BR112017002270B1 - Aptamero, uso de um aptamero, composicao farmaceutica, coluna de aferese e metodo para a preparaqao de um oligonucleotideo aptamero - Google Patents

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Abstract

A presente invenQao refere-se a novas moleculas de aptamero para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteins G, uma Composicao farmaceutica que compreende essas moleculas de aptamero, uma coluna de aferese que compreende essas moleculas de aptamero e um metodo para a determinagao das sequencias de nucleotfdeos para uso como sequencias de moleculas de aptamero.

Description

CAMPO DA INVENCAO
[001] A presente invengao refere-se a novas moleculas de aptamero para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, uma Composicao farmaceutica que compreende essas moleculas de aptamero, uma coluna de aferese que compreende essas moleculas de aptamero e um metodo para a determinagao das sequencias de nucleotideos para uso como sequencias de moleculas de aptamero.
ANTECEDENTES DA INVENCAO
[002] O sistema imune forma uma parte essencial de todos os mamiferos. Os mamiferos fazem uso de seu sistema imune na defesa contra microrganismos, na detecgao e remogao de celulas anormais como, por exemplo, celulas tumorais, e na regeneragao de tecidos. Atraves disso, o organismo conta com dois mecanismos de defesa interconectados, imunidade humoral e celular.
[003] Os anticorpos, quando ligados a seus antigenos sao acionadores da resposta imune humoral. Os anticorpos podem atuar de varias maneiras. Alem de neutralizagao do antigeno, os anticorpos tambem ativam o sistema de complemento. Ha tambem anticorpos, que sao dirigidos a antigenos do proprio corpo. Como razao para a geragao desses autoanticorpos assim chamados, sao vistos mimetismo molecular e/ou ativagao bystander. A ligagao especifica dos autoanticorpos para antigenos proprios pode ativar celulas exterminadoras naturais (celulas Natural Killer- NK) que sao capazes de facilitar a degradagao desses antigenos.
[004] Doengas autoimunes sao baseadas nesse reconhecimento especifico e ligagao de anticorpos dirigidos a partes constituintes proprias do corpo, que acionam uma resposta imunologica contra as proprias celulas ou tecidos. Alem desse efeito imunoestimulatbrio, os autoanticorpos podem contribuir para o desenvolvimento de fenotipos patogenicos tambem por outros mecanismos.
[005] E bem conhecido que existem autoanticorpos que sao especificos para a parte extracelular de receptores acoplados a proteina G, como: receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelinal, receptor M2 muscannico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores ativados por proteinase (PAR), receptores MAS, receptores 5HT4 e/ou receptores M3 e, apos ligagao especifica, podem ativar ou bloquear esses receptores.
[006] Receptores acoplados a proteina G sao moleculas de transdugao de sinal que transduzem informagoes do espago extracelular para dentro da celula. Eles pertencem a uma familia de receptores que abrangem mais de 1000 receptores diferentes e sao subdivididos em cinco subgrupos. Eles representam um principle de transdugao de sinal sobre a membrana celular na celula que esta presente em muitas especies diferentes.
[007] Uma propriedade tipica de GPCRs e que eles tem tres diferentes algas extracelulares com diferentes epitopos aos quais substancias podem se ligar e causar diferentes reagbes intracelulares. A adrenalina de proteina humoral e capaz de ligar ao receptor adrenergico beta 1 para aumentar a intensidade e frequencia da batida de uma celula muscular do coragao.
[008] Funcionalmente, autoanticorpos patogenicos contra GPCRs sao frequentemente, mas nem sempre do subtipo lgG3 (glicoproteina Imunoglobulina G, subclasse 3) e tem a capacidade de se ligar a diferentes algas de GPCR e para diferentes locais dentro das algas. Estes anticorpos funcionalmente patogenicos exercem uma fungao celular patolbgica e por sua vez organica pela sua interagao com o GPCR.
[009] Dessa forma, ha muitos autoanticorpos diferentes que sao direcionados contra diferentes receptores. No caso do musculo cardlaco, estes sao, por exemplo, os autoanticorpos direcionados contra o receptor beta 1 adrenergico ou o receptor muscarinico de acetilcolina. Outros anticorpos que tem um importante papel em outras doengas sao direcionados contra o receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico alfa 2, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelinal, receptor muscarinico M2, receptor AT1 de angiotensina II, receptores ativados por proteinase (PAR), receptores MAS, receptores 5HT4, receptores M3 e outros.
[0010] A presenga desses anticorpos em um organismo pode levar a efeitos agonisticos ou antagonlsticos, no sentido de uma ativagao permanente ou bloqueio dos respectivos receptores, que desempenha um papel no desenvolvimento da doenga.
[0011] A cardiomiopatia dilatada (DCM) e uma das doengas em que uma alta porcentagem dos pacientes tem essa ativagao de autoanticorpos que se ligam a partes extracelulares do receptor adrenergico beta 1, em particular a 1a ou 2a alga do receptor adrenergico beta 1. Consequentemente, foi sugerida uma patogenese autoimune de DCM nesses pacientes. Mediante ligagao desses autoanticorpos, os receptores sao continuamente ativados porque o mecanismo de feedback fisiologico que limita a ativagao dos GPCRs e suprimido.
[0012] Existem outras doengas do sistema cardiovascular, as quais foram sugeridas serem em relagao a presenga de autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, como, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia periparto, miocardite, hipertensao pulmonar e hipertensao maligna. Autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G tambem foram encontrados em pacientes, por exemplo, com glaucoma, Diabetes mellitus, hiperplasia prostatica benigna, escleroderma, sindrome de Raynaud, pre-eclampsia e em doenQa de Chagas cronica, bem como as com a rejeipao de aloenxerto de rim.
[0013] Geralmente, as regioes de epitopo destes receptores consistem em cadeias de peptideos que compreendem cerca de 20 aminoacidos, enquanto os epitopos especificos de doenpa constituem uma sequencia de 3 a 5 aminoacidos de uma destas regioes. No entanto, a interapao indesejada de autoanticorpos com esses epitopos desempenha um papel importante para o desenvolvimento e cronificapao de varias doenpas autoimunes.
[0014] Em estudos recentes, demonstrou-se que a remopao desses autoanticorpos a partir do sangue atraves de adsorpao de imunoglobulina contribui para a regenerapao do musculo cardiaco (Wallukat G, Reinke P, Dorffel WV, Luther HP, Bestvater K, Felix SB, Baumann G. (1996) Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption. Int J Cardiol. 54:191-195; Muller J, Wallukat G, Dandel M, Bieda H, Brandes K, Spiegelsberger S, Nissen E, Kunze R, Hetzer R (2000) Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Circulation. 101:385-391). W.V. Dorffel, S.B. Felix, G. Wallukat, S. Brehme, K. Bestvater, T. Hofmann, F.K. Kleber, G. Baumann, P. Reinke (1997) Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. Circulation 95, 1994-1997 e W.V. Dorffel, G. Wallukat, Y. Dorffel, S.B. Felix, G. Baumann (2004).
[0015] Immunoadsorption in idiopathic dilated cardiomyopathy, a 3- year follow-up. Int J. Cardiol. 97,20 529-534).
[0016] Descobriu-se ainda que certos aptameros podem ser usados para interferir com a interapao de anticorpos, em particular, de autoanticorpos, especificos para a 2a alpa extracelular do receptor adrenergico beta 1 humano com seu alvo (documento WO 2012/000889 A1). Aptameros sao oligonucleotideos de cadeia curta caracterizados por uma alta afinidade para a sua molecula a Ivo. I nibindo a interagao, os aptameros foram capazes de diminuir ou mesmo abolir a ativagao permanente do receptor adrenergico beta 1 sem a necessidade de remogao desses anticorpos. Alem disso, aptameros para uso em tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes que sao associados com a presenga de autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G tern sido divulgados no documento WO 2012/119938 A2.
[0017] De acordo com uma realizagao preferencial, os aptameros sao usados para diminuir ou abolir a ativagao do receptor acoplado a proteina G pelos respectivos autoanticorpos. De acordo com outra realizagao preferencial, os aptameros sao usados para neutralizar os autoanticorpos direcionados contra um receptor acoplado a proteina G e/ou reduzir o efeito dos autoanticorpos nos receptores acoplados a proteina G ao qual eles sao direcionados contra.
[0018] No entanto, somente um numero muito limitado de aptameros que poderia ser aplicado contra as doengas autoimunes especificas mencionadas acima estao atualmente disponiveis e a sua eficacia e inocuidade para a aplicagao em pacientes humanos continua a ser confirmada. A disponibilidade de aptameros adicionais que apresentam interferencia melhorada com a interagao de autoanticorpos com GPCRs e, portanto, desejada.
[0019] Consequentemente, e um objeto da presente invengao fornecer novos aptameros para o uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
[0020] Alem disso, e outro objeto da presente invengao fornecer uma Composicao farmaceutica que compreende essas moleculas de aptameros bem como colunas de aferese que compreendem esses aptameros.
[0021] Tambem e um objeto da presente invengao fornecer um metodo para a determinagao de sequencias de nucleotideos de novos aptameros para o uso na terapia e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
DESCRICAQ RESUMIDA DA INVENCAO
[0022] Este objeto e resolvido pelos aspectos da presente invengao conforme especificado desse ponto em diante.
[0023] De acordo com o primeiro aspecto da presente invengao, e fornecido um aptamero que compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz uma gramatica definida pelo conjunto de regras de produgao P: P = { s > M | Y| D | E | H (1) M > NRM (2) M > MR (3) M > RM (4) N > M (5) D > YM (6) E > VM (6a) Y — > K | KL | LK | LKL (7) H > LV | V (8) R > L (9) Z > A|C|G |T (10) L > ZL | Z (11) BX - > Gx (12) CX - > BXLBX (13) M > CXLCX (14) K > CXLBX (15) V > CXL (16) } com as condigoes: a.) Q e o conjunto de numeros naturais b.) F e um subconjunto de numeros naturais definidos como F:={XeQ|(X>1)} c.) Usando F definimos: (1) VXeFBM:M^>CXLCX (2) \/X e FBKKCXLBX (3) \/X eFBV tV —>CXL (4) YX e F: CXBXLBX (5) e F: 5% P[ G 1 d.) U e um conjunto de nao terminals definidos como U = {S, M, N, D, E, Y, H, R, Z, L, BX, CX, K, V} Para BX e CX consulte c) e.) W e um conjunto de terminals definidos como W = {A, C, G, T, Gx} Gx denota todos os terminals que podem ser derivados de acordo com b.) e c.)(5) f.) S E U e o simbolo inicial.
[0024] para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanina e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA, em que o aptamero nao compreende a sequencia de nucleotideos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24).
[0025] Em uma realizagao preferencial do primeiro aspecto da invengao, a sequencia de nucleotideos do aptamero tem um comprimento de no maximo 593 nucleotideos.
[0026] Em outra realizagao preferencial do primeiro aspecto da invengao, a sequencia de nucleotfdeos e uma sequencia de DNA.
[0027] Ainda em outra realizagao preferencial do primeiro aspecto da invengao, a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA.
[0028] Em uma realizagao preferencial do primeiro aspecto da invengao, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das seguintes sequencias: (5’-GTTGTTTGGGGTGG-3’ SEQ ID No: 1), (5’-GTTGTTTGGGGTGGT-3’ SEQ ID No: 2), (5’-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3’ SEQ ID No: 3), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3’ SEQ ID No: 4), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 5), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 6), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 7), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 8), (5’-TGGTGGTGGTGGT-3’ SEQ ID No: 9), (5’-GGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 10), (5’-GGTGGTTGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 11), (5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 12), (5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGT GGTTGTGGTGGTGG TGG-3’ SEQ ID No: 13), (5’-GGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3’ SEQ ID No:14), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’ SEQ ID No: 15), (5’-GGTGGTGGTGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’ SEQ ID No: 16), (5’-TTTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 17), (5’-TGGTGGTGGT-3’ SEQ ID No: 18), (5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’ SEQ ID NO: 20),
[0029] Em uma realizaqao preferencial do primeiro aspecto da invenqao, a sequencia de nucleotideos do aptamero tem um comprimento de pelo menos 4 nucleotideos, preferencialmente pelo menos 8 nucleotideos, mais preferencialmente pelo menos 12 nucleotideos.
[0030] Em uma realizaqao preferencial do primeiro aspecto da invenqao, a sequencia de nucleotideos do aptamero tem um comprimento de no maximo 120 nucleotideos, preferencialmente no maximo 100 nucleotideos, mais preferencialmente no maximo 80 nucleotideos.
[0031] Em uma realizaqao preferencial do primeiro aspecto da invenqao, o aptamero e capaz de interagir com um autoanticorpo, preferencialmente um autoanticorpo que e especifico para um receptor acoplado a proteina G, preferencialmente especifico para qualquer um dos receptores acoplados a proteina G humana, receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3.
[0032] Em uma realizaqao preferencial do primeiro aspecto da invenqao, o aptamero e para uso como ingrediente seletivo durante aferese terapeutica de sangue ou constituintes do mesmo, de um paciente que sofre de uma doenqa autoimune associada com a ocorrencia de receptores acoplados a proteina G contra autoanticorpos.
[0033] Em uma realizaQao preferencial do primeiro aspecto da invenQao, a doenQa autoimune e uma das cardiomiopatias, cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, escleroderma, sindrome de Raynaud, doenQa oclusiva arterial periferica (DAOP), pre-eclampsia, rejeipao de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenQa de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina peitoral instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE)), esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilaQao atrial, vitiligo, sindrome hemolftica uremica, sindrome da pessoa ngida e/ou bloqueio cardiaco congenito.
[0034] Em uma realizaQao preferencial do primeiro aspecto da invenQao, o aptamero e para uso em detecQao in vitro de um anticorpo sendo especifico para um receptor acoplado a proteina G, humana, receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarfnico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3.
[0035] Em outra realizaQao preferencial do primeiro aspecto da invenQao, o anticorpo a ser detectado e um autoanticorpo.
[0036] Ainda em outra realizaQao preferencial do primeiro aspecto da invenQao, o anticorpo esta presente ou deriva de um fluido corporal, preferencialmente um fluido de um corpo humano, mais preferencialmente de sangue humano, plasma, soro, urina, fezes, fluido sinovial, fluido intersticial, linfa, saliva, fluido espinhal e/ou fluido lacrimal.
[0037] Ainda em outra realizaQao preferencial do primeiro aspecto da invengao, o fluido corporal e tirado de um individuo que sofre ou tem suspeita de sofrer de uma doenga autoimune, preferencialmente uma doenga autoimune associada a presenga de autoanticorpos no soro do paciente especificos para um receptor acoplado a proteina G, mais preferencialmente doengas autoimunes associadas a presenga de autoanticorpos no soro do paciente especificos para receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscannico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptores M3.
[0038] Ainda em outra realizagao preferencial do primeiro aspecto da invengao, o aptamero compreende a seguinte sequencia de nucleotideos (5’- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No. 12).
[0039] De acordo com o segundo aspecto da presente invengao, e fornecida uma Composicao farmaceutica que compreende pelo menos um aptamero da presente invengao e, opcionalmente, pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitavel.
[0040] Em uma realizagao preferencial do segundo aspecto da presente invengao, e fornecido a Composicao farmaceutica para o uso no tratamento de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
[0041] De acordo com o terceiro aspecto da presente invengao, e fornecido uma coluna de aferese que compreende um aptamero de acordo com o primeiro aspecto da invengao.
[0042] Em uma realizagao preferencial do terceiro aspecto da presente invengao, a coluna de aferese e fornecida para uso no tratamento e/ou diagnostico de uma doenga autoimune, em que a doenga autoimune e cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, esclerodermia, sindrome de Raynaud, doenga obstrutiva da arterial periferica (PAOD), pre-eclampsia, rejeigao de aloenxerto do rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenga de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina peitoral instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE), esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilagao atrial, vitiligo, sindrome hemolitica uremica, sindrome da pessoa rlgida e/ou bloqueio cardlaco congenito.
[0043] De acordo com o quarto aspecto da presente invengao, e fornecido um metodo para a preparagao de um oligonucleotldeo aptamero que compreende as etapas de determinagao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero que compreende a aplicagao dos seguintes conjuntos de regras de produgao P: p = { s -> M|Y|D|E|H (1) M NRM (2) M -> MR (3) M -> RM (4) N M (5) D YM (6) E -> VM (6a) Y -> K | KL | LK | LKL (7) H LV | V (8) R L (9) Z A| C| G |T (10) L ZL|Z (11) BX —; > Gx (12) CX —■ > BXLBX (13) M —■ ► CXLCX (14) K —■ > CXLBX (15) V —i ► CXL (16) } com as condigoes: a.) Q e o conjunto de numeros naturais b.) F e um subconjunto de numeros naturais definidos como F:={XeQ| (X>1)} c.) Usando F definimos: (1) VXeFBM:M^>CXLCX (2) VX^FBK.K ^CXLBX (3) VXeF3V:V^>CXL (4) VXeF:CX^>BXLBX (5) XfX eF:BX 1 d.) U e um conjunto de nao terminais definidos como U = {S, M, N, D, E, Y, H, R, Z, L, BX, CX, K, V}
[0044] Para BX e CX consulte c) e.) W e um conjunto de nao terminais definidos como W = {A, C, G, T, Gx} Gx denota todos os terminais que podem ser derivados de acordo com b.) e c.)(5) f.) S e Ueo simbolo inicial.
[0045] em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanina e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de RNA, e que produz um oligonucleotideo aptamero que tem a sequencia de nucleotideos obtida na primeira etapa.
DESCRICAO DAS FIGURAS
[0046] A Figura 1 mostra a neutralizagao dos AABs adrenoceptores alfal por aptameros (2 pL).
[0047] A Figura 2 mostra a neutralizagao dos AABs adrenoceptores betal por aptameros (2 pL).
[0048] A Figura 3 mostra a influencia dos aptameros sobre os efeitos dos AABs contra os receptores PAR1/PAR2.
[0049] A Figura 4 mostra a neutralizagao de AABs do receptor da endotelina 1 ETA por aptameros (2 pL).
[0050] A Figura 5 mostra a neutralizagao do efeito do AAB B1 - adrenoceptor pelos aptameros de SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 19 e SEQ ID No. 20.
[0051] A Figura 6 mostra os efeitos de diferentes aptameros (2 pL) sobre a taxa de batimento dos cardiomiocitos.
[0052] A Figura 7 mostra os efeitos do aptamero de SEQ ID No. 12 sobre AABs direcionados contra diferentes receptores acoplados a proteina G.
[0053] A Figura 8 mostra a neutralizagao dos AABs adrenoceptores beta 1 por 100 nM, 400 nM e 1000 nM de diferentes aptameros (SEQ ID No.: 1, 4a 9, 11 a14e16a18)de acordo com a invengao (2 pL).
[0054] A Figura 9 mostra identidades de sequencia mutuas de aptameros calculadas com o uso de gramatica fornecida de acordo com a invengao entre si (SEQ ID No.: 25 a 45) e com sequencias de controle (SEQ ID No.: 46 a 50) que nao estao de acordo com a invengao.
[0055] A Figura 10 mostra a neutralizagao de AABs adrenoceptores betal por 100 nM de diferentes aptameros (SEQ ID No.: 25 a 45) de acordo com a invengao (2 pL).
[0056] A Figura 11 mostra a neutralizagao de AABs adrenoceptores betal por 400 nM de diferentes aptameros (SEQ ID No.: 31 a 34, 44 e 45) de acordo com a invengao (2 pL).
[0057] Figura 12 mostra a neutralizagao dos AABs adrenoceptores betal por 100 nM, 400nM e 1000 nM de diferentes sequencias de controle (SEQ ID No.: 46 a 50) que nao estao de acordo com a invengao (2 pL).
[0058] A Figura 13 mostra a atividade de AABs adrenoceptores beta 1 isolados de pacientes que sofrem de depressao ou cardiomiopatia de Chagas (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12.
[0059] A Figura 14 mostra a atividade de AABs adrenoceptores beta 2 isolados de pacientes que sofrem de glaucoma, esquizofrenia, cardiomiopatia de Chagas, sindrome hemolitica uremica (EHEC) ou doenga de Alzheimer (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12.
[0060] A Figura 15 mostra a atividade de AABs AT1 isolados de pacientes que sofrem de alopecia, rejeigao de aloenxerto renal ou pressao sanguinea alta em doenga renal (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12.
[0061] A Figura 16 mostra a atividade de AABs ETA isolados de pacientes que sofrem de hipertensao arterial pulmonar, doenga de Raynaud, angina de peito ou pressao sanguinea alta em doenga renal (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12.
[0062] A Figura 17 mostra a atividade dos AABs alfa 1 isolados de pacientes que sofrem de hipertensao arterial pulmonar, quimioterapia, esclerose multipla, alopecia, alopecia areata, sindrome hemolitica uremica (EHEC), sindrome de Sjogren, doenga de Alzheimer, neurodermatite, Diabetes mellitus Tipo I ou psorlase (da esquerda para a direita) na ausencia ou presenga de 100 nM do aptamero inventive de SEQ ID No.: 12.
[0063] A Figura 18 mostra a atividade de AABs PAR isolados de pacientes que sofrem de doenga de Raynaud, angina de peito ou sindrome de Sjogren (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No: 12.
[0064] A Figura 19 mostra a atividade de AABs MAS isolados de pacientes que sofrem de quimioterapia, esclerose multipla ou Diabetes mellitus Tipo I (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12.
[0065] A Figura 20 mostra a atividade de AABs 5HT4 isolados de pacientes que sofrem de depressao, esquizofrenia ou enxaqueca/doenga de Parkinson (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12.
[0066] A Figura 21 mostra a atividade de AABs M2 isolados de pacientes que sofrem de cardiomiopatia de Chagas, alopecia areata, enxaqueca / doenga de Parkinson ou sindrome de Sjogren (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No: 12.
DESCRICAO DETALHADA DA INVENCAO
[0067] Os presentes inventores reconheceram que os oligonucleotideos que sao capazes de interagir com autoanticorpos especificos para receptores acoplados a proteina G e interferir na interagao patogenica entre estas duas moleculas compartilham padroