CN102816232B

CN102816232B - 花生2s-4b蛋白及其生产方法

Info

Publication number: CN102816232B
Application number: CN201110453668.8A
Authority: CN
Inventors: 宾金华; 何红卫; 张子明; 植智聪; 龙明慧
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2031-12-30
Also published as: CN102816232A

Abstract

本发明公开了花生2s清蛋白组分中2s-4b蛋白及其生产方法。本发明根据本实验室得到的花生2s蛋白双向电泳及2s-4b的MS质谱分析结果，设计一对简并引物，采用RACE的方法克隆出2s-4b基因。构建pET-32a-2s-4b融合表达载体，诱导得到大小约40kDa的2s-4b融合蛋白，对2s-4b融合进行复性、肠激酶酶切得到具有蛋白酶抑制剂活性的2s-4b蛋白。本发明2s-4b蛋白能诱导肺腺癌A549细胞凋亡，并对其凋亡机制进行了研究。具有广阔的应用前景。本发明蛋白的特点是，可在大肠杆菌中高效表达、稳定性好、纯度高且有高活性，适合规模化和产业化。

Description

花生2s-4b蛋白及其生产方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及花生2s-4b蛋白及其生产方法。

背景技术

癌症是目前严重威胁人类健康与生命的“三大杀手”之一，其发生率逐年增高，在2008年，全世界有2500，0000癌症病人，估计有1200，0000癌症新增病例，700，0000人万死于癌症。预计在2030年将有2700，0000癌症病人，1700，0000人死于癌症（World cancer report 2008）。其中超过一半的癌症病例和60％的癌症死亡病例发生在中等达国家。而在所有的癌症中，肺癌的发病率和死亡率都是最高的。非小细胞肺癌（NSCLC）为肺癌的主要类型，占肺癌的75％～80％。手术为其首选的治疗方法。但由于当前肺癌的早期诊断水平有限，70％～80％的患者确诊时已属晚期，总的治愈率不足10％。肺腺癌是肿瘤临床中非小细胞肺癌( NSCLC)常见的类型之一，具有易侵袭、易转移和易产生耐药等特点，因此还亟待寻找更有效的治疗肺腺癌药物（Collins，2005；Kopper，2004）。

胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor，TI）泛指具有胰蛋白酶抑制活性的多肽或蛋白质，广泛存在于动、植物和微生物中，能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡，具有多种生物活性，调节生物体内许多重要的生命活动，而且很多已被开发为新药，是一种重要的生化药物和生化试剂（Maya，1997）。因此，人们对肿瘤相关的胰蛋白酶抑制剂（tumor-associated trypsininhibitor，TATI）在医学上的应用越来越感兴趣。国内外众多的研究表明植物胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤的功能。可能是一种新的抗肿瘤药物。花生蛋白抗肿瘤的作用是近几年才受到人们的关注，相关研究不多，并没有深入研究它对肿瘤的影响及其作用机理。

本实验室段小华（2004）从花生种子中纯化分离出一个具有胰蛋白酶抑制活性的2s清蛋白。经PAGE、HPLC分离，纯化的2s清蛋白含有两条多肽，而经SDS-PAGE分析，此2s清蛋白由5种低分子量的亚基组成。温韵洁（2008）发现2s蛋白各组分对胰蛋白酶均有一定的抑制作用。花生2s蛋白对胰蛋白酶具有抑制作用，此外，还对淀粉酶有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶无抑制作用。对该蛋白进行氨基酸分析发现它富含Cys，属于Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制剂类（BBI）（Tixier，1968；杨晓泉等，1998）。黄叶可（2010）利用双向电泳发现每种亚基并不是由单一蛋白组成。植智聪（2010）对花生种子2s清白中的2s-4b进行基因克隆、原核表达。

有研究表明，花生仁、花生油、花生壳、花生种皮、茎、叶、芽等均有药用价值（周萍等，2008）。但是对花生中的2s清蛋白的药用价值研究较少。

发明内容

本发明的目的是基于实验室研究的基础上，对花生种子2s清蛋白中的2s-4b融合蛋白诱导表达，纯化和复性，以及对2s-4b融合蛋白进行肠激酶酶切制备2s-4b单体蛋白，并对其蛋白酶抑制剂活性进行测定。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种新型抗肿瘤蛋白花生2s-4b蛋白，运用生物信息学手段对2s-4b编码蛋白的结构特点、性质与功能进行分析和预测，得知其开放阅读框（ORF）共含519 bp，包括起始密码子ATG和终止密码子TAA，编码172个氨基酸，分子量为20.1 kDa，等电点为5.96。2s-4b编码蛋白的N端含有一个长约20 个氨基酸的信号肽，具有AAI结构域；其二级结构主要由α-螺旋组成。

上述花生2s-4b蛋白，由2s-4b融合蛋白酶切后得到，不含有载体蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还公开了上述融合蛋白的原核表达载体pET-32a-2s-4b。

本发明还公开了2s-4b蛋白的制备方法包括如下步骤：

1. 2s-4b cDNA的克隆

提取花生总RNA并对RNA的含量和质量进行测定，从花生总RNA合成第一链cDNA 与3'-cDNA。根据本实验室获得的2s蛋白MS-MS结果见图2、表2-1和表2-2，设计2s-4b的简并引物。进行PCR，回收目的条带进行亚克隆和测序，获得2s-4b 基因简并引物片段。根据简并引物所得的测序结果，设计2s-4b 3’-RACE上游引物进行3’-RACE的PCR扩增。根据简并引物所得的测序结果，设计2s-4b 5’-RACE下游引物采用TaKaRa公司5’-Full RACE Kit试剂盒，从花生cDNA中扩增目的基因5’端片段。将3’和5’-RACE测序获得的3’和5’-cDNA末端在DNAMAN6.0上进行序列拼接，获得一条cDNA全长序列。比对该序列与MS结果上的氨基酸位点，确定其为2s-4b基因。

2. pET-32a-2s-4b 原核表达载体的构建

取含有pET-32a空质粒的DH5α菌进行培养，提取质粒。将2s-4b 基因纯化产物和pET-32a质粒进行双酶切，回收纯化酶切产物。然后将2s-4b 基因与pET-32a质粒进行连接，构建成功pET-32a-2s-4b重组质粒。将构建好的重组质粒转化到Rosetta-gami菌株的感受态细胞中。

3. 2s-4b 融合蛋白的诱导表达、纯化及酶切

将含有表达质粒pET-32a-2s-4b的 Rosetta-gami菌进行培养，加入IPTG进行诱导。经SDS-PAGE检测，得到一条分子量40 kDa的目的条带。然后离心收集菌体，用破碎缓冲液进行破碎，离心去上清。将上清稀释后上样至His·Bind Resin Ni-charged亲和层析柱，然后将目的蛋白洗脱。洗脱后的目的蛋白稀释后在复兴缓冲液中进行复性，将复性后的的目的蛋白进行胰蛋白酶抑制剂活性测定。将复性后的2s-4b 融合蛋白浓缩用肠激酶进行酶切，酶切产物上样至His·Bind Resin Ni-charged亲和层析柱纯化，洗脱回收不含载体蛋白的2s-4b蛋白。经SDS-PAGE检测，2s-4b蛋白分子量为20 kDa左右，与软件预测值一致。最后对回收的2s-4b蛋白进行浓缩和胰蛋白酶抑制剂活性测定，期胰蛋白酶抑制剂活性略高于2s-4b 融合蛋白。通过检测，证明所获得的蛋白为具有胰蛋白酶抑制剂活性2s-4b蛋白。

本发明还公开了2s-4b蛋白的抗肿瘤用途。以肺腺癌A549细胞为靶细胞，以不同浓度的2s-4b 蛋白体外处理细胞后，采用MTT检测、形态学观察、流式细胞检测等方法测定2s-4b 蛋白体外诱导肺腺癌A549 细胞的凋亡作用。研究结果表明，2s-4b 蛋白对肺腺癌A549细胞的抑制率可达到90％，早期凋亡率最高可达到37.4％，对肺腺癌A549细胞的抑制效果明显。

本发明还公开了2s-4b蛋白诱导肺腺癌A549细胞的凋亡机制。通过人类全基因芯片对2s-4b蛋白处理后的和未经2s-4b蛋白处理的肺腺癌A549细胞的基因进行分析。人类全基因芯片提供的基因列表共23229个基因共检测到9940个基因，差异表达基因共499个。经过筛选后得出，A549 细胞在2s-4b 蛋白处理前后共有18个与凋亡和细胞周期相关的基因表达发生改变。2s-4b 蛋白处理 A549 细胞后与凋亡相关的差异表达基因有：Apaf-1、Caspase3、Caspase7、Caspase8、Caspase6、IAP、Trailr、TRADD、Endog 等9 个。与细胞周期调控通路相关的差异表达基因有： P21cip1、P57kip2、Skp2、P19ink4d、P18ink4c、CycE、Gadd45、CDK7 、GSK3β等9条。

本发明所用的2s-4b 简并引物扩增序列如SEQ ID NO:2所示；所用的2s-4b 3’RACE 序列如SEQ ID NO:3所示；所用的2s-4b 5’RACE 序列如SEQ ID NO:4所示；2s-4b拼接全长序列如SEQ ID NO:5所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中基因克隆采用的是RACE（Rapid Amplication of cDNA Ends，cDNA末端快速扩增）技术，该技术由已知的部分cDNA序列扩增出完整的cDNA的5’末端和3’末端，是一种简单可靠和有效的方法。利用原核表达体系，通过IPTG诱导实现2s-4b 融合蛋白在大肠杆菌Rosetta-gami中的简单、快速、高效的表达。本发明公开的2s-4b 融合蛋白在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白含量的58％。结合简单的分离纯化步骤易得到纯度85％的2s-4b 融合蛋白。采用透析的方法通过逐渐降低外透液浓度缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构。通过肠激酶酶切可切掉2s-4b 融合蛋白中的载体蛋白，经再次纯化得到2s-4b蛋白片段，排除载体蛋白带来的影响。采用本发明的蛋白序列和表达体系容易制备大量该蛋白，利于产业化生产。

本发明还对该蛋白对肺腺癌A549细胞的抑制作用进行了评价。该蛋白能抑制肺腺癌A549细胞的生长，其 IC50 为150 µg/mL左右。经形态学观察，发现2s-4b蛋白作用A549细胞后可清楚观察到细胞凋亡现象，并且呈现显著量效、时效的依赖关系。经流式细胞仪分析，2s-4b蛋白作用A549细胞后细胞被特异性的阻滞在G1 期，细胞最高早期凋亡率达到37.4％。该蛋白对肺腺癌A549细胞具有较好的抑制效果，可能具有更好的临床应用效果。

附图说明

表1为2s-4b MS分析结果；

表2 为2s-4b MS分析所得的氨基酸片段；

图1为花生总 RNA 的质量分析；

图2~4是2s-4b 简并引物扩增片段、3’序列及5’序列的获得，其中，A为2s-4b简并引物PCR电泳图，B为2s-4b 3’RACE PCR电泳图，C为2s-4b 5’RACE PCR电泳图；

图5为2s-4b拼接2s-4b含酶切位点cDNA PCR电泳图；

图6为pET-32a-2s-4b 重组质粒双酶切，其中，M1：DL2000 DNA Marker；M2：250 bp DNA Ladder Marker；1：pET-32a-2s-4b 重组质粒，2：pET-32a-2s-4b 重组质粒双酶切；3：pET-32a-2s-4b 重组质粒单酶切，4：pET-32a 质粒；5：pET-32a 质粒双酶切，6：pET-32a 质粒单酶切；

图7为2S粗蛋白的2D-SDS-PAGE电泳；

图8为2s-4b 融合蛋诱导表达，其中，M:低分子量蛋白标准，1、2、3：IPTG诱导融合蛋白表达；

图9为包涵体的复性，其中，M：低分子量蛋白标准，1、2、3：复性后的 2s-4b 融合蛋白；

图10为2s-4b融合蛋白复性后蛋白酶抑制剂活性测定；

图11为2s-4b融合蛋白酶切，其中，M低分子量蛋白标准，框中为目的条带；

图12为2s-4b融合蛋白酶切纯化效果检测，其中，M：低分子量蛋白标准，1：2s-4b蛋白，2：2s-4b融合蛋白；

图13为2s-4b 蛋白对肺腺癌细胞的抑制率；

图14为荧光显微镜观察2s-4b蛋白诱导肺腺癌A549细胞；

图15为流式细胞检测2s-4b蛋白处理A549细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例 1 2s-4b cDNA 的克隆

1. 采用本领域常规的Trizol法提取花生总RNA。

2. RT-PCR 检测

3. 从花生总 RNA 合成第一链 cDNA 与3'-cDNA

使用 TaKaRa PrimeScrioptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录合成 cDNA 第一链。反应体系和反应条件参考相关试剂盒说明即可（图1）。

4. 2s-4b 基因简并引物片段的获得

根据本实验室获得的 2s 蛋白 MS-MS 结果，设计 2s-4b 的简并上下游引物如SEQ ID NO:6~7所示。其中 R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，＝A/C/G，D＝A/G/T，N=A/C/G/T。在一个200 μL Eppendorf 薄壁管中配制 60 μL PCR 反应体系。

5. 2s-4b cDNA 3' 端的获得

根据简并引物所得的测序结果，设计 2s-4b 3’- RACE 上游引物如SEQ ID NO:8~9所示。

采用 2s-4b3-1、2s-4b3-2 与试剂盒提供的通用引物 AUAP （如SEQ ID NO:10所示）组合进行 3’-RACE 的 PCR 扩增。

6. 2s-4b 的5’RACE片段的获得

根据简并引物所得的测序结果，设计 2s-4b 5’-RACE 下游引物如SEQ ID NO:11~14所示。

采用 TaKaRa 公司 5’-Full RACE Kit 试剂盒，从花生 cDNA 中扩增目的基因 5’端片段。

7. 2s-4b cDNA 编码区序列的获得

将 3’和 5’-RACE 测序获得的 3’ 和 5’-cDNA 末端在 DNAMAN6.0 上进行序列拼接，获得一条 cDNA 全长序列。比对该序列与 MS 结果上的氨基酸位点，确定其为目的基因。通过分析已经得到的2s-4b 的 cDNA 序列与 pET32a 载体的酶切位点，选择 Nco I 与 Not I 这两个限制性内切酶，设计引物 2s-4b-NcoF（如SEQ ID NO:15所示）和2s-4b-NotR（如SEQ ID NO:16所示）。

实施例 2 pET-32a- 2s-4b 原核表达载体的构建与鉴定

1. 2s-4b 基因 PCR 产物的纯化

使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit 对 2s-4b 的 PCR 产物进行纯化。

2. 2s-4b 基因纯化产物和 pET-32a 质粒的双酶切

3. 酶切产物胶回收纯化

2s-4b 基因酶切产物的纯化使用 TaKaRa DNA 片段纯化试剂盒进行。

4. 2s-4b 基因与 pET-32a 质粒的连接

使用 TaKaRa 公司的 T4 DNA Ligase 进行连接。

5. 大肠杆菌感受态细胞的制备

6. 重组质粒 pET-32a-2s-4b 的转化

7. 重组质粒的检测

通过 PCR 鉴定抗性板上的大肠杆菌中 pET-32a 质粒是否连接了 2s-4b 全长 cDNA 片段。pET-32a-2s-4b 重组质粒的双酶切鉴定。

实施例 3 AtACDO1 同源基因 OsACDO1 反义消减载体和正向过表

1. 2s-4b 融合蛋白的诱导表达

（1）将 pET-32a-2s-4b 重组质粒分别转入大肠杆菌 Rosetta-gami中。

（2）挑单菌落接种于 2 ml 含有四抗的 LB 液体培养基中，37 ℃，200 rpm 培养 12 h。

（3）取 200 µl 初摇菌液于 20 ml 含有四抗的 LB 液体培养基中，37 ℃，200 rpm 培养 4~5 h（测定菌液OD590=0.5~1.9）。

（4）当菌液 OD590 到达 0.5~1.9 时，取出 1 ml 菌液，10,000 × g，室温离心 1 min，弃培养液，加入 100 µl 灭菌的PBS重悬菌体，-20 ℃保存。

（5）向剩余的培养菌液中加入 IPTG 使终浓度达到 0.1 mM和1 mM，在 37 ℃，200 rpm 培养，诱导目的基因的表达。

（6）诱导1 h、2 h、3 h 和 4 h 的时候分别取出 2 ml 菌液（1 ml/管）一管用于测定菌液浓度（OD590），另一管 10,000 × g，室温离心 1 min，弃培养液，加入 100 µl 灭菌的 PBS 重悬菌体，-20 ℃保存。

（7）按 PBS 重悬样品液：灭菌双蒸水：2×SDS 电泳裂解液=1：4：5配制电泳样品液，沸水浴 5min 后，13,000 × g，室温离心 5 min，取上清进行 12.5 % 的 SDS-PAGE 电泳，电泳后胶板进行考马斯亮蓝 R-250 染色，12 %甲醇-8 % 乙酸脱色。

2. 2s-4b 融合蛋白包涵体变性溶解

（1）收集 28 ℃ 0.5 mM IPTG 诱导的培养菌液，4 ℃ 12000 × g 离心 10 min，收集沉淀的菌体。

（2）取 0.1 g 菌体加 10 mL 破碎缓冲液（1×结合缓冲液，8 M 尿素，2 mM DTT，5 mg/ml 溶菌酶，pH 7.9）混匀，在冰上放置 30 min 后，室温放置过夜。

（3）破碎后的菌液用 1 mL 注射器吹打至不粘稠，12000 × g，4 ℃离心 1 min，上清即为包涵体溶解液。

3. 2s-4b 融合蛋白包涵体的纯化

（1）取 1 ml 镍琼脂糖凝胶预装柱，加4倍柱体积的双蒸水洗柱。用 6 倍柱体积的 1×清洗缓冲液洗柱。用 4 倍柱体积的 1×结合缓冲液（含 8 M 尿素）平衡柱子。

（2）取包涵体溶解液 1 ml 以0.5 ml/min 上样，反复上样 1 h。

（3）用 9 倍柱体积的 1×结合缓冲液（含 8 M 尿素）洗去未吸附的样品，流速 0.5 ml/min，2 ml/管收集。

（4）用 6 倍柱体积的 1×洗涤缓冲液（含 8 M 尿素）洗去杂质，流速 0.5 ml/min。用 4 倍柱体积的 1×洗脱缓冲液（分别含 20、50、100、250、500 mM 咪唑，8 M 尿素）梯度洗脱目的蛋白，流速 0.5 ml/min，2 ml/管收集。收集的部分用 12.5% 的 SDS-PAGE电泳检测纯度，并用考玛斯亮蓝法测定纯化蛋白的浓度。

4. 包涵体的复性

参考 Bovine Prethrombin 等（1990）的方法，稍作修改后进行包涵体的复性。

（1）纯化后的融合蛋白稀释至蛋白浓度为 0.025~0.1 mg/mL。

（2）使用尿素梯度浓度透析复性：复性液（100 mM Na₂HPO₄，2 mM EDTA，0.1 mM GSSG，0.2 mM GSH，pH 7.9）含尿素浓度分别为 6 M、4 M、2 M，每个浓度在 4 ℃ 透析 24 h。

（3）最后在 4 ℃透析于 PBS 缓冲液 24 h，中间更换一次 PBS 缓冲液。

（4）复性好的蛋白利用超滤管进行浓缩。

（5）浓缩好的蛋白储存于 -20 ℃ 冰箱，用 12.5％SDS-PAGE 检测蛋白纯度，并用 Bradford 法测定蛋白质的含量。

5. 2s-4b融合蛋白蛋白酶切

将 1 ml 复性、浓缩后的 2s-4b 融合蛋白与 10 µl 重组肠激酶混合，在 25 ℃下酶切过夜。酶切后的蛋白用 His·Bind Resin Ni-charged 亲和层析柱进行纯化，2s-4b 片段上未连有 His 标签将不会与柱子结合，而切下的硫氧还蛋白片段上连有 His 标签会与柱子结合，那么用 PBS 洗脱下来就是 2s-4b 片段。

6. 目的蛋白胰蛋白酶抑制活性的测定

方法参照 Norika 等（1982）和 Raya-Duarte 等（1992）。

（1）取出 0.1 ml 复性后的 2s-4b 重组蛋白，加入 0.1 ml 2.5 mg/ml 的胰蛋白酶液，37 ℃ 水浴 20～30 min。

（2）加入 1 ml 的1 mM的 BAPNA 溶液，37 ℃水浴 10 min。

（3）加入 0.2 ml 的 30％醋酸终止酶反应。

（4） 4 ℃ 放置 30 min。

（5） 4 ℃，10,000 × g 离心 5 min（保证溶液不混浊）

（6）测上清液 410 nm 处光吸收值（A1）

以PBS缓冲液代替胰蛋白酶液作为空白对照；以 PBS 缓冲液代替蛋白样品作为无抑制剂对照，测定光密度值（A2）即：

表1

2s-4b 蛋白对胰蛋白酶的抑制活性单位定义为：（A2－A1）/0.001×10 min。所有测定均设三个重复，取平均值。

注：PBS、胰蛋白酶液和 BAPNA 试剂均用 50 mM Tris-HCl （pH 7.5，含20 mM CaCl₂）缓冲液配置。

实施例 4 2s-4b 蛋白诱导肺腺癌 A549 细胞凋亡

1. 肺腺癌 A549 细胞的培养

肺腺癌细胞 A549 使用含有 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液，在设定为 37 ℃、5 % CO₂ 培养箱内培养。镜下观察细胞生长融合达 70-80 %，准备传代。常规开紫外照射超净台 20 min，同时把含培养基、0.25 % 胰酶、PBS 放置 37 ℃ 度培养箱中孵育。 20 min 后开始传代。先弃掉旧培养液，加 PBS 洗一次，然后加0.25 % 胰酶 2 ml 消化（指 25 cm×25 cm 大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置 37 ℃二氧化碳培养箱中孵育 3 min 左右（新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），加 4 ml 新鲜培养基终止消化。反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中 1000 rpm，1 min，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀，分至 3 个新的培养瓶中，补足培养液。将培养瓶平放，小心移入 37 ℃ 二氧化碳培养箱中培养过夜。次日观察。

2. MTT法测定细胞生长

取处于对数生长期的 A549 细胞，用新鲜的 RPMI-1640 培养基将细胞密度调至 5×10³个/mL，接种于 96 孔板内，100 µl/孔，于 37 ℃，5 % CO₂ 培养箱内培养。贴壁细胞培养 24 h 后用目的蛋白处理。每孔加入样品溶液 5 µl，每一种样品设 5 个浓度，不加药的为对照孔，每个浓度设三个平行孔。细胞加药后继续培养 24 h，然后向细胞液中加入 5 µg/mL 的 MTT 溶液，10 µl/孔，继续于 37 ℃ 5 % CO₂ 的培养箱内培养 4 h 后，吸去上清，每孔加入 100 µl DMSO，37 ℃ 培养约 10 min，待结晶溶解完全后，微量振荡器振荡约 1 min，利用酶标仪在 570 nm 处测每孔溶液的光密度 OD 值。数据处理：利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品三个孔 OD 值的平均值，并用平均值按如下公式计算细胞增殖抑制率（Inhibitory Rate，IR%）。

细胞增殖抑制率 %=（1-药物 OD 值）/对照组 OD 值×100%

3. 细胞形态学观察

（1）将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗 20 遍，再置于无水酒清中浸泡 6 h ，再用三蒸水冲洗 3 遍（将酸冲洗干净，如果未清洗干净，将导致细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

（2）高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。

（3）胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

（4）加细胞时，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。取对数生长期的 A549 细胞按 2×10⁵个/mL 的密度接种。

（5）贴壁细胞培养过夜后，分别加入终浓度为 50 µg/mL、150 µg/mL 和 200 µg/mL 的 2s-4b 蛋白处理 24 h 和 48 h ，同时设空白对照、PBS 对照、BSA 对照。

（6）处理 24 h 后后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。48 h 后再次取样。

4. Annexin V/PI双染色法

（1）取对数生长期的 A549 细胞按 2×10⁵个/ml 的密度将细胞接种于 6 孔板中，每孔 900 µl 细胞悬液，放入培养箱培养细胞过夜。

（2）取出培养板分别加入终浓度为 30、60、90、120 µg/ml 的 2s-4b 蛋白（过滤除菌）300 µl，同时设空白对照、PBS 对照（加入 300 µl 无菌 PBS）。

（3）弃去培养基，然后加 0.25% 胰酶 2 ml 消化5 min，加 1 ml 新鲜培养基终止消化。反复吹打板底上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中 1000 rpm， 1 min，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加入新鲜培养基，吹打均匀，再次离心（1000 rpm， 1 min）。

（4）用结合缓冲液以 1×10⁶/ml 细胞的浓度重悬。

（5）加入荧光染料 4 ℃ 下孵育 20 min，避光并不时振动。

（6）流式细胞仪分析：以标准程序用流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件 ModFit 分析。

实施例 5 2s-4b 蛋白诱导肺腺癌 A549 细胞凋亡机制

1. 用于基因芯片分析的样品准备

（1）取对数生长期的 A549 细胞按 2×10⁵个/mL 的密度将细胞接种于培养瓶中，每瓶 4mL 细胞悬液，放入培养箱培养细胞过夜。

（2）取出培养板分别加入终浓度为 110 µg/ml 的 2s-4b 蛋白（过滤除菌）300 µl，同时设 PBS 对照。

（3）处理 24 h 后用移液器吸去培养基，并加入 3 ml 左右的 PBS 洗一次（需要注意的是从冰箱中取出的 PBS 缓冲液温度要尽量回复到室温，避免给细胞冷的刺激）。

（4）吸去 PBS 后，加入适量的 Trizol 试剂，Trizol 的量按 10 cm² 的面积加 1 ml的 Trizol ，用移液器反复吹打细胞，使细胞充分裂解。

（5）溶解了细胞的 Trizol 在室温静置 10 min 后，转移到 1.5 ml 离心管中，用干冰保存后送样检测。

2. 细胞RNA 的提取

Trizol（Invitrogen, Gaithersburg，MD，USA）一步法提取组织块或细胞中的总RNA ，通过异丙醇沉淀法浓缩 RNA ，并进一步采用NucleoSpin® RNA clean-up 试剂盒（MACHEREY-NAGEL，Germany）对总 RNA 进行过柱纯化，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。

3. 对样品RNA 进行荧光标记

（1）反转录合成 1st-strand cDNA 以 Total RNA 或 mRNA 起始，含有 T7 启动子序列的 T7 Oligo（dT）Primer 为引物，使用 CbcScript 酶合成 1st-strand cDNA。

（2）合成 2nd-strand cDNA 用 RNase H 将杂合链中的 RNA 切成短片段，DNA Polymerase 以 RNA 短片段为引物延伸，合成 2nd-strand cDNA，并纯化双链 cDNA。

（3）体外转录合成 cRNA 以 cDNA 为模板，利用T7 Enzyme Mix 合成cRNA；然后用 RNA Clean-up Kit（MN）纯化。随机引物反转录取 5µg cRNA，用 CbcScript Ⅱ酶，Random Primer 进行反转录，反转录产物用 PCR NucleoSpin Extract II Kit（MN）纯化。

（4） cDNA 用 KLENOW 酶标记取上述反转录产物，以 Random Primer 为引物进行 KLENOW 酶标记，标记产物用 PCR NucleoSpin Extract II Kit （MN）纯化，纯化后抽干。

（5） Cy5-dCTP 、Cy3-dCTP（GE Healthcare Cat. No. PA 55021/ PA53021）。

4. 杂交与清洗

标记的 DNA 溶于 80 µl 杂交液中（3×SSC，0.2%SDS， 5×Denhart’s，25%甲酰胺），于 42 ℃ 杂交过夜。杂交结束后，先在 42 ℃ 左右含 0.2 % SDS，2×SSC 的液体中洗 5 min，而后在 0.2×SSC（saline sodium citrate）中室温洗 5 min。玻片甩干后即可用于扫描。

5. 芯片扫描

芯片用 LuxScan 10 KA 双通道激光扫描仪（CapitalBio 公司）进行扫描。

6. 芯片图像的采集与数据分析

（1）采用 LuxScan 3.0 图像分析软件（CapitalBio 公司）对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；

（2）片间校正：根据 cy5 和 cy3 总体信号的 global mean 对各芯片进行片间线性校正，使得各张芯片的 global mean 相同；

（3）片内归一化：Lowess 方法（Yang， 2002）归一化；线性归一化。

（4）根据信号强度和图像质量对基因进行标记

S：饱和点，信号值>60000

B：坏点

E：表达基因，信号值 >1500（单张芯片），信号值 >800（荧光交换芯片）

M：临界表达基因，1500> 信号值>800（单张芯片），800> 信号值 >400（荧光交换芯片）

（5）表达基因筛选：删除了荧光信号弱的基因（保留 IV 为 E 或 M 的数据）以及芯片上的阴性对照、内标、外标等冗余的数据；

（6）差异表达基因筛选

单张芯片，以 2 倍或 1.5 倍标准筛选差异表达基因。荧光交换芯片，首先进行 ratio 值整合，ratio=（ratio1*ratio2）0.5，再以 2 倍或 1.5 倍标准筛选差异表达基因。每个基因有三个以上重复 ratio，即用 SAM 软件进行分析（Tusher 等，2001），FDR 控制在 5 % 以内，再以 2 倍或 1.5 倍标准筛选差异表达基因。

（7）数据整理

all data：在此组样品中芯片检测的所有信号，包括表达有变化及没有变化的基因，其中：

Ratio 值为：lowess归一化以后的结果；

checked genes：检测到的有效基因；

differentially expressed genes：差异表达基因。

实验结果数据如图5~15所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南师范大学

<120> 花生2s-4b蛋白及其生产方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 172

<212> PRT

<213> 花生2s-4b蛋白氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Lys Leu Thr Ile Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala His Ala Ser Ala Arg Gln Gln Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg

20 25 30

Cys Gln Ser Gln Leu Glu Arg Ala Asn Leu Arg Pro Cys Glu Gln His

35 40 45

Leu Met Gln Lys Ile Gln Arg Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Arg Asp Pro

50 55 60

Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Asp Arg

65 70 75 80

Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Pro Tyr Asp Arg Arg Gly Ala Gly Ser

85 90 95

Ser Gln His Gln Glu Arg Cys Cys Asn Glu Leu Asn Glu Phe Glu Asn

100 105 110

Asn Gln Arg Cys Met Cys Glu Ala Leu Gln Gln Ile Met Glu Asn Gln

115 120 125

Ser Asp Arg Leu Gln Gly Arg Gln Gln Glu Gln Gln Phe Lys Arg Glu

130 135 140

Leu Arg Asn Leu Pro Gln Gln Cys Gly Leu Arg Ala Pro Gln Arg Cys

145 150 155 160

Asp Leu Asp Val Glu Ser Gly Gly Arg Asp Arg Tyr

165 170

<210> 2

<211> 299

<212> DNA

<213> 2s-4b 简并引物扩增序列

<400> 2

attccttgtg agcagcattt tatgcagaag atccaacgtg acgaggattc atatgaacgg 60

gacccgtaca gccctagtca ggatccgtac agccctagtc catatgatcg gagaggcgct 120

ggatcctctc agcaccaaga gaggtgttgc aatgagctga acgagtttga gaacaaccaa 180

aggtgcatgt gcgaggcatt gcaacagatc atggagaacc agagcgatag gttgcagggg 240

aggcaacagg agcaacagtt caagagggag ctcaggaacc taccccaaca atgcggaat 299

<210> 3

<211> 291

<212> DNA

<213> 2s-4b 3'RACE 序列

<400> 3

atttctcagc accaagagag gtgttgcaat gagctgaacg agtttgagaa caaccaaagg 60

tgcatgtgcg aggcattgca acagatcatg gagaaccaga gcgataggtt gcaggggagg 120

caacaggagc aacagttcaa gagggagctc aggaacttgc ctcaacagtg cggccttagg 180

gcaccacagc gttgcgactt ggacgtcgaa agtggcggca gagacagata ctaaacacct 240

atctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tcgatgtcga ctcgagtcaa t 291

<210> 4

<211> 388

<212> DNA

<213> 2s-4b 5'RACE 序列

<400> 4

attcgcggat ccacagccta ctgatgatca gtcgatggaa aacactcttc aatacacatt 60

ccataaccac cacaacaaca atggccaagc tcaccatact agtagccctc gcccttttcc 120

tcctcgctgc ccacgcatct gcgaggcagc agtgggaact acaaggagac agaagatgcc 180

agagccagct cgagagggcg aaccttaggc cctgcgagca acatctcatg cagaaaatcc 240

aacgtgacga ggattcatat ggacgggacc cgtacagccc tagtcaggat ccgtacagcc 300

ctagtcagga cccggacaga cgtgatccgt acagccctag tccatatgat cggagaggcg 360

ctggatcctc tcagcaccaa gagagaat 388

<210> 5

<211> 650

<212> DNA

<213> 2s-4b拼接全长

<400> 5

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatggaaaac actcttcaat acacattcca 60

taaccaccac aacaacaatg gccaagctca ccatactagt agccctcgcc cttttcctcc 120

tcgctgccca cgcatctgcg aggcagcagt gggaactaca aggagacaga agatgccaga 180

gccagctcga gagggcgaac cttaggccct gcgagcaaca tctcatgcag aaaatccaac 240

gtgacgagga ttcatatgga cgggacccgt acagccctag tcaggatccg tacagcccta 300

gtcaggaccc ggacagacgt gatccgtaca gccctagtcc atatgatcgg agaggcgctg 360

gatcctctca gcaccaagag aggtgttgca atgagctgaa cgagtttgag aacaaccaaa 420

ggtgcatgtg cgaggcattg caacagatca tggagaacca gagcgatagg ttgcagggga 480

ggcaacagga gcaacagttc aagagggagc tcaggaactt gcctcaacag tgcggcctta 540

gggcaccaca gcgttgcgac ttggacgtcg aaagtggcgg cagagacaga tactaaacac 600

ctatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatcgatgtc gactcgagtc 650

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 2s-4b 简并上游引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

ccntgygarc arcayytnat gc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 2s-4b 简并下游引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

ccrcaytgyt gnggnarrtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 2s-4b 3'- RACE 上游引物（一扩）

<400> 8

gatccaacgt gacgaggatt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 2s-4b 3'- RACE 上游引物（二扩）

<400> 9

tctcagcacc aagagaggtg tt 22

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> AUAP

<400> 10

cgatgtcgac tcgagtc 17

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 2s-4b 5'-RACE 下游引物（一扩）

<400> 11

gaggcaacag gagcaacag 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 2s-4b 5'-RACE 下游引物（二扩）

<400> 12

gatcctctca gcaccaagag ag 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 5' RACE Outer Primer

<400> 13

catggctaca tgctgacagc cta 23

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 5' RACE Inner Primer

<400> 14

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg 34

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 2s-4b-NcoF

<400> 15

catgccatgg caatggccaa gctcac 26

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 2s-4b-NotR

<400> 16

gcagagacag atactaaacg cggccgctaa actat 35

Claims

1.花生2s-4b蛋白在制备抗肺腺癌药物中的应用，其特征在于，花生2s-4b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。