CN107192778B - 一种基于靶蛋白亲和整体色谱柱分离细菌生物膜抑制成分的方法 - Google Patents

一种基于靶蛋白亲和整体色谱柱分离细菌生物膜抑制成分的方法 Download PDF

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Abstract

一种细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其包括：(1)色谱柱的原位聚合；(2)受体蛋白的原位固定化；(3)受体蛋白亲和整体色谱柱的性能评价；(4)将含有细菌生物膜抑制活性的样品过亲和整体色谱柱；(5)亲和纯化洗脱液中细菌生物膜抑制活性的检测；其中所述受体蛋白为群感系统中与生物膜相关的受体蛋白。所述方法通过检测QSI活性鉴定生物膜抑制成分，不仅操作简单、方向明确，而且能有效减少假阳性产物；对天然药物中抗菌活性成分的分离鉴定有重要意义。

Description

一种基于靶蛋白亲和整体色谱柱分离细菌生物膜抑制成分的 方法
技术领域
本发明属于天然药物分离领域，具体涉及一种基于靶蛋白亲和整体 色谱柱的细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法、以及所述分离鉴定方法 中使用的分离装置。
背景技术
近年研究发现，细菌附着后分泌粘性胞外基质并在其中生长繁殖而形 成的具有高度构造性的复合物，即细菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)，是 导致耐药行为的重要原因。现有抗生素应用不仅不能有效清除BBF，还会 诱导产生耐药性，因而引起了广泛的关注。
深入研究发现，BBF的形成等一系列病原菌的生命活动均依赖于群体 感应(quorum sensing，QS)系统的调控。群体感应抑制剂(QS inhibitor， QSI)有别于传统抗菌药的作用机制，一方面通过抑制该系统相关受体蛋白 来调控其致病行为(包括BBF形成、外毒素和各种侵袭性酶类的合成和 分泌等)，另一方面并不杀灭细菌从而避免了选择性压力导致的耐药，这为 从根本上解决细菌的抗药性问题提供了全新的研究思路。
我国中药和天然药物资源极其丰富，药用植物近万种，为抗菌药物发 现提供了重要的物质来源基础。目前已在植物中分离鉴定了一些有效的 QSI，例如从伞形科植物中发现的法卡林二醇，从补骨脂中分离的补骨脂 素，从佛手中发现的佛手苷内酯等。药用植物源的QSI相此于化学合成抗 菌药物，具有低毒、廉价、不良反应及副作用相对较小、不易产生耐药性 等优势。从天然药物中发掘靶向群感效应的抗菌药效物质，不仅具有切实 的可行性，而且有利于经典中药焕发出新的生命力。
然而，现有从中药中获取QSI的策略和方法都同时存在着严重的瓶 颈。从筛选策略上看，基于中药成分复杂多样的特点，从中获取QSI一般 必需先经过提取分离鉴别得到单体化合物，然后对每一个单体进行药效学 筛选验证。显然，这种“先分离鉴别，后筛选验证”的策略不仅耗时，效率 低，而且费用高昂。同时，由于中药里QSI含量较少，分离纯化困难，导 致大部分仅能停留在粗提物上来考察抑制活性。因此，寻找更多高效的 QSI，有效实现对BBF的抑制作用，成为了目前亟待解决的重要科学问题。
现有技术中最新的QSI筛选方法主要集中于以下三类：(1)天然的活 性指示菌分析筛选法，基于QS系统能够调控细菌某些色素基因的表达， 直观快速地筛选出QSI，虽然适合大量样品的粗筛，方法也简便易行，但 由于样品有可能对菌体的生长有一定的抑制作用，因而不能排除干扰因素 而导致的假阳性结果。(2)QSI选择器(QSI Selector，QSIS)筛选法，通过 自杀基因sacB模型进行定性初筛，再利用luxCDABE，lacZ，gfp等模型进 一步量化，从而避免了假阳性结果的出现，已经成功获得了许多具QSI活 性的合成化合物和天然提取物，但操作复杂，筛选成本高且不适合微量分 析，例如CN105504002A。(3)计算机虚拟筛选法，筛选速度快、成本较 低，有助于提高开发新型药物的效率；但准确性需要进一步考察，仅适用 于初筛阶段。
鉴于现有筛选策略和技术的局限性，严重阻碍了中药QSI的阐明。因 此，寻找其他高效、准确、简便的筛选方法意义重大。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种 方法简单、方向明确、能适应高通量筛选的细菌生物膜抑制成分分离鉴 定方法。
具体而言，本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其特 征在于包括以下步骤：
(1)色谱柱的原位聚合；
(2)受体蛋白的原位固定化；
(3)受体蛋白亲和整体色谱柱的性能评价；
(4)将含有细菌生物膜抑制活性的样品过亲和整体色谱柱；
(5)亲和纯化洗脱液中细菌生物膜抑制活性的检测。
其中，所述受体蛋白为群感系统中与生物膜形成相关的受体蛋白。
所述与生物膜形成相关的受体蛋白包括RhlR、QscR、LasR等，在一 个优选的实施方式方式中所述受体蛋白为LasR。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(1)包括： 将HEMA、交联剂、环己醇、正葵醇和AIBN混合溶液装入1mL玻璃片 中，超声脱气后注入石英毛细管内，两端以硅胶塞封口，60℃下反应12h； 聚合反应结束后，依次用甲醇、水反复冲洗除去未反应物、残留溶剂、低 聚产物，即制备获得poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(2)包括： 将步骤(1)的整体色谱柱活化引入活性伯氨基，将活化的整体色谱柱与受 体蛋白衍生物反应，所述受体蛋白的衍生物包括受体蛋白C端修饰的衍生 物，在一个优选的实施方式中所述受体蛋白衍生物为受体蛋白的N-羟基琥 珀酸亚胺酯衍生物。
优选的，所述整体色谱柱活化的步骤包括：将整体色谱柱基质中的羟 基氧化为醛基、然后与二胺进行缩合反应，引入活性伯氨基。
优选的，所述群感系统中与生物膜相关的受体蛋白的N-羟基琥珀酸亚 胺酯衍生物是通过以下方法制备获得：将群感系统中与生物膜相关的受体 蛋白与碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺反应生成琥珀酰亚胺酯 衍生物。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(3)所述性 能评价包括群感系统中与生物膜相关的受体蛋白固定量的检测、亲和特异 性评价。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(3)中所述 群感系统中与生物膜相关的受体蛋白固定量检测包括：根据步骤(2)中蠕 动泵的流速和群感系统中与生物膜相关的受体蛋白溶液的浓度计算输入至 色谱柱的群感系统中与生物膜相关的受体蛋白总量；收集合并流出的洗脱 液，通过考马斯亮蓝G250在595nm处的吸光值，计算流出色谱柱的群感 系统中与生物膜相关的受体蛋白总量。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(3)中优选 使用(Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮为阳性标准品，验证亲和整体色 谱柱的亲和特异性。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(4)包括： 以植物提取物为样品鉴定对细菌生物膜形成的抑制作用，所述植物提取物 为广金钱草的醇提取物。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其步骤(5)包括： 用制备型HPLC对亲和纯化洗脱液中的细菌生物膜抑制组分进行检测和分 离，收集化合物峰验证其对细菌生物膜形成的抑制率。
本发明所述细菌生物膜抑制成分的分离鉴定方法，其HPLC的条件为： 使用C18色谱柱，以1％甲酸溶液和甲醇溶液为流动相滴度洗脱，DAD检 测器274nm处检测。
