CN103675164B - 分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法 - Google Patents
分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103675164B CN103675164B CN201310677352.6A CN201310677352A CN103675164B CN 103675164 B CN103675164 B CN 103675164B CN 201310677352 A CN201310677352 A CN 201310677352A CN 103675164 B CN103675164 B CN 103675164B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- affinity column
- estrogens
- estrogen receptor
- low
- binding buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法,包括如下步骤:步骤1:制备重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,具体步骤如下:1-1)基因工程菌M3中重组受体蛋白的表达;1-2)Ni-NTA亲和层析柱的活化;1-3)雌激素受体蛋白募集;步骤2:通过亲和层析法分离待测混合样品中的雌激素,具体步骤如下:2-1)混合样品浓缩;2-2)将该浓缩液加入到结合缓冲液中得到含待测样品的结合缓冲液,加入的浓缩液的量以不产生沉淀为前提;2-3)亲和分离该含待测样品的结合缓冲液中的雌激素类内分泌干扰物;步骤3:对洗脱液中的雌激素类物质进行色谱检测。
Description
技术领域
本发明属于水中有毒有害污染物分析技术领域,具体涉及一种分离检测环境中潜在的雌激素类内分泌干扰物的方法。
背景技术
近些年来,环境中存在的内分泌干扰物对公共健康和野生生态系统造成的巨大的安全隐患已经引起了广泛关注,其中雌激素类内分泌干扰物具有雌激素效应,是目前发现的种类最多、危害最大的一类内分泌干扰物。环境中的雌激素类内分泌干扰物在进入到人和野生动物体内后,会导致内分泌系统、生殖系统、免疫系统以及神经系统在内的多个系统紊乱,造成生殖障碍、个体发育畸形甚至可能造成生态系统中部分物种灭绝。研究表明环境中的雌激素类内分泌干扰物主要来自于化工产品及其产物中间体和生活过程中产生的废物,如壬基酚、辛基酚、双酚A和邻苯二甲酸酯等。目前常规的水处理工艺无法有效地去除这些内分泌干扰物,而且在水处理过程中还会产生许多新兴的雌激素类内分泌干扰物。因此,新兴的雌激素类内分泌干扰物的分离检测对于今后这类污染物的研究和控制都是很有必要的。
检测水中的雌激素类内分泌干扰物的关键在于实现污染物的分离,液相色谱是目前最常用的方法。比如通过液相色谱对污水中所有污染物进行分离纯化,再通过生物检测方法对分离后样品进行雌激素效应的检测。因为污水中的污染物种类繁多且仅有极少的一部分会产生雌激素效应,逐一地分离检测其中的每个污染物不仅工作量巨大而且效率低下。
发明内容
有鉴于此,确有必要提供一种更高效分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法。
一种分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,包括如下步骤:
步骤1:制备重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,具体步骤如下:
1-1)基因工程菌M3中重组受体蛋白的表达:在含有150g/L的蔗糖和50 mg/L的卡那霉素的LB培养基中接入活化后的M3菌种,37 ℃震荡培养至吸光值OD600=0.9-1.0,光程=1 cm,3小时内降温至15 ℃,加入诱导剂0.5毫摩尔每升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养16小时,离心收集菌体;
1-2)Ni-NTA亲和层析柱的活化:提供Ni-NTA亲和层析柱,分别以1 mL高纯水1次、1 mL 0.1摩尔每升硫酸镍溶液1次、1 mL高纯水1次和连续3次1 mL平衡缓冲液作为清洗液依次冲洗该Ni-NTA亲和层析柱,该亲和层析柱中的Ni-NTA柱材为10 μL-20μL;
1-3)使用活化后的Ni-NTA亲和层析柱募集雌激素受体蛋白:以平衡缓冲液重悬步骤1-1)收集到的菌体;低温超声破碎所述菌体的细胞壁;低温离心收集上清液;将1mL该上清液与活化后的Ni-NTA亲和层析柱低温混合孵育2小时,并以平衡缓冲液每次1mL,冲洗3次该低温混合孵育后的Ni-NTA亲和层析柱,即制得所述重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱;
