de deleción preparados
basándose en Phl p 1 NoCys fueron estudiados mediante el mismo
procedimiento referente a la capacidad de unión a IgE (ensayo de
tiras reactivas, EAST) y a la acción funcional (activación de
basófilos). Sorprendentemente, los mutantes de deleción mostraron
propiedades hipoalergénicas particularmente intensas.
Por consiguiente, también son objeto de la
invención aquellas variantes de alérgenos Phl p 1, en las que
-opcional-
mente de forma adicional a las variantes descritas anteriormente con Cys eliminadas o sustituidas- falta al menos un intervalo o una combinación de intervalos que se corresponden con los aminoácidos 1-6, 1-30, 92-104, 115-119, 175-185 y 213-220 de la secuencia primaria de la proteína Phl p 1 madura, en comparación con el alérgeno
natural.
mente de forma adicional a las variantes descritas anteriormente con Cys eliminadas o sustituidas- falta al menos un intervalo o una combinación de intervalos que se corresponden con los aminoácidos 1-6, 1-30, 92-104, 115-119, 175-185 y 213-220 de la secuencia primaria de la proteína Phl p 1 madura, en comparación con el alérgeno
natural.
Son especialmente preferibles, y por tanto
también son objeto de la invención, aquellas variantes del alérgeno
Phl p 1 en las que faltan exclusivamente los aminoácidos
213-220 o al mismo tiempo los aminoácidos
1-6 y 115-119 correspondientes a la
secuencia Phl p 1 madura.
La reactividad con células T basada en la
eficacia de la inmunoterapia específica de las variantes
hipoalergénicas de Phl p 1 se analizó in vitro mediante un
ensayo de proliferación con linfocitos T específicos de Phl p 1 de
alérgicos al polen de gramíneas. Los alérgenos modificados mostraron
una reactividad con células T ampliamente conservada, lo que
permite un uso inmunoterapéutico de las variantes hipoalergénicas de
Phl p 1.
Se propone preparar las variantes de alérgenos
según la invención partiendo de la secuencia de ADN clonada con
ayuda de métodos de ingeniería genética. Aunque en principio también
pueden ser modificaciones químicas de los extractos de alérgenos
nativos (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7),
377-382).
De forma genuina, mediante las variaciones de
alérgenos del grupo 1 descritas en la presente solicitud de patente
también son posibles otras modificaciones en posiciones distintas,
por ejemplo, para aumentar la hipoalergenicidad. Estas
modificaciones pueden consistir, por ejemplo, en inserciones,
deleciones e intercambios de aminoácidos, rotura de la proteína en
fragmentos, así como fusiones de la proteína o sus fragmentos con
otras proteínas o
péptidos.
péptidos.
Además, es objeto de la invención una molécula
de ADN que codifica para una variante de alérgeno descrita
anteriormente, un vector de expresión recombinante que contiene esta
molécula de ADN, así como un organismo huésped transformado con
dicha molécula de ADN o dicho vector de expresión. Los organismos
huésped apropiados pueden ser organismos procariotas o eucariotas,
monocelulares o pluricelulares, como bacterias o levaduras. El
organismo huésped preferido según la invención es E.
coli.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de una variante de alérgeno según
la invención mediante cultivo del mencionado organismo huésped y
obtención de la correspondiente variante del alérgeno a partir del
cultivo.
Además, son objeto de la presente invención las
variantes de alérgenos descritas anteriormente, moléculas de ADN y
vectores de expresión, en calidad de medicamento.
Además, son objeto de la presente invención las
preparaciones farmacéuticas que contienen al menos una de estas
variantes de alérgenos o una molécula de ADN correspondiente o un
vector de expresión correspondiente, así como dado el caso otros
principios activos y/o excipientes para el tratamiento de alergias
en cuya activación toman parte los alérgenos del grupo 1 de
Poaceae, o para la vacunación inmunoterapéutica de pacientes
con alergias en cuya activación toman parte los alérgenos del grupo
1 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.
Cuando se trata de preparaciones farmacéuticas del segundo tipo (que
contienen al menos una molécula de ADN o un vector de expresión),
estas preparaciones contienen preferiblemente también hidróxido de
aluminio, un oligonucleótido inmunoestimulador que contiene CpG o
una combinación de ambos excipientes.
Las preparaciones farmacéuticas en el sentido de
la invención se pueden emplear como productos terapéuticos en
medicina humana o veterinaria. Se tienen en cuenta como portadores
las sustancias orgánicas o inorgánicas que son adecuadas para la
aplicación parenteral y no reaccionan con las variantes de alérgenos
del grupo 1 según la invención. Para la aplicación parenteral se
emplean en particular soluciones, preferentemente soluciones
oleosas o acuosas, también suspensiones, emulsiones o implantes. Las
variantes de alérgenos según la invención también se pueden
liofilizar y los liofilizados obtenidos se pueden emplear, por
ejemplo, para la preparación de preparados inyectables. Las
preparaciones indicadas se pueden esterilizar y/o pueden contener
excipientes como agentes lubricantes, conservantes, estabilizantes
y/o humectantes, emulsionantes, sales para modificar la presión
osmótica, sustancias tampón y/o otros principios activos. Además,
mediante la formulación correspondiente de las variantes de
alérgenos según la invención, se pueden obtener preparados depot,
por ejemplo por adsorción en hidróxido de
aluminio.
aluminio.
Finalmente, es objeto de la presente invención
el uso de al menos una variante de alérgeno según la invención o
una molécula de ADN según la invención o un vector de expresión
según la invención para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de alergias en cuya activación toman parte los alérgenos
del grupo 1 de Poaceae, o para la vacunación
inmunoterapéutica de pacientes con alergias en cuya activación toman
parte los alérgenos del grupo 1 de Poaceae y/o para la
prevención de dichas alergias.
La preparación de las variantes Phl p 1 NoCys,
Phl p 1 NoCys \Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 (Fig. 3), así como su caracterización
inmunológica, se presenta a continuación a modo de ejemplo para las
variantes hipoalergénicas de Phl p 1 con las modificaciones de
ingeniería genética descritas arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de las proteínas recombinantes se
realizó como proteínas de fusión con histidina (vector de expresión
pProExHT; Invitrogen, Carlsbad, EUA) en Escherichia coli
(cepa JM109). rPhl p 1 wt y las variantes se purificaron en primer
lugar mediante la unión específica de los restos histidina
N-terminales en una matriz quelato de Ni^{2+}
(cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados, IMAC,
del inglés
Immobilized-Metal-Ion-Affinity-Chromatography)
y posteriormente por filtración en gel preparativa (cromatografía
de exclusión por tamaño, SEC, del inglés
Size-Exclusion-Chromatography). La
pureza de las proteínas eluídas se controló por
SDS-PAGE y SEC analítica (Fig. 4a). La identidad de
las proteínas purificadas se comprobó mediante la unión de un
anticuerpo monoclonal específico de Phl p 1 (Fig. 4b).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de tiras reactivas es un método de
ensayo sencillo para la determinación de la reactividad IgE de IgE
específicas a partir de sueros de alérgicos en proteínas de ensayo
unidas a membrana.
Para ello las sustancias a ensayar se mezclan
entre sí, en la misma concentración y cantidad, en una tira
reactiva de membrana de nitrocelulosa bajo condiciones no
desnaturalizantes. Paralelamente se puede incubar una serie de
tiras de membrana de este tipo con diferentes sueros de alérgicos.
Tras una etapa de lavado, en la membrana se hacen visibles los
anticuerpos IgE unidos específicamente mediante una reacción de
tinción, mediada por un conjugado fosfatasa
alcalina/anti-IgE humana.