第二方面，本发明提供一种用于分离鉴定细菌生物膜抑制成分的装置， 其包括串联的群感系统中与生物膜相关的受体蛋白亲和整体色谱柱、C18 分离柱、二极管阵列检测器、以及可选的ESI-MS/MS。
本发明所述群感系统中与生物膜相关的受体蛋白亲和整体色谱柱通过 以下方法制备，(1)将HEMA、交联剂、环己醇、正葵醇和AIBN混合溶 液装入1mL玻璃片中，超声脱气后注入石英毛细管内，两端以硅胶塞封口， 60℃下反应12h；聚合反应结束后，依次用甲醇、水反复冲洗除去未反应 物、残留溶剂、低聚产物，即制备获得poly(HEMA-co-EDTA)整体色谱柱。(2)将步骤(1)的整体色谱柱活化引入活性伯氨基，将活化的整体色 谱柱与群感系统中与生物膜相关的受体蛋白的N-羟基琥珀酸亚胺酯衍生 物4℃反应过夜。
第三方面，本发明提供用于分离鉴定细菌生物膜抑制成分的装置在分 离鉴定细菌生物膜抑制成分中的用途。
本发明所述装置在分离鉴定细菌生物膜抑制成分中的用途包括，将具有抗 菌活性和/或QSI活性的植物醇提取物上样所说装置，依次过群感系统中与 生物膜相关的受体蛋白亲和整体色谱柱、C18分离柱、二极管阵列检测器、 以及可选的ESI-MS/MS，鉴定分离产物的细菌生物膜抑制成分。
与现有技术相此，本发明的优点在于：
(1)本发明首次公开了一种利用群感系统中与生物膜相关的受体蛋白亲和 整体色谱柱，特别是LasR亲和整体色谱柱，分离鉴定QSI的方法及装置， 通过群感系统中与生物膜相关的受体蛋白AI信号途径筛选细菌生物膜抑 制剂。其方法相对于QSI选择器(QSISelector，QSIS)筛选法操作简单， 技术要求较低；相对于天然的活性指示菌分析筛选法和计算机虚拟筛选法 确定性更好，能有效避免产生大量假阳性结果。
(2)群感系统中与生物膜相关的受体蛋白亲和整体色谱柱，特别是LasR 亲和整体色谱柱，制备简单、耐受酸碱、性质稳定、柱效高、渗透性好、 生物相容性佳等优点，同时表面易于改性适合目标蛋白的固定化；此外， 由于整体柱易于实现毛细管微型化并联用HPLC，样品消耗量较低。
(3)本发明将群感系统中与生物膜相关的受体蛋白亲和整体色谱柱，特别 是LasR亲和整体色谱柱，与HPLC-DAD-ESI-MS/MS串联，能够从粗提 样本中分离出作用于群感系统中与生物膜相关的受体蛋白的QSI候选化合 物作为细菌生物膜抑制剂。另外，实际应用中可以根据需要调节亲和色谱 的条件，如分离到的产物过多，可设置更为严格的亲和条件，以保留与群 感系统中与生物膜相关的受体蛋白亲和力更高的化合物；如分离到的产物 过少或没有得到产物，可设置更为温和的亲和条件，以避免遗漏与群感系 统中与生物膜相关的受体蛋白具有亲和力的细菌生物膜抑制剂。
附图说明
图1整体色谱柱原位聚合的分子反应式
图2poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱的扫描电镜图
A比例尺为50μm
B比例尺为10μm
图3LasR的原位固定化反应示意图
图4LasR亲和整体色谱柱的特异性检测
图5广金钱草提取物中HPLC-DAD分析结果
图6A扫描电镜下观察细菌生物膜的形成情况-广金钱草单体化合物实验组，视野比 例尺10μm
图6B扫描电镜下观察细菌生物膜的形成情况-阴性对照组，视野比例尺10μm
图7原子力显微镜观察菌落的堆积和形成情况
A广金钱草单体化合物实验组
B阴性对照组
图8A广金钱草LasR亲和整体色谱柱洗脱液中8种单体化合物对ATCC27853的生物膜抑制率
图8B广金钱草LasR亲和整体色谱柱洗脱液中8种单体化合物对ATCC9027的生物膜抑制率
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文 中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此 外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱的制备
