BR112018008704B1

BR112018008704B1 - Método de preparação e sua aplicação de material de absorção para múltiplos fatores patogênicos da sépsis

Info

Publication number: BR112018008704B1
Application number: BR112018008704-1A
Authority: BR
Inventors: Yue Zheng; Jun Deng; Qingguang Liu
Original assignee: Chongqing Zhengbo Biotechnology Co. Ltd.
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2016-10-27
Publication date: 2022-03-03
Also published as: CN105195114A; AU2016345333B2; AU2016345333A1; EP3369479A4; EP3369479A1; US20190054227A1; CA3003516A1; BR112018008704A2; CN105195114B; CA3003516C; US10898632B2; WO2017071601A1; EP3369479B1; JP6859357B2; JP2019502747A

Abstract

MÉTODO DE PREPARAÇÃO E SUA APLICAÇÃO DE MATERIAL DE ABSORÇÃO PARA MÚLTIPLOS FATORES PATOGÊNICOS DA SÉPSIS. A invenção refere-se a um material de absorção para múltiplos fatores patogênicos da sépsis e seu método de preparação e sua aplicação. O material de absorção é formado por acoplamento de um portador de boas propriedades mecânicas e compatibilidade sanguínea com um ligante capaz de absorver uma pluralidade de moléculas relacionadas com agentes patogénicos. Pode efectivamente absorver endotoxina bacteriana, ADN de CpG, peptidoglicano, LTA, ARN de vírus e zimosan a partir de fluidos tais como sangue e afins, desempenha assim um papel significativo no tratamento de purificação do sangue da sépsis.

Description

CAMPO TÉCNICO

[01] A invenção pertence ao campo ténico dos medicamentos, em particular a um material absorvente para fatores patológicos mútiplos da sépsis e a um seu modo de preparação e sua aplicação na preparação de um dispositivo de tratamento de purificação do sangue da sépsis.

TECNOLOGIA DE FUNDO

[02] Sépsis é uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica mediada por agente infeccioso (systemic inflammatory response syndrome, SIRS). Todos os anos, até 19 milhões de pessoas em todo o mundo terão sépsis e é a principal causa de morte dos pacientes atualmente infectados, e até hoje não há tratamento ideal. Estudos mostraram que o padrão de moléculas associadas a patógenos liberados por bactérias (pathogen-associated molecular pattern, PAMP), vírus, fungos e outros patógenos são os principais fatores patogênicos da sépsis, e atualmente conhecidos PAMP incluem endotoxina (lipopolissacarídeo) de bactérias, CpG de ADN, PGN, LTA, RNA viral do vírus e Zymosan de fungos, etc. Por essa razão, os pesquisadores desenvolveram vários antagonistas, como a polimixina B, o anticorpo monoclonal A, proteína crescente bactericida/permeabilidade, oligonucleotídeo inibitório, etc., principalmente visando endotoxinas bacterianas e ADN de CpG, e a maioria deles é pré-clínica ou estudos clínicos, não tendo sido aplicados ao clínico. Além de medicamentos, tratamentos de purificação do sangue também são considerados um meio eficaz para tratar a sépsis. O chamado tratamento de purificação do sangue refere-se ao propósito de levar o sangue de um paciente para fora do corpo, removendo fatores patogênicos no sangue através de um dispositivo de purificação especial e purificando o sangue para alcançar o objetivo de tratar doenças. O dispositivo de tratamento de purificação do sangue é geralmente composto por uma bomba, um circuito sanguíneo circulante, uma purificação do sangue e uma parte de controlo relacionada e semelhantes. Em que o material de absorção com a função de absorver fatores patogênicos é o componente principal do dispositivo de tratamento de purificação do sangue.

[03] tratamento de purificação do sangue da sépsis consiste em absorver e remover o PAMP no sangue de um doente por absorção de material que tem a função de absorver PAMP. Atualmente, pesquisadores japoneses desenvolveram o material absorvente à endotoxina Torymyxin, que é composto de transportadores de fibra de poliestireno e polimixina B ligada covalentemente ao transportador, e foi publicado no mercado no Japão (1994) e Europa (2002) e está conduzindo a Fase. III ensaios clínicos nos Estados Unidos. Este tipo de material absorvente pode efetivamente absorver endotoxina e tem boa biocompatibilidade, e é sufiFig. para o tratamento de purificação do sangue da sépsis (Hisataka Shoji. Remoção de endotoxina extracorpórea para o tratamento de sépsis: cartucho de absorção de endotoxina (Toraymixin). Ther Apher Dial. 2003; 7 (1): 108114.). Por exemplo, patentes de invenção com patente N°ZL03144383.4 divulga um material de absorção de endotoxina que toma material molecular elevado, natural ou sintético, como transportador e dimetilamina como o ligando, e pode ser utilizado para perfusão sanguínea para remover endotoxina no sangue de um paciente. Patentes de invenção com patente N°ZL03144231.5 revela um material absorvente que toma gel de agarose esférico como transportador com uma quantidade eficaz fixa de um ligando de afinidade e pode absorver eficientemente a endotoxina no sangue por perfusão sanguínea. A patentes de invenção com patente N°ZL20071001250501 divulga um material de absorção que toma o gel de agarose como transportador e é acoplado ao catião sal e à molécula hidrofóbica através da molécula do braço espacial, e pode ser utilizado para remover a endotoxina no plasma. As patentes de invenção CN101322933B e CN101322934B divulgam um material absorvente de endotoxina obtido pela utilização de celulose porosa esférica como veículo e fixamente ligado à polimixina B. A patentes de invenção pública CN102247817B divulga um material absorvente de endotoxina utilizando aglomerados moleculares como o grupo funcional e um método de preparação do mesmo. A patentes de invenção com o número de pedido internacional PCT/AT2010/000017 revela um material absorvente de endotoxina que consiste em um veículo poroso insolúvel em água e polimixina B imobilizada no veículo. O pedido internacional No. PCT/AT2011/000273 divulga um material absorvente de endotoxina que consiste num suporte poroso insolúvel em água e uma polimixina B e albumina ligada de um modo não covalente à superfície do veículo. A patentes de invenção pública CN103769060A divulga um absorvente que utiliza o gel de agarose, álcool polivinílico, celulose ou PS como transportador, e é acoplado a piccolamina B e pode absorver endotoxina, ADN de CpG e peptidoglicano. No entanto, o material absorvente acima mencionado pode absorver apenas alguns PAMPs, tais como endotoxina, que é ineficaz para outros PAMPs, de modo que é difícil exercer um efeito terapêutico na sépsis induzida por outros PAMPs. Portanto, é importante desenvolver materiais de absorção com amplo espectro mais amplo e maior capacidade de absorção.

