ES2378870T5

ES2378870T5 - Vacuna que comprende péptidos Amb a 1 para uso en el tratamiento de alergia a ambrosía

Info

Publication number: ES2378870T5
Application number: ES09251252.4T
Authority: ES
Inventors: Mark Larche; Roderick Peter Hafner; Paul Laidler
Original assignee: Circassia Ltd
Current assignee: Circassia Ltd
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2009-05-01
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2029-05-01
Also published as: JP5788319B2; CA2734379A1; CN104710512A; PL2153841T5; AU2009281013A1; EP2153841B1; EP2433639A2; KR20110044787A; JP2012500193A; US8491910B2; US20130295123A1; EP2433639A3; EP2444100A3; PL2153841T3; EA201170336A1; EP2444100A2; CN102170897B; US20120108524A1; EP2153841B2; US9347937B2

Description

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En otras palabras, una realización específica de la invención proporciona una composición para uso en la prevención o tratamiento de alergia a ambrosía mediante inducción de inmunotolerancia que comprende entre tres y trece secuencias peptídicas, en la que la composición consiste en:

5 a) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:

RGW01 GMIKSNDGPPI; RGW01A GLIKSHDGPPV; RGW01B GLIKSNDGPAA;

10 o una variante de los mismos, y; b) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:

RGW03 KDLLENGAIFVTSG; RGW03A DVFENGAIFVPSG; RGW03B RDLLENGAIFLPSG;

o variantes de los mismos y; 15 c) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:

RGW04 KAGMIPAEPGEA

RGW4A SAGMIPAEPGEA;

o variantes de los mismos y opcionalmente; 20 d) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:

RGW02 GSSQIWIDHSSLSKS;

RGW04 KAGMIPAEPGEA;

RGW4A SAGMIPAEPGEA;

RGW06 VVNSDKTIDGRGVKVE;

RGW06A AINNDKTIDGRGAKVE;

RGW09 ETRRSLKTSGAYN;

RGW10 FGFFQVVNNNYD;

RGW10A HGFFQVVNNNYD;

RGW05 KEGTLRFAAAQNRP;

RGW05A KEGTLRFGAAQNRP;

o variantes de los mismos y opcionalmente; e) al menos uno de los polipéptidos con las siguientes secuencias:

25 RGW07 GEAAIKLTSSAGVLS; RGW07C KGEAAIKLTSSAGVLSK; RGW07D KGEAAIKLTSSAGVLSKK;

o variantes de los mismos.

Se apreciará que (a) a (e) anteriormente representan criterios rigurosos y altamente selectivos para la identificación

30 de combinaciones adecuadas de la invención. Por ejemplo, si se seleccionan seis péptidos aleatoriamente a partir de las secuencias de la invención habría cerca de un millón de combinaciones posibles para elegir. Por el contrario, es útil considerar un ejemplo de una combinación de seis polipéptidos en la cual se aplican los criterios anteriores. Por ejemplo, considerar una combinación en la que se seleccionan los siguientes polipéptidos:

35 i) uno cualquiera de los polipéptidos de RGW01, RGW01A o RGW01B y uno cualquiera de los polipéptidos de RGW03, RGW03A o RGW03B y uno cualquiera de los polipéptidos de RGW04 y RGW04A; y ii) tres polipéptidos adicionales seleccionados entre los polipéptidos de cualquiera de RGW02, RGW09, RGW06, RGW06A, RGW10, RGW10A, RGW05 o RGW05A; y finalmente

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Penalización de apertura de hueco: 10,00, % de identidad por retraso: 30, Penalización de huecos finales: activada, Distancia de separación de hueco: 0, Matriz negativa: no, Penalización de extensión de hueco: 0,20, Penalizaciones de hueco específicas de resto: activada, Penalizaciones de hueco hidrófilo: activada, Restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un resto particular tiene por objeto incluir restos

5 idénticos que simplemente se han derivatizado.

Un péptido variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más o hasta 10 sustituciones de aminoácido a partir de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.

10 Las variantes de sustitución preferentemente implican el reemplazo de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y la realización de sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, un aminoácido se puede sustituir con un aminoácido alternativo que tiene propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas

15 propiedades de los 20 aminoácidos principales que se pueden usar para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes:

Ala: alifático, hidrófobo, neutro Met hidrófobo, neutro

Cys: polar, hidrófobo, neutro Asn polar, hidrófilo, neutro

Asp: polar, hidrófilo, cargado (-) Pro hidrófobo, neutro

Glu: polar, hidrófilo, cargado (-) Gln polar, hidrófilo, neutro

Phe: aromático, hidrófobo, neutro Arg polar, hidrófilo, cargado (-)

Gly: alifático, neutro Ser polar, hidrófilo, neutro

His: aromático, polar, hidrófilo, cargado (-) Thr polar, hidrófilo, neutro

Ile: alifático, hidrófobo, neutro Val alifático, hidrófobo, neutro

Lys: polar, hidrófilo, cargado (+) Trp aromático, hidrófobo, neutro

Leu: alifático, hidrófobo, neutro Tyr aromático, polar, hidrófobo

20 Las variantes adicionales incluyen aquellas en las cuales en lugar del aminoácido de origen natural el aminoácido que aparece en la secuencia es un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos usados en las secuencias también se pueden modificar, por ejemplo, marcar, con la condición de que la función del péptido no se afecte negativamente de forma significativa.

25 Cuando el péptido tiene una secuencia que varía de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 o un fragmento de las mismas, las sustituciones se pueden producir a través de la longitud completa de la secuencia, dentro de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 o fuera de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Por ejemplo, las variaciones descritas en el presente documento, tales como adiciones, supresiones, sustituciones y modificaciones, se pueden producir dentro de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Un péptido variante

30 puede comprender o consistir básicamente en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31 en la cual se han realizado una, dos, tres, cuatro o más sustituciones de aminoácidos. Un péptido variante puede comprender un fragmento de la proteína parental que es más grande que cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. En esta realización, las variaciones descritas en el presente documento, tales como sustituciones y modificaciones, se pueden producir dentro y/o fuera de la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.

35 Los péptidos variantes de la invención tienen de 9 a 20 o más preferentemente de 13 a 17 aminoácidos de longitud. Los péptidos pueden ser de la misma longitud que las secuencias peptídicas en cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31.

Los péptidos se pueden obtener químicamente a partir del alérgeno de polipéptido, por ejemplo mediante escisión

40 proteolítica o se pueden obtener en un sentido intelectual a partir del alérgeno de polipéptido, por ejemplo usando la secuencia de aminoácidos del alérgeno de polipéptido y sintetizando péptidos en base a la secuencia. Los péptidos se pueden sintetizar usando métodos bien conocidos en la técnica.

Cuando los polipéptidos comprenden restos que son típicamente difíciles de conservar durante la preparación, estos

45 restos se pueden reemplazar. Por ejemplo, glutamato forma espontáneamente piroglutamato en solución particularmente cuando está presente en el extremo N de un péptido. Por tanto, los restos de los péptidos de la invención que corresponden a un glutamato o un resto de glutamina en la secuencia de una secuencia de proteína de alérgeno nativa se pueden reemplazar con piroglutamato en los péptidos de la invención cuando un resto de este tipo está presente en el extremo N de un péptido.

50 El término “péptido” incluye no sólo moléculas en las cuales los restos de aminoácidos se unen mediante enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino también moléculas en las cuales el enlace peptídico está invertido. Tales peptidomiméticos retro-inversos se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los que se describen en Meziere et al (1997) J. Immunol. 159.3230-3237. Este enfoque implica preparar

55 pseudopéptidos que contienen cambios que implican a la estructura principal y no la orientación de las cadenas

laterales. Meziere et al (1997) muestran que, al menos para respuestas del CMH de clase II y células T auxiliares, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlace peptídico CO-NH son mucho más resistentes a la proteólisis.

5 De forma similar, se puede prescindir del enlace peptídico con todo siempre que se use un resto enlazador apropiado que conserve la separación entre los átomos de carbono del resto de aminoácido; es particularmente preferido si el resto enlazador tiene sustancialmente la misma distribución de carga y sustancialmente la misma planitud que el enlace peptídico. También se apreciará que el péptido se puede bloquear de forma conveniente en su extremo N o C de forma de ayudar a reducir la susceptibilidad a digestión exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino N terminal de los péptidos se puede proteger sometiéndolo a reacción con un ácido carboxílico y el grupo carboxilo C terminal del péptido se puede proteger sometiéndolo a reacción con una amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen glicosilación y fosforilación. Otra modificación potencial es que los hidrógenos en las aminas de cadena lateral de R o K se pueden reemplazar con grupos metileno (-NH2 → -NH(Me) o –N(Me)2).

15 Los análogos de péptidos de acuerdo con la invención también pueden incluir variantes peptídicas que aumentan o disminuyen la semivida del péptido in vivo. Los ejemplos de análogos capaces de aumentar la semivida de péptidos usados de acuerdo con la invención incluyen análogos peptoides de los péptidos, derivados de D-aminoácidos de los péptidos e híbridos péptido-peptoide. Una realización adicional de los polipéptidos de variante usados de acuerdo con la invención comprende formas de D-aminoácidos del polipéptido. La preparación de polipéptidos usando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos reduce enormemente cualquier degradación indeseada de un agente de este tipo mediante procesos metabólicos normales, reduciendo las cantidades de agente que se necesita administrar, junto con la frecuencia de su administración.

Los péptidos proporcionados por la presente invención se pueden obtener a partir de variantes de corte y empalme

25 de las proteínas parentales codificadas por ARNm generados mediante corte y empalme alternativo de los transcritos primarios que codifican las cadenas de proteína parental. Los péptidos también se pueden obtener a partir de mutantes de aminoácido, variantes de glicosilación y otros derivados covalentes de las proteínas parentales que conservan al menos una propiedad de unión al CMH de los alérgenos. Los derivados ilustrativos incluyen moléculas en las que los péptidos de la invención se modifican covalentemente mediante sustitución, química, enzimática u otro medio apropiado con un resto diferente a un aminoácido de origen natural. Además se incluyen variantes de origen natural de las proteínas parentales encontradas en diferentes ácaros. Una variante de este tipo se puede codificar por una variante alélica o representar una variante de corte y empalme alternativo.

Las variantes como se describen anteriormente se pueden preparar durante la síntesis del péptido o mediante

35 modificación post-producción o cuando el péptido esté en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.

De acuerdo con la invención, los péptidos adicionales que la composición puede comprender preferentemente son variantes funcionales de cualquiera de SEC ID Nº: 1 a 31. Es decir, los péptidos son preferentemente capaces de inducir una respuesta inmune. En particular, los péptidos son preferentemente capaces de inducir producción de citoquina en individuos alérgicos a ambrosía. Típicamente, la composición de la invención comprenderá por lo tanto, al menos un polipéptido o variante del mismo que produce una respuesta de citoquina en más del 45, 50, 55%, preferentemente el 60% o el 65% de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía. El número de individuos en un panel de individuos alérgicos a ambrosía puede ser cualquier número mayor de uno, por ejemplo al 45 menos 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 individuos. Preferentemente la composición comprende al menos dos, tres

o más preferentemente cuatro péptidos de este tipo. Preferentemente la respuesta de citoquina es producción de IL13 o IFN-gamma. La producción de citoquina se puede medir mediante cualquier método adecuado. La producción de una citoquina típicamente se considera que ha ocurrido como respuesta a un péptido si el nivel de citoquina producido en presencia del péptido es al menos 2, 3, 4 ó 5 veces superior al nivel de fondo de dicha citoquina que se produce en la ausencia de un estímulo (es decir, el nivel producido por el mismo individuo en ausencia del péptido o cualquier otro estímulo). Como alternativa, la producción de una citoquina se puede considerar que ha ocurrido si la cantidad de citoquina producida supera un límite reconocido, típicamente 90, 95 o preferentemente 100 g/ml, típicamente a partir de una muestra de aproximadamente 1,25 x 106 células en 250 l.

55 Los métodos adecuados para medir producción de citoquina típicamente incluyen la medición de la liberación de citoquina a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o partir de una muestra tomada de un sujeto. La muestra típicamente es sangre o suero. La liberación de citoquina a partir de PBMC se mide después de incubar las células en presencia de un péptido determinado. Los sobrenadantes de la mezcla de incubación después se ensayan para determinar la presencia de una citoquina, usando cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo de ELISA, ELISPOT o ensayo citométrico de flujo. Los métodos particularmente preferidos incluyen ensayos en serie Multiplex bead como se describe en, por ejemplo, Jager et al; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, Vol 10(1) pág. 133-139. Típicamente, la composición puede comprender al menos un péptido adicional o variante del mismo que no esté entre los polipéptidos seleccionados previamente, hasta un total de trece péptidos diferentes, que producen una respuesta de citoquina en más del 30%, el 35%, el 40%, preferentemente el

65 45% o el 50% de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía.

La composición comprende además uno o más péptidos adicionales o variantes de los mismos que no están entre los polipéptidos seleccionados previamente, hasta un total de trece péptidos diferentes, que producen una respuesta de citoquina en más del 10%, el 15%, el 20%, el 25%, preferentemente el 30% o el 35% de individuos en una población de individuos alérgicos a ambrosía.

5 La composición puede comprende además uno o más péptidos adicionales que inducen la liberación de IL-10. IL-10 se conoce como un modulador inmune que puede cambiar la respuesta de células T de una respuesta de tipo alérgica. Una liberación de IL-10 significativa puede conducir a la inducción de células T reguladoras que dan origen a o que mejoran la tolerancia de la presencia de otros péptidos en la composición.

Preferentemente, dicho péptido puede inducir la liberación de IL-10 en al menos el 35, el 40, el 45, el 50 o el 55% de una población. En esta realización, por lo tanto el péptido es capaz de unirse a un subconjunto de alelos del CMH que es ilustrativo de una proporción equivalente de la población de muestra. Preferentemente, los péptidos inducen la liberación de IL-10 en el 55% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más o

15 el 90% o más de una población.

“Inducción de liberación de IL-10” se define en el presente documento como una liberación que es medible mediante métodos usados comúnmente en la técnica. Típicamente, la respuesta se mide in vitro usando células T obtenidas a partir de los individuos alérgicos. Una “inducción” se valora como un nivel de IL-10 que es mayor que aquél observado en una muestra de control cuando las células T no están expuestas al péptido. En algunas realizaciones, una inducción de liberación de IL-10 adecuada para inducción de inmunotolerancia se puede definir como una liberación de IL-10 de al menos el 35, el 40, el 45, el 50 o el 55% de la cantidad promedio de IL-10 liberada como respuesta al alérgeno de proteína completa del cual el primer polipéptido es un fragmento. Se ha de comprender que el alérgeno de proteína usado como una comparación puede ser el polipéptido intacto completo o puede ser una

25 forma truncada que comprende los epítopos de células T que median la respuesta inmune al alérgeno de proteína. Comúnmente, los péptidos individuales obtenidos a partir del alérgeno de proteína demostrarán una liberación de IL10 promedio que es mucho más baja que la obtenida como respuesta al alérgeno de proteína completo o truncado como se ha definido anteriormente. Sin embargo, los péptidos individuales que muestran liberación de IL-10 de al menos el 35, el 40, el 45, el 50 o el 55% de la liberación de IL-10 al alérgeno de proteína completo o truncado pueden ser agentes de inducción de inmunotolerancia particularmente adecuados. Los péptidos también pueden presentar una respuesta promedio que es igual que o mayor que, la respuesta observada en respuesta al alérgeno de proteína completo o truncado.

Como alternativa el nivel promedio de IL-10 liberado se puede medir en términos absolutos, en cuyo caso un nivel

35 promedio por encima de aproximadamente 400, 450, 500 ó 550 pg/ml se considerará que es una inducción, típicamente a partir de una muestra de aproximadamente 1,25 x 106 células en 250 l.

Se ha de comprender que el promedio puede ser la media, la mediana o la moda de las liberaciones de IL-10 individuales observadas en la población. Se ha de comprender que cuando un individuo en la población presenta una liberación inusualmente baja o inusualmente alta de IL-10 en comparación con los otros miembros de la población, se pueden excluir del promedio. Esto puede permitir la medición de un promedio que sea más ilustrativo de las respuestas mostradas en la población. El término “inusualmente bajo” o “inusualmente alto” se puede referir a diferenciales de 10 veces o 20 veces en comparación con un promedio más ilustrativo de las liberaciones de IL-10 que excluye los individuos que muestran características de liberación de IL-10 inusuales.

45 Las variantes adecuadas capaces de unirse a TCR se pueden obtener empíricamente o seleccionarse de acuerdo con criterios conocidos. Dentro de un péptido único existen determinados restos que contribuyen a la unión dentro de la ranura de unión a antígeno del CMH y otros restos que interaccionan con regiones hipervariables del receptor de células T (Allen et al (1987) Nature 327: 713-5).

Dentro de los restos que contribuyen a la interacción de receptor de células T, se ha demostrado una jerarquía que corresponde a la dependencia de activación de células T tras la sustitución de un resto peptídico determinado. Usando péptidos que han tenido uno o más restos de contacto de receptor de células T sustituidos por un aminoácido diferente, varios grupos han demostrado efectos profundos sobre el proceso de activación de células T.

55 Evavold & Allen (1991) Nature 252: 1308-10 demostraron la disociación de proliferación de células T y producción de citoquina. En este modelo in vitro, un clon de células T específico de restos 64-76 de hemoglobina (en el contexto de I-Ek), se expuso a un análogo peptídico en el que cual se había realizado una sustitución conservativa de ácido glutámico por ácido aspártico. Esta sustitución no interfirió significativamente con la capacidad del análogo de unirse a I-Ek.

A continuación de la exposición in vitro de un clon de células T a este análogo, no se detectó proliferación aunque se mantuvo la secreción de IL-4, al igual que la capacidad del clon de ayudar a respuestas de células B. En un estudio posterior el mismo grupo demostró la separación de citólisis mediada por células T de la producción de citoquinas. En este caso, el primero permaneció inalterado mientras que el último estuvo alterado. La eficacia de ligandos 65 peptídicos alterados in vivo se demostró inicialmente en un modelo murino de EAE (encefalomielitis alérgica experimental) por McDevitt y colegas (Smilek et al (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 9633-9637). En este modelo

se induce EAE mediante inmunización con el péptido encefalitogénico Ac1-11 de MBP (proteína básica de mielina). La sustitución en la posición cuatro (lisina) con un resto de alanina generó un péptido que se unió bien a su elemento limitante (AAu), pero que era no inmunogénico en la cepa susceptible PL/JxSJLF1 y que, además prevenía la aparición de EAE cuando se administraba antes o después de la inmunización con el péptido

5 encefalitogénico. Por tanto, se pueden identificar restos que influyen sobre la capacidad de los péptidos de inducir diversas funciones de las células T.

De forma provechosa, los péptidos se pueden diseñar para favorecer la proliferación de células T y la inducción de de desensibilización. Metzer y Wraith han demostrado capacidad de inducción de tolerancia mejorada de péptidos en los cuales se han realizado sustituciones que aumentan la afinidad péptido-CMH (Meztler & Wraith (1993) Int Immunol : 1159-65). Sloan-Lancaster et al (1993) Nature 363: 156-9 demostraron que un ligando de péptido alterado puede provocar anergia a largo plazo y profunda en células T clonadas.

Las composiciones de la invención son capaces de inducir una respuesta de fase tardía en un individuo que está

15 sensibilizado a los alérgenos. La expresión “respuesta de fase tardía” incluye el significado como se expone en Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, págs. 1113-1130. La respuesta de fase tardía puede ser cualquier respuesta de fase tardía (LPR). Preferentemente, los péptidos son capaces de inducir una respuesta asmática tardía (LAR) o una respuesta rinítica tardía o una respuesta dérmica de fase tardía o una respuesta ocular de fase tardía. Si un péptido particular puede dar origen a una LPR o no se puede terminar usando métodos bien conocidos en la técnica; un método particularmente preferido es el que se describe en Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J y Kay Ab. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. En: Handbook of Experimental Immunology (4) Capítulo 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications, 1986.

25 Por tanto, preferentemente, los péptidos individuales de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo que se ha sensibilizado a los alérgenos. Si un individuo se ha sensibilizado o no a los alérgenos se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos tales como ensayo de punción de piel con soluciones de extractos de alérgenos, inducción de LPR cutánea, historia clínica, exposición a alérgeno y ensayo de radioalergoabsorbencia (RAST) para medición de IgE específica de alérgeno. Si un individuo particular se espera o no que se beneficie del tratamiento se puede determinar mediante el médico en base a, por ejemplo, tales ensayos.

La desensibilización o inducción de inmunotolerancia de un individuo a los alérgenos significa inhibición o amortiguación de reacciones tisulares alérgicas inducidas por los alérgenos en individuos sensibilizados apropiadamente. Se ha demostrado que las células T se pueden activar selectivamente y posteriormente volverlas

35 no sensibles. Además la inducción de anergia o eliminación de estas células T conduce a la desensibilización del paciente para un alérgeno particular. La desensibilización se manifiesta en sí misma como una reducción de una respuesta a un alérgeno o un péptido obtenido de un alérgeno o preferentemente una eliminación de una respuesta de este tipo, a la segunda administración o administraciones adicionales del alérgeno o péptido obtenido de alérgeno. La segunda administración se puede realizar después de que un período de tiempo adecuado ha pasado para permitir que ocurra la desensibilización, esto es preferentemente cualquier período entre un día y varias semanas. Un intervalo de aproximadamente dos semanas es preferido.

Aunque las composiciones de la invención son capaces de inducir una LPR en un individuo alérgico a ambrosía, se debe apreciar que cuando se usa una composición para tratar a un paciente es preferible que se use una

45 concentración suficientemente baja de la composición de forma de que no ocurra LPR observable pero que la respuesta sea suficiente para desensibilizar parcialmente las células T de forma que se pueda proporcionar la próxima dosis (preferentemente más elevada) y así sucesivamente. De esta manera la dosis se acumula para proporcionar una desensibilización completa pero con frecuencia sin inducir nunca una LPR en el paciente. Sin embargo, la composición o péptido es capaz de hacerlo a una concentración más elevada que la que se administra.

Las composiciones de la invención preferentemente son capaces de inducir una respuesta de fase tardía en el 50%

o más de un panel de individuos alérgicos a ambrosía de la población. Más preferentemente, las composiciones son capaces de inducir una LPR en el 55% o más, el 60% o más, el 65% o más, el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más o el 90% o más de individuos sensibilizados en un panel. Si las composiciones son capaces o no

55 de inducir una LPR en un porcentaje determinado de un panel de sujetos se puede determinar mediante métodos que se conocen bien en la técnica.

Se comprenderá que los péptidos de la invención comprenden un epítopo de célula T que consiste en un núcleo de 9 aminoácidos que son la secuencia esencial mínima necesaria para la unión al CMH de clase II. Sin embargo, los péptidos también pueden comprender restos adicionales flanqueantes del núcleo de 9 aminoácidos. Por lo tanto, los péptidos pueden comprender una región que contiene un epítopo de célula T, en la que algunos restos se pueden modificar sin afectar la función del epítopo. Por consiguiente, las variantes funcionales de los péptidos como se ha definido anteriormente incluyen péptidos que se alteran para mejorar su solubilidad con relación a la secuencia nativa de los péptidos. La solubilidad mejorada es provechosa para la inducción de inmunotolerancia de sujetos a 65 alérgenos a partir de los cuales se obtienen los péptidos de la invención, ya que la administración de agentes poco solubles a sujetos provoca respuestas inflamatorias no inductoras de inmunotolerancia indeseadas. La solubilidad de

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metros o menos, 2 metros o menos, 1 metro o menos o 0 metros de los artículos descritos anteriormente. Los síntomas de alergia pueden incluir picor de los ojos, mucosidad, dificultades para respirar, picor y enrojecimiento de la piel o erupción.

El individuo que se tiene que tratar puede ser de cualquier edad. Sin embargo, preferentemente, el individuo puede estar en el grupo de edad de 1 a 90, 5 a 60, 10 a 40 o más preferentemente 18 a 35.

Preferentemente, el individuo que se tiene que tratar es de una población que tiene frecuencias alélicas del CMH dentro del intervalo de frecuencias que son ilustrativos de la población caucásica. Las frecuencias alélicas de población de referencia para 11 familias de alelos de DERB1 comunes se muestran en la Tabla 1 (Datos de HLA Facts Book, Parham and Barber).

Tabla 1

DRB1: 1 3 4 7 8 11 12 13 14 15 16

%: 6,4 14,7 15,7 8,8 3,4 8,3 3,9 14,7 2,9 17,6 2,5

% de población de referencia: 9,4 11,1 12,8 13,2 3,7 13,4 2,3 10,2 3,2 10,7 3,6

15 Las frecuencias de referencia se obtuvieron mediante análisis de estudios múltiples que indicaban frecuencias y las figuras mostradas son valores medios. Por lo tanto preferentemente, el individuo que se tiene que tratar es de una población que tiene frecuencias alélicas del CMH equivalentes a la población de referencia para los alelos a los que se hace referencia en la Tabla 1 (tal como para al menos 1, 2, 3, 4, 5 o todos los alelos), por ejemplo dentro de los intervalos de esas figuras más o menos el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 10, el 15 o el 20%.

Preferentemente el individuo es de una población en la que las frecuencias alélicas de los siguientes alelos de DRB1 son:

4 – al menos el 9%

25 7 –al menos el 10% 11 –al menos el 8%

El individuo puede haber tenido alergia a ambrosía durante al menos 2 semanas, 1 mes, 6 meses, 1 año o 5 años. El individuo puede sufrir de una erupción, congestión nasal, descarga nasal y/o tos causada por la alergia. Al individuo puede o no haberse administrado otras composiciones/compuestos que tratan alergia a ambrosía.

El individuo típicamente vive en una región geográfica con un clima caliente y húmedo. El individuo típicamente sufre de una alergia a ambrosía en una estación particular. La estación típicamente corresponde a la época de floración de la ambrosía, que típicamente es del verano a otoño, preferentemente finales del verano (de julio a agosto en el

35 hemisferio norte) a principios de otoño (septiembre a octubre en el hemisferio norte). El individuo alérgico a ambrosía es típicamente alérgico al polen de ambrosía.

Inmunoterapia de combinación

Ya que muchos individuos son alérgicos o pueden necesitar la desensibilización a varios antígenos de polipéptidos, la presente invención también proporciona medios para desensibilizar a individuos que son alérgicos a múltiples antígenos. “Tolerancia” inducida en un individuo a un primer antígeno de polipéptido o alérgeno puede crear en el individuo un “entorno tolerante” en el que las respuestas inmunes inapropiadas a otros antígenos se pueden regular negativamente con el fin de proporcionar tolerancia a otros antígenos.

45 Este hallazgo significa que los individuos que son alérgicos a múltiples alérgenos se pueden tratar en un período de tiempo enormemente reducido y que los individuos gravemente alérgicos a algunos alérgenos (por ejemplo, cacahuete) pero más suavemente alérgicos a otros alérgenos (por ejemplo, caspa de gato) se pueden beneficiar de una terapia en la que se establece la tolerancia al alérgeno más suave y después este entorno de tolerancia se usa para proporcionar tolerancia al otro alérgeno más extremo. Adicionalmente, los individuos que sufren de un trastorno autoinmune que están sensibilizados de forma adicional (o de otra manera que son inmunes) a un antígeno o alérgeno no relacionado se pueden beneficiar de un régimen de tratamiento en donde la tolerancia al antígeno o alérgeno no relacionados establecen primer lugar y después este entorno de tolerancia se usa para proporcionar tolerancia al auto antígeno asociado con el trastorno autoinmune.

55 Por lo tanto se proporciona un método para desensibilizar a un individuo alérgico a ambrosía al alérgeno de ambrosía como se ha descrito anteriormente y uno o más antígenos polipeptídicos diferentes adicionales. El método implica, en una primera etapa, administrar al individuo una composición/formulación (composición primaria) de acuerdo con la invención como se ha descrito en el presente documento y en el que la administración se lleva a cabo en una manera suficiente para generar un estado hiposensible frente al alérgeno de ambrosía. Una vez que se ha establecido un estado hiposensible hacia el alérgeno de ambrosía o ha ocurrido al menos un cambio hacia la desensibilización, el método implica la administración de una composición secundaria que comprende un segundo antígeno polipeptídico diferente hacia el cual se tiene que sensibilizar el individuo. La administración de la

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539716; 539715; 423193; 423192; 423191; 423190; 1364213; 1364212; 395407; 163827; 163823; 163825; 1169665; 232086; 1169666. Látex Secuencias de Hevea: Hev b I

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Hev b 3

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Secuencias de Hevea adicionales (acceso de NCBI entrez):

15 3319923; 3319921; 3087805; 1493836; 1480457; 1223884; 3452147; 3451147; 1916805; 232267; 123335; 2501578; 3319662; 3288200; 1942537; 2392631; 2392630; 1421554; 1311006; 494093; 3183706; 3172534; 283243; 1170248; 1708278; 1706547; 464775; 266312; 231586; 123337; 116359; 123062; 2213877; 542013; 2144920; 1070656; 2129914; 2129913; 2129912; 100135; 82026; 1076559; 82028; 82027; 282933; 280399;

20 100138; 1086972; 108697; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 913758; 913757; 913756; 234388; 1092500; 228691; 1177405; 18839; 18837; 18835; 18833; 18831; 1209317; 1184668; 168217; 168215; 168213; 168211; 168209; 348137.

Césped inglés 25 Secuencias de Lolium:

126385 Lol p 1

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1268386 Lol p 2a

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126387 Lol p 3

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2498581 Lol p 5a

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2498582 Lol p 5b

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10 455288 Lol p isoforma 9

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15 1582249 Lol p 11

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Secuencias de Lolium adicionales (acceso de NCBI entrez):

5 135480; 417103; 687261; 687259; 1771355; 2388662; 631955; 542131; 542130; 542129; 100636; 626029; 542132; 320616; 320615; 320614; 100638; 100634; 82450; 626028; 100639; 283345; 542133; 1771353; 1763163; 310877; 310875; 250525; 55317; 515377; 510911; 939932; 439950; 2718; 168316; 168314; 485371; 2388664; 2832717; 2828273; 548867.

10 Árbol de Olivo

Secuencias de olivo

416610 Ole e 1 15

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20: Parietaria Secuencias de Parietaria 24997750 Par j P2

25: 1352506 Par j P5

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1532056 Par j P8

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1532058 Par j P9

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Phl p 5

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Phl p 5

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10 Phl p 5

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Phl p 5b

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Phl p 5a

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Phl p 5

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Phl p 5b

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15 Phl p 5

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1352699 ALÉRGENO VES V1

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1346323 ALÉRGENO VES V2

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549194 ALÉRGENO VES VI

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15 Secuencias de Vespula adicionales (acceso de NCBI entrez): 549193; 549192; 549191; 549190; 549131; 117414; 126761; 69576; 625255; 627131; 627188; 627187; 482382; 112561; 627186; 627185; 1923233; 317645; 317647; 745570; 225764; 162551. 20 Secuencias de alérgeno de árbol (principalmente abedul): 114922 Bet v 1

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130975 Bet v 2

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1168696 Bet v 3

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809536 Bet v 4

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15 543675 Que a I -Quercus alba = árboles de roble (fragmento) GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL

543509 Car b I -Carpinus betulus = árboles de carpinus (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQADGC

20 543491 Aln g I -Alnus glutinosa = árboles de aliso (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI

1204056 Rubisco 25

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Secuencias de alérgeno de árboles adicionales (número de acceso NCBI entrez):

30 131919; 128193; 585564; 1942360; 2554672; 2392209; 2414158; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3015520; 2935416; 464576; 1705843; 1168701; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1842188; 2564228; 2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 1813311; 1536831; 534910; 534900; 534318; 1340000; 1339998; 2149808; 66207; 2129477; 1076249; 1076247; 629480; 481805; 81443; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963;

35 1361962;1361961 ;1361960;1361959;320546;629483; 629482; 629481; 541804; 320545; 81444; 541814:; 629484; 474911; 452742; 1834387; 298737; 298736; 1584322; 1584321; 584320; 1542873; 1542871; 1542869; 1542867; 1542865; 1542863; 1542861; 1542859; 1542857; 1483232; 1483230; 1483228; 558561; 551640; 488605; 452746;

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1076241 Cry j II proteína -Cedro japonés

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541803 Cry j I precursor -Cedro japonés

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541802 Cry j I precursor-Cedro japonés

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5: Perro

Secuencias de canis:

10: Can f 1

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Fragmento de albúmina sérica 15 EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL Fragmento de albúmina sérica

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Can f 2

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1703445 Bla g 2

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2326190 Bla g 5

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Secuencias de cucaracha adicionales (números de acceso de NCBI Entrez):

2580504; 1580797; 1580794; 13622590; 544619; 544618; 1531531; 1580792; 1166573; 1176397; 2317849. 15 Secuencias de alérgeno (general)

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1086972; 999009; 999356; 999355; 994866; 994865; 913758; 913757; 913756; 913285; 913283; 926885; 807138; 632782; 601807; S468S2; 633938; 544619; 544618; 453094; 4S 1275; 451274; 407610; 407609; 404371; 409328; 299551; 299550; 264742; 261407; 255657; 250902; 250S2S; 1613674; 1613673; 1613672; 1613671; 1613670; 1613304; 1613303; 1613302; 1613240; 1613239; 1613238; 1612181; 1612180; 1612179; 1612178; 1612177; 5 1612176; 1612175; 1612174; 1612173; 1612172; 1612171; 1612170; 1612169; 1612168; 1612167; 1612166; 1612165; 1612164; 1612163; 1612162; 1612161; 1612160; 16121 S9; 1612158; 1612157; 16121 S6; 1612155; 16121 S4; 16121 S3; 1612152; 1612151; 1612150; 1612149; 1612148; 1612147; 1612146; 1612145; 1612144; 1612143; 1612142; 1612141; 1612140; 1612139; 1093120; 447712; 447711; 447710; 1587177; 158542; 1582223; 1582222; 1531531; 1580792; 886215; 1545317; 1545315; 1545313; 1545311; 545831; 1545887; 1545885; 1545883; 1545881; 1545879; 1545877; 1545875; 166486; 1498496; 1460058; 972513; 1009442; 1009440; 1009438; 1009436; 1009434; 7413; 1421808; 551228; 452606; 32905; 1377859; 1364213; 1364212; 395407; 22690; 22688; 22686; 22684; 488605; 17680; 1052817; 1008445; 1008443; 992612; 706811; 886683; 747852; 939932; 19003; 1247377; 1247375; 1247373; 862307; 312284; 999462; 999460; 999458; 587450; 763064; 886209; 1176397; 1173557; 902012; 997915; 997914; 997913; 997912; 997911; 997910; 99790; 997908; 997907; 997906;

15 997905; 997904; 997903; 997902; 997901; 997900; 997319; 997318; 997317; 997316; 997315; 997314; 997313; 997312; 910984; 910983; 910982; 910981; 511604; 169631; 169629; 169627; 168316; 168314; 607633; 555616; 293902; 485371; 455288; 166447; 166445; 166443; 166435; 162551; 160780; 552080; 156719; 156715; 515957; 515956; 515955; 515954; 515953; 459163; 166953; 386678; 169865.

Los alérgenos/antígenos particularmente preferidos incluyen: proteína de caspa de gato Fel d1; proteínas de Ambrosía Der P1, Der P2 y Der P7, proteína de Ambrosía amb a 1.1, a 1.2, a 1.3 o a1.4; proteínas de Césped inglés loI p1 y lol p 5; proteínas de césped variedad Timothy phl p 1 y phl p5; proteína de césped Bermuda Cyn d 5; proteínas de Alternaria alternata Alt a 1 , Alt a 2 y Enolasa (Alt a 6); proteína de Abedul Bet v1 y P14; proteínas de Cucaracha alemana Bla g 2, Bla g 2, Bla g 3, Bla g 4, Bla g 5 y Bla g 6; proteína de Altamisa Art v1; proteína de

25 Cardo ruso Sal k 1 y Sal k 2; cacahuete Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, profilinas de planta o proteínas de transferencia de lípidos o un antígeno de leucocitos humanos.

Métodos de administración

Una vez se han formulado, las composiciones de la invención se pueden administrar a un sujeto in vivo usando una diversidad de vías y técnicas conocidas. Por ejemplo, una composición se puede proporcionar como una solución, suspensión o emulsión inyectable y administrarse por vía parenteral, subcutánea, epicutánea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, inyección intravenosa usando una aguja y jeringa convencional o usando un sistema de inyección de jet líquido. Las composiciones también se pueden administrar por

35 vía tópica a la piel o tejido mucosal, tal como por vía nasal, por vía intratraqueal, por vía intestinal, por vía rectal o por vía vaginal o proporcionarse como una pulverización finamente dividida adecuada para administración respiratoria o pulmonar. Otros modos de administración incluyen administración oral, supositorios, administración sublingual y técnicas de administración transdérmica activa o pasiva.

Cuando un péptido de la invención se tiene que administrar, se prefiere administrar el péptido a un sitio en el organismo en el que tendrá la capacidad de contactar células presentadoras de antígeno adecuadas y donde éste o éstos tendrán la oportunidad de ponerse en contacto con células T del individuo. Cuando se tiene que administrar una CPA, se prefiere administrar la CPA a un sitio en el organismo en el que la misma tendrá la capacidad de contactar y activar células T adecuadas del individuo.

45

Regímenes de administración

La administración de los péptidos (tal como la composición que contiene una pluralidad de péptidos) se puede realizar mediante cualquier método adecuado como se ha descrito anteriormente. Cantidades adecuadas del péptido se pueden determinar empíricamente, pero típicamente están en el intervalo proporcionado más adelante. Una administración única de cada péptido puede ser suficiente para tener un efecto beneficioso para el paciente, pero se apreciará que puede ser beneficioso si el péptido se administra más de una vez, en cuyo caso los regímenes de administración típicos pueden ser, por ejemplo, una o dos veces a la semana durante 2-4 semanas cada 6 meses o una vez al día durante una semana cada cuatro a seis meses.

55 Las dosis de administración dependerán de varios factores incluyendo la naturaleza de la composición, la vía de administración y el programa y el tiempo del régimen de administración. Las dosis adecuadas de una molécula de la invención pueden estar en el orden de hasta 15 g, hasta 20 g, hasta 25 g, hasta 30 g, hasta 50 g, hasta 100 g, hasta 500 g o más por administración. Las dosis adecuadas puede ser menores de 15 g, pero al menos 1 ng o al menos 2 ng o al menos 5 ng o al menos 50 ng o al menos 100 ng o al menos 500 ng o al menos 1 g o al menos 10 g. Para algunas moléculas de la invención, la dosis usada puede ser más elevada, por ejemplo, hasta 1 mg, hasta 2 mg, hasta 3 mg, hasta 4 mg, hasta 5 mg o mayor. Tales dosis se pueden proporcionar en una formulación líquida, a una concentración adecuada para permitir un volumen apropiado para administración mediante la vía seleccionada.

65 La invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos:

Ejemplo 1

Epítopos de célula T potenciales

Las regiones de Amb a 1 descritas más adelante se identificaron como que comprenden potencialmente uno o más epítopos de células T:

Tabla 2

REGIÓN DE INTERÉS: RESTOS EN AMB A 1 (isoforma 1.3) SECUENCIA

A: 178-189 GMIKSNDGPPIL

B: 202-213 GSSQIWIDHCSLSKS

C: 343-354 DKDLLENGAIFVTSGSDPVLTPVQ

D: 364-375 PVQSAGMIPAEPGEA

E: 103-114 EGTLRFAAAQNRPLW

F: 130-141 QELVVNSDKTIDGRGVKVEII

G: 376-387 GEAAIKLTSSAGVFSCHP

H: 226-237 GSTHVTISNCKF

I: 280-297 FGFFQWNNNYDRWGTYA

J: 38-48 ETRSLQACEALN

10 Las secuencias proporcionadas para las regiones G, I y J en la solicitud de prioridad, GB 0815258.3 son las siguientes: GEAAIKLTSSAGVLSCRP (Región G), HGFFQVVNNNYDRGTYA (Región I) y ETRRLTTSGAYN (Región J). Estas secuencias se han corregido en la Tabla 2 de forma que las mismas corresponden a las regiones pertinentes de la secuencia de longitud completa de Amb a 1 isoforma 1.3 como se proporciona más adelante.

15 Las regiones mostradas en la Tabla 2 se analizaron adicionalmente posteriormente para observar cuál de ellas estaba altamente conservada entre las 4 isoformas de Amb a1 diferentes mostradas más adelante (1.1, 1.2, 1.3 y 1.4). Para las secuencias más adelante, se usan los siguientes estilos de texto para indicar regiones de interés:

Región A, Región B, Región C, Región D, Región E, Región F, Región G, Región H, Región I, Región J

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49/50 sujetos. Por tanto, esta combinación peptídica cubre eficazmente la población de estudio completa y se esperaría cobertura completa con el uso de variantes de solubilidad mejorada de RGW07 (véase más adelante). Las combinaciones peptídicas que comprenden (RGW01 + RGW03B + RGW04A + RGW02 + RGW05 + RGW06A) o variantes de los mismos junto con RGW07 o variantes del mismo también tienen la ventaja de proporcionar una

5 respuesta positiva de IL-10 (véase más adelante y la Figura 3).

El ensayo de solubilidad demostró que RGW07 tenía mala solubilidad en un entorno ácido, así que se añadieron restos de lisina adicionales a RGW07 (indicado en la Tabla 6). Los péptidos modificados se ensayaron para determinar solubilidad y su capacidad de inducir IL-10 a partir de PBMC en presencia de la mezcla de péptidos identificados en la Figura 1 (RGW01 + RGW03B + RGW04A + RGW02 + RGW05 + RGW06A). Los controles incluían la mezcla de péptido sin variante de RGW07 y con alérgeno Amb a 1 completo. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Tabla 6 – Solubilidad de RGW07 y variantes 15

Péptido: Secuencia Restos en Amb a 1 Punto isoeléctrico (pl) GRAVY Solubilidad mg/ml

RGW07: GEAAIKLTSSAGVLS 376-390 6,00 0,69 0,7

RGW 07C: KGEAAIKLTSSAGVLSK K376-390K 9,70 0,15 1,55

RGW 07D: KGEJIKLTSSAGVLSKK K376-390KK 10,00 -0,07 4,26

En base a estos análisis, se observó que RGW07D se prefería tanto por solubilidad como por su capacidad de inducir IL-10 en presencia de los otros seis péptidos.

Ejemplo 2 – Ensayo de liberación de histamina

El propósito de este ensayo era identificar péptidos individuales que son capaces de activar basófilos sanguíneos (como un sustituto de mastocitos tisulares) que da como resultado la liberación de histamina que puede dar como resultado reacciones alérgicas durante la terapia. Los péptidos o combinaciones de péptidos que inducen la

25 liberación de histamina frecuentemente se pueden considerar inadecuados para inclusión en la vacuna de péptidos.

La liberación de histamina requiere el entrecruzamiento de moléculas de IgE específicas adyacentes en la superficie del basófilo. Los péptidos que se estaban evaluando eran pequeños (11 a 18 aminoácidos de longitud) y, por lo tanto, no deberían poseer una estructura terciaria significativa que les posibilitaría retener la conformación de un epítopo de unión a IgE de la molécula completa. Adicionalmente, los monómeros peptídicos en solución, incluso si los mismos están unidos por IgE, no deben ser capaces de reticular moléculas de IgE adyacentes.

Se evaluó la liberación de histamina a partir de sangre completa periférica fresca de sujetos alérgicos a ambrosía. Se usaron basófilos de sangre periférica como un sustituto de mastocitos tisulares que no eran prácticos para el

35 ensayo. La sangre se incubó in vitro con péptidos individuales identificados en el Ejemplo 1 (RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A, RGW07 y RGW07D). Adicionalmente, se analizaron las respuestas a mezclas preferidas de 7 péptidos identificados en el Ejemplo 1. Las mezclas preferidas ensayadas de 7 péptidos consistían en i) RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A, RGW07 y ii) RGW01, RGW02, RGW03B, RGW04A, RGW05, RGW06A y RGW07D.

La liberación de histamina en respuesta al extracto de alérgeno de ambrosía completo se midió en cada sujeto para confirmar la sensibilización de basófilos. Se incluyó un control positivo en cada ensayo que representa la liberación de histamina total, generado congelando/descongelando las células dos veces. Se generó un control negativo para liberación de histamina espontánea incubando células en tampón únicamente.

45 El ensayo se realizó usando el kit de Inmunoensayo de Liberación de Histamina Immunotech de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación de la exposición in vitro de basófilos sanguíneos a péptidos, mezclas de péptidos, alérgeno completo o tampón en pocillos de placa de microtitulación, los sobrenadantes se retiraron y la histamina en las muestras se convirtió a acil histamina. Las muestras aciladas se ensayaron mediante un ELISA de acil histamina competitivo.

Los péptidos se ensayaron para determinar su capacidad de inducir liberación de histamina a lo largo de un intervalo de 5 log en base 10 (1 a 10.000 ng/ml). El intervalo de concentración ensayado se seleccionó en base a dosis teóricas in vivo de péptido que se pueden conseguir durante la terapia. Por ejemplo, una dosis de 31 g

55 (aproximadamente 3 nmol/equivalente de péptido) de cada péptido que entra en un volumen de sangre de 5 litros, daría como resultado una concentración en sangre de 6 ng/ml, en el extremo inferior del intervalo de dosis del ensayo de liberación de histamina. Se usó extracto de alérgeno de ambrosía completo a lo largo de un intervalo de concentración ligeramente más elevado (10 a 100.000 ng/ml).

Se realizaron mediciones únicas para cada dilución. Después de la finalización del ELISA, los niveles de histamina individuales se determinaron mediante interpolación de la curva normal generada en el ensayo de ELISA. Los

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Claims

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