Como ejemplo de las moléculas Phl p 1
modificadas descritas, se presentan aquí los resultados de los
ensayos de tiras reactivas referentes a Phl p 1 NoCys, Phl p 1
NoCys \Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 mediante el empleo de sueros individuales de
alérgicos al polen de gramíneas (Fig. 5). Se emplearon solamente
sueros de alérgicos con un título de IgE elevado frente a la Phl p 1
natural. Los anticuerpos IgE de estos pacientes reaccionan del
mismo modo con el equivalente recombinante rPhl p 1 wt.
Resulta claro que los anticuerpos IgE
específicos de Phl p 1 de todos los sueros de pacientes se unen en
menor grado a la variante recombinante Phl p 1 NoCys, pero no al
alérgeno natural Phl p 1.
Se obtiene una reducción aún mayor de la
capacidad de unión a IgE mediante la eliminación adicional de
determinados intervalos de secuencia, lo que se representa en la
variante Phl p 1 NoCys \Delta213-220. La variante
Phl p 1 NoCys \Delta213-220 muestra con todos los
sueros de alérgicos probados una capacidad de unión a IgE muy
reducida frente a la proteína natural recombinante no modificada.
Se puede conseguir otra reducción de la capacidad de unión a IgE de
Phl p 1 en anticuerpos IgE de determinados sueros mediante la
combinación de varias deleciones, lo que se puede reconocer en los
resultados del ensayo de la variante Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 con el suero de alérgicos al polen de
gramíneas P14 (Fig. 5).
Por tanto, resulta claro que tanto la
sustitución de cisteínas como la deleción de intervalos específicos
de secuencia reduce la capacidad de unión a IgE de la molécula de
Phl p 1.
En contraposición al ensayo de tiras reactivas,
con el ensayo de inhibición EAST (Enzyme Allergosorbent Test) se
analizan las interacciones entre alérgeno e IgE en solución, de modo
que mediante la inmovilización en la membrana se puede excluir de
forma esencial el molesto enmascaramiento de los epítopos de la
sustancia a ensayar.
El ensayo de inhibición EAST se realiza como
sigue. Se recubren placas de microtitulación con alérgenos, aquí
nPhl p 1. Tras la eliminación por lavado de las moléculas de
alérgeno no unidas, la placa se bloquea con albúmina de suero
bovino para evitar uniones inespecíficas posteriores. Los
anticuerpos IgE de alérgicos, como acervo representativo de sueros
individuales (acervo de suero) o como suero individual, se incuban a
la dilución adecuada con las placas de microtitulación recubiertas
de alérgeno. La cantidad de anticuerpos IgE unidos al alérgeno se
cuantifica fotométricamente mediante un conjugado fosfatasa
alcalina/anti-IgEh mediante la transformación de un
sustrato en un producto final coloreado.
La unión de los anticuerpos IgE se inhibe de
forma específica según la sustancia mediante un alérgeno soluble o
la sustancia a ensayar (alérgeno modificado recombinante)
dependiendo de la concentración.
A modo de ejemplo para las moléculas de Phl p 1
modificadas, aquí se presentan los resultados del ensayo referentes
a Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys \Delta213-220 y Phl
p 1 NoCys \Delta1-6, 115-119,
213-220 en comparación con la molécula de
referencia nPhl p 1.
Los ensayos de inhibición de IgE representativos
presentados en la Figura 6 con cuatro sueros individuales de
alérgicos al polen de gramíneas muestran que incluso con altas
concentraciones de la variante Phl p 1 NoCys (hasta 5 \mug/ml)
sólo se obtuvo aproximadamente el 20-50% del efecto
inhibidor máximo del alérgeno natural no modificado nPhl p1. El
efecto inhibidor máximo más bajo indica una pérdida de epítopos de
IgE.
Los perfiles de la curva de las variantes Phl p
1 NoCys \Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 muestran que estas variantes de Phl p 1
tienen una capacidad de unión a IgE aún menor. No se pudo demostrar
un efecto inhibidor individualmente variable o se demostró sólo a
muy baja intensidad (0-20% del efecto inhibidor
máximo).