CONTEÚDO DA INVENÇÃO

[04] O objectivo da invenção é visar a deficiência da capacidade de absorção do material adsorvido anterior. A invenção proporciona um material absorvente de fator multi-patogénico de sépsis, que pode efetivamente absorver vários fabtores patogénicos da sépsis, tais como endotoxinas bacterianas, ADN de CpG, peptidoglicano, ácido fosfatídico, RNA viral e zimosan

[05] De sangue e outros fluidos, e pode tratar a sépsis, eliminando os PAMPs.

[06] O esquema técnico da invenção é que: O método de preparação do ligante do material absorvente para vários fatores patogênicos da sépsis no fluido absorvente inclui as seguintes etapas: 1) Em DCM, o composto 1 reage com Boc2O para formar o composto 2, a temperatura da reação é de 20-30 °C, a razão de equivalência do composto 1 para Boc2O é 1:0.5-2, a equação da reação é:

2) Em MeOH/NH3, o composto 2 é submetido a redução de hidrogenação para gerar o composto 3 na presença de RaneyNi e hidrogênio, a temperatura de reação é 20-50 °C, a pressão é 1-10MPa, e a massa de RaneyNi é 10%-50% por cento da massa do composto 2, e a equação da reação é:

3) Em etanol ou metanol, o composto 3 reage com nitrilo α, β-insaturado para gerar o composto 4, a temperatura da reação é de 20-50°C, a razão de equivalência do composto 3 em relação ao nitrilo α, β-insaturado é de 1:2-3, e a equação da reação é:

4) Em DCM, o composto 5 reage com N hidroxisuccinimida na presença de diciclo-hexilcarbodiimida e 4-dimetilaminopiridina para gerar o composto 6, a temperatura de reação 20-30°C, a raiz de equivalência do composto 5 a N-hidroxisuccinimida 1:1-2 A equação da reação é

5) Em dioxano, o composto 4 reage com o composto 6 para gerar o composto 7, a temperatura da reação é 30-50°C, a razão de equivalência do composto 4 para o composto 6 é 1:1-2, e a equação da reação é:

6) O composto 7 reage com carbonato de N-benzil succinimidilo para gerar o composto 8 no dioxano, a temperatura da reacção é 30-50 °C, a razão correspondente do Composto 7 para N-benzil succinimidil carbonato é 1:1-2, e a equação reacional é :

7) Em etanol ou metanol, o composto 8 reage com Boc2O na presença de RaneyNi e hidrogênio para gerar o composto 9, a temperatura da reação é de 30-50 °C, a razão de equivalência do composto 8 ao Boc2O é 1:0.5-3, a pressão é de 1-10 MPa, A massa de RaneyNi é de 10%-50% da massa do composto 8, e a equação da reação é:

8) Em metanol, o composto 9 reage com o Pd/C e o hidrogênio para gerar o composto 10, a temperatura da reação é 20-50 °C, a pressão é pressão normal até 10 MPa, a massa do carbono paládio é 10 a-30% da massa do composto 9, e a equação da reação é:

9) Em DCM, o composto 10 reage com o anidrido succico na presença de 4-dimetilaminopiridina para gerar o composto 11, a temperatura de reaco 20-30°C, a proporo de equivalência do composto 10 ao anidrido succico de 1:1-2 e a equação da reação é:

10) Em acetato de etilo, o composto 11 reage com N-hidroxissuccinimida para gerar o composto 12 a uma temperatura de reação de 20-30 graus, a razão equivalente do composto 11 à N -hidroxisuccinimida é entre 1:1 e 2, e a equação da reação é do seguinte modo:

[07] Os vários fatores patogênicos da sépsis Mencionados acima incluem endotoxinas bacterianas, ADN de CpG, PGN, ácido lipoteicóico, ssRNA viral, RNA viral e/ou zimosan.

[08] O fluido inclui sangue humano ou plasma ou injeção de droga ou reagente biológico líquido.

[09]material de absorção de vários fatores spatogênicos da épsis é composto de ligante e transportador no acoplamento, e sua estrutura molecular é mostrada da seguinte forma

[010] O transportador é a resina de poliestireno aminado ou agarose aminado.

[011] método de preparação de materiais de absorção para vários fatore as seguintes etapas: 1)Em solução aquosa THF ou THF ou solução THFethanol, o composto 12 reage com o veículo M para gerar o composto 13, a razão de massa do composto 12 para o transportador M é de 0.01-1:100, e a equação da reação é:

2) Fechamento do amino residual do portador: Em N, N-diisopropiletilamina, o anidrido ácico adicionado ao composto 13 para fazer reagir de modo a obter o produto bruto do fecho de amino residual do transportador, a proporo de equivalência do composto 13 para anidrido ácico 1:1-2 e a equação da reação:

3) Preparação do produto final: Em metanol, solução de metanol com concentração de 2-6M é adicionada ao produto bruto em um banho de gelo para obter o produto final MTAM, a razão de volume do produto bruto para a solução de metanol de ácido clorídrico é 1:0,5-1,5, e o equação da reação é:

[012] O material de absorção de fator multi- dispositivo de tratamento de purificação do sangue da sépsis, para ser específico, a preparação da coluna de absorção no dispositivo de tratamento de purificação.

[013] Os estudos experimentais do candidato mostram que: (1) O ligando é efetivamente conectado ao suporte por acoplamento covalente; (2) O material de absorção tem um efeito significativo de absorção na endotoxina bacteriana, ADN do genoma bacteriano, peptidoglicano, ácido da parede fosfato, RNA viral e polissacarídeo de levedura no plasma.

[014] Moléculas relacionadas a patógenos são os principais fatores patogênicos que levam à sépsis, seja por terapia medicamentosa ou purificadora do sangue, o que é importante para a remoção dessas moléculas do paciente. De acordo com a invenção, um novo ligando com função de absorção molecular relacionada com mútiplos patogáios acoplado num transportador correspondente, e o veículo pode ser resina de poliestireno ou agarose, e o transportador pode ser amplamente aplicado na clássica e provou ter uma boa compatibilidade sanguínea. O material da invenção é aplicado a um dispositivo de tratamento de purificação do sangue e pode efetivamente absorver endotoxina bacteriana, ADN de genoma bacteriano, peptidoglicano, ácido de parede de fosfato, RNA de vírus e polissacarídeo de levedura no sangue, e tem uma perspectiva de aplicação importante no tratamento da sépsis sanguínea tratamento de purificação. Ao mesmo tempo, será entendido pelos peritos na técnica que a presente invenção, para além da utilização de materiais para tratamento médico, pode também ser utilizada para remover endotoxinas bacterianas, ADN de CpG, peptidoglicano, ácido lipoteicóico de soluções como fármacos, agentes biológicos, RNA Viral e zimosan. FIG. ANEXOS PARA ILUSTRAR Fig. 1 mostra a figura esquemática da estrutura molecular do Fig. 2 mostra o resultado da absorção estática do material absorvente na endotoxina bacteriana em água; A Fig. 3 mostra o resultado da absorção estática do material absorvente na endotoxina bacteriana no plasma; A Fig. 4 mostra o resultado da absorção dinâmica do material absorvente na endotoxina bacteriana no plasma; A Fig. 5 mostra o resultado de deteco de adsoro estica do material absorvente em endotoxina bacteriana, CpG de ADN, CpG de ADN, CpG de ADN, ssRNA viral, dsRNA viral e zimosan no plasma, em que 5A o resultado do teste de capacidade de adsoro do material absorvente. na endotoxina bacteriana, 5B é o resultado do teste de capacidade de absorção do material absorvente no CpG de ADN, e 5C é o resultado do teste de capacidade de absorção do material absorvente no CpG de ADN, 5D é o resultado do teste de capacidade de absorção do material absorvente no ADN de CpG, e 5E é o resultado do teste de capacidade de absorção do material absorvente no ssRNA do vírus, e 5F é o resultado do teste de capacidade de absorção do material absorvente no CpG de ADN de dsRNA, 5G é o resultado do teste ADN de CpG do material de absorção zimosan; Fig. 6 mostra os resultados da detecção de absorção dinâmica de endotoxina bacteriana, CpG de ADN, peptidoglicano, LTA ssRNA viral, dsRNA viral, e zymosan no plasma por materiais absorventes. Entre eles, 6A é o resultado do teste da capacidade de absorver material para absorver endotoxina bacteriana. Entre eles, 6B é o resultado do teste da capacidade de absorver material para absorver o ADN de CpG, 6C é o resultado do teste da capacidade de absorver material para absorver peptidoglicano, 6D é o resultado do teste da capacidade de absorver material para absorver ácido fosfórico, 6E teste resultado da capacidade de absorver material para absorver o ssRNA do vírus, 6F é o resultado do teste da capacidade do material absorvente para absorver o dsRNA do vírus, 6G é o resultado do teste da capacidade de absorção do material para absorver o zymosan. A Fig. 7 é o resultado da detecção de absorção estática do material absorvente na solução de lisado bacteriano (várias misturas de PAMPs); 7A é o resultado do teste da capacidade de absorção do material de absorção à lisorresolução de Escherichia coli, 7B é o resultado do teste da capacidade de absorção do material de absorção à solução de lisado de staphylococcus aureus; A Fig. 8 é o resultado de detecção de absorção dinâmica do material absorvente na solução de lisado bacteriano (várias misturas de PAMPs). 8A é o resultado do teste da capacidade de absorção do material de absorção à lisorresolução de Escherichia coli, 8B é o resultado do teste da capacidade de absorção do material de absorção à solução de lisado de staphylococcus aureus.

MODO ESPECIFICO DE IMPLEMENTAÇÃO

[015] Os seguintes exemplos são apenas uma solução preferida para a descrição detalhada da presente invenção, que não se destina a limitar a invenção em qualquer forma.

[016] Os reagentes químicos utilizados nos exemplos foram reagentes analíticos, adquiridos à Sigma- Aldrich. Os LPS, LTA e zimosan experimentais foram adquiridos à Sigma-Aldrich, e o ADN de CpG foi adquirido à Sangon Biotech Bioengineering (Xangai) Co., Ltd., enquanto a PGN e o RNA viral foram adquiridos à Invivogen. Na ausência de instruções especiais, outros reagentes são reagentes analíticos comercialmente disponíveis. Ambas as abreviações Português e Inglesas têm os seguintes significados Português:

Exemplo 1: Preparação do ligante 1 1.1 Método experimental:

6 g de bis (2-cianoetil) amina (Composto 1) foram dissolvidos em 60 mL de diclorometano temperatura ambiente, uma soluo de diclorometano contendo equivalentes iguais de Boc2O foi adicionado gota a gota, a reacção dura 10 horas, agita-se para secar o solvente, adiciona-se água e acetato de etilo para extrair 3 vezes, utiliza-se sulfato de sódio anidro para secar, agita-se o solvente para secar para obter o composto 2. 11 g do Composto 2 são dissolvidos em 400 mL de solução saturada de metanol amoníaco, 1 g de RaneyNi é adicionado, 4 MPa de hidrogénio é carregado, a reacção é levada a cabo à temperatura ambiente durante 72 horas, e o composto 3 é obtido seque o solvente. 5,2 g do Composto 3 são dissolvidos em 40 mL de etanol, e uma concentração de 15 M de solução de etanol de acrilonitrilo é adicionada gota a gota sob um banho de gelo, e a mistura é feita reagir durante 10 horas a 40 °C; Agitar o solvente para secar para obter o composto 4. 4,2 g de ido 3,4- dimetoxifenilpropiico (Composto 5) foi dissolvido em DCM, 2,3 g de N-hidroxisuccinimida, 2,8 g de diciclo- hexilcarbodiimida e 0,5 g de 4-dimetilaminopiridina foram adicionados, a reação foi conduzida temperatura ambiente durante 12 horas. Agitar o solvente para secar para obter o composto 6. 2 g do composto 4 são dissolvidos em 15 mL de dioxano, 1,76 g do composto 6 são adicionados para reagir em 50 °C por 24 horas para obter o composto 7, seguido pela adição de 1,48 g de carbonato de N-benzil succinimida, a reação é continuada durante 20 horas, áua e acetato de etilo sá adicionados durante 3 vezes para extrair, sulfato de sáio anidro sá utilizados a dia, agitar o solvente para secar para obter o composto 8. 1 g do composto 8 foi dissolvido em etanol, 1 g de Boc2O e 0,1 g de RaneyNi foram adicionados, carregados com 2 MPa de hidrogênio, reagiram por 48 horas a 45 °C, filtraram-se e agitaram o solvente para secar para obter o composto 9. 0,44 g do Composto 9 são dissolvidos em 5 ml de metanol, adiciona-se 45 mg de Pd/C, carrega-se hidrogénio, efectua-se a reação durante 48 horas a 30 °C e agita-se o solvente para secar para obter o composto 10. 0,4 g do composto 10 são dissolvidos em diclorometano, 12 mg de 4-dimetilaminopiridina, 80 mg de anidrido succínico, reagem a 25 °C durante 48 horas, agitam o solvente para secar até obter 11, seguido por adição de 5 mL de acetato de etilo, 93 mg de N-hidroxissuccinimida, reagem a 25 °C durante 72 horas, agita-se o solvente para secar para obter o composto 12 (ligando 1). 1.2 Resultados experimentais: Um ligando 1 é obtido e a detecção do espectro de massa mostra: [M+Na]+m/z=957.5; A espectroscopia de ressonância magnética nuclear mostra: 6.80-7,54 (m, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,40 (s lg, 2H), 3,34-3,28 (m, 3H), 3,23-3,21 (m, 2H), 3,15 (s largo, 5H), 3,09-2,97 (m, 5H), 2,93-2,89 (m, 2H), 2,82 (s l, 4H), 2,74-2,64 (m, 3H), 2,59-2,57 (m, 2H), 1,90 (s, 2H), 1,81-1,75 (m, 5H), 1,65-1,63 (m, 3H), 1,44-1,41 (m, 27H), verificar a constituição química

Exemplo 2: Preparação do ligante 2 2.1 Método experimental: O processo de acordo com o Exemplo 1 foi preparado e feito reagir sob a mesma escala e condições, com a exceção de o ácido 3,4- dimetoxifenilpropiónico (Composto 5) ter sido substituído por ácido 3-fenilpropiónico. 2.2 Resultados experimentais: Um ligando 2 é obtido e a detecção do espectro de massa mostra: [M + Na]+ m/z = 897,5, e verificar a constituição química

Exemplo 3: Preparação do ligante 3 3.1 Método experimental: O processo de acordo com o Exemplo 1 foi preparado e a reação foi levada a cabo sob a mesma escala e condições, excepto que o acrilonitrilo foi substituído por 3-butendinitrilo. 3.2 Resultados experimentais: Um ligando 3 é obtido e a detecção do espectro de massa mostra: [M + Na]+ m/z = 985,5, e verificar a constituição química

Exemplo 4: Preparação do ligante 4 4.1 Método experimental: A reação foi realizada na mesma escala e condições utilizando o modo de preparação descrito no Exemplo 1, substituindo o ido 3,4- dimetoxibenzenopropico (composto 5) por ido 3,4- dimetoxibenzco. 4.2 Resultados experimentais: Um ligando 4 é obtido e a detecção do espectro de massa mostra: [M + Na]+ m/z = 929,5, e verificar a constituição química

Exemplo 5: Preparação do ligante 5 5.1 Método experimental: A reação foi realizada à mesma escala e condições utilizando o método de preparação descrito no Exemplo 1, com a exceção de que a dupla (2-cianopropil) amina (composto 1) foi substituída por metileno diacetonitrilo. 5.2 Resultados experimentais: Um ligando 5 é obtido e a detecção do espectro de massa mostra: [M + Na]+ m/z = 929,5, e verificar a constituição química

Exemplo 6: Preparação de múltiplos fatores patogênicos de material absorvente agarose como portador 6.1 Método experimental:

5 mL do gel de agarose aminado aminado (Beijing Weishi Bohui Chromatography Technology Co., Ltd) foram dispersos em 2 mL de tetra-hidrofurano e depois 2 mg do ligando 1 foram dissolvidos numa pequena quantidade de tetra-hidrofurano e adicionados gota a gota à solução. Reagir à temperatura ambiente durante 48 horas, filtrar e lavar com água para obter o composto 13. Adicionar 0,5 mL de N, N-diisopropiletilamina com uma concentração de 10 mM ao Composto 13, depois adicionar 0,8 mL de anidrido acético, reagir à temperatura ambiente durante 8 horas, e filtrar para obter um produto em bruto fechado em amina. O produto em bruto foi dissolvido em 3 mL de metanol, 2 mL de soluo de metanol com uma concentrao de 6 foram adicionados gota a gota sob um banho de gelo, a reação foi realizada temperatura ambiente durante cerca de 2 horas, filtrada e lavada com uma para obter o produto final MTAM01S. 1.2 Resultados experimentais: O material absorvente MTAM01S foi obtido e armazenado numa solução de etanol a uma concentração de 20%, e a estrutura é mostrada na FIG. 1, em que a poro transportadora gel de agarose. Exemplo 7: Preparação de Materiais de Absorção PAMP (MTAM01P) com Resina de Poliestireno como Transportador 7.1 Método experimental: O método de preparação descrito no Exemplo 6 foi realizado na mesma escala e condiçãs, excepto que o gel de agarose aminado foi substituição por poli (estireno-co-divinilbenzeno) metilado de amáio (adquirido da Sigma-Aldrich). 7.2 Resultados experimentais: O material de absorção MTAM01P é obtido, armazenado em solução de etanol com concentração de 20%, e a estrutura é mostrada na Figura 1, com a parte de suporte sendo resina de poliestireno. Exemplo 8: Teste da capacidade de absorção estática de endotoxinas bacterianas (LPS) em água por MTAM01S e MTAM01P 8.1 Método experimental: Misturou-se 0,5 ml de endotoxina (1 μg/ml) com 0,5 ml de resina de agarose (veículo S), resina de poliestireno (veículo P), MTAM01S ou MTAM01P, respectivamente, e a reação oscilatória foi realizada durante 1 hora a 37°C. O nível de endotoxina foi detectado quantitativamente por centrifugação. O método de teste é baseado na Farmacopeia Chinesa (II) Apêndice XIE. Teste de endotoxina bacteriana e na literatura “Wei Guo, Zheng Jiang. Análise dos fatores de influência da detecção quantitativa de endotoxinas bacterianas e suas contramedidas. Journal of Regional Surgery, 2003, 12: 215-166. " Os resultados experimentais são indicados pelo valor medido da endotoxina e convertidos em taxa de absorção para expressar. 8.2 Resultados experimentais: A taxa de absorção de resina de agarose e poliestireno na endotoxina em água foi de 8,31% e 8,39%, indicando que o transportador apresentou pouca capacidade de absorção. MTAM01S e MTAM01P têm boa atividade de absorção na endotoxina, que são 93,83% e 89,41%, respectivamente, como mostra a figura 2. Exemplo 9: Detecção da capacidade de absorção estática de endotoxinas bacterianas (LPS) no plasma por MTAM01S e MTAM01P 9.1 Método experimental: 0. 5ml de endotoxina (1 μg/ml) dissolvidos em plasma foram misturados com 0,5ml de resina de agarose (S portador), resina de poliestireno (portador P), MTAM01S ou MTAM01P no mesmo volume, e a reação oscilatória durou 1 hora a 37 °C. O nível de endotoxina foi detectado por centrifugação e o método de detecção foi o mesmo do Exemplo 8. Os resultados experimentais são indicados pelo valor medido da endotoxina e convertidos em taxa de absorção para expressar. 9.2 Resultados experimentais: A taxa de absorção de endotoxina no plasma por resina de poliestireno e agarose foi de apenas 7,61% e 8,20%, indicando que o transportador apresentou pouca capacidade de absorção. MTAM01S e MTAM01P têm boa atividade de absorção na endotoxina no plasma, e a taxa de absorção pode alcançar 92,67% e 88,10%, respectivamente, e os resultados são mostrados na figura 3. Exemplo 10: Detecção da absorção dinâmica de endotoxinas bacterianas (LPS) no plasma por MTAM01S e MTAM01P 10.1 Método experimental: 10 ml de resina de agarose (veículo S), resina de poliestireno (veículo P), MTAM01S e MTAM01P foram preenchidos em coluna cromatográfica com 3 cm de diâmetro e 15 cm de altura e 10 ml de endotoxinas dissolvidas em plasma humano (1 M.g/ml) foram carregados e o filtrado foi repetido durante 8 vezes. O nível de endotoxina em cada filtrado foi testado. O método de detecção foi o mesmo do Exemplo 8. Os resultados experimentais são indicados pelo valor medido da endotoxina e convertidos na taxa final de absorção. 10.2 Resultados experimentais: As resinas de agarose e poliestireno não têm capacidade de absorção nas endotoxinas, enquanto MTAM01S e MTAM01P têm boa capacidade de absorção na endotoxina e são diretamente proporcionais ao número de tempos de absorção, e a taxa de absorção final atinge 92,83% e 85,90%. é mostrado na FIG. 4 Exemplo 11: Detecção de endotoxinas bacterianas (LPS), ADN genômico bacteriano (CpG de ADN), peptidoglicano (PGN), ácido lipoteicóico (LTA), vírus ssRNA, dsRNA viral e polissacarídeo de levedura (Zymosan) no plasma por MTAM01S e MTAM01P 11.1 Método experimental: 0,5 ml de endotoxina (1.mu.g/ml) dissolvida em plasma humano, ADN de CpG (10.mu.g/ml), peptidoglicano (10.mu.g/ml), ácido lipoteicóico (10.mu./g ml), ssRNA viral (10.mu.g/ml), dsRNA viral (10.mu.g/ml) e zimosan (10.mu.g/ml), respectivamente, com 0.5 ml de resina de agarose (portador S) resina de poliestireno (portador P), MTAM01S ou MTAM01P foi misturada no mesmo volume, reação oscilatia a 37 durante uma hora. Adicionaram-se 20 μl do sobrenadante às células da estirpe RAW 264.7 de macrófagos de ratinho cultivadas in vitro (1 x 106/ml) e incubaram se durante 12 horas para detectar o efeito estimulante de plasma contendo moléculas associadas a patogênicos em células de reação inflamatórias antes e após a absorção. O método de detecção específico é executado de acordo com o manual de instruções de operação do kit ELISA de mouse da empresa eBioscience, que compreende principalmente as seguintes etapas: 0 Adicionando o sobrenadante a uma placa de 96 cavidades pré- revestida com um anticorpo de captura, incubando à temperatura ambiente durante 2 horas e lavando com PBS durante 5 vezes; 0 Adição de monoanticorpo marcado com biotina, incubação à temperatura ambiente por 1 hora e lavagem com PBS por 5 vezes; 0 Adicionando peroxidase de rábano marcada com avidina, incubando durante meia hora à temperatura ambiente, lavando com PBS por 5 vezes; 0 Adicionando solução de revelação de cor, incubando por 10 minutos a 37 °C, solução de adição; 0 Foi utilizado um leitor de microplacas de comprimento de onda de 450 nm para determinar a densidade óptica. Os resultados experimentais mostraram que a taxa de inibição do TNF-α nas células de resposta inflamatória refletiu a capacidade de absorção dos materiais adsorvidos nos PAMPs. 11.2 Resultados experimentais: A absorção de TNF- α de células RAW 264.7 tratadas com plasma antes e depois do tratamento não foi inibida pelo tratamento com resina de poliestireno e agarose de quaisquer moléculas associadas a agentes patogénicos. Os efeitos de MTAM01S e MTAM01P em células de resposta inflamatória diminuíram significativamente, indicando que o nível molecular de moléculas relacionadas a patógenos no plasma foi grandemente reduzido após a absorção de MTAM01S e MTAM01P. Como resultado, como mostrado na Figura 5, a Figura 5A é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em endotoxina bacteriana (LPS), a Figura 5B é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em ADN genômico bacteriano (ADN de CpG), a Figura 5C é um resultado da capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em peptidoglicano (PGN), Figura 5D é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P no ácido lipoteicóico (LTA) A Figura 5E é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P no ssRNA do vírus, a Figura 5F é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em dsRNA viral e a Figura 5G é um resultado da absorção. teste de capacidade de MTAM01S e MTAM01P em zimosan. Exemplo 12: Detecção da capacidade de absorção dinâmica de endotoxinas bacterianas (LPS), ADN genômico bacteriano (CpG de ADN), peptidoglicano (PGN), ácido lipoteicóico (LTA), vírus ssRNA, ssRNA B e polissacarídeo de levedura (Zymosan) no plasma por MTAM01S e MTAM01P 12.1 Método experimental: 10 ml de resina de agarose (transportador S), resina de poliestireno (transportador P), MTAM01S e MTAM01P foram enchidos, respectivamente, numa coluna com um diâmetro de 3 cm e uma altura de 15 cm, endotoxina (1. mu.g/ml) , ADN de CpG (10 ug/mL), peptidoglicano (10 ug/mL), ido lipoteicoico (10 mL/g), ARNsi viral (10 mL/mL) foram retirados 10 ml de plasma humano. O filtrado foi repetido durante 5 vezes, e cada um dos 1o, 3o e 5o filtros foi adicionado a 264,7 células a 20 & mu; l, no sobrenadante do vírus (10 ug/ml) e no zimosan (10 ug/ml). Os efeitos do plasma nas células de resposta inflamatória antes e depois da absorção foram detectados pelo método do Exemplo 11. 12.2 Resultados experimentais: Resinas de agarose e poliestireno não têm efeito de absorção em qualquer PAMP, e MTAM01S e MTAM01P podem obviamente absorver vários PAMPs, mostrando uma diminuição significativa na atividade de estimulação do plasma adsorvido em células de resposta inflamatória (uma diminuição significativa na liberação de TNF-a) Como mostrado na FIG. 6, o nível de PAMPs no plasma foi grandemente reduzido após a absorção de MTAM01S e MTAM01P, como mostrado na FIG. 6, em que a FIG. 6A é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P na endotoxina bacteriana (LPS), FIG. 6B é um resultado da capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P no ADN genómico bacteriano (CpG de ADN), FIG. 6C é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em peptidoglicano (PGN), e a FIG. 6D é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P no ácido lipoteicóico (LTA), FIG. 6E é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em ssRNA viral, e a FIG. 6F é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em RNA viral, FIG. 6G é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P em polissacarídeos de levedura. Exemplo 13: Teste de capacidade de absorção estática de MTAM01S e MTAM01P em solução de lise bacteriana (várias misturas de pamps) 13.1 Método experimental: As soluções de Escherichia coli e Staphylococcus aureus cultivadas foram adicionadas a tampão lirato (50 mM Tris pH 8,0, 10% glicina, 0,1% trion-X100, 100 μg/ml de lisozima, 1 mM PMSF), ultra-sónico (3 vezes, 20 segundos) romper a membrana celular, respectivamente, por razão de volume de 2:1. O produto de lise bacteriana foi diluído com plasma humano, e a concentração foi de 1 x 108 UFC/ml (E. coli) e 5 x 108 UFC/ml (Staphylococcus aureus ) de acordo com a contagem bacteriana. Os produtos de clivagem foram misturados com 0,5 ml de resina de agarose (veículo S), resina de poliestireno (veículo P), MTAM01S ou MTAM01P no mesmo volume, respectivamente, e a reacção foi realizada durante 1 hora a 37 °C. 20 ul do sobrenadante foram adicionados a uma cultura in vitro de macrófagos de camundongos da cepa RAW 264.7 (1x106/ml) e incubados por 12 horas para medir o efeito estimulante do plasma nas células de resposta inflamatória antes e após a absorção. O método de detecção foi o mesmo do Exemplo 11. 13.2 Resultados experimentais: Resinas de agarose e poliestireno não têm efeito de absorção em todos os tipos de PAMPs, e MTAM01S e MTAM01P têm boa atividade de absorção em misturas de PAMPs derivadas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A solução de lise bacteriana exibida por MTAM01S e MTAM01P diminuiu significativamente a actividade de estimulação das células de resposta inflamatória (uma diminuição significativa na libertação de TNF-α), como mostrado na FIG. 7, em que a FIG. 7A é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P na solução de lise de Escherichia coli, FIG. 7B é um resultado de teste da capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P contra a solução de lise de Staphylococcus aureus. Exemplo 14: Teste de capacidade de absorção dinâmica de MTAM01S e MTAM01P em solução de lise bacteriana (várias misturas moleculares relacionadas ao patógeno) 14.1 Método experimental: 10ml de resina de agarose (transportador S), resina de poliestireno (portador P), MTAM01S e MTAM01P foram carregados numa coluna com um dietro de 3 cm e uma altura de 15 cm respectivamente. A solução de lise de Escherichia coli e Staphylococcus aureus foi preparada de acordo com o método do Exemplo 10. Foram tomados 10 ml de solução de lise bacteriana diluída em plasma humano e o filtrado foi repetidamente carregado por 5 vezes, e cada um dos primeiro, terceiro e quinto filtros foi adicionado às células RAW264.7, e a estimulação da solução de lise bacteriana antes e depois a absorção foi detectada pelo método de acordo com o Exemplo 11. 14.2 Resultados experimentais: Resinas de agarose e poliestireno não têm efeito de absorção em vários PAMPs bacterianos, e MTAM01S e MTAM01P podem absorver misturas de PAMPs derivadas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus (bactérias positivas para couro). A solução de lise bacteriana exibida por MTAM01S e MTAM01P diminuiu significativamente a atividade de estimulação cáulas de resposta inflamatáia (uma diminuiáo significativa na libertaáo de TNF--α), como mostrado na FIG. 8, em que a FIG. 8A é um resultado do teste de capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P na solução de lise de Escherichia coli, FIG. 8B é um resultado de teste da capacidade de absorção de MTAM01S e MTAM01P contra a solução de lise de Staphylococcus aureus. Exemplo 15: Preparação de materiais de absorção baseados em ligantes 2- 5 15.1 Método experimental: O máodo de preparaáo descrito no Exemplo 6 foi realizado na mesma escala e condiçãs, excepto que o ligando 1 foi substituáo por um ligando 2 ou um ligando 3 ou um ligando 4 ou um ligando 5, e os ligandos 2 a 5 foram respectivamente acoplados para o gel de agarose aminado ou a resina de poliestireno aminado, respectivamente. 15.2 Resultados experimentais: Obtenção de um material de absorção MTAM02S com um gel de agarose como veículo e um ligando 2 como o ligando; O gel de agarose como transportador; o ligando 3 como o material absorvente de ligando MTAM03S; O gel de agarose como transportador; o ligando 4 como o material absorvente de ligando MTAM04S; O gel de agarose como transportador; o ligando 5 como o material absorvente de ligando MTAM05S; Uma resina de poliestireno como transportador e um ligando 2 como o material absorvente de ligando MTAM02P; A resina de poliestireno é um transportador, equipado com material absorvente baseado em 3 MTAM03P; A resina de poliestireno é um transportador, equipado com material absorvente baseado em 4 MTAM04P; A resina de poliestireno é um transportador, com o abutment 5 sendo um material de acoplamento MTAMIC05P. Exemplo 16: Detecção de endotoxinas bacterianas (LPS), CpG de ADN (CpG de ADN), peptidoglicano (PGN), ácido lipoteicóico (LTA), vírus ssRNA, dsRNA viral e polissacarídeo de levedura (Zymosan) no plasma por MTAM02- 05S e MTAM02-05P 16.1 Método experimental: O método de teste descrito no Exemplo 12 foi realizado na mesma escala e condição, exceto que os materiais de absorção MTAM01S e MTAM01P foram substituídos por MTAM02-05S e MTAM02-05P, respectivamente. 16.2 Resultados experimentais: O MTAM02-05S e o MTAM02-05P também podem absorver significativamente vários PAMPs, mostrando uma redução significativa na atividade de estimulação do plasma pós-adsorvido nas células de resposta inflamatória (uma diminuição significativa na liberação de TNF-α). Após 5 tratamentos de absorção por filtração, a taxa de inibição do TNF-α foi estimulada por PAMPs para expressar a capacidade de absorção de materiais adsorvidos em PAMPs, e os resultados são mostrados na Fig. 1. Tabela 1 Teste de capacidade de absorção de MTAM02-05S e MTAM02-05P

[017] A experiência mostra que o material de absorção tem notável efeito de absorção na endotoxina bacteriana, ADN de CpG, peptidoglicano, ácido lipoteicóico, vírus RNA e Zymosan em fluidos tais como plasma e similares, e o efeito de estimulação do plasma tratado nas células imunes é obviamente inibido, que o material de absorção é adequado para purificação do sangue de pacientes com sépsis.

Claims

1. Método de preparação de um ligante de materiais adsorventes para adsorção de múltiplos fatores patogênicos de sepse em fluidos, caracterizadopor compreender as seguintes etapas: 1) Em diclorometano, o composto 1 reage com dicarbonato de di-tercbutila para formar o composto 2, a temperatura da reação é de 20°C a 30°C, a razão de equivalência do composto 1 para o dicarbonato de di-terc- butila é de 1:0.5 a 1:2, a equação da reação é:

2) Em uma solução saturada de amônia em metanol, o composto 3 é gerado a partir do composto 2 por meio de hidrogenação na presença de níquel Raney e hidrogênio, a temperatura de reação é de 20°C a 50°C, a pressão é de 1 MPa a 10 MPa, e a massa de níquel Raney (Raney Ni) é de 10% a 50% da massa do composto 2, e a equação da reação é:

4) Em etanol ou metanol, o composto 3 reage com nitrila α,β-insaturada para gerar o composto 4, a temperatura da reação é de 20°C a 50°C, a razão de equivalência do composto 3 para a nitrila α,β-insaturada é de 1:2 a 1:3, e a equação da reação é:

5) Em diclorometano, o composto 5 reage com N- hidroxissuccinimida para gerar o composto 6 na presença de N,N'-diciclohexilcarbodiimida e 4-dimetilaminopiridina, a temperatura de reação é de 20°C a 30°C, a razão de equivalência do composto 5 para a N-hidroxissuccinimida é de 1:1 a 1:2, e a equação da reação é:

6) Em dioxano, o composto 4 reage com o composto 6 para gerar o composto 7, a temperatura da reação é de 30°C a 50°C, a razão de equivalência do composto 4 para o composto 6 é 1:1 a 1:2, e a equação da reação é:

6) Em dioxano, o composto 7 reage com Ncarbobenzoxioxissuccinimida para gerar o composto 8, a temperatura da reação é de 30°C a 50°C, a razão de equivalência do composto 7 para a Ncarbobenzoxioxissuccinimida é de 1:1 a 1:2, e a equação da reação é:

7) Em etanol ou metanol, o composto 8 reage com dicarbonato de di-tercbutila para gerar o composto 9 na presença de níquel Raney e hidrogênio, a temperatura da reação é de 30°C a 50°C, a razão de equivalência de composto 8 para dicarbonato de di-tercbutila é de 1:0.5 a 1:3, a pressão é de 1 MPa a 10 MPa, a massa de níquel Raney é de 10% a 50% da massa de composto 8, e a equação da reação é:

8) Em metanol, o composto 10 é gerado a partir do composto 9 na presença de paládio sobre carbono e hidrogênio, a temperatura da reação é de 20°C a 50°C, a pressão varia da pressão atmosférica até 10 MPa, a massa do paládio sobre carbono é de 10% a 30% da massa de composto 9, e a equação da reação é:

9) Em diclorometano, o composto 10 reage com o anidrido succínico para gerar o composto 11 na presença de 4-dimetilaminopiridina, a temperatura de reação é de 20°C a 30°C, a razão de equivalência de composto 10 para anidrido succínico é de 1:1 a 1:2 e a equação da reação é:

10) Em acetato de etila, o composto 11 reage com N-hidroxissuccinimida para gerar o composto 12, a temperatura de reação é de 20°C a 30°C, a razão de equivalência de composto 11 para N-hidroxissuccinimida é de 1:1 a 1:2 e a equação da reação é:

em que nas fórmulas gerais dos compostos 1 a 12, R1 a R5 são H ou OCH3; n1 a n4 são um número inteiro selecionado dentre 1 a 6; e n5 é um número inteiro selecionado dentre 0 a 3.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por múltiplos fatores patogênicos de sepse incluírem endotoxina bacteriana, DNA genômico bacteriano, peptidoglicano, ácido lipoteicoico, RNA viral e/ou zimosano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos fluidos incluírem sangue ou plasma sanguíneo humano ou injeção de fármaco ou reagente biológico líquido.

4. Material adsorvente para múltiplos fatores patogênicos de sepse caracterizado pelo material ser formado pelo acoplamento de um ligante preparado por um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um veículo, em que a sua estrutura molecular é mostrada conforme a seguir :

5. Material adsorvente, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo veículo ser agarose com funcionalidade de amina ou resina de poliestireno com funcionalidade de amina.

6. Método de preparação de um material adsorvente para adsorver múltiplos fatores patogênicos de sepse caracterizado por compreender as seguintes etapas: 1) Em tetrahidrofurano ou solução aquosa de tetrahidrofurano ou solução aquosa de etanol, o composto 12 reage com o veículo M para gerar o composto 13, a razão em massa de composto 12 para veículo M é de 0,01:100 a 1:100, e a equação da reação é:

2) Bloqueio de amino residual de veículo: em N,N-diisopropiletilamina, anidrido acético é adicionado ao composto 13 e reage com o composto 13 para obter o produto bruto no qual o amino residual de veículo é bloqueado, a razão de equivalência de composto 13 para anidrido acético é de 1:1 a 1:2 e a equação da reação é:

3) Preparação do produto final: em metanol, ácido clorídrico 2 M a 6 M em metanol é adicionado ao produto bruto em banho de gelo, a reação gera o produto final MTAM, a razão em volume de produto bruto para ácido clorídrico em metanol é de 1:0,5 a 1:1,5, e a equação da reação é:

7. Uso de um material adsorvente, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizadopor ser na preparação de um dispositivo de purificação de sangue para tratamento de sepse.