通过预实验对HEMA、EDMA、环己醇、正葵醇和AIBN聚合反应(图 1)中各组分相对含量与聚合产物性状之间的关系进行优化。通过扫描电镜 对不同组分含量所产生的毛细管柱进行扫描，优选出原位聚合反应的最佳 原料组成为：甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)与乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)此例为55∶45(v/v)；生孔剂占反应混合物的54.35％(vol％)。
将HEMA、EDMA、环己醇、正葵醇和AIBN混合溶液按上述优选 的此例装入1mL玻璃瓶中，超声脱气后灌入合适长度的预处理好的石英 毛细管内，然后两端用硅胶塞封口，60℃下反应12h，聚合反应完毕后， 依次用甲醇、水反复冲洗未反应物、残留溶剂或其他可能低聚物，即制备 得到poly(HEMA-co-EDMA)整体柱，扫描电镜结果表明所产生的poly (HEMA-co-EDMA)整体色谱柱的聚合度适中、孔径大小合适、分布均 匀(图2)。
实施例2：LasR原位固定制备LasR亲和整体色谱柱
将poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱活化引入活性伯氨基，具体方法 包括先用偏高碘酸钠将poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱基质中游离的 羟基氧化为醛基，然后再在Na(CN)BH3的催化下与丁二胺进行醛胺缩合引 入游离的活性伯氨基。
取重组表达纯化的LasR蛋白300μg溶解于1mL 0.01M的PBS缓冲液 中，加入10mg碳化二亚胺(EDC)、15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (sulfo-NHS)，混匀4℃反应2h，生成LasR蛋白的氨基反应性NHS酯。
分子筛除去游离的EDC、sulfo-NHS，将LasR蛋白的氨基反应性NHS 酯衍生物加入带有活性伯氨基的poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱，4℃ 反应过夜。0.01M的PBS缓冲液冲洗至无蛋白流出为止(图3)。测量595nm 吸光度，根据输入蛋白总量和输出蛋白量的差值，计算固定化LasR的量。
实施例3：LasR亲和整体色谱柱的特异性评价
利用现有技术已知的LasR抑制剂对制备的亲和整体柱进行亲和特 异性测试，从而评价该柱的有效性。
使用现有技术已知的群体感抑制剂呋喃酮C31((Z)-4-溴-5-(溴亚甲基) -2(5H)-呋喃酮)为阳性对照，验证LasR亲和整体色谱柱对细菌生物膜抑制 剂的结合和保留能力。结果如图4所示，在6分钟时加入洗脱液1.2min后 出现洗脱峰，表明呋喃酮C31能够特异性结合到LasR亲和整体色谱柱上， 在洗涤步骤中不解离，洗脱步骤中从LasR亲和整体色谱柱上解离。
使用本领域常用的载体蛋白质BSA为阴性对照，验证LasR亲和整体 色谱柱对杂蛋白的非特异性结合能力。加入洗脱液后，未出现任何洗脱峰， 表明BSA不能特异性结合到LasR亲和整体色谱柱上，在洗涤步骤中即流 出色谱柱，洗脱步骤中未产生任何洗脱峰。
实施例4：广金钱草乙醇提取物的抑菌活性和抑制细菌生物膜形成的 能力
根据传统中药材清热解毒的功效以及现代医学中细菌感染的机制，清 热解毒类药材通常具有抗菌消炎的作用。广金钱草具有清热利尿功能，然 而至今尚未能纯化出其中的抗菌活性成分。
将广金钱草用70％乙醇回流提取3h，旋蒸浓缩获得广金钱草乙醇粗提 取物，进行细菌生长抑制实验和生物膜形成抑制实验。
细菌生长抑制实验采用经典的二倍稀释法测定。取13支无菌试管，第 1管加1.8mL营养肉汤，第2～13管每管各加1mL营养肉汤；在无菌操作 条件下，吸取稀释好的药物0.2mL加入到第1管，混匀后吸取1mL入第2 管中，依次倍此稀释至第13管，最后保持其浓度依次是512μg/mL、 256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、 2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。各管均加入供试菌液0.05mL，混匀之后置 于37℃培养24h，在生长对照管的细菌生长状况良好的前提下，以肉眼观 察药物最低浓度管无菌生长者，即为该受试药物的MIC。
细菌生物膜形成抑制实验依照细菌粘附到微量聚氯乙烯96孔板的能 力进行分析。将100μL含有0.2％酪蛋氨酸和甘油加入稀释培养过夜的菌 液(OD600，0.05)，加入到96孔微量板的各孔中。然后每孔加入系列浓度 (1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC)的测试样品。30℃培养20h后， 用蒸馏水洗涤2次、除去浮游生物细胞，然后加入125μL 1％龙胆紫。室温放置15min后，用蒸馏水小心洗涤3次，加入300μL 95％乙醇以溶解染 色的生物膜，对其溶液在630nm的吸光度进行分析。平行测定三次。结果 以生物膜抑制率(％)表示。吸光度值与生物膜的形成程度正相关。
生物膜抑制率(％)＝(OD阴性组-OD样品组)/OD阴性组×100％
抑菌试验结果表明广金钱草乙醇粗提物对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓 度(MIC)为32μg/mL，群体感抑制剂呋喃酮C31对所述铜绿假单胞菌的 MIC为2μg/mL。
细菌生物膜形成抑制实验结果表明广金钱草乙醇粗提物对铜绿假单胞 菌生物膜形成的抑制活性为：吸光度(630nm)为0.073±0.006，抑制率为 80.84％；阳性对照品呋喃酮C31对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制活性 为：吸光度(630nm)为0.053±0.007，抑制率为86.09％。证实了该乙醇提取 物具有QS抑制效果。
实施例5：广金钱草乙醇提取物过LasR亲和整体色谱柱洗脱液的 HPLC-DAD分析结果(图5)
将实施例4中制备的广金钱草乙醇提取物过LasR亲和整体色谱柱， 收集洗脱液，将含蛋白的洗脱级分合并，进行HPLC-DAD色谱分析。
优化后的色谱条件为：以Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm， 5μm particlesize)为色谱柱，1％甲酸溶液和甲醇(含0.1％磷酸)为流动 相梯度洗脱，DAD检测器在274nm处进行检测。
图5所示的HPLC-DAD图谱给出了广金钱草提取液经过LasR亲和整 体色谱柱后洗脱液中的12个单体化合物作为候选生物膜形成抑制剂。
实施例6：广金钱草乙醇提取物过LasR亲和整体色谱柱后候选单体 化合物对细菌生物膜形成的抑制率和生物膜抑制情况
从实施例5所示12个单体化合物中取一个单体化合物，将经培养有细 菌生长的生物膜载体用2.5％戊二醛固定，依次用50％，70％，90％，无 水乙醇梯度脱水，然后用醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，载体表面在 真空条件下镀金粉，电子扫描显微镜观察，确认生物膜形成。
图6A、图6B的结果表明，阴性对照组组细菌聚集、形成大量生物膜； 实验组细菌聚集度低、形成生物膜较少。
将耐药细菌接种于LB培养基中，37℃培养24h，收集菌液，5000r/min离 心5min，用无菌生理盐水洗涤2次。洗后的细菌重新加入生理盐水配成0.5麦 氏此浊度标准(细菌数约为5×108-9CFU/mL)的菌悬液，再加生理盐水稀释50 倍。对照组为MHB培养基，用药组为溶解有活性化合物的MHB培养基，与 药物接触15h。取1mL培养液，离心5min，弃去上清液，将收集的细菌样本 用双蒸水洗涤两次，去除表面浮游细菌，小心滴于盖玻片，待水分自然风干，用原子力显微镜观察成像。
图7的结果表明，阴性对照组由于大量生物膜的形成导致细菌聚集；实 验组则由于生物膜的形成收到了抑制，导致菌体分散。
利用实施例4中所述的方法对8种进行生物膜抑制实验，实验结果如图 8A、图8B所示。
图8A、图8B的结果表明，来自金钱草的8种化合物能够抑制多种细菌 生物膜的形成，且对细菌生物膜形成的抑制作用呈现剂量依赖。
综合上述实施例的内容可知，本发明所建立的基于LasR亲和整体色 谱柱的分离鉴定细菌生物膜抑制成分的方法，适用于天然药物中抗菌活性 成分的分离鉴定，获得对细菌生物膜形成的抑制作用的单体化合物的效率 高、方向明确、具有较好的可预期性。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术 领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或 替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (5)

1.一种利用LasR亲和整体色谱柱分离鉴定细菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)色谱柱的原位聚合，包括：将HEMA、EDMA、环己醇、正葵醇和AIBN混合溶液装入1mL玻璃片中，超声脱气后注入石英毛细管内，两端以硅胶塞封口，60℃下反应12h；聚合反应结束后，依次用甲醇、水反复冲洗除去未反应物、残留溶剂、低聚产物，即制备获得poly(HEMA-co-EDMA)整体色谱柱；
(2)受体蛋白LasR的原位固定化，包括：将步骤(1)的整体色谱柱活化引入活性伯氨基，将活化的整体色谱柱与受体蛋白衍生物反应，所述受体蛋白衍生物包括受体蛋白的N-羟基琥珀酸亚胺酯衍生物；
(3)受体蛋白LasR亲和整体色谱柱的性能评价；
(4)将含有细菌生物膜抑制活性的样品过亲和整体色谱柱；
(5)亲和纯化洗脱液中细菌生物膜抑制活性的检测，用制备型HPLC对亲和纯化洗脱液中的细菌生物膜抑制组分进行检测和分离，收集化合物峰验证其对细菌生物膜形成的抑制率；
所述细菌生物膜抑制成分是作用于生物膜相关的受体蛋白LasR的群体感应抑制剂(QSI)。
2.如权利要求1所述利用LasR亲和整体色谱柱分离鉴定细菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于整体色谱柱活化的步骤包括：将整体色谱柱基质中的羟基氧化为醛基、然后与二胺进行缩合反应，引入活性伯氨基；和/或
受体蛋白的N-羟基琥珀酸亚胺酯衍生物通过以下方法制备：将受体蛋白与碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺反应生成琥珀酰亚胺酯衍生物。
3.如权利要求1所述利用LasR亲和整体色谱柱分离鉴定细菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于步骤(3)所述性能评价包括群感系统中与生物膜相关的受体蛋白固定量的检测、亲和特异性评价；
所述群感系统中与生物膜相关的受体蛋白固定量检测包括：根据步骤(2)中蠕动泵的流速和群感系统中与生物膜相关的受体蛋白蛋白溶液的浓度计算输入至色谱柱的群感系统中与生物膜相关的受体蛋白总量；收集合并流出的洗脱液，通过考马斯亮蓝G250在595nm处的吸光值，计算流出色谱柱的群感系统中与生物膜相关的受体蛋白总量。
4.如权利要求1所述利用LasR亲和整体色谱柱分离鉴定细菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于所述步骤(4)包括：以植物提取物为样品鉴定对细菌生物膜形成的抑制作用，所述植物提取物为广金钱草的醇提取物。
5.如权利要求4所述利用LasR亲和整体色谱柱分离鉴定细菌生物膜抑制成分的方法，其特征在于所述步骤(5)包括使用C18色谱柱，以1％甲酸溶液和甲醇溶液为流动相梯度洗脱，DAD检测器274nm处检测。
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β2-肾上腺素受体亲和色谱及其在苦杏仁活性成分筛选中的应用;郑晓晖等;《科学通报》;20070930;第52卷(第18期);摘要，第1节 *
牛血清白蛋白键合的液相手性整体柱制备及其蛋白柱载量的研究;武苏等;《中国药科大学学报》;20160425;第47卷(第2期);第2.1节，第2.3节 *

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