ES2897421T3 - Nuevas moléculas inmunoterapéuticas y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas moléculas inmunoterapéuticas y usos de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a moléculas tales como péptidos, polipéptidos y proteínas que interaccionan inmunológicamente con linfocitos T en sujetos que tienen alergia al cacahuete o alergia a otros frutos secos, y a secuencias genéticas que las codifican. Estas moléculas son preferiblemente inmunointeractivas con los linfocitos T en sujetos que tienen alergia al alérgeno Ara h 1. Las moléculas de la presente invención son útiles en el desarrollo de agentes de diagnóstico, terapéuticos y profilácticos para afecciones caracterizadas por una respuesta inmune anormal, inapropiada o no deseada de otro modo frente a Ara h 1 o un derivado u homólogo del mismo.

Antecedentes de la invención

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que hace referencia el autor en esta memoria descriptiva se recopilan alfabéticamente al final de la descripción.

La referencia a cualquier estado de la técnica en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que el estado de la técnica forma parte del conocimiento general común en Australia.

La alergia al cacahuete es un trastorno incurable y potencialmente mortal que afecta aproximadamente al 1% de la población general (Husain et al. J Am Acad Dermatol. 66(1):136-43, 2012, Burks, Lancet. 371(9623):1538-46, 2008). Se caracteriza por la aparición repentina de anafilaxia, que puede ocurrir con la exposición a cantidades mínimas de proteínas de cacahuete (Hourihane et al., J Allergy Clin Immunol 100:596-600, 1997; Pumphrey, Current Opinión in Allergy & Clinical Immunology. 4(4):285-90, 2004). La anafilaxia inducida por frutos secos es la que se asocia con mayor frecuencia con mortalidad o con características potencialmente mortales (Bock et al. J Allergy Clin Immunol.

119(4):1016-8, 2007; Burks 2008, supra). Las proteínas del cacahuete se ocultan con frecuencia dentro de fuentes de alimentos aparentemente seguros, de modo que un contacto accidental ocurre hasta en el 50% de los pacientes durante un período de 5 años (Sicherer et al., Paediatrics 102: e6, 1998). No es sorprendente que la alergia a los frutos secos se asocie con una morbilidad psicológica significativa, tanto para los pacientes como para los cuidadores, similar a la que sufren los que padecen enfermedades debilitantes crónicas como la artritis reumatoide (Primeau et al., Clin Exp Allergy 30:1135-43, 2000; Kemp et al. Med. J. Aust. 188(9):503-4, 2008). Una cura, si bien es un imperativo para eliminar la alergia a los frutos secos como causa de mortalidad, también es necesaria para eliminar la carga psicológica crónica a la que están sujetos los sujetos alérgicos al cacahuete.

Hasta la fecha, los esfuerzos en la inmunoterapia para la alergia al cacahuete han tenido un éxito extremadamente limitado. Nelson et al. han mostrado que una tolerancia al cacahuete se puede inducir mediante un protocolo de inmunoterapia rápido, pero que la tolerancia se pierde en aproximadamente la mitad de los sujetos durante la dosificación de mantenimiento y, además, que las inyecciones se asocian con episodios frecuentes de anafilaxia en la mayoría de los sujetos durante las fases de preparación y de mantenimiento (Nelson et al., J Allergy Clin Immunol 99:744-51, 1997). Oppenheimer et al. mostraron hallazgos similares dentro de su estudio, mostrando nuevamente que una terapia activa está asociada con una alta tasa de anafilaxia sistémica. Una recopilación de datos en ese estudio terminó después de que la administración de extracto de cacahuete a un sujeto aleatorizado con placebo diera como resultado su muerte, destacando la naturaleza peligrosa de esta afección (Oppenheimer et al., J Allergy Clin Immunol 90: 256-62, 1992). Estudios recientes de inmunoterapia oral con harina de cacahuete integral brindan una esperanza de que la desensibilización sea factible, pero las reacciones adversas observadas resaltan los principales problemas de seguridad (Hofmann et al. J. Allergy Clin. Immunol. 124, 286, 2009; Jones et al. J. Allergy Clin. Immunol. 24, 292, 2009; Clark et al. Allergy 64, 1218, 2009; Varshney et al. J Allergy Clin Immunol. 127(3):654-60, 2011; Varshney et al. J Allergy Clin Immunol. 124(6):1351 -2, 2009; Anagnostou et al. Clin Exp Allergy. 41 (9):1273-81,2011; Allen y O'Hehir. Clin Exp Allergy.

41 (9):1172-4, 2011; Yu et al. Int Arch Allergy Immunol. 159(2):179-182, 2012; Thyagarajan et al. J Allergy Clin Immunol.

126(1):31-2, 2010; Blumchen et al. J Allergy Clin Immunol 126(1):83-91, 2010). Incluso con la exclusión de los niños propensos a sufrir síntomas graves o asma, dos estudios describieron un episodio anafiláctico, en un caso durante una provocación alimentaria inicial (Clark et al. Allergy 64, 1218, 2009) y en el otro durante el tratamiento de un niño que no había experimentado previamente anafilaxia (Hofmann et al. J. Allergy Clin. Immunol. 124, 286, 2009).

El desarrollo de estrategias novedosas para superar la morbilidad asociada con la inmunoterapia con alérgenos depende de una comprensión precisa de la base inmunológica para una inmunoterapia exitosa, así como de sus efectos secundarios. Se ha establecido desde hace mucho tiempo que la morbilidad debida a una inmunoterapia con alérgenos se debe al entrecruzamiento de IgE, y que esa acción no es necesaria para que esa terapia sea eficaz (Litwin et al., Int Arch Allergy Appl Immunol87: 361-61,998). También se sabe que una de las acciones decisivas de la inmunoterapia en la producción de tolerancia, es su capacidad para cambiar el fenotipo predominante de los linfocitos T específicos, desde un fenotipo TH2 a un fenotipo regulador. Estos linfocitos T reguladores actúan mediante la producción de citocinas antiinflamatorias IL-10 y/o TGFp. (Akdis y Akdis, J Allergy Clin Immunol. 123:735-46, 2009; Akdis & Akdis, Nature Reviews: Drug Discovery. 8:645-60. 2009; Akdis y Akdis, J Allergy Clin Immunol 127:18-27, 2011).

Una diferencia clave entre las respuestas de anticuerpos y linfocitos está en el reconocimiento de antígenos, los anticuerpos reconocen epítopos conformacionales dependientes de la estructura terciaria molecular, mientras que los linfocitos T CD4+ reconocen péptidos lineales cortos. Esta diferencia en el reconocimiento de antígenos es la base de muchas estrategias novedosas de inmunoterapia, incluyendo el uso de péptidos basados en epítopos de linfocitos T, mutantes de epítopos de linfocitos B y ligandos de péptidos alterados (Rolland et al. Pharmacology & Therapeutics 121:273-284, 2009). Todos esos métodos dependen de la alteración o la ausencia de una estructura terciaria molecular, de modo que se pierde el entrecruzamiento de IgE y la activación de las células efectoras. La inmunoterapia con péptidos es un método con respecto al cual existe una evidencia de eficacia, y está documentado tanto para la alergia a la caspa de gato como para la alergia al veneno de abeja. Tres estudios diferentes han mostrado que, en ausencia de cualquier efecto secundario sistémico, se podría lograr una tolerancia hacia el alérgeno principal del veneno de abeja, la fosfolipasa A2 (PLA2), utilizando secuencias que contienen epítopos de linfocitos T (Muller et al. J Allergy Clin Immunol. 101: 747-54, 1998; Tarzi et al. Clin Exp Allergy. 36: 465-74, 2006; Fellrath et al. J Allergy Clin Immunol. 111: 854-61,2003), mientras que varios estudios han demostrado que péptidos basados en la estructura del principal alérgeno felino Fel d 1, pueden usarse para inducir respuestas clínicas disminuidas (Norman et al., Am J Respir Crit Care Med 154: 1623-8, 1996; Marcotte et al., J Allergy Clin Immunol 101: 506-13, 1998; Pene et al., J Allergy Clin Immunol 102: 571-8, 1998; Oldfield et al. Lancet 360: 47-53, 2002; Alexander et al. Clin Exp Allergy 35: 52-8, 2004; Alexander et al. Allergy 60: 1269-74, 2005). Más recientemente, un ensayo de fase IIa ha confirmado la seguridad, tolerabilidad y eficacia potencial de una mezcla de siete péptidos procedentes de Fel d 1 (Toleromune Cat©, Cicassia Ltd., Oxford, Reino Unido) (Worm et al. J Allergy Clin Immunol. 127: 89-97, 2011) con ensayos de fase IIb ahora en curso (Moldaver & Larche. Allergy. 66: 784-91, 2011). Para el desarrollo de tales estrategias es crucial la retención de los epítopos de los linfocitos T, de modo que se pueda inducir un cambio fenotípico de los linfocitos T.

La capacidad de unirse directamente a moléculas del MHC de clase II permite que los péptidos sean presentados por APCs no profesionales o inmaduras sin señales proinflamatorias y coestimuladoras que promueven la inducción de tolerancia, anergia y/o actividad supresora en los linfocitos T respondedores (Moldaver & Larche, Allergy 66: 784-91, 2011). Esto también permite que los péptidos se presenten con mayor frecuencia que los péptidos procesados a partir de la molécula completa (Santambrogio et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96:15056-61), y dado que también son más seguros que el alérgeno completo, los péptidos se pueden administrar en concentraciones más altas, repolarizando así las respuestas de los linfocitos T de manera más efectiva.

Es importante que al dirigir los linfocitos T de forma específica a epítopos dominantes de los principales alérgenos, se pueden alterar las respuestas frente a extractos de alérgenos completos (supresión ligada). Muchos estudios que han informado sobre una inmunoterapia exitosa con péptidos en modelos murinos de alergia, demostraron que la administración de péptidos de epítopos de linfocitos T dominantes de los principales alérgenos inducía tolerancia no solo frente a esos péptidos, sino también frente a alérgenos purificados y extractos de alérgenos completos (Yang et al. Clin Exp Allergy 40(4): 668-78, 2010; Yoshitomi et al. J Pept Sci. 13(8): 499-503, 2007; Marazuela et al. Mol Immunol. 45(2):438-45, 2008; Rupa et al. Allergy. 67(1): 74-82, 2012; Hoyne et al. J Exp Med. 178(5): 1783-8, 1993; Hall et al. Vaccine. 21(5-6):549-61,2003).

Por consiguiente, existe una necesidad tanto de identificar los principales alérgenos del cacahuete como, además, de identificar los epítopos de los linfocitos T de esos alérgenos. La caracterización de la identificación y el análisis de esos epítopos es fundamental para el desarrollo de una metodología diagnóstica e inmunoterapéutica específica. Con este fin, aunque la molécula alergénica del cacahuete Ara h 1 ha sido previamente objeto de análisis, no se ha logrado la identificación de las regiones epitópicas centrales de los linfocitos T, que son esenciales para el desarrollo de una vacuna eficaz. Además, los estudios previos se han visto limitados por el hecho de que se han basado en el uso de tetrámeros de HLA-DR, evitando así una detección de epítopos presentados por otros tipos de HLA. Dado que la eficacia de una vacuna para la población general requiere que los epítopos en cuestión se puedan presentar en una variedad de diferentes tipos de HLA, existe una necesidad no solo de identificar los epítopos de linfocitos T dentro de la molécula de Ara h 1 sino, además, de identificar los epítopos que son dominantes y que pueden ser presentados eficazmente por los diversos tipos de HLA que son representativos de la población.

En el trabajo que ha conducido a la presente invención, se han identificado regiones epitópicas centrales dominantes de Ara h 1, degeneradas para el HLA. Ese grupo de regiones epitópicas centrales es único en términos de su nivel de eficacia particularmente alto. A diferencia de los péptidos de 20 meros de Ara h 1 previamente estudiados que se identificaron basándose únicamente en su capacidad para mostrar algún nivel de reactividad de los linfocitos T, las secuencias descritas en este documento son un conjunto seleccionado de regiones del epítopo central de los linfocitos T que son inmunodominantes, en relación con otros fragmentos peptídicos de Ara h 1, y también están degeneradas para el HLA porque se unen a dos o más tipos de HLA. Además, esas regiones epitópicas centrales están presentadas por moléculas del HLA-DQ. Las moléculas del HLA-DQ están más conservadas en las poblaciones mixtas que las moléculas del HLA-DR. En consecuencia, los péptidos presentados en el HLA-DQ permiten una cobertura más amplia de la población. La identificación de ese grupo específico de regiones epitópicas centrales ha facilitado, por primera vez, el desarrollo de métodos efectivos para el tratamiento de afecciones caracterizadas por respuestas inmunes anormales, inapropiadas o no deseadas frente a Ara h 1 o sus derivados u homólogos, otra alergia a los frutos secos o alergia a una composición, tal como los alimentos que contienen el alérgeno Ara h 1. La identificación de esos epítopos también ha facilitado el desarrollo de una tecnología de diagnóstico correspondiente.

Prickett et al (2012) Allergy 67 (supl. 96):12, resumen número 25, se relaciona con el desarrollo de péptidos de epítopos de linfocitos T CD4+ con diversidad de restricción del MHC, como candidatos para una terapia para la alergia al cacahuete.

Compendio de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o una etapa o un grupo de números enteros establecidos, o etapas de números enteros, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "obtenido a partir de" se entiende que indica que un número entero o un grupo de números enteros se ha originado a partir de la especie especificada, pero no necesariamente se ha obtenido directamente a partir de la fuente especificada. Además, tal y como se usa en el presente documento, las formas singulares de "un/una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Esta memoria descriptiva contiene información sobre una secuencia de aminoácidos preparada usando el programa PatentIn versión 3.5, que se presenta en este documento después de la bibliografía. Cada secuencia de aminoácidos se identifica en la lista de secuencias mediante el indicador numérico <210> seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <210> 1, <210> 2, etc.). La longitud, el tipo de secuencia (proteína, etc.) y el organismo fuente de cada secuencia se indican mediante una información proporcionada en los campos de indicadores numéricos <211 >, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se identifican mediante el indicador SEQ ID NO: seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, etc.). El identificador de secuencia al que se hace referencia en la memoria descriptiva se correlaciona con la información proporcionada en el campo del indicador numérico <400> en la lista de secuencias, que viene seguido del identificador de secuencia (por ejemplo, <400> 1, <400> 2, etc.). Es decir, SEQ ID NO: 1 tal y como se detalla en la memoria descriptiva, se correlaciona con la secuencia indicada como <400> 1 en la lista de secuencias.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición según el primer aspecto de la invención para uso en el tratamiento o la prevención de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por hipersensibilidad a Ara h 1 o a un derivado u homólogo del mismo.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro de diagnóstico o seguimiento de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por hipersensibilidad a Ara h 1 o a un derivado u homólogo del mismo, comprendiendo dicho método seleccionar linfocitos T que reaccionan con Ara h 1 utilizando el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

El primer aspecto de la presente invención también proporciona una composición que comprende además uno o varios péptidos que comprenden una secuencia de una región epitópica central de los linfocitos T de Ara h 1, seleccionada a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos, y en donde cada uno de los uno o varios péptidos no tiene más de 28 aminoácidos de longitud.

Adicionalmente, se describe en el presente documento una composición que comprende uno o varios péptidos, cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde los péptidos incluyen una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) EGALML (SEQ ID NO: 6)

(vii) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(viii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(ix) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(x) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos.

Los péptidos en las composiciones descritas en este documento pueden ser capaces de modificar la función de los linfocitos T cuando se presentan a linfocitos T aislados a partir de sujetos que tienen una afección caracterizada por una respuesta inmune anormal, no deseada o inapropiada frente a Ara h 1, pero en donde los péptidos son incapaces de unirse a IgE específica de Ara h 1.

Adicionalmente, en este documento se describe una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde los péptidos incluyen una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en: (i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) EGALML (SEQ ID NO: 6)

(vii) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(viii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(ix) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(x) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos, en donde los péptidos son capaces de reducir la hipersensibilidad hacia Ara h 1 o la hipersensibilidad hacia una composición que comprende Ara h 1, cuando se administran a un sujeto que tiene una afección caracterizada por dicha hipersensibilidad.

Adicionalmente, se describe en este documento una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde los péptidos incluyen el epítopo NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3) junto con una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(v) EGALML (SEQ ID NO: 6)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

Adicionalmente, se describe en el presente documento una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde el péptido incluye el epítopo EGALML (SEQ ID NO: 6) junto con una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos.

En la medida en que la composición se diseña de manera que las regiones epitópicas centrales se incluyen como parte de un péptido más grande, debe entenderse que cualquier péptido dado puede diseñarse para incluir una o varias regiones epitópicas centrales. Con este fin, el primer aspecto de la presente invención también proporciona una composición en la que los uno o varios péptidos adicionales se seleccionan a partir de la lista:

(i) FQNLQNHRIV (SEQ ID NO: 12)

(ii) RIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 13)

(iii) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 14)

(iv) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 15)

(v) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 16)

(vi) ENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 17)

(vii) NNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 18)

(viii) SNNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 19)

(ix) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 20)

(x) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 21)

(xi) SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 22)

(xii) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO: 24)

(xiii) KAMVIVVVNKG (SEQ ID NO: 25)

(xiv) AMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 26)

(xv) VVNKGTGNLELVAVRK (SEQ ID NO: 27)

(xvi) AMVIVVVNKGTGNLELV (SEQ ID NO: 28)

(xvii) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 29)

(xviii) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 30)

(xix) VFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 31)

(xx) GDVFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 32)

(xxi) VFIMPAAHPV AINASS (SEQ ID NO: 33)

Adicionalmente, se describe en el presente documento una composición que comprende el péptido definido por SEQ ^{ID NO: 15, 16 o 17 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID} nO: ^{12-14 o 18-33.}

En una realización del primer aspecto de la invención, la composición comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 23 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NO: 12-22 o 24-33.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Perfil de la frecuencia de donantes que responden a los péptidos de 20 meros de Ara h 1. Frecuencias de donantes que responden al reconocimiento con TCL de péptidos de 20 meros de Ara h 1 (n = 18 sujetos alérgicos al cacahuete).

Figura 2: Cartografiado de los epítopos centrales de linfocitos T dentro de los péptidos de 20 meros de Ara h 150 y 51. Proliferación de TCL específicas de 20 meros en conjuntos de péptidos truncados. TCL representativas mostradas para los péptidos 50 (A) y 51 (B) (pocillos replicados en cpm media DE). Los paneles superiores indican el epítopo en solapamiento entre los 20 meros (n = 2; 3 TCL). Los paneles inferiores indican epítopos únicos para cada 20 mero; A) n = 3; 6 TCL. B) n = 4; 7 TCL. Las secuencias de epítopos reconocidas por la TCL representada están en negrita y los 'epítopos consolidados' reconocidos por todas las TCL específicas están subrayados.

Figura 3: Activación de basófilos como respuesta a péptidos candidatos de Ara h 1. Gráfico de caja y bigotes que muestra el porcentaje de basófilos (IgEh1) activados (CD63h1) como respuesta a Ara h 1 o a péptidos candidatos para siete sujetos alérgicos al cacahuete. El control negativo era sin antígeno (no estimulado) y los controles positivos eran anti-IgE, fMLP y CPE. Los bigotes muestran valores de mínimos a máximos.

Figura 4: Ensayo representativo basado en CFSE para detectar la proliferación de linfocitos T CD4+ en PBMC. Proliferación de PBMC marcadas con CF SE del sujeto 26 alérgico al cacahuete después de 7 días de estimulación con péptidos de 20 meros de Ara h 1 seleccionados. El medio solo (sin antígeno) o el extracto de cacahuete crudo (CPE, por sus siglas en inglés) proporcionaban controles negativos y positivos, respectivamente. Se analizaron al menos 10.000 linfocitos T CD4+ vivos por muestra. Las puertas indican el porcentaje de linfocitos T CD4+CFSEto (en proliferación) del total de linfocitos T CD4+ con índices de estimulación (SI, por sus siglas en inglés) entre paréntesis. Figura 5: Especificidad representativa de la restricción del HLA clase II de reconocimiento del epítopo de linfocitos T. Proliferación de TCLs específicas de los epítopos seleccionados en presencia de AcMos (Ai y Bi) de HLA-DR (círculos), -DQ (cuadrados) o -DP (triángulos) o anticuerpos de control del isotipo (10 ug/ml) (Aii y Bii), (pocillos replicados en cpm media DE). Los gráficos muestran datos de muestras para un epítopo restringido a HLA-DR (442-458) (A) y un epítopo restringido a HLA-DQ (507-524) (B).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, en parte, en la identificación de regiones epitópicas centrales de linfocitos T dominantes de Ara h1 degeneradas para el HLA. La identificación de esas regiones epitópicas centrales inmunodominantes ha permitido una mejora de la metodología de diagnóstico y el desarrollo de composiciones terapéuticas y profilácticas y enfoques de tratamiento significativamente más eficaces que los que han estado disponibles hasta la fecha, para afecciones tales como, pero sin limitarse a, la alergia al cacahuete.

La presente invención es como se define en las reivindicaciones.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición según el primer aspecto de la invención para uso en el tratamiento o la prevención de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por hipersensibilidad a Ara h 1 o a un derivado u homólogo del mismo.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro de diagnóstico o seguimiento de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por hipersensibilidad a Ara h 1 o a un derivado u homólogo del mismo, comprendiendo dicho método la selección de linfocitos T reactivos con Ara h 1 utilizando el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

El primer aspecto de la presente invención también proporciona una composición que comprende además uno o varios péptidos que comprenden una secuencia de una región epitópica central de linfocitos T de Ara h 1 seleccionada a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos, y en donde cada uno de los uno o varios péptidos no tiene más de 28 aminoácidos de longitud.

Adicionalmente, en el presente documento se describe una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde los péptidos incluyen una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1 seleccionadas a partir de la lista que consiste en: (i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) EGALML (SEQ ID NO: 6)

(vii) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(viii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(ix) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(x) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos.

Los péptidos en las composiciones descritas en este documento pueden ser capaces de modificar la función de los linfocitos T cuando se presentan a linfocitos T aislados a partir de sujetos que tienen una afección caracterizada por una respuesta inmune anormal, no deseada o inapropiada de otro modo frente a Ara h 1 o frente a un alérgeno presente en una composición, tal como alimentos, que comprenden Ara h 1 pero cuyos péptidos son incapaces de unirse a una IgE específica de Ara h 1.

Sin limitar la presente invención de ninguna manera, los cacahuetes contienen muchas proteínas, con el número de bandas distintas visibles en un SDS-PAGE, dependiendo de la metodología utilizada. Hasta 53 bandas son visibles después de una cromatografía líquida de alta presión (de Jong et al., Clin Exp Allergy 28: 743-51, 1998). Solo dos de esas proteínas merecen ser clasificadas como alérgenos principales, utilizando criterios convencionales, según los cuales la reactividad de IgE ocurre en más del 50% de la población alérgica al cacahuete; esas proteínas se denominan Ara h 1 y Ara h 2 (Burks et al., Allergy 53: 725-30, 1998). Aunque varios estudios han indicado que Ara h 2 es el más potente de estos dos alérgenos (Blanc et al. Clin Exp Allergy. 2009; 39(8): 1277-85; Koppelman et al. Clin Exp Allergy. 2004; 34(4): 583-90; Palmer et al. Clin Immunol. 2005; 115(3): 302-12), Ara h 1 también juega un papel importante en la patogenia de la alergia al cacahuete, en donde numerosos estudios informan de fuertes correlaciones entre la gravedad de los síntomas y la reactividad de IgE tanto frente a Ara h 1 como frente a Ara h 2 (Glaumann et al. Allergy. 2012; 67(2): 242-7; Chiang et al. Pediatr Allergy Immunol. 2009; 21(2 Pto 2): e429-38; Asarnoj et al. Allergy. 2010, 65(9): 1189-95; Moverare et al. Int Arch Allergy Immunol 2011; 156(3): 282-90; Lin et al. J Microbiol Immunol Infecí 2012; Peeters et al. Clin Exp Allergy.

2007; 37(1): 108-15). Ara h 1 es el alérgeno principal más abundante en el cacahuete, y representa del 12 al 16% de la proteína total del cacahuete (Koppelman et al. Allergy. 2001; 56(2):132-7).

Aún sin limitar de ningún modo la presente invención, el alérgeno Ara h 1 es una glicoproteína de almacenamiento de semillas 7S o vicilina. La concentración de Ara h 1 en el cacahuete aumenta con el tamaño del grano (4-16 mg de Ara h 1 extraídos/g de cacahuete), por lo que la expresión de la proteína se asocia con la madurez del cacahuete (Pomés et al. 2006, Clin Exp Allergy. 36(6): 824-30). Ara h 1 es un homotrímero que se mantiene unido a través de áreas hidrófobas en los extremos distales de los monómeros, en donde se encuentran la mayoría de los epítopos de unión de IgE. Cada monómero de 64,5 kD tiene un motivo de cupina que consiste en dos barriles p centrales, cada uno asociado con un dominio de bucle de hélices a.

La referencia a "Ara h 1" debe entenderse como una referencia a todas las formas de esa molécula, incluida la referencia a cualquier isoforma que pueda surgir del corte y empalme alternativo del ARNm de Ara h 1 o de formas polimórficas o mutantes funcionales de Ara h 1. Además debe entenderse que se extiende a cualquier proteína codificada por el gen de Ara h 1, cualquier polipéptido de una subunidad, como formas precursoras que se pueden generar, ya sea que existan como un monómero, un multímero o una proteína de fusión. También incluye una referencia a análogos o equivalentes de Ara h 1, como los que pueden producirse cuando un producto que comprende Ara h 1 de forma natural, se genera sintéticamente con el fin de generar un producto como aditivo alimentario. Por lo tanto, la presente invención proporciona epítopos y métodos para su uso en el diagnóstico y el tratamiento de cualquier afección caracterizada por una hipersensibilidad frente a Ara h 1 o una molécula similar a Ara h 1, tal como alergia al cacahuete o alergia a frutos secos, o alergia a un antígeno presente en una composición, tal como un alimento, cuya composición también comprende Ara h 1. Preferiblemente, dicho Ara h 1 comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 11.

La referencia a "linfocitos T" debe entenderse como una referencia a cualquier célula que comprende un receptor de linfocito T. A este respecto, el receptor de linfocito T puede comprender una cualquiera o varias de las cadenas a, p, Y o 5. La presente invención no pretende limitarse a ninguna subclase funcional particular de linfocitos T, aunque en una realización preferida, el linfocito T objeto es un linfocito T colaborador y aún más preferiblemente un linfocito de tipo Th2 y/o un linfocito Treg. A este respecto, la referencia a "modificar la función de los linfocitos T" debe entenderse como una referencia a la modificación de una o varias funciones que un linfocito T es capaz de realizar. Por ejemplo, la función objeto puede ser la proliferación, diferenciación u otra forma de actividad funcional celular como la producción de citocinas. En una realización, la actividad funcional objeto es la proliferación.

En términos de "modificar la función" de los linfocitos T aislados a partir de sujetos que tienen una afección caracterizada por una respuesta inmune anormal, no deseada o inapropiada frente a Ara h 1 o a una composición que comprende Ara h 1, debe entenderse que esto no es necesariamente una referencia a la modificación de la función de todos los linfocitos T en una muestra biológica dada, pero es probable que, de hecho, refleje la modificación del funcionamiento de solo algunos de los linfocitos T en la muestra. Por ejemplo, solo una porción de los linfocitos T colaboradores en una muestra de linfocitos T dada, puede responder funcionalmente al contacto con el péptido objeto. Debe entenderse que esa respuesta parcial está dentro del alcance de los usos previstos de las composiciones de la presente invención. También debe entenderse que los linfocitos T que se obtienen a partir del sujeto, pueden ser linfocitos T recién recogidos o pueden haber sufrido alguna forma de manipulación in vitro o in vivo antes de la prueba. Por ejemplo, se pueden haber generado líneas de linfocitos T a partir de la muestra de células y son esas líneas de linfocitos T las que luego forman la población de linfocitos T obtenidas a partir del sujeto que se somete a ensayo de acuerdo con la presente invención. En la medida en que la actividad funcional objeto sea la proliferación de linfocitos T, el ensayo de proliferación de linfocitos T se realiza preferiblemente tal y como se describe en el presente documento. Aún más preferiblemente, la modificación objeto de la función de los linfocitos T es la inducción de una proliferación. A este respecto, la referencia a un linfocito T "reactivo con Ara h 1" debe entenderse como una referencia a un linfocito T que responde funcionalmente a la presentación en el HLA de un epítopo de linfocito T de Ara h 1. De manera similar, la referencia a una IgE "específica de Ara h 1" debe entenderse como una referencia a una IgE dirigida a los epítopos de linfocitos B de Ara h 1.

La referencia a una respuesta inmune "anormal, no deseada o inapropiada" debe entenderse como una referencia a cualquier forma de actividad fisiológica que implica la activación y/o el funcionamiento de una o varias células inmunes, en donde esa actividad es inapropiada porque es de un tipo inapropiado o avanza hacia un grado inapropiado. Puede ser anormal en el sentido de que, de acuerdo con principios inmunológicos conocidos, no debería ocurrir cuando ocurre o debería ocurrir cuando no ocurre. En otro ejemplo, la respuesta inmune puede ser inapropiada porque es una respuesta fisiológicamente normal pero que es innecesaria y/o no deseada, tal y como ocurre con respecto a las respuestas de hipersensibilidad de tipo I frente a alérgenos inocuos. En el contexto de la presente invención, esa respuesta inmune puede dirigirse a Ara h 1 o puede dirigirse a un alérgeno diferente que está presente en una composición junto con Ara h 1. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, se ha determinado que incluso cuando la respuesta de hipersensibilidad se dirige a un alérgeno distinto de Ara h 1, en donde el alérgeno está presente en una composición que, no obstante, comprende Ara h 1, el tratamiento a través de las composiciones para uso de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención, que se dirige a Ara h 1, induce no obstante una modulación beneficiosa de la funcionalidad de Th2 y Treg, de manera que la hipersensibilidad que existe frente al alérgeno no relacionado, no obstante se reduce. Preferiblemente, dicha respuesta inmune es una hipersensibilidad al cacahuete.

Por "hipersensibilidad al cacahuete" se entiende la inducción de síntomas clínicos de una hipersensibilidad al cacahuete mediada por IgE. Sin embargo, debe entenderse que, aunque los síntomas clínicos pueden ser evidentes, no todos esos individuos mostrarán necesariamente niveles detectables de IgE sérica específica del cacahuete, lo cual se mide utilizando el sistema Kallestad Allercoat EAST System (Sanofi-Pasteur Diagnostics, EE.UU.), aunque no obstante debería entenderse que esos individuos entran dentro del alcance de la definición de los que presentan "hipersensibilidad al cacahuete". Alternativamente, las pruebas pueden continuar utilizando los sistemas Pharmacia o UniCap. Debe entenderse que la referencia a "hipersensibilidad a Ara h 1" tiene un significado correspondiente en el contexto de una reactividad frente a la proteína de Ara h 1.

Adicionalmente, en el presente documento se describe una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde los péptidos incluyen una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) EGALML (SEQ ID NO: 6)

(vii) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(viii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(ix) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(x) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos, en donde los péptidos son capaces de reducir la hipersensibilidad o hipersensibilidad frente a Ara h 1 de una composición que comprende Ara h 1 cuando se administra a un sujeto que tiene una afección caracterizada por dicha hipersensibilidad.

La reducción de la hipersensibilidad frente a Ara h 1 (y la hipersensibilidad frente a alérgenos de manera más general) se analiza con más detalle a continuación. Brevemente, sin embargo, esto puede tomar la forma de que un individuo se desensibilice o tolere parcial o completamente Ara h 1 específicamente o el cacahuete u otras proteínas de manera más general.

La referencia a un "péptido" incluye la referencia a un péptido, polipéptido o proteína o partes de los mismos. El péptido puede estar glicosilado o no glicosilado y/o puede contener una variedad de otras moléculas fusionadas, ligadas, unidas o asociadas de otro modo a la proteína, como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas. En lo sucesivo, la referencia a un "péptido" incluye un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos así como un péptido asociado con otras moléculas tales como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas.

Los "derivados" incluyen fragmentos, partes, porciones y variantes de fuentes naturales, sintéticas o recombinantes que incluyen proteínas de fusión. Las partes o fragmentos incluyen, por ejemplo, regiones activas del péptido objeto. Los derivados se pueden obtener a partir de una inserción, deleción o sustitución de aminoácidos. Los derivados de una inserción de aminoácidos incluyen fusiones terminales del extremo amino y/o carboxilo así como inserciones intrasecuenciales de aminoácidos únicos o múltiples. Las variantes de una secuencia de aminoácidos mediante inserción son aquellas en las que se introducen uno o varios residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado de la proteína, aunque también es posible una inserción aleatoria con una selección adecuada del producto resultante. Las variantes por deleción se caracterizan por la eliminación de uno o varios aminoácidos de la secuencia.

Las variantes de aminoácidos mediante sustitución son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo de la secuencia y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Un ejemplo de variantes de aminoácidos por sustitución son las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las adiciones a las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones con otros péptidos, polipéptidos o proteínas.

Los equivalentes químicos y funcionales del péptido objeto deben entenderse como moléculas que muestran una o varias de las actividades funcionales de esas moléculas y se pueden obtener a partir de cualquier fuente, tal como sintetizadas químicamente o identificadas mediante procesos de selección, como la selección de productos naturales.

Los homólogos incluyen péptidos obtenidos a partir de variedades distintas del cacahuete, tales como péptidos obtenidos a partir de otros frutos secos.

Los análogos contemplados en este documento incluyen, pero no se limitan a, una modificación de las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de péptidos, polipéptidos o proteínas y el uso de agentes reticulantes y otros métodos que imponen restricciones conformacionales a las moléculas proteicas o sus análogos. Los mutantes incluyen moléculas que muestran una actividad funcional modificada (por ejemplo, péptidos de Ara h 1 que expresan uno o varios epítopos de linfocitos T pero que carecen de reactividad con los linfocitos B).

Los ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino, como una alquilación reductora mediante reacción con un aldehído seguida de una reducción con NaBH4; aminación con acetimidato de metilo; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguida de reducción con NaBH4.

El grupo guanidina de los residuos de arginina puede modificarse mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede modificarse mediante una activación de carbodiimida mediante la formación de O-acilisourea seguida de una posterior derivatización, por ejemplo, a una amida correspondiente.

Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse mediante métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación del ácido perfórmico a ácido cisteico; formación de una mezcla de disulfuros con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados de mercurio usando 4-cloromercuriobenzoato, ácido 4-cloromercuriofenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercurio-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino.

Los residuos de triptófano pueden modificarse mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Por otro lado, los residuos de tirosina pueden alterarse mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

La modificación del anillo de imidazol de un residuo de histidina puede realizarse mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carboetoxilación con dietilpirocarbonato.

Ejemplos de una incorporación de aminoácidos y derivados no naturales durante la síntesis de proteínas incluyen, entre otros, el uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienilalanina y/o isómeros D de aminoácidos. En la Tabla 1 se muestra una lista de aminoácidos no naturales contemplados en este documento.

Tabla 1

Se pueden utilizar agentes reticulantes, por ejemplo, para estabilizar conformaciones 3D, utilizando agentes reticulantes homo-bifuncionales tales como los imidoésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH2)n con n = 1 a n = 6, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que normalmente contienen un resto reactivo con amino tal como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico de grupo.

En la medida permitida por las presentes reivindicaciones, es posible modificar la estructura de un péptido en las composiciones de acuerdo con la invención para varios fines, tales como aumentar la solubilidad, mejorar la eficacia terapéutica o preventiva, mejorar la estabilidad o aumentar la resistencia a una degradación proteolítica. Puede producirse un péptido modificado en el que se ha alterado la secuencia de aminoácidos, como mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos, para modificar la inmunogenicidad y/o reducir la alergenicidad. De forma similar, se pueden añadir componentes a los péptidos en las composiciones de la invención para producir el mismo resultado.

Por ejemplo, un péptido se puede modificar para que muestre la capacidad de inducir la anergia de linfocitos T. En ese caso, los residuos de unión decisivos para el receptor de linfocitos T se pueden determinar usando técnicas conocidas (por ejemplo, sustitución de cada residuo y determinación de la presencia o ausencia de reactividad de los linfocitos T). En un ejemplo, aquellos residuos que han demostrado ser esenciales para interaccionar con el receptor de linfocitos T, se pueden modificar reemplazando el aminoácido esencial por otro residuo de aminoácido preferiblemente similar (una sustitución conservadora), cuya presencia muestre que altera la reactividad de las linfocitos T o el funcionamiento de los linfocitos T. Además, aquellos residuos de aminoácidos que no son esenciales para la interacción del receptor de linfocitos T, pueden modificarse reemplazándolos por otro aminoácido cuya incorporación puede alterar la reactividad de los linfocitos T o el funcionamiento de los linfocitos T, pero no elimina, por ejemplo, la unión a las proteínas relevantes del MHC. En otro ejemplo más, se pueden crear péptidos mutantes que muestran una unión normal a linfocitos T pero anulan la unión a IgE.

Las sustituciones conservadoras ejemplares se detallan en la Tabla 2, a continuación, e incluyen:

Esas modificaciones darán como resultado la producción de moléculas que entran dentro del alcance de "mutantes" del péptido objeto, tal y como se define en el presente documento. "Mutantes" debe entenderse como una referencia a péptidos que muestran una o varias características estructurales o actividades funcionales que son distintas de las mostradas por el péptido homólogo no mutado. En la medida permitida por las presentes reivindicaciones, los péptidos en las composiciones de la invención también pueden modificarse para incorporar uno o varios polimorfismos resultantes de una variación alélica natural y los D-aminoácidos, aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos pueden sustituirse en los péptidos para producir péptidos modificados que entran dentro del alcance de la invención. Los péptidos también se pueden modificar mediante conjugación con polietilenglicol (PEG) mediante técnicas conocidas. También se pueden añadir grupos indicadores para facilitar una purificación y aumentar potencialmente la solubilidad de los péptidos según la invención. También se pueden usar otros tipos de modificación bien conocidos que incluyen la inserción de sitios de escisión de endoproteasas específicas, la adición de grupos funcionales o el reemplazo de residuos hidrófobos con residuos menos hidrófobos, así como la mutagénesis dirigida al sitio de un ADN que codifica los péptidos de la invención, para introducir modificaciones que podrían ser útiles para una amplia gama de fines. Las diversas modificaciones de los péptidos en las composiciones de acuerdo con la invención que se han mencionado anteriormente, se mencionan solo a modo de ejemplo y simplemente pretenden ser indicativas de la amplia gama de modificaciones que pueden efectuarse, en la medida permitida por las presentes reivindicaciones.

Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, la presente invención proporciona composiciones que comprenden péptidos que retienen toda o parte de su capacidad para interaccionar con linfocitos T, pero muestran una reactividad de anticuerpo, parcial o completamente inhibida, anulada o regulada negativamente de otro modo. Una regulación por disminución de la reactividad del anticuerpo se puede lograr mediante cualquier método adecuado, en donde esos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en la medida en que un epítopo de linfocito B se define por su secuencia lineal de aminoácidos, se pueden añadir, eliminar o sustituir uno o varios residuos de aminoácidos para hacer que la secuencia lineal mutada sea distinta de la secuencia natural, en la medida permitida por las presentes reivindicaciones. En la medida en que un epítopo puede estar definido adicional o alternativamente por un epítopo conformacional, se puede buscar romper esa conformación interrumpiendo una estructura secundaria o, en la medida en que existen homodímeros o heterodímeros, una estructura terciaria del péptido. Esto se puede lograr, por ejemplo, interrumpiendo la formación de enlaces, tales como enlaces disulfuro, que se sabe que estabilizan las estructuras 2a y/o 3a. En términos de los epítopos de linfocitos T definidos anteriormente en el presente documento, esas regiones epitópicas no comprenden epítopos de linfocitos B.

Los epítopos definidos por las SEQ ID NOs: 1-10 son las regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, en donde se ha determinado que también muestran degeneración para el HLA, en particular la presentación mediante HLA-DQ, siendo esto crucial en términos de desarrollo de un régimen de tratamiento efectivo. Las composiciones según el primer aspecto de la presente invención comprenden un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23) y pueden comprender además uno o varios péptidos que comprenden una secuencia procedente del grupo de regiones epitópicas centrales definidas por SEQ ID NOs 1,2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 o 10, en donde cada uno de los péptidos adicionales no tiene más de 28 aminoácidos de longitud.

En una realización según el primer aspecto de la invención, dicha composición comprende un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23) y cualquier región adicional entre una región epitópica, dos regiones epitópicas, tres regiones epitópicas, cuatro regiones epitópicas, cinco regiones epitópicas, seis regiones epitópicas, siete regiones epitópicas, ocho regiones epitópicas o nueve regiones epitópicas.

Adicionalmente, en este documento se describe una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde los péptidos incluyen el epítopo NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3) junto con una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(iv) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(v) EGALML (SEQ ID NO: 6)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos.

Adicionalmente, en el presente documento se describe una composición que comprende uno o varios péptidos, en donde cada uno de los cuales tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos contiguos y en donde el péptido incluye el epítopo EGALML (SEQ ID NO: 6) junto con una o varias regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, seleccionadas a partir de la lista que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10)

o derivados funcionales u homólogos de los mismos.

La composición según el primer aspecto de la invención puede incluir al menos tres péptidos, al menos cuatro péptidos, al menos cinco péptidos, al menos seis péptidos, al menos siete péptidos, al menos ocho péptidos, al menos nueve péptidos o diez péptidos.

Como se ha detallado anteriormente, las composiciones del primer aspecto de la presente invención comprenden regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h1 degeneradas para e1HLA: como mínimo, un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23). En la medida permitida por las reivindicaciones, estas regiones epitópicas centrales pueden administrarse como péptidos independientes o pueden formar parte de una estructura mayor, tal como un péptido más largo o una estructura no peptídica. Como apreciará el experto en la técnica, una región epitópica a veces puede ser demasiado pequeña, por sí misma, para inducir una respuesta inmunitaria. Los haptenos son un ejemplo de ese tipo de epítopo. Por tanto, las regiones epitópicas centrales de la presente invención pueden formularse junto con cualquier molécula portadora proteica o no proteica, para lograr el nivel necesario de inmunogenicidad.

En una realización, los péptidos adicionales que comprenden regiones epitópicas centrales forman parte de un péptido más grande de hasta 28 aminoácidos contiguos de longitud. Los péptidos adicionales pueden tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 aminoácidos. Preferiblemente, los péptidos adicionales tienen una longitud de 12-25 aminoácidos, una longitud de 15-25 aminoácidos, una longitud de 15-20 aminoácidos o una longitud de 10-20 aminoácidos.

En la medida en que las composiciones según el primer aspecto de la invención se diseñan de manera que las regiones epitópicas centrales se incluyen como parte de un péptido más grande, debe entenderse que cualquier péptido dado puede diseñarse para incluir una o varias regiones epitópicas centrales. Con este fin, el primer aspecto de la presente invención también proporciona una composición en la que uno o varios péptidos adicionales se seleccionan a partir de la lista:

(i) FQNLQNHRIV (SEQ ID NO: 12)

(ii) RIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 13)

(iii) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 14)

(iv) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 15)

(v) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 16)

(vi) ENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 17)

(vii) NNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 18)

(viii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(ix) SNNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 19)

(x) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 21)

(xi) SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 22)

(xii) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23)

(xiii) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO: 24)

(xiv) KAMVIVVVNKG (SEQ ID NO: 25)

(xv) AMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 26)

(xvi) VVNKGTGNLELVAVRK (SEQ ID NO: 27)

(xvii) AMVIVVVNKGTGNLELV (SEQ ID NO: 28)

(xviii) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 29)

(xix) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 30)

(xx) VFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 31)

(xxi) GDVFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 32)

(xxii) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 33)

Adicionalmente, en el presente documento se describe una composición que comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 15, 16 o 17 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 12-14 o 18-33.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 23 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 12-22 o 24-33.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, el uno o varios péptidos adicionales de la composición se seleccionan a partir de la lista:

(i) FQNLQNHRIV (SEQ ID NO: 12)

(ii) RIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 13)

(iii) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 14)

(iv) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 15)

(v) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 16)

(vi) NNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 18)

(vii) SNNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 19)

(viii) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(ix) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 21)

(x) SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 22)

(xi) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23)

(xii) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO: 24)

(xiii) KAMVIVVVNKG (SEQ ID NO: 25)

(xiv) AMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 26)

(xv) AMVIVVVNKGTGNLELV (SEQ ID NO: 28)

(xvi) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 29)

(xvii) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 30)

(xviii) GDVFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 32)

(xix) VFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 31)

Adicionalmente, en el presente documento se describe una composición que comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 15 o 16 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 12-14, 18-26 o 28-32.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 23 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 12-16, 18-22, 24-26 o 28-32.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, el uno o varios péptidos adicionales de la composición se seleccionan a partir de la lista:

(i) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 14)

(ii) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 15)

(iii) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 21)

(iv) VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23)

(v) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO: 24)

(vi) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 29)

(vii) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 30)

Adicionalmente, en el presente documento se describe una composición que comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 15 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 14, 21,23, 24, 29 o 30.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende el péptido definido por SEQ ID NO: 23 junto con uno o varios de los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 14, 15, 21,24, 29 o 30.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 14, 15, 21,23, 24, 29 y 30.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 14, 16, 21,23, 24, 29 y 30.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 14, 15, 22, 23, 24, 29 y 30.

En otra realización adicional del primer aspecto de la invención, la composición comprende los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 14, 15, 21,23, 24, 29 y 32.

En el contexto de la presente invención, debe entenderse que cuando se hace referencia al uso del péptido definido por SEQ ID NO: 14, este péptido puede estar sustituido por:

(i) los péptidos definidos por SEQ ID NO: 12 y 13;

(ii) el péptido definido por SEQ ID NO: 12; o

(iii) el péptido definido por SEQ ID NO: 13.

En la medida en que se hace referencia al uso del péptido definido mediante SEQ ID NO: 15, este péptido puede estar sustituido por el péptido definido por SEQ ID NO: 16 o 17.

En la medida en que se hace referencia al uso del péptido definido mediante SEQ ID NO: 21, este péptido puede estar sustituido por el péptido definido por:

(i) el péptido definido por SEQ ID NO: 22;

(ii) los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 18 y 20;

(iii) los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 20 y 19;

(iv) el péptido definido por SEQ ID NO: 18;

(v) el péptido definido por SEQ ID NO: 19; o

(vi) el péptido definido por SEQ ID NO: 20.

En la medida en que se hace referencia al uso del péptido definido por SEQ ID NO: 29, este péptido puede estar sustituido por el péptido definido por:

(i) los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 25, 28 y 27;

(ii) los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 25 y 26;

(iii) los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 25 y 28;

(iv) los péptidos definidos por SEQ ID NOs: 25 y 27;

(v) los péptidos definidos por SEQ ID NO: 25;

(vi) el péptido definido por SEQ ID NO: 28;

(vii) el péptido definido por SEQ ID NO: 27; o

(viii) el péptido definido por SEQ ID NO: 26.

En la medida en que se hace referencia al uso del péptido definido por SEQ ID NO: 30, este péptido puede estar sustituido por el péptido definido por:

(i) el péptido definido por SEQ ID NO: 32;

(ii) el péptido definido por SEQ ID NO: 33; o

(iii) el péptido definido por SEQ ID NO: 31.

En otro aspecto más de estas realizaciones del primer aspecto de la invención, la composición comprende 3 o 4 o 5 o 6 de los péptidos enumerados.

En otra realización más del primer aspecto de la invención, la composición comprende los 7 péptidos.

Los péptidos de las composiciones de la presente invención pueden prepararse mediante métodos recombinantes o sintéticos químicos. Según una realización preferida de la presente invención, el péptido de la composición es un péptido recombinante que preferentemente es inmunológicamente reactivo con los linfocitos T de individuos con hipersensibilidad al cacahuete, el cual se expresa mediante la expresión de una célula hospedadora transformada con un vector que codifica la secuencia peptídica de la presente invención. El péptido puede fusionarse con otro péptido, polipéptido o proteína. Alternativamente, el péptido puede prepararse mediante técnicas de síntesis química, tales como el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield. Además, aunque los péptidos sintéticos de la secuencia proporcionada anteriormente representan una realización preferida, la presente invención también se extiende a preparaciones biológicamente puras de los péptidos de origen natural o fragmentos de los mismos. Por "biológicamente pura" se entiende una preparación que comprende al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70% o preferiblemente al menos aproximadamente el 80% y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% o más, según se determina por el peso, la actividad u otros medios adecuados.

Por lo tanto, debe entenderse que la presente invención incluye composiciones que comprenden además péptidos que comprenden al menos una región epitópica central de linfocitos T de Ara h 1, como se ha definido anteriormente, junto con otros aminoácidos (que pueden o no ser de origen natural) u otros especies químicas. En un aspecto preferido de la invención, esos péptidos pueden comprender uno o varios epítopos de Ara h 1, en donde los epítopos son regiones epitópicas centrales de linfocitos T. Los péptidos con uno o varios epítopos de Ara h 1 son deseables para aumentar la eficacia terapéutica.

El segundo aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

Debe entenderse que la referencia a "péptidos" incluye la referencia a péptidos que comprenden uno o varios epítopos de linfocitos T. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido objeto es preferiblemente una secuencia de ácidos desoxirribonucleicos tal como un ADNc o una secuencia genómica. Una secuencia genómica puede comprender exones e intrones. Una secuencia genómica también puede incluir una región promotora u otras regiones reguladoras.

La molécula de ácido nucleico puede ligarse a un vector de expresión capaz de expresarse en una célula procariota (por ejemplo, E. coli) o una célula eucariota (por ejemplo, células de levadura, células de hongos, células de insectos, células de mamíferos o células de plantas). La molécula de ácido nucleico puede estar ligada o fusionada o asociada de otro modo con una molécula de ácido nucleico que codifica otra entidad tal como, por ejemplo, un péptido señal. También puede comprender información adicional de la secuencia de nucleótidos fusionada, ligada o asociada de otro modo con ella en una de las porciones terminales 3' o 5' o en ambas porciones terminales 3' y 5'. La molécula de ácido nucleico también puede formar parte de un vector, tal como un vector de expresión. La última realización facilita la producción de formas recombinantes del péptido objeto cuyas formas están incluidas en la presente invención.

Esos ácidos nucleicos pueden ser útiles para la producción recombinante de epítopos de linfocitos T de Ara h 1 o proteínas que los comprenden, mediante la inserción en un vector apropiado y la transfección en una línea celular adecuada. Esos vectores de expresión y líneas de células hospedadoras también forman un aspecto de la invención.

Al producir péptidos mediante técnicas recombinantes, las células hospedadoras transformadas con un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica un péptido de acuerdo con la invención o un equivalente funcional de la secuencia de ácido nucleico, se cultivan en un medio adecuado para las células particulares en cuestión. Los péptidos se pueden purificar luego a partir del medio de cultivo celular, las células hospedadoras o ambos, usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel, la ultrafiltración, la electroforesis o la inmunopurificación con anticuerpos específicos para el péptido.

Los ácidos nucleicos que codifican Ara h 1 o péptidos que comprenden regiones epitópicas centrales de linfocitos T de Ara h 1, que incluyen SEQ ID NO: 23 según se reivindica, pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos, levaduras o células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino (CHO). Los vectores de expresión, promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión adecuados se mencionan en Sambruck et al. (1989). Los expertos en la técnica conocen bien otros vectores de expresión, promotores, potenciadores y otros elementos de expresión adecuados. Ejemplos de vectores de expresión adecuados en levadura incluyen Yep Sec 1 (Balderi et al., 1987, Embo J., 6: 229-234.); pMFa (Kurjan y Herskowitz., 1982, Cell., 30: 933-943); JRY88 (Schultz et al., 1987, Gene., 54: 113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Esos vectores están disponibles libremente al igual que los sistemas de expresión de baculovirus y mamíferos. Por ejemplo, un sistema de baculovirus está disponible comercialmente (ParMingen, San Diego, CA) para la expresión en células de insectos, mientras que el vector pMsg está disponible comercialmente (Pharmacia, Piscataway, NJ) para la expresión en células de mamífero.

Para una expresión en E. coli, los vectores de expresión adecuados incluyen, entre otros, pTrc (Amann et al., 1998, Gene., 69: 301-315) pGex (Amrad Corporation, Melbourne, Australia); pMal (N.E. Biolabs, Beverley, MA); pRit5 (Pharmacia,, Piscataway, NJ); pEt-11 d (Novagen, Maddison, W i) (Jameel et al., 1990, J. Virol., 64: 3963-3966) y pSem (Knapp et al., 1990, Bio Techniques., 8: 280-281). El uso de pTRC y pEt-11 d, por ejemplo, conducirá a la expresión de una proteína no fusionada. El uso de pMal, pRit5, pSem y pGex conducirá a la expresión de un alérgeno fusionado con la proteína que se une a maltosa E (pMal), la proteína A (pRit5), la galactosidasa truncada (PSEM) o la glutatión S-transferasa (pGex). Cuando un epítopo de linfocito T de Ara h 1 o un péptido que lo comprende se expresa como una proteína de fusión, es particularmente ventajoso introducir un sitio de escisión enzimática en la unión de la fusión entre la proteína portadora y el péptido en cuestión. A continuación, el péptido de la invención puede recuperarse desde la proteína de fusión mediante una escisión enzimática en el sitio enzimático y purificación bioquímica utilizando técnicas convencionales para la purificación de proteínas y péptidos. Los diferentes vectores también tienen diferentes regiones promotoras que permiten una expresión constitutiva o inducible o la inducción de temperatura. Además, puede ser apropiado expresar péptidos recombinantes en diferentes hospedadores de E. coli que tienen una capacidad alterada para degradar proteínas expresadas de forma recombinante. Alternativamente, puede ser ventajoso alterar la secuencia de un ácido nucleico para usar codones preferentemente utilizados por E. coli, en donde esa alteración del ácido nucleico no afectará a la secuencia de aminoácidos de las proteínas expresadas.

Las células hospedadoras se pueden transformar para expresar los ácidos nucleicos de la invención usando técnicas convencionales, tales como coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección o electroporación mediada por DEAE-dextrano. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar las células hospedadoras en Sambruck et al. (1989) y otros textos para laboratorio. La secuencia de ácido nucleico de la invención también se puede sintetizar químicamente usando técnicas convencionales.

Además de la producción recombinante de péptidos para las composiciones según la invención, los ácidos nucleicos pueden utilizarse como sondas con fines experimentales o de purificación.

Una identificación y síntesis de los epítopos de linfocitos T de Ara h 1 tal y como se describe en el presente documento, ahora facilita el desarrollo de una variedad de protocolos de diagnóstico y de tratamiento profiláctico/terapéutico para uso en relación con afecciones inmunitarias relacionadas con el cacahuete. También se facilita el desarrollo de reactivos para uso en los mismos. En consecuencia, el tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención para uso en el tratamiento o la prevención de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por una hipersensibilidad hacia Ara h 1 o un derivado u homólogo del mismo. Los métodos de tratamiento en los cuales se pueden usar la composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención o los péptidos, derivados funcionales, homólogos o análogos de los mismos que de otro modo se describen en el presente documento incluyen, pero no se limitan a:

(i) La administración a un paciente como un medio para desensibilizar o inducir tolerancia inmunológica frente a Ara h 1 o moléculas similares a Ara h 1. Esto se puede lograr, por ejemplo, induciendo anergia de Th2 dirigida a Ara h 1 o apoptosis. Ese resultado puede lograrse mediante una cualquiera entre varias técnicas que incluyen el uso de péptidos que mantienen la reactividad del epítopo de los linfocitos T pero que, de forma natural o como resultado de una mutación, no pueden someterse a la unión de IgE. Alternativamente, se pueden utilizar protocolos de desensibilización/tratamiento que se basan en la administración de concentraciones específicas de un péptido dado de acuerdo con un régimen específico para inducir la tolerancia. Esa metodología puede eliminar la hipersensibilidad frente a Ara h 1 o puede reducir la gravedad de la hipersensibilidad frente a Ara h 1 o la sensibilidad frente a un alérgeno presente en una composición que comprende Ara h 1, tal como una alergia al cacahuete. La referencia en el presente documento al tratamiento de la sensibilidad a Ara h 1 debe entenderse que incluye dentro de su alcance el tratamiento de afecciones caracterizadas por una sensibilidad a las composiciones que comprenden Ara h 1, como los cacahuetes en general, incluso si la sensibilidad está dirigida a un alérgeno distinto de Ara h 1.

Preferiblemente, esos regímenes de tratamiento son capaces de modificar la respuesta de los linfocitos T o la respuesta de ambos linfocitos B y T del individuo en cuestión. Tal y como se usa en el presente documento, una modificación de la respuesta alérgica del individuo que padece hipersensibilidad al cacahuete puede definirse como la inducción de una falta de respuesta o una disminución de los síntomas frente a la molécula de Ara h 1, según se determina por procedimientos clínicos convencionales (Varney et al. 1991 British Medical Journal 302: 265-269). Una disminución de los síntomas incluye cualquier reducción de una respuesta alérgica en un individuo frente a Ara h 1, después de que se ha completado un régimen de tratamiento. Esa disminución puede ser subjetiva o estar determinada clínicamente, por ejemplo, usando pruebas cutáneas convencionales conocidas en la técnica.

La exposición de un individuo a los péptidos de la presente invención, en donde los péptidos comprenden al menos un epítopo de linfocitos T, puede tolerar o anergizar subpoblaciones de linfocitos T apropiados, de tal manera que dejan de responder a Ara h 1 y no participen en la estimulación de una respuesta inmune después de esa exposición. Preferiblemente, el péptido o los péptidos en las composiciones de acuerdo con el primer aspecto de la invención, retendrán epítopos de linfocitos T inmunodominantes pero se anula la unión a IgE. Además, incluso si el alérgeno en cuestión no es Ara h 1, sino que se dirige a un alérgeno diferente que está presente en la misma composición que Ara h 1 (como un alérgeno de cacahuete diferente), la inmunización con Ara h 1 puede inducir un efecto supresor de la asistencia que actúa para reducir el grado de hipersensibilidad a ese alérgeno.

La administración de una composición que contiene péptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invención, puede modificar el perfil de secreción de citocinas en comparación con la exposición al alérgeno Ara h 1 de origen natural. Esa exposición también puede influir en las subpoblaciones de linfocitos T que normalmente participan en la respuesta alérgica para migrar fuera del sitio o sitios de exposición normal al alérgeno y hacia el sitio o sitios de la administración terapéutica. Esa redistribución de las subpoblaciones de linfocitos T puede mejorar o reducir la capacidad del sistema inmunológico de un individuo para estimular la respuesta inmunitaria habitual en el sitio de exposición normal al alérgeno, lo que da lugar a una disminución de los síntomas alérgicos.

Una modificación de la respuesta de los linfocitos B se puede lograr, por ejemplo, mediante una modulación del perfil de citocinas producidas por los linfocitos T, como se ha detallado anteriormente. Específicamente, una disminución de la producción de IL-4 e IL-13 obtenidas a partir de linfocitos T, disminuye por tanto la síntesis de IgE.

(ii) Las composiciones que contienen el péptido de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención pueden usarse en la capacidad de un agente adsorbente para eliminar linfocitos T dirigidos a Ara h 1 desde una muestra biológica o desde un paciente.

Adicionalmente, en el presente documento se describe un método para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección en un sujeto, en donde la afección se caracteriza por la respuesta inmune anormal, no deseada o inapropiada de otro modo frente a Ara h 1, o un alérgeno en una composición que comprende Ara h 1, en donde dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una composición tal y como se ha definido en esta memoria anteriormente durante un tiempo y en condiciones suficientes para eliminar o reducir la presencia o la función en dicho sujeto de los linfocitos T dirigidos a dicho Ara h 1 u otro alérgeno.

Preferiblemente, dicha afección es hipersensibilidad a los cacahuetes o frutos secos que contienen Ara h 1 o moléculas similares a Ara h 1, tales como avellanas, almendras o nueces de Brasil.

Dicho método puede desensibilizar o inducir una tolerancia inmunológica frente a Ara h 1 u otro alérgeno de dicha composición.

Dicha desensibilización o tolerancia se puede lograr induciendo una anergia de Th2 o apoptosis.

Dicha desensibilización o tolerancia se puede lograr induciendo linfocitos Treg específicos de Ara h 1.

Una "cantidad eficaz" significa una cantidad necesaria, al menos en parte, para lograr la respuesta inmune deseada, o para retrasar el inicio o inhibir la progresión o detener por completo, el inicio o la progresión de una afección particular que se está tratando. La cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar, el grado de protección deseado, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina.

También debe entenderse que la composición según el primer aspecto de la presente invención puede comprender exclusivamente epítopos de Ara h 1 o también puede comprender otros epítopos o moléculas útiles para lograr una eficacia terapéutica, como una variedad de epítopos de Ara h 2.

El sujeto del tratamiento o profilaxis (los métodos de tratamiento o profilaxis no se reivindican por sí mismos, solo composiciones para uso de acuerdo con el tercer aspecto de la invención) es generalmente un mamífero tal como, pero no limitado a, ser humano, primate, ganado (por ejemplo, oveja, vaca, caballo, burro, cerdo), animal de compañía (por ejemplo, perro, gato), animales de ensayos de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, cobaya, hámster), animales salvajes cautivos (por ejemplo, zorro, ciervo). Preferiblemente, el mamífero es un ser humano o un primate. Lo más preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

La referencia en el presente documento a "tratamiento" y "profilaxis" debe considerarse en su contexto más amplio. El término "tratamiento" no implica necesariamente que un sujeto sea tratado hasta una recuperación total. De manera similar, "profilaxis" no significa necesariamente que el sujeto no contraiga finalmente una enfermedad. Por consiguiente, el tratamiento y la profilaxis incluyen una mejoría de los síntomas de una afección particular o prevenir o reducir de otro modo el riesgo de desarrollar una afección particular. Se puede considerar que el término "profilaxis" reduce la gravedad o la aparición de una afección particular. El "tratamiento" también puede reducir la gravedad de una afección existente.

La composición según el primer aspecto de la invención que comprende el péptido o los péptidos según se reivindica, puede ser una composición farmacéutica, cuya administración puede realizarse por cualquier medio conveniente. Se contempla que el péptido o los péptidos de la composición farmacéutica muestren actividad terapéutica cuando se administran en una cantidad que depende del caso particular. La variación depende, por ejemplo, del ser humano o animal y del agente seleccionado. Puede aplicarse un amplio intervalo de dosis. Considerando un paciente, por ejemplo, se pueden administrar desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg de un agente por kilogramo de peso corporal por día. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente, semanalmente, mensualmente u otros intervalos de tiempo adecuados o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación.

La composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención se puede administrar de una manera conveniente, tal como por vía oral, intravenosa (cuando sea soluble en agua), intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intranasal, sublingual o vía supositorio o mediante implantación (p. ej., usando moléculas de liberación lenta). La composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede administrarse en forma de sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables, tales como sales de adición de ácidos o complejos metálicos, p. ej., con zinc, hierro o similares (que se consideran sales para los fines de esta solicitud). Ejemplos ilustrativos de tales sales de adición de ácido son clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartrato y similares. Si el ingrediente activo se va a administrar en forma de comprimido, el comprimido puede contener un aglutinante como tragacanto, almidón de maíz o gelatina; un agente desintegrante, como ácido algínico; y un lubricante, como estearato de magnesio.

De acuerdo con estos métodos, el péptido o los péptidos en la composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención pueden coadministrarse con uno o varios de otros compuestos o moléculas. Por "coadministrar" se entiende la administración simultánea en la misma formulación o en dos formulaciones diferentes a través de la misma ruta o diferentes rutas, o la administración secuencial mediante la misma ruta o diferentes rutas. Por administración "secuencial" se entiende una diferencia de tiempo de segundos, minutos, horas o días entre la administración de los dos tipos de moléculas. Esas moléculas se pueden administrar en cualquier orden.

Adicionalmente, en el presente documento se describe el uso de una composición tal y como se ha definido anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por una respuesta inmune anormal, no deseada o inapropiada de otro modo frente a Ara h 1.

Preferiblemente, dicha afección es la hipersensibilidad a los cacahuetes o a frutos secos que contienen Ara h 1 o moléculas similares a Ara h 1, tales como la avellana.

La composición según el primer aspecto de la invención puede ser una composición farmacéutica que comprende uno o varios vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Se hace referencia a dicha composición como los ingredientes activos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles, o pueden estar en forma de crema u otra forma adecuada para aplicación tópica. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar protegida frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de superfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede realizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Se puede producir una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos procedentes de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado procedente de la solución previamente esterilizada mediante filtración de los mismos.

Cuando los ingredientes activos están adecuadamente protegidos, pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en forma de comprimidos, o pueden incorporarse directamente con los alimentos de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos un 1% en peso de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, por supuesto, se puede variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente un 5 y aproximadamente un 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es de tal modo que se obtiene una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de manera que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,1 pg y 2000 mg de compuesto activo.

Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes que se enumeran a continuación: un aglutinante tal como goma, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma de unidad de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes varios otros materiales como revestimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizantes tal como el aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de unidad de dosificación debería ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el (los) compuesto(s) activo(s) se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

La composición farmacéutica también puede comprender moléculas genéticas tales como un vector capaz de transfectar células diana, en donde el vector es portador de una molécula de ácido nucleico que codifica un agente modulador. El vector puede ser, por ejemplo, un vector vírico.

Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, por vía respiratoria (por ejemplo, intranasal u oral mediante aerosol), intratraqueal, nasofaríngea, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracraneal, intradérmica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracereberal, intranasal, infusión, oral, rectal, a través de un parche de cánula intravenosa, implante y sublingual. Preferiblemente, dicha vía de administración es subcutánea, intradérmica o intranasal.

El cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro de diagnóstico o de seguimiento de una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por hipersensibilidad a Ara h 1 o un derivado u homólogo del mismo, comprendiendo dicho método una selección de linfocitos T reactivos con Ara h 1, utilizando el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

Las aplicaciones en diagnóstico para las que se puede usar la composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención o los epítopos o péptidos descritos de otro modo en el presente documento incluyen, pero no se limitan a:

(i) Medir la reactividad de las células de un sujeto frente a Ara h 1. Esto es útil, por ejemplo, con respecto al diagnóstico y/o el seguimiento de afecciones caracterizadas por una respuesta inmune anormal, no deseada o inapropiada frente a Ara h 1. Los péptidos pueden añadirse a una solución o fijarlos sobre un soporte sólido junto con células obtenidas a partir de sangre periférica o de biopsias tisulares no fraccionadas, fraccionadas u obtenidas como una línea celular continua. La reactividad frente al péptido objeto puede medirse luego mediante ensayos de proliferación convencionales, tales como la incorporación de H3-timidina, medición de moléculas expresadas o secretadas tales como marcadores de superficie, citocinas u otros ensayos convencionales de la actividad celular que son bien conocidos en la técnica.

(ii) El uso de un epítopo de linfocitos T que comprende péptidos junto con un ensayo de proliferación de linfocitos T que utiliza una muestra de linfocitos T obtenida a partir del sujeto, facilitará, por ejemplo, la identificación de una población que responde a los linfocitos T.

Pueden utilizarse métodos para detectar Ara h 1, por ejemplo, para detectar cualitativa o cuantitativamente los niveles de Ara h 1. Sin embargo, esos métodos también se pueden utilizar para detectar mutaciones o polimorfismos en Ara h 1, mutaciones que pueden dar como resultado, por ejemplo, la pérdida de reactividad de los linfocitos T frente a Ara h 1. Esos métodos se pueden utilizar con el fin de detectar moléculas de péptidos adecuadas para uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo que padece hipersensibilidad relacionada con Ara h 1.

Adicionalmente, en el presente documento se describe un método para diagnosticar o controlar una afección en un mamífero, en donde la afección se caracteriza por una respuesta anormal, no deseada o inapropiada frente a Ara h 1, comprendiendo dicho método una selección de linfocitos T reactivos con Ara h 1, utilizando los péptidos o epítopos definidos anteriormente en esta memoria.

Preferiblemente, dicha afección es hipersensibilidad a los cacahuetes o frutos secos que contienen Ara h 1 o moléculas similares a Ara h 1, tales como avellanas, almendras o nueces de Brasil.

Adicionalmente, en el presente documento se describen kits de diagnóstico para uso en la metodología de diagnóstico definida anteriormente en el presente documento.

La presente invención se describirá ahora con más detalle haciendo referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes. En la medida en que algunos de los siguientes ejemplos estén fuera del alcance de las reivindicaciones adjuntas, se incluyen únicamente como ejemplos comparativos.

Ejemplos

Métodos

Sujetos

Se reclutaron sujetos adultos alérgicos al cacahuete desde la clínica The Alfred Allergy Clinic, Melbourne, Australia (Tabla 4). Todos los sujetos tenían síntomas clínicos de alergia al cacahuete mediada por IgE y una puntuación CAP de IgE específica al cacahuete >1 (>0,49 kUA/l; Pharmacia CAP System™, Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suecia). Los sujetos utilizados para la generación de la línea de linfocitos T (TCL) estaban genotipados (HLA-DRB 1, -DQB 1 y -DPB 1, exón 2) por el Servicio de Inmunogenética y Trasplantes de Victoria (Tabla 5). El estudio fue aprobado por los comités de ética de la Universidad Alfred y Monash y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada sujeto.

Antígenos

El extracto de cacahuete crudo (CPE) se preparó a partir de cacahuete comercial, tostado en seco sin sal, como se ha descrito (Prickett et al. 2011 supra; de Leon et al. Clin Exp Allergy. 2003; 33(9): 1273-80). Ara h 1 y Ara h 1 se enriquecieron a partir de CPE mediante cromatografía líquida como se ha descrito (Prickett et al. 2011 supra). Los contenidos en endotoxinas eran 1,7, 4,0 y 78,0 UE/mg para CPE, Ara h 1 y Ara h 1 respectivamente (ensayo LAL cromogénico de punto final, Lonza, Walkersville, EE.UU.). Los péptidos de Ara h 1 (Mimotopes, Victoria, Australia y GenScript USA Inc, Nueva Jersey, EE.UU.; Tabla 6) se reconstituyeron teniendo 2 mg/ml en dimetilsulfóxido al 10%/PBS (conjuntos de péptidos de 20 meros y truncados) o PBS solo (péptidos de epítopos centrales sintetizados a medida). Se confirmó que todos los antígenos no eran ni mitogénicos ni tóxicos como se ha descrito (Eusebius et al. Int Arch Allergy Immunol. 2002; 127(3): 234-44).

Generación de líneas de linfocitos T (TCL) CD4+ específicas de Ara h 1

Se generaron TCL oligoclonales específicas de Ara h 1 a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sujetos alérgicos al cacahuete, utilizando una metodología basada en el succinimidiléster de diacetato de 5,6-carboxifluoresceína (CFSE) (Mannering et al. J ImmunolMethods. 2005; 298(1 -2): 83-92) como se ha descrito (Prickett et al. 2011 supra), con CPE (100 pg/mL), Ara h 1 (10 pg/mL) o péptidos de 20 meros que incluían la secuencia de Ara h 1 (solapamiento de 11 aminoácidos (aa) (solapamiento de 17 aa para el último péptido); Tabla 6 ; 10 pg/mL/péptido) como antígenos impulsores. Se evaluó la especificidad (proliferación) de todas las TCL para 20 meros de Ara h 1 individuales (10 pg/mL) así como CPE (100 pg/mL) y/o Ara h 1 (10 pg/mL). Se cartografiaron las secuencias del epítopo central dentro de los 20 meros seleccionados, usando conjuntos de péptidos truncados desde el extremo N-terminal o C-terminal del 20 mero como se ha descrito (Prickett et al. 2011 supra).

Ensayos de linfocitos T

Todo el cultivo se realizó en RPMI-1640 que contenía L-glutamina 2 mM, 100 UI/mL de penicilina-estreptomicina y suero AB humano inactivado por calor al 5% (Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.) (cRPMI). La proliferación de TCL inducida con antígeno se evaluó mediante ensayos de captación de 3H-timidina (3H-TdR) como se ha descrito (Prickett ^{et al. 2011 supra). Un índice de estimulación} (Si ^{(por sus siglas en inglés); linfocitos T estimulados con antígenos en} cpm/linfocitos T no estimulados en cpm) >2,5 se consideró positivo y todas las respuestas positivas se confirmaron en >2 ensayos. La restricción del HLA del reconocimiento de epítopos mediante TCL se evaluó utilizando anticuerpos monoclonales (AcMo) contra HLA-DR (L243), HLA-DQ (SVP-L3) o HLA-DP (B7/21) para bloquear la presentación de epítopos como se ha descrito (Prickett et al. 2011 supra). Para permitir una detección de la proliferación de linfocitos T CD4+ inducida por los péptidos dentro de las PBMC completas, se establecieron cultivos de 7 días de PBMC marcadas con CFSE como se ha descrito, para la generación de TCL (Prickett et al. 2011 supra). Al menos 10.000 linfocitos T CD4+ se analizaron por cada muestra y el SI se calculó como porcentaje de células CD4+CFSElo (proliferadas) con antígeno/porcentaje de células CD4+CFSEto sin antígeno (fondo). El umbral de detección para una respuesta específica en este ensayo se evaluó expandiendo una TCL específica de péptido procedente de linfocitos CD4+ proliferados sobre un intervalo de valores SI para tres sujetos. Una TCL específica podía generarse a partir de linfocitos T divididos con un SI tan bajo como 1,1 en los tres sujetos (datos no mostrados), lo que permite la designación de un SI >1,1 como positivo.

Prueba de activación de basófilos

La activación de basófilos se evaluó mediante una regulación positiva de CD63 detectada por citometría de flujo como se ha descrito (Drew et al. J Immunol. 2004; 173(9): 5872-9). Los controles positivos eran anticuerpo anti-IgE humana de conejo (7,5 ug/mL; DAKO Corporation, CA, EE.UU.), N-formil-metionina-leucina-fenilalanina (fMLP) (0,4 ug/mL; Sigma) y CPE. Se sometieron a ensayo CPE, Ara h 1 y los péptidos en un intervalo de concentración de log-3 (5, 0,5 y 0,05 ug/mL).

Resultados

Selección de péptidos de 20 meros de Ara h 1 que contienen epítopos de linfocitos T CD4+ dominantes reconocidos por sujetos alérgicos al cacahuete

Se generaron un total de 145 líneas de linfocitos T específicas de Ara h 1 (TCL) a partir de PBMC de 18 sujetos alérgicos al cacahuete con diversidad de HLA (Tablas 4 y 5) mediante el aislamiento y la expansión de linfocitos T CD4+CFSElC) específicos de antígeno (proliferados) a partir de cultivos de 7 días de PBMC marcadas con CFSE, estimulados con CPE, Ara h 1 o grupos de péptidos de 20 meros de Ara h 1 que incluían colectivamente la secuencia de Ara h 1 (Tabla 6). El o los péptidos de 20 meros reconocidos (SI > 2,5) por cada sujeto se muestran en la Tabla 7 y los datos se resumen en la Figura 1. Para algunos sujetos, la estimulación con CPE o Ara h 1 generaba la mayor parte de TCL, mientras que para otros eran los grupos de péptidos. Cuando se generaron TCL a partir de un sujeto dado usando diferentes preparaciones de antígenos (CPE, Ara h o grupos de péptidos), las especificidades de los 20 meros de las TCL eran comparables. En general, no había un sesgo en la especificidad generada de los 20 meros de las TCL, dependiendo de la preparación del antígeno.

Las 145 TCL reconocían colectivamente epítopos a lo largo de toda la secuencia de Ara h 1, y solo cuatro de los sesenta y nueve 20 meros fallaron en estimular cualquier TCL. Catorce 20 meros (23, 24, 26, 38, 40, 44-51 y 57) fueron reconocidos cada uno por cuatro (22%) o más sujetos, siendo los péptidos 50 y 51 los que tenían más respondedores (seis sujetos; 33%) (Figura 1). Con el fin de seleccionar 20 meros que contenían epítopos de linfocitos T dominantes, se consideraron varios factores además de las frecuencias de respondedores, incluyendo la magnitud de la respuesta de TCL, el número de TCL específicas por sujeto, la reproducibilidad de la respuesta de TCL específica y la capacidad de dirigirse a linfocitos T específicos en PBMC. Basándose en esos parámetros, se seleccionaron nueve de los catorce 20 meros (los péptidos 23, 24, 40, 46, 47, 49, 50, 51 y 57) para análisis posteriores. Esos nueve 20 meros fueron reconocidos colectivamente por 16 de los 18 sujetos (89%) en esa cohorte, e inducían típicamente respuestas proliferativas fuertes y consistentes en TCL específicas, siendo la mayoría de los SI superiores a cinco y muchos considerablemente más altos (Tabla 7). Además, cada uno de esos 20 meros fue reconocido por múltiples TCL procedentes de muchos respondedores, lo que refleja una prevalencia de linfocitos T específicos para esos péptidos entre los repertorios de linfocitos T de los sujetos. Para evaluar el reconocimiento en una cohorte más amplia, se examinaron PBMC de 21 sujetos alérgicos al cacahuete adicionales mediante un ensayo con CFSE para medir la proliferación de linfocitos T CD4+ en PBMC completas después de siete días de estimulación con cada péptido (Tabla 1, panel superior y Figura 4). Este ensayo proporcionó un cribado sensible y preciso para detectar respuestas de linfocitos T CD4+ específicos de un péptido dentro de PBMC completas. Los 21 sujetos mostraban proliferación de linfocitos T en PBMC frente a CPE o una combinación de Ara h 1 y Ara h 1 enriquecida. Los 20 meros fueron reconocidos colectivamente por 19 (90 de esos sujetos, con 8-12 (38-60%) respondedores por cada 20 meros. El análisis de cuatro sujetos de la cohorte original utilizada para la generación de TCL, confirmó que también tenían linfocitos T específicos de otros 20 meros, además de los reconocidas por su TCL (Tabla 1, panel inferior). En general, un reconocimiento de los linfocitos T del panel seleccionado de nueve 20 meros, se confirmó en 35 (90%) de los 39 sujetos analizados.

Cartografiado de epítopos centrales de linfocitos T dentro de péptidos de 20 meros de Ara h 1 seleccionados

Los péptidos de longitud mínima reducen el riesgo de entrecruzamiento de IgE unida a células con células inflamatorias durante la administración clínica y facilitan la producción terapéutica. La secuencia mínima estimuladora de linfocitos T (epítopo central) dentro de cada 20 mero seleccionado, se determinó sometiendo a ensayo la proliferación de TCL reactivas procedentes de diferentes sujetos para conjuntos de péptidos truncados (por ejemplo, Figura 2 y Tabla 2). El número de residuos necesarios para inducir una proliferación máxima de los linfocitos T variaba de 6 a 19 aa entre diferentes TCL y/o sujetos (Tabla 2), de acuerdo con informes anteriores para epítopos de linfocitos T CD4+ (Hemmer et al. IntImmunol. 2000; 12(3): 375-83 (Hemmer et al. Int Immunol. 2000; 12(3): 375-83; Suri et al. CurrOpin Immunol.

2006; 18(1): 70-7). Debido a una variación en el número de residuos flanqueantes necesarios para el reconocimiento óptimo del epítopo (Suri et al. 2006 supra), se consideró que una TCL reconocía el mismo epítopo si los péptidos que contenían una secuencia central común inducían el reconocimiento. Basándose en ese criterio, se identificaron diez epítopos distintos de linfocitos T CD4+ (“epítopos consolidados”, Tabla 2), con partes centrales comunes que variaban de 5 a 12 aa (secuencias subrayadas, Tabla 2). Se seleccionaron las secuencias de "epítopos consolidados" para incluir los residuos requeridos para una estimulación máxima de todas las TCL específicas sometidas a ensayo, para asegurar el reconocimiento más amplio posible.

Se encontró al menos un epítopo dentro de cada uno de los nueve 20 meros, con los 20 meros 50 y 51, en donde cada uno contenía dos epítopos de linfocitos T distintos pero solapantes: uno único para cada 20 mero ((442-458) y (452-470)), y el otro dentro de la secuencia del solapamiento ((451-461), Tabla 2 y Figura 2). Ninguna TCL respondía a ambos epítopos dentro de ninguno de los 20 meros, lo que confirma aún más la distinción de esos epítopos (datos no mostrados). Algoritmos para una predicción del epítopo del HLA (Singh et al. Bioinformatics, 2001; 17(12): 1236-7; Vita et al. Nucleic Acids Res. 2010; 38 (publicación de la base de datos):D854-62) también destacaban uno o varios motivos fuertes que se unían al HLA de clase II (HLA-II) dentro de cada una de nuestras secuencias de estimulación mínima. Los datos se muestran para Propred (Singh et al. 2001 supra) un algoritmo de la unión a HLA-DR en la Tabla 8. Ese algoritmo no predecía los epítopos de HLA-DR dentro del péptido 40, pero los algoritmos de la base de datos de epítopos inmunes (IEDB) y el recurso de análisis (Vita et al. 2010, supra) predecían que los epítopos dentro de ese péptido se unirán más fuertemente a moléculas del HLA-DP y/o -DQ.

Finalmente, para evitar una duplicación innecesaria de las secuencias y minimizar el número de péptidos para un tratamiento, seis de los epítopos consolidados (que comprendían tres parejas de epítopos solapantes) se combinaron en tres péptidos individuales de 20 aa o menos ((206-225), (409-427) y (451-470); sombreado gris, Tabla 2). Los péptidos de los epítopos combinados estimulaban eficazmente las TCL específicas de cualquiera de los epítopos (datos no mostrados) y junto con los cuatro epítopos consolidados restantes ((353-371), (436-452), (442-458) y (507­ 524)), proporcionaban un panel de siete péptidos candidatos para una caracterización adicional (véanse los asteriscos, Tabla II). El cribado basado en CFSE de nueve sujetos procedentes de nuestras cohortes confirmaba que esos péptidos podían dirigirse cada uno directamente a números detectables de linfocitos T específicos de Ara h 1 entre PBMC completas de sujetos alérgicos al cacahuete (Tabla 9).

Determinación de la especificidad de la restricción del HLA de clase II de los epítopos de linfocitos T de Ara h 1

No existe una asociación identificada del HLA-II con la alergia al cacahuete (Shreffler et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2006; 96(6): 865-9), por lo tanto, los péptidos seleccionados para la terapia deben unirse a diversas moléculas del HLA-II para una aplicabilidad amplia. Para determinar el tipo de HLA-II que presenta cada epítopo, se usaron AcMos anti-HLA-DR, -DP o -DQ para bloquear la presentación de epítopos individuales a los linfocitos T. Para cada TCL sometida a ensayo, el reconocimiento de los epítopos fue evitado por uno o varios AcMos de1HLA de una manera dependiente de la dosis (por ejemplo, Figura 5) y el mismo AcMo bloqueaba el reconocimiento de CPE (datos no mostrados), demostrando una coherencia con la presentación de formas de epítopos procesadas naturalmente y sintéticas. Se sometieron a ensayo al menos dos sujetos y/o una TCL por epítopo (Tabla 3). De acuerdo con las predicciones de los algoritmos del HLA-II descritos anteriormente (Singh et al. 2001 supra; Vitae et al. 2010 supra), el anti-HLA-DR bloqueaba el reconocimiento de todos los epítopos menos uno, (353-371), que estaba bloqueado por el anti-HLA-DQ en ambos sujetos evaluados. Para los epítopos (436-452) y (507-524), el reconocimiento estaba bloqueado por anti-HLA-DR para algunas TCL pero por anti-HLA-DQ para otras, confirmando la degeneración de la unión a HLA para esos epítopos.

Para evaluar la degeneración de la unión a HLA de los epítopos cuyo reconocimiento estaba bloqueado por un solo AcMo del HLA, se compararon los alelos respectivos del HLA de al menos dos sujetos con TCL específicas para ese epítopo (Tabla 5 y Tabla 3). La ausencia de alelos compartidos HLA-DRB1 o HLA-DQB1 entre los sujetos que reconocían epítopos restringidos a HLA-DR o HLA-DQ, respectivamente, confirmaba que cada epítopo se presentaba en al menos dos moléculas de HLA diferentes. Los algoritmos de unión al HLA respaldaron aún más esos datos, en donde cada epítopo contenía motivos previstos para unirse con múltiples moléculas de1HLA ((Singh et al. 2001 supra; Vitae et al. 2010 supra) (por ejemplo, Tabla 8).

Prueba de los péptidos candidatos para la activación de basófilos

Para proporcionar una alternativa segura a los alérgenos completos, los péptidos no deben unirse ni entrecruzarse con IgE unida a una célula. La reactividad de los basófilos frente a los péptidos se evaluó en sangre de nuevo aporte de siete de los sujetos alérgicos al cacahuete reclutados para ese estudio (Tabla 4) (Figura 3). Los siete sujetos mostraban niveles elevados de activación de basófilos con CPE a lo largo de un intervalo de concentración. Mientras que las respuestas a Ara h 1 variaban entre los sujetos con la dosis más baja, la concentración más alta inducía una activación elevada en todos los sujetos. Sin embargo, ninguno de los péptidos candidatos inducía una activación con ninguna de las concentraciones sometidas a ensayo. Un sujeto mostraba una respuesta muy baja (8%) frente al péptido (409-427), pero estaba por debajo del umbral de activación positiva (Boumiza et al. Clin Mol Allergy. 2005; 3:9) y era insignificante en comparación con la activación inducida por Ara h 1 (80-90%) o CPE (74-76%) en ese sujeto.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento se puede someter a variaciones y modificaciones distintas a las descritas específicamente.

Tabla 1. Detección basada en CFSE de la proliferación de linfocitos T CD4+ de donantes alérgicos al cacahuete como respuesta a 20 meros de Ara h 1 seleccionados

n° de respondedor 21/21 11/21 12/21 8/21 8.15 11.15 9/15 1021 11/21 11/21

% de respondedor 100 52 57 33 53 52 60 48 52 52

El panel superior muestra una nueva cohorte de donantes alérgicos al cacahuete; el panel inferior muestra cuatro sujetos procedentes de una cohorte de donantes alérgicos al cacahuete empleada para la generación de TCL. CPE, extracto de cacahuete crudo; ve, positivo; nt, no evaluado (las reservas de péptidos no estaban disponibles en el momento de la evaluación); Gris, índices de estimulación >1,1 <2,5; Negro, índices de estimulación >2,5

* Proliferación de fondo sin antígeno, % de linfocitos T CD4+ CFSElC) del total de los linfocitos T CD4+; A una combinación de Ara h 1 enriquecido y Ara h 1 (10 1.tg/mL de cada uno) se utilizó en lugar de CPE en esos sujetos.

Tabla 2. Secuencias de epítopos centrales de linfocitos T calcografiadas dentro de los 20 meros de Ara h 1 seleccionados

(Respondedores

Iconfirmados

Residuos/ Su-N° de residuos Residuos Secuencia T L etos

_.

Epítopos solapantes combinados

« (352-371) (353-371) W STESSlKN lSm m riKB _(353-371)

359-371 ^{BMMimTOK¥SKE} 19 aa WSTRSSEXyEC-^ TCEVSKe* 3 3

_{Epítopos solapantes combinados}

4 f (433-432) ^(435-445) VBKEGA1ML

_(436449) (436-453} _{VEKEGAIMLPHFX VEIKE6ALMLPHH4SKA* 5 3} (440-452) EGA1MLPHFNSKA

Epitopos solapantes combinados

57 (505-524) (507-5») &D¥íTMPAABM?JLiMA£S

(509-5») VHMPAAHPVAMASS

(510-521) HMM AHPmiM (567-524}: GDW MPlAHW ABIAiS*' O 4 (511-517) láPAAHP _Mas

(511-5:31) IMPAAHPttAlM

El sombreado gris indica parejas de epítopos solapantes consolidados, combinadas en péptidos únicos para análisis posteriores

* Los siete péptidos candidatos propuestos para una terapia

Tabla 3. Restricción de la clase II del HLA de péptidos de epítopos centrales

20- Restricción Alelo(s) del HLA correspondientes

mero Epítopo Sujeto del HLA

nt = no evaluado (TCL no disponible). El sombreado gris indica parejas de epítopos solapantes, combinadas en péptidos únicos para análisis posteriores

Tabla 4. Estadísticas demográficas de los sujetos

TCL, línea de linfocitos T ; CFSE de 20 meros, cribado de la reactividad de los linfocitos T frente a 20 meros de Ara h 1 seleccionados; CFSE central, cribado de la reactividad de los linfocitos T frente a los péptidos candidatos de Ara h 1; BAT, prueba de activación de basófilos; na, datos no disponibles; SPT, prueba de punción cutánea (RAST no disponible para ese sujeto).

Tabla 5. Genotipado del HLA para sujetos utilizados para la generación de líneas de linfocitos T

Todas las abreviaturas del HLA cumplen con los cambios recientes en la nomenclatura de los alelos. (http://hla.alleles.org/announcement.html y http: //www.ebi.ac.uldimqt/h1a/). Alelos seguidos de Iv representan grupos de alelos que comparten secuencias comunes en el exón 2 (http://hla.alleles.orq/alleles/p qroups.html).

Tabla 6. Péptidos de 20 meros de Ara h 1

Tabla 7. Respuestas proliferativas (absorción de timidina) de líneas de linfocitos T frente a péptidos de 20 meros de Ara h 1

N°

TCL, línea de linfocitos T. Solo se muestran los índices de estimulación positivos (SI >2,5). Para sujetos con múltiples TCL específicas para un 20 mero dado, se muestra el SI más alto. Los SIs superiores a 10 se han redondeado al número entero más próximo. Gris oscuro, SI >2,5<5,0; Negro, SI >5,0.

Tabla 8. Motivos de unión a HLA-DR previstos en 20 meros de Ara h 1 seleccionados Los motivos de unión a HLA-DR (sombreado gris) se predijeron utilizando el algoritmo ProPred (http: www.immuneepitope.org; consultado el 30 de enero de 2012). Los residuos de anclajes primarios previstos están en negrita y subrayados. El péptido 40 (352-371) no se muestra ya que ese algoritmo no predijo motivos de unión a HLA-DR para ese péptido.

Tabla 9. Detección basada en CFSE de la proliferación de linfocitos T CD4+ de donantes alérgicos a los cacahuetes como respuesta a péptidos candidatos de Ara h 1

Su­ ^{N° de}

jeto antígeno* 371 427 452 458 470 524 ^{N° %}

N° de respondedor 9/9 5'9 4 /9 6/9 6 /9 4 ’9 5/9 6 '9

% de respondedor 100 Sé 44 67 67 44 56 67

CPE, extracto de cacahuete crudo; ve, positivo; Gris, índices de estimulación >1, 1 <2,5; Negro, índices de estimulación >2,5

* Proliferación de fondo sin antígeno, % de linfocitos T CD4+ CFSElC) del total de los linfocitos T CD4+; A una combinación de Ara h 1 enriquecido y Ara h 1 (10 1.tg/mL de cada uno) se utilizó en lugar de CPE en esos sujetos.

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

2. La composición según la reivindicación 1, que comprende además uno o varios péptidos que comprenden una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en:

(i) FQNLQNHR (SEQ ID NO: 1)

(ii) IVQIEA (SEQ ID NO: 2)

(iii) NEGVIVKVSK (SEQ ID NO: 3)

(iv) FGKLFEVK (SEQ ID NO: 4)

(v) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 5)

(vi) PHFNSKAMVIV (SEQ ID NO: 7)

(vii) IVVVN (SEQ ID NO: 8)

(viii) VVNKGTGNLEL (SEQ ID NO: 9)

(ix) IMPAAHP (SEQ ID NO: 10);

en donde cada uno de los uno o varios péptidos no tiene más de 28 aminoácidos de longitud.

3. La composición según la reivindicación 1 o 2, que comprende además derivados u homólogos funcionales de una o varias de las secuencias mostradas en (i) a (ix) de la reivindicación 2.

4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha composición comprende al menos tres péptidos, al menos cuatro péptidos, al menos cinco péptidos, al menos seis péptidos, al menos siete péptidos, al menos ocho péptidos, al menos nueve péptidos o diez péptidos.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dichos péptidos se seleccionan a partir de la lista:

(i) FQNLQNHRIV (SEQ ID NO: 12)

(ii) RIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 13)

(iii) FQNLQNHRIVQIEAKPNTLV (SEQ ID NO: 14)

(iv) WSTRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 15)

(v) STRSSENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 16)

(vi) ENNEGVIVKVSKE (SEQ ID NO: 17)

(vii) NNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 18)

(viii) SNNFGKLFEVKPDKKNPQ (SEQ ID NO: 19)

(ix) EVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 20)

(x) NNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 21)

(xi) SNNFGKLFEVKPDKKNPQLQ (SEQ ID NO: 22)

(xii) ALMLPHFNSKAMVIVVV (SEQ ID NO: 24)

(xiii) KAMVIVVVNKG (SEQ ID NO: 25)

(xiv) AMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 26)

(xv) VVNKGTGNLELVAVRK (SEQ ID NO: 27)

(xvi) AMVIVVVNKGTGNLELV (SEQ ID NO: 28)

(xvii) KAMVIVVVNKGTGNLELVAV (SEQ ID NO: 29)

(xviii) GDVFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 30)

(xix) VFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 31)

(xx) GDVFIMPAAHPVAINASSE (SEQ ID NO: 32)

(xxi) VFIMPAAHPVAINASS (SEQ ID NO: 33).

6. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).

7. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o la prevención de una afección en un mamífero, en donde la afección está caracterizada por una hipersensibilidad a Ara h 1 o a un derivado u homólogo del mismo.

8. La composición para uso según la reivindicación 7, en donde dicha afección es hipersensibilidad a los cacahuetes o a los frutos secos que contienen Ara h 1 o un derivado u homólogo del mismo, opcionalmente en donde dichos frutos secos son avellanas, almendras o nueces de Brasil.

9. La composición para uso según la reivindicación 7 u 8, en donde dicha composición desensibiliza o induce una tolerancia inmunológica frente a Ara h 1.

10. Un método in vitro de diagnóstico o seguimiento de una afección en un mamífero, en donde la afección está caracterizada por una hipersensibilidad a Ara h 1 o a un derivado u homólogo del mismo, comprendiendo dicho método un cribado de los linfocitos T reactivos con Ara h 1 utilizando el péptido que consiste en VEIKEGALMLPHFNSKA (SEQ ID NO: 23).