Por tanto, conforme a los resultados del ensayo
de tiras reactivas se puede justificar que mediante la introducción
de deleciones dirigidas adicionales se puede reducir más la
capacidad de unión a IgE de Phl p 1.
La reducción funcional de la alergenicidad se
determinó mediante un ensayo in vitro de activación de
basófilos. Para el ensayo de activación de basófilos se incuba
sangre entera heparinizada procedente de alérgicos al polen de
gramíneas con diferentes concentraciones de las sustancias a
ensayar. Las sustancias alergénicas se unen específicamente a los
anticuerpos IgE unidos a Fc\varepsilonRI de los basófilos y
conducen a una ramificación de las moléculas de Fc\varepsilonRI.
Esta ramificación de Fc\varepsilonRI mediada por IgE inducida por
alérgenos conduce a la activación de los basófilos. La activación es
la primera etapa en la reacción alérgica de estas células
efectoras. La posterior transducción de señal tiene como resultado
la desgranulación de las células efectoras y por tanto el
desencadenamiento de las reacciones alérgicas in vivo.
Se puede demostrar in vitro la activación
de granulocitos basófilos inducida por alérgenos mediante la
cuantificación de la expresión de una proteína de superficie
(CD203c) acoplada con la transducción de señal de la ramificación
del receptor de IgE (Kahlert y col., 2003, Cli., Exp. Allergy 33:
1266-72). El número de proteínas CD203c expresadas
en una célula y el valor porcentual de las células activadas de una
mezcla de células se mide con alta sensibilidad mediante la unión
de un anticuerpo monoclonal con marcador de fluorescencia en el
marcador de superficie y a continuación análisis mediante citometría
de flujo activada por fluorescencia.
Como sustancia de referencia aquí se empleó Phl
p 1 natural (nPhl p 1) purificada paralelamente a las sustancias a
ensayar. A modo de ejemplo para las moléculas modificadas de Phl p 1
descritas, aquí se presentan los resultados de Phl p 1 NoCys, Phl p
1 NoCys \Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220.
En la figura 7 se presentan en forma de curvas
los resultados representativos del ensayo de las variantes Phl p 1
NoCys con basófilos de cuatro alérgicos definidos clínicamente. La
reducción de la eficacia alergénica de la variante Phl p 1 NoCys
relativa a nPhl p 1 natural resulta evidente a través del
desplazamiento de las curvas de activa-
ción.
ción.
Los resultados del ensayo de las variantes Phl p
1 NoCys \Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220, en consonancia con los resultados del
ensayo de tiras reactivas y del ensayo de inhibición de IgE,
presentan una reducción aún mayor de la eficacia alergénica
relativa, como muestran las curvas representativas de las figuras 8
y 9.
Mientras que en un intervalo de concentración de
las sustancias a ensayar de 100-1000 pM mediante el
alérgeno natural ya se activó una proporción máxima de los
basófilos, empleando los alérgenos modificados Phl p 1 NoCys
\Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 no se pudo demostrar activación de basófilos
o ésta fue muy
baja.
baja.
La eficacia alergénica de la variante Phl p 1
NoCys \Delta213-220, como se puede calcular
mediante los valores A50 de la curva, fue \sim
100-1000 veces menor y la de la variante Phl p 1
NoCys \Delta1-6, 115-119,
213-220 fue más de 1000 veces menor respecto a la
referencia nPhl p 1 (A50: concentración de alérgeno al 50% del
número máximo de basófilos activados).
\vskip1.000000\baselineskip
Los linfocitos T auxiliares reaccionan con
fragmentos de péptidos de los alérgenos (aprox.
12-25 aminoácidos), que se forman por
descomposición enzimática en células presentadoras de antígeno (APC)
y tras la inclusión de los péptidos adecuados en las moléculas MHC
de clase II individuales, las células T se presentan en la
superficie de las APC. Esta activación específica de alérgeno de los
linfocitos T auxiliares es la condición para la proliferación y
para la diferenciación funcional (TH1 y TH2). La influencia de los
linfocitos T específicos de alérgeno en la hiposensibilización a
través del tratamiento con alérgenos o un derivado de alérgeno se
considera la clave de la eficacia terapéutica.
Para estudiar la reactividad con las células T
se establecen líneas de células T oligoclonales de alérgicos al
polen de gramíneas bajo estimulación con moléculas de nPhl p 1 o
rPhl p 1 wt según el procedimiento habitual. En un ensayo de
proliferación se estimularon las diferentes líneas de células T con
los alérgenos de referencia nPhl p 1 y rPhl p 1 wt, así como las
variantes Phl p 1 recombinantes modificadas. La velocidad de
proliferación se determinó mediante la incorporación de
[^{3}H]-timidina con los procedimientos
habituales.
A modo de ejemplo para las moléculas de Phl p 1
modificadas descritas, aquí se presentan los resultados del ensayo
de proliferación de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys
\Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220.
Los resultados presentados en la Tabla 1 con
líneas de células T de ocho alérgicos al polen de gramíneas muestran
que se pudo estimular la proliferación de linfocitos T mediante las
variantes de alérgenos recombinantes. La reactividad con las
células T de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys
\Delta213-220 y Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 sólo se reduce un poco, en comparación con
los alérgenos naturales recombinantes y naturales no modificados,
lo que demuestra la conservación de los decisivos epítopos de
células T.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para la construcción de la variante Phl p 1
NoCys (ID. SEC. Nº 3 y 4) se realizaron seis etapas de PCR partiendo
del ADNc de rPhl p 1 wt ("GenBank" registro Z27090; NCBI,
Bethesda, USA). Se realizaron mutaciones puntuales, en las que se
emplearon cebadores específicos de PCR, que en lugar de codones que
codifican para cisteína contenían los que codifican para serina
(secuencias cebadoras, ver Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Preparación del fragmento de ADN
N-terminal "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S] (pb
1-212)": mediante la amplificación por PCR de
oligonucleótidos largos solapados (P 1-63, P
49-111, P 97-158 y P
144-212) se generó un fragmento de ADN con las
mutaciones C41S, C57S, C69S.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Preparación del fragmento de ADN
C-terminal "Phl p 1 [C69S, C72S, C77S, C83S] (pb
193-720)": PCR del ADNc de Phl p 1 wt con los
cebadores P 193-261 y P 703-720
HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
Preparación del ADN que codifica para "Phl p 1
[C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S] (pb 1-720)":
PCR de los fragmentos solapados "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S] (pb
1-212)" y "Phl p 1 [C69S, C72S, C77S, C83S]
(pb 193-720)" con los cebadores P
1-63 y P 703-720 HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
Preparación del fragmento de ADN
N-terminal "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S,
C83S, C139S] (pb 1-428)": PCR del ADNc de "Phl
p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S] (pb
1-720)" con los cebadores P 1-63
y P 406-428as.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
Preparación del fragmento de ADN
C-terminal "Phl p 1 [C139S] (pb
406-720)": PCR del ADNc de rPhl p 1 con los
cebadores P 406-428s y P 703-720
HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
Preparación del ADN completo que codifica para
Phl p 1 NoCys: PCR de los fragmentos solapados "Phl p 1 [C41S,
C57S, C69S, C72S, C77S, C83S, C139S] (pb 1-428)"
y "Phl p 1 [C139S] (pb 406-720) con los cebadores
P 1-63 y P 703-720
HindIII".
Los ADN que codifican para Phl p 1 NoCys fueron
digeridos con el enzima de restricción HindIII, se ligaron
en el vector de expresión pProExHT (Invitrogen, Carlsbad, USA) a
través de los sitios de restricción EheI y HindIII y
finalmente se secuenciaron completamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
2
La secuencia de ADN que codifica para la
variante de deleción Phl p 1 NoCys \Delta213-220
(ID. SEC. Nº 15 y 16) se generó mediante PCR del ADN de Phl p 1
NoCys empleando el cebador 5' P 1-18 así como el
cebador 3' P 613-720
(\Delta637-660) HindIII acortado específico
para el intervalo de secuencia a eliminar.
Los ADNc se digirieron con el enzima de
restricción HindIII, se ligaron mediante los sitios de
restricción EheI y HindIII en el vector de expresión
pProExHT (Invitrogen, Carlsbad, USA) y a continuación se
secuenciaron completamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La secuencia de ADN que codifica para la
variante de deleción Phl p 1 NoCys \Delta1-6,
115-119, 213-220 (ID. SEC. Nº 5 y
6) se generó en tres etapas mediante PCR empleando oligonucleótidos
acortados específicos del intervalo de secuencia a eliminar.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Preparación del fragmento de ADN
N-terminal "Phl p 1 NoCys
\Delta1-6 (pb 1-300)": PCR del
ADNc de Phl p 1 NoCys con los cebadores P22-63
(\Delta1-18) y P 250-318.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Preparación del fragmento de ADN
C-terminal "Phl p 1 NoCys
\Delta115-119, 213-220 (pb
283-663)": PCR de Phl p 1 NoCys con los
cebadores P 301-384
(\Delta343-357) y P 613-720
(\Delta637-660) HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
Preparación del ADN completo que codifica para
Phl p 1 NoCys \Delta1-6, 115-119,
213-220:
PCR de los fragmentos solapados "Phl p 1 NoCys
\Delta1-6 (bp 1-300)" y "Phl
p 1 NoCys \Delta115-119, 213-220
(pb 283-663)" con los cebadores
P22-63 (\Delta1-18) y P
703-720 HindIII.
El ADN que codifica para Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119,
213-220 se digirió con el enzima de restricción
HindIII, se ligó en el vector de expresión pProExHT
(Invitrogen, Carlsbad, USA) mediante los sitios de restricción EheI
y HindIII y a continuación se secuenció completamente.
Los ADN de las variantes Phl p 1 NoCys
\Delta1-6 (ID. SEC. Nº 5 y 6), Phl p 1 NoCys
\Delta1-30 (ID. SEC. Nº 7 y 8), Phl p 1 NoCys
\Delta92-104 (ID. SEC. Nº 9 y 10), Phl p 1 NoCys
\Delta115-119 (ID. SEC. Nº 11 y 12), Phl p 1
NoCys \Delta175-185 (ID. SEC. Nº 13 y 14) se
prepararon, clonaron y secuenciaron de la forma correspondiente.
<110> Merck Patent GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes de los alérgenos del grupo
1 de Poaceae con alergenicidad reducida y reactividad con
células T conservada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P 04/107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> DE 102004035337.9
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-07-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 723
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(723)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 723
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(723)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(705)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 633
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(633)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(684)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 708
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(708)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 690
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(690)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 699
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(699)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 666
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(666)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Phleum pratense
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (20)
1. Variantes de Phl p 1, caracterizadas
porque presentan una reactividad IgE reducida del alérgeno natural,
así como una reactividad con linfocitos T ampliamente conservada y
porque faltan las cisteínas de las posiciones de aminoácido 41, 57,
69, 72, 77, 83 y 139 correspondientes a la proteína madura Phl p
1.
2. Variantes de Phl p 1 según la reivindicación
1, caracterizadas porque las cisteínas de las posiciones de
aminoácido 41, 57, 69, 72, 77, 83 y 139 correspondientes a la
proteína madura Phl p 1 están sustituidas por otro aminoáci-
do.
do.
3. Variantes de Phl p 1 según la reivindicación
2, caracterizadas porque las cisteínas de las posiciones de
aminoácido 41, 57, 69, 72, 77, 83 y 139 correspondientes a la
proteína madura Phl p 1 están sustituidas por serina (Variante Phl
p 1 NoCys según ID SEC. Nº 4).
4. Variantes de Phl p 1 según una o varias de
las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizadas porque
les falta al menos un intervalo o una combinación de intervalos
correspondientes a los aminoácidos 1-6,
1-30, 92-104,
115-119, 175-185 y
213-220 de la secuencia primaria de la proteína Phl
p 1 madura, en comparación con el alérgeno
natural.
natural.
5. Variantes de Phl p 1 según una o varias de
las reivindicaciones de la 1 a la 4, en las que faltan los
aminoácidos 213-220 correspondientes a la secuencia
de Phl p 1 madura.
6. Variantes de Phl p 1 según la reivindicación
4 o 5, en las que las cisteínas 41, 57, 69, 72, 77, 83 y 139 de la
proteína madura se sustituyen por serina y faltan los aminoácidos
213-220 (Variante Phl p 1 NoCys
\Delta213-220 según ID. SEC. Nº 16).
7. Variantes de Phl p 1 según la reivindicación
4, en las que faltan los aminoácidos 1-6,
115-119 y 213-220 correspondientes
a la secuencia de Phl p 1 madura.
8. Variantes de Phl p 1 según la reivindicación
4 o 7, en las que las cisteínas 41, 57, 69, 72, 77, 83 y 139 de la
proteína madura están sustituidas por serina y faltan los
aminoácidos 1-6, 115-119 y
213-220 (Variantes Phl p 1 NoCys
\Delta1-6, 115-119 y
213-220 según SEC. ID. Nº 18).
9. Variantes de Phl p 1 según las
reivindicaciones 1-8, caracterizadas porque
se obtuvieron de forma recombinante por métodos de ingeniería
genética.
10. Moléculas de ADN que codifican para
variantes de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de
la 1 a la 9.
11. Vector de expresión recombinante que
contiene una molécula de ADN según la reivindicación 10, unida
funcionalmente con una secuencia de control de expresión.
12. Organismo huésped no humano, transformado
con una molécula de ADN según la reivindicación 10 o con un vector
de expresión según la reivindicación 11.
13. Procedimiento para la preparación de una
variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de
la 1 a la 9 mediante cultivo de un organismo huésped según la
reivindicación 18 y obtención de las variantes de alérgeno
correspondientes a partir del cultivo.
14. Variantes de alérgeno según una o varias de
las reivindicaciones de la 1 a la 9, como medicamento.
15. Preparación farmacéutica que contiene al
menos una variante de alérgeno correspondiente a una o varias de
las reivindicaciones de la 1 a la 9 y dado el caso otros principios
activos y/o excipientes para el tratamiento preventivo y
terapéutico de alergias en cuya activación toman parte los alérgenos
del grupo 1 de la especie Poaceae.
16. Uso de al menos una variante de alérgeno
según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 9 para la
preparación de un medicamento para la prevención y terapia de
alergias en cuya activación toman parte los alérgenos del grupo 1
de la especie Poaceae.
17. Molécula de ADN según la reivindicación 10,
como medicamento.
18. Vector de expresión recombinante según la
reivindicación 11, como medicamento.
19. Preparación farmacéutica que contiene al
menos una molécula de ADN según la reivindicación 10 o al menos un
vector de expresión según la reivindicación 18 y dado el caso otros
principios activos y/o excipientes para la vacunación
inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya
activación toman parte alérgenos del grupo 1 de Poaceae y/o
para la prevención de dichas alergias.
20. Uso de al menos una molécula de ADN según la
reivindicación 10 o al menos un vector de expresión según la
reivindicación 18 para la preparación de un medicamento para la
vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias, en
cuya activación están implicados alérgenos del grupo 1 de
Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.
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