步骤2:通过亲和层析法分离待测混合样品中的雌激素类内分泌干扰物,具体步骤如下:
2-1)混合样品浓缩:以0.22 μm滤膜过滤待检测的水样,调节水样pH值到2-3,使用固相萃取技术将该水样中的非极性有机组分分离并溶解在有机溶剂中,得到浓缩液,该浓缩液中非极性有机组分浓度比在原待测水样中扩大1000-5000倍;
2-2)将该浓缩液加入到结合缓冲液中得到含待测样品的结合缓冲液,加入的浓缩液的量以不产生沉淀为前提;
2-3)亲和分离该含待测样品的结合缓冲液中的雌激素类内分泌干扰物:将该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱与1mL含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育不少于12小时,以平衡缓冲液冲洗每次1mL,冲洗3次该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,加入洗脱缓冲液,对该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱进行洗脱,得到洗脱液;
步骤3:对分离的雌激素类内分泌干扰物进行色谱检测。
相较于现有技术,本发明的有益效果在于建立了一种针对性地分离检测环境中雌激素的方法,通过该重组人I型雌激素受体蛋白亲和柱可以先将所有能够与该雌激素受体结合的组分从待测的混合组份中分离出来,再将分离出的组分进行色谱检测,解决了混合样品中成分复杂导致纯化分离困难的难题,同时提高了检测效率。操作中所用设备、药品均为实验室常用,简单易得,能够应用于对环境样品中雌激素类内分泌干扰物的分离检测。
附图说明
图1是待测雌二醇的液相色谱。
图2是雌激素受体蛋白亲和层析柱对图1的雌二醇的亲和回收结果。
图3是雌激素受体蛋白亲和层析柱对双酚A的亲和回收结果。
图4是雌激素受体蛋白亲和层析柱对双酚A氯消毒副产物的亲和回收结果。
图5为采用无雌激素受体蛋白的亲和层析柱对双酚A氯消毒副产物的分离回收结果。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明提供的分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法作进一步的详细说明。
本发明实施例提供一种利用亲和层析法分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,包括如下步骤:
步骤1:制备重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,具体步骤如下:
1-1)基因工程菌M3中重组受体蛋白的表达:把活化后的M3菌种接入含有蔗糖和卡那霉素的LB培养基(2)(LB培养基(2)中含有150 g/L的蔗糖和50 mg/L的卡那霉素)中,接入的M3菌种与该LB培养基(2)的体积比可以为3:20,37 ℃震荡培养至吸光值OD600=0.9-1.0(光程=1 cm),3h匀速降温至15 ℃,加入诱导剂0.5毫摩尔每升(mM) 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)继续培养16 h,离心收集菌体,-20 ℃冻存;M3菌种的活化具体可以是将M3菌种的单克隆接种到含有卡那霉素的LB培养基(1)中(LB培养基(1)中含有50 mg/L的卡那霉素)37 ℃震荡培养过夜(不少于12小时(h))至吸光值OD600=2.4-2.7(光程=1 cm)。
1-2)Ni-NTA亲和层析柱的活化:提供Ni-NTA亲和层析柱,分别以1 mL高纯水1次(杂质的含量小于0.1mg/L)、1 mL 0.1摩尔每升(M) NiSO4溶液1次、1 mL高纯水1次和连续3次1 mL平衡缓冲液作为清洗液依次冲洗该Ni-NTA亲和层析柱材,该亲和层析柱中的Ni-NTA柱材为10μL-20μL;每次冲洗的具体过程为在Ni-NTA亲和层析柱中加入清洗液,充分重悬Ni-NTA柱材,在低温条件下以1000rpm-3000rpm水平转子离心大于1分钟,去除上清液。
1-3)使用活化后的Ni-NTA亲和层析柱募集雌激素受体蛋白:以平衡缓冲液重悬步骤1-1)收集到的菌体(每1 g菌体10 mL平衡缓冲液),在低温下超声破碎菌体细胞壁,低温离心收集上清液,将1mL该上清液与该活化后的Ni-NTA亲和层析柱低温混合孵育2 h,离心去除上清液,并以平衡缓冲液每次1mL,冲洗3次该低温混合孵育后的Ni-NTA亲和层析柱,即制得所述重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱;低温超声破碎菌体细胞壁所用的超声细胞破碎仪超声功率为10W-15W,超声为间隔进行,即每超声1-2秒后休息2-4秒(例如每超声2秒后休息2秒),超声时间与休息时间之和为5分钟-10分钟,超声可在冰浴条件下进行,从而实现低温超声。
1-4)检测该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱的结合活性:配制1 mL含已知含量的已知种类雌激素(如雌二醇)的结合缓冲液(例如该雌二醇的浓度为1 mg/L)与该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱低温混合孵育过夜(不少于12 h),以平衡缓冲液每次1mL,冲洗3次该与含雌二醇的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,加入洗脱缓冲液洗脱,该洗脱缓冲液为可以造成蛋白质变性,且对有机物,尤其是非极性有机物具有较好溶解性,且具有良好挥发性的溶剂(如100μL甲醇、乙醇或丙酮(色谱纯)),通过高效液相色谱-PDA检测器检测该重组人I型雌激素受体蛋白亲和柱对于雌二醇的回收量,与亲和分离前该雌二醇用量的比值即为回收效率,当回收效率大于75%时视为合格;该步骤1-4)为可选择步骤,用于确定该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱的回收效果是否合格。该回收量为该洗脱步骤所得的洗脱液中雌激素的含量,可通过色谱检测确定。
步骤2:通过亲和层析法分离待测混合样品中的雌激素类内分泌干扰物,具体步骤如下:
2-1)混合样品浓缩:以0.22 μm滤膜过滤待检测的水样,调节水样pH值到2-3,将该水样中的非极性有机组分分离并溶解在有机溶剂(如甲醇)中,得到浓缩液,该浓缩液中非极性有机组分浓度比在原待测水样中扩大1000-5000倍。该分离水样中非极性有机组分可通过现有的常用技术完成,例如使用HLB固相萃取柱(waters公司生产)从待测水样中分离该非极性有机组分。
2-2)将该浓缩液加入到结合缓冲液中得到含待测样品的结合缓冲液,加入的浓缩液的量以不产生沉淀为前提;一般地,加入后非极性有机组分浓度比在原待测水样中扩大20-100倍。
2-3)亲和分离该含待测样品的结合缓冲液中的雌激素类内分泌干扰物:将该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱与1mL含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育过夜(不少于12 h),以平衡缓冲液每次1mL,冲洗3次该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,加入100μL洗脱缓冲液,对该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱进行洗脱,得到洗脱液,洗脱液中含有从该非极性有机组分中分离出的一种或多种雌激素类内分泌干扰物;该洗脱缓冲液为可以造成蛋白质变性,且对有机物,尤其是非极性有机物具有较好溶解性,且具有良好挥发性的溶剂(如甲醇、乙醇或丙酮(色谱纯))。
步骤3:对分离到的雌激素类内分泌干扰物进行色谱检测:具体可以通过高效液相色谱-PDA检测器检测洗脱液中的雌激素类内分泌干扰物。
所述M3菌种为发明人通过分子生物学技术人工构建重组雌激素受体蛋白配体结合结构域(LBD)的基因工程表达菌,以表达菌种名(质粒名–抗性基因名–启动子–限制性内切酶1–蛋白序列–限制性内切酶2)的格式表示为:E.coli BL21 DE3(pET28a(-)–Kan–T7–(EcoRI )–M3–(XhoI)),其中E.coil BL21 DE3为一种现有的大肠杆菌,pET28a(-)为一种现有的质粒,M3是将人I型雌激素受体蛋白配体结合结构域亚单位蛋白(氨基酸序列第302到552个),即hERα-LBD302-552中的第381, 417, 530位的3个半胱氨酸突变为丝氨酸。该M3菌种可通过以下方法获得:使用化学转化的方法将1 ng所述质粒导入到50 μL感受态的E.coli BL21 DE3细胞中,在1 mL LB培养基中37℃震荡孵育45分钟后,10000 rpm离心30秒收集菌体细胞,涂布在含有50 mg/L的卡那霉素的LB平板上,37℃避光倒置培养14小时,获得单克隆。由于转化获得的菌种在保存过程中可能发生变异,因而优选采用-20℃保存质粒并在使用前制备M3菌种的方法。
本方法中所谓“低温”均为0℃~8℃,优选为4℃。
所述平衡缓冲液的组成为:Tris-HCl 20 mM、NaCl 300 mM、咪唑 40mM、表面活性剂NP-40 0.1%(体积百分比)、苯甲基磺酰氟(PMSF) 1 mM、 巯基乙醇5μM,平衡缓冲液的pH=7.5。
所述结合缓冲液的组成为:Tris-HCl 20 mM、 NaCl 300 mM、甘油20%(体积百分比),结合缓冲液的pH=7.5。
本发明的有益效果在于建立了一种针对性地分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法,通过该重组人I型雌激素受体蛋白亲和柱可以先将所有能够与雌激素受体结合的组分从待测的混合组份中分离出来,再将分离出的一种或几种组分进行色谱检测,解决了混合样品中成分复杂导致纯化分离困难的难题,同时提高了检测效率。操作中所用设备、药品均为实验室常用,简单易得,能够应用于对环境样品中雌激素类内分泌干扰物的分离检测。
下面结合附图和具体实例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例为一种分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法,包括如下步骤:
步骤1:检测亲和柱的结合活性,具体方法入下:
在20 mL LB培养基(内含150g/L的蔗糖和50 mg/L的卡那霉素)中接入3 mL活化后的M3菌种,37 ℃震荡培养至OD600=0.9-1.0(光程=1 cm),3 h内缓慢降温至15 ℃,加入诱导剂0.5mM IPTG继续培养16 h,分两份离心收集菌体,-20℃冻存。取其中一份以1 mL平衡缓冲液重悬菌体,超声破碎细菌细胞壁(冰浴),低温离心收集上清液,与活化后的Ni-NTA亲和柱低温混合孵育2 h,再以3 mL的平衡缓冲液冲洗。配制1 mL雌二醇的结合缓冲液(1 mg/L)与亲和柱低温混合孵育过夜(不少于12 h),以3 mL的平衡缓冲液冲洗,加入100μL甲醇(色谱纯)洗脱样品,通过高效液相色谱联合PDA检测器在雌二醇的特征吸收峰280nm处检测,液相色谱柱C18柱(4.6mm,250mm,5μm),流动相为甲醇:水=80:20,雌二醇的保留时间为10.98分钟。回收前雌二醇的量如图1所示,利用本实施例制备的亲和柱回收到的雌二醇的量如图2所示,其与亲和分离前雌二醇的量的比值即为回收效率,如表1所示。
表1,利用亲和柱分离回收雌二醇的实验结果
亲和后 | 亲和前 | 回收效率(%) | |
峰面积 | 329133 | 367799 | 89.49 |
利用高效液相色谱方法对亲和柱分离回收到的雌二醇进行定量,雌激素受体蛋白亲和柱对雌二醇的回收效率达到了89.49%,符合使用要求。
步骤2:对含有双酚A标准品的水样,雌激素受体蛋白亲和柱分离检测双酚A,具体步骤如下:
将步骤1中另一份菌体如同步骤1中所述制备雌激素受体的亲和柱。将含有双酚A的水样用0.22 μm滤膜过滤水样,调节其pH值到2-3,用HLB固相萃取柱浓缩样品,用甲醇重新溶解后,加入到结合缓冲液中,与募集了雌激素受体的亲和柱混合孵育12 h,以3 个1mL的平衡缓冲液冲洗,加入100μL甲醇(色谱纯)洗脱样品,通过高效液相色谱联合PDA检测器在双酚A的特征吸收峰280nm处检测,液相色谱柱C18柱(4.6mm,250mm,5μm),流动相为甲醇:水=80:20,双酚A的保留时间为8.72分钟。亲和柱对双酚A的回收量如图3所示。本方法适用于对混合样品中标准雌激素的分离检测。
实施例2
本实施例为一种分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法,包括如下步骤:
步骤1:检测亲和柱的结合活性,同实施例1以雌二醇回收量,计算亲和柱的回收效率。
步骤2:对含有双酚A标准品氯消毒后的水样,雌激素受体蛋白亲和柱分离检测双酚A,具体步骤如下:
当步骤1中检测亲和柱对雌二醇的回收效率大于75%时,将步骤1中另一份菌体如同步骤1中所述制备雌激素受体的亲和柱。将含有双酚A氯消毒后的水样用0.22 μm滤膜过滤水样,调节其pH值到2-3,用HLB固相萃取柱浓缩样品,用甲醇重新溶解后,加入到结合缓冲液中,与募集了雌激素受体的亲和柱混合孵育12 h,以3个1 mL的平衡缓冲液冲洗,加入100μL甲醇(色谱纯)洗脱样品,通过高效液相色谱联合PDA检测器在双酚A的特征吸收峰280nm处检测,液相色谱柱C18柱(4.6mm,250mm,5μm),流动相为甲醇和水的阶梯浓度,其中0-5 分钟为55%甲醇, 5-25分钟从55%甲醇线性变化到70%甲醇,25-35 分钟为70%甲醇,35-55分钟从70%甲醇线性变化到100%甲醇,以及55-70分钟为100% 甲醇。亲和柱对双酚A氯消毒副产物的回收情况如图4所示。本方法分离得到了双酚A氯消毒后混合物中4个可以与雌激素受体特异性结合的组分,经质谱和雌激素活性生物检测后证实分别为双酚A、一氯代双酚A(图中product I)、二氯代双酚A(图中product II)和三氯代双酚A(图中product III),都具有生物活性的雌激素效应。
另外,还采用无雌激素受体蛋白的Ni-NTA亲和层析柱对双酚A氯消毒副产物进行分离回收,结果如图5所示,可以看到当亲和柱上无雌激素受体受体蛋白时,没有特异性组分被回收。
本方法适用于对混合样品中雌激素活性消毒副产物的分离检测。
另外,本领域技术人员还可在本发明精神内做其他变化,当然,这些依据本发明精神所做的变化,都应包含在本发明所要求保护的范围之内。
Claims (9)
1.一种分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:制备重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,具体步骤如下:
1-1)基因工程菌M3中重组受体蛋白的表达:在含有150g/L的蔗糖和50mg/L的卡那霉素的第二LB培养基中接入活化后的M3菌种,37℃震荡培养至吸光值OD600=0.9-1.0,光程=1cm,3小时内降温至15℃,加入诱导剂0.5毫摩尔每升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养16小时,离心收集菌体;
1-2)Ni-NTA亲和层析柱的活化:提供Ni-NTA亲和层析柱,分别以1mL高纯水1次、1mL 0.1摩尔每升硫酸镍溶液1次、1mL高纯水1次和连续3次1mL平衡缓冲液作为清洗液依次冲洗该Ni-NTA亲和层析柱,该亲和层析柱中的Ni-NTA柱材为10μL-20μL;
1-3)使用活化后的Ni-NTA亲和层析柱募集雌激素受体蛋白:以平衡缓冲液重悬步骤1-1)收集到的菌体;低温超声破碎所述菌体的细胞壁;低温离心收集上清液;将1mL该上清液与活化后的Ni-NTA亲和层析柱低温混合孵育2小时,并以平衡缓冲液每次1mL,冲洗3次该低温混合孵育后的Ni-NTA亲和层析柱,即制得所述重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱;
步骤2:通过亲和层析法分离待测混合样品中的雌激素类内分泌干扰物,具体步骤如下:
2-1)混合样品浓缩:以0.22μm滤膜过滤待检测的水样,调节水样pH值到2-3,将该水样中的非极性有机组分分离并溶解在有机溶剂中,得到浓缩液,该浓缩液中非极性有机组分浓度比在原待测水样中扩大1000-5000倍;
2-2)将该浓缩液加入到结合缓冲液中得到含待测样品的结合缓冲液,加入的浓缩液的量以不产生沉淀为前提;
2-3)亲和分离该含待测样品的结合缓冲液中的雌激素类内分泌干扰物:将该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱与1mL含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育不少于12小时,以平衡缓冲液冲洗每次1mL,冲洗3次该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,加入洗脱缓冲液,对该与含有待测样品的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱进行洗脱,得到洗脱液;
步骤3:对分离的雌激素类内分泌干扰物进行色谱检测。
2.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,进一步包括步骤1-4)检测该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱的结合活性:配制含已知含量的已知种类雌激素的结合缓冲液与该重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱低温混合孵育不少于12小时,以平衡缓冲液冲洗该与含已知浓度的已知种类雌激素的结合缓冲液低温混合孵育的重组人I型雌激素受体蛋白亲和层析柱,加入洗脱缓冲液洗脱,检测该重组人I型雌激素受体蛋白亲和柱对于该已知种类雌激素的回收量,与亲和分离前该已知种类雌激素的已知含量的比值即为回收效率,当回收效率大于75%时视为合格。
3.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,将该M3菌种活化步骤具体是将M3菌种的单克隆接种到含有50mg/L卡那霉素的第一LB培养基中,37℃震荡培养不少于12小时,至吸光值OD600=2.4-2.7,光程=1cm。
4.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,所述M3菌种为:E.coli BL21 DE3(pET28a(-)–Kan–T7–(EcoRI)–M3–(XhoI)),其中M3是将人I型雌激素受体蛋白配体结合结构域亚单位蛋白(氨基酸序列第302到552个),即hERα-LBD302-552中的第381,417,530位的3个半胱氨酸突变为丝氨酸。
5.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,所述平衡缓冲液的组成为:Tris-HCl 20mM、NaCl 300mM、咪唑40mM、NP400.1%、苯甲基磺酰氟1mM、巯基乙醇5μM,pH=7.5。
6.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,所述结合缓冲液的组成为:Tris-HCl 20mM、NaCl 300mM、甘油20%,pH=7.5。
7.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液为甲醇、乙醇或丙酮。
8.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,所述低温超声破碎菌体细胞壁所用的超声细胞破碎仪超声功率为10W-15W,超声为间隔进行,即每超声1-2秒后休息2-4秒,超声时间与休息时间之和为5分钟-10分钟。
9.如权利要求1所述的分离检测雌激素类内分泌干扰物的方法,其特征在于,所述低温超声破碎、低温离心收集及低温混合孵育的温度均为0℃~8℃。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310677352.6A CN103675164B (zh) | 2013-12-13 | 2013-12-13 | 分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310677352.6A CN103675164B (zh) | 2013-12-13 | 2013-12-13 | 分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103675164A CN103675164A (zh) | 2014-03-26 |
CN103675164B true CN103675164B (zh) | 2015-04-15 |
Family
ID=50313359
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310677352.6A Active CN103675164B (zh) | 2013-12-13 | 2013-12-13 | 分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103675164B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107192778B (zh) * | 2017-06-06 | 2020-03-03 | 郭嘉亮 | 一种基于靶蛋白亲和整体色谱柱分离细菌生物膜抑制成分的方法 |
CN109946409B (zh) * | 2019-03-21 | 2022-07-26 | 山东师范大学 | 一种雌激素干扰物固相萃取亲和柱及其制备方法和应用 |
CN112903836B (zh) * | 2021-01-13 | 2023-03-24 | 上海凯宝药业股份有限公司 | 体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102060922A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-05-18 | 北京大学 | 重组人雌激素α受体配体结合域蛋白及其制备和应用 |
CN103033631A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-10 | 中国海洋大学 | 利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒 |
CN103405508A (zh) * | 2013-08-05 | 2013-11-27 | 哈尔滨商业大学 | 肉苁蓉中雌激素活性成分的提取方法 |
-
2013
- 2013-12-13 CN CN201310677352.6A patent/CN103675164B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102060922A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-05-18 | 北京大学 | 重组人雌激素α受体配体结合域蛋白及其制备和应用 |
CN103033631A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-10 | 中国海洋大学 | 利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒 |
CN103405508A (zh) * | 2013-08-05 | 2013-11-27 | 哈尔滨商业大学 | 肉苁蓉中雌激素活性成分的提取方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Endocrine disruptor bisphenol A strongly binds to human estrogen-related receptor γ(ERRγ) with high constitutive activity;Sayaka Takayanagi et al.;《Toxicology Letters》;20060903;95–105 * |
Prediction of toxicity and data exploratory analysis of estrogen-active endocrine disruptors using counter-propagation artificial neural networks;Natasa Stojic et al.;《Journal of Molecular Graphics and Modelling》;20100917;450–460 * |
环境雌激素研究进展;李剑等;《现代预防医学》;20061231;第33卷(第8期);1355-1359 * |
雌激素受体ERβ配体结合区的异源表达与纯化;时国庆等;《北京科技大学学报》;20071231;第29卷;208-211 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103675164A (zh) | 2014-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104312996B (zh) | α‑L‑鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用 | |
JPH0284186A (ja) | プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポリデオキシリボヌクレオチド、それを含むベクター及びそれを含む形質転換体 | |
CN103675164B (zh) | 分离检测环境中雌激素类内分泌干扰物的方法 | |
CN103555729B (zh) | 一种改造的trail基因序列、表达方法及应用 | |
CN106967660A (zh) | 一种生产复苏促进因子的基因工程菌及其应用 | |
CN110950937A (zh) | 一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用 | |
CN102517306B (zh) | 四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用 | |
US10882888B2 (en) | Method for extracting 2′,3′-cyclic nucleoside monophosphates | |
CN103160483B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用 | |
CN106754989B (zh) | 布渣叶黄烷酮-2-羟基化酶及其编码基因与应用 | |
CN104178481A (zh) | 一种30分钟内提取土壤微生物基因组dna的试剂盒 | |
CN104232671A (zh) | 筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法 | |
CN103397006A (zh) | 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶(rdh)及其编码基因与应用 | |
CN105039370A (zh) | 用于生物合成白藜芦醇的融合基因、表达载体及制备方法 | |
CN103966191A (zh) | 一种重组牛源性胰蛋白酶的制备方法 | |
CN102898512B (zh) | 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途 | |
CN114854728A (zh) | 一种脯氨酸消旋酶及其制备和应用 | |
CN103409449A (zh) | 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法 | |
CN109762834B (zh) | 一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法 | |
CN102911955B (zh) | 人工合成人肠激酶基因及其表达纯化方法 | |
CN105112402A (zh) | 一种植物线粒体dna的快速提取方法 | |
CN103146785B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌添加前体物发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺 | |
JPH02273193A (ja) | 組換えインターロイキン―2融合蛋白質類 | |
US10351857B2 (en) | Marine bacterial gene LfliZ and use | |
CN101058805B (zh) | 突变羧肽酶原b及突变羧肽酶b的生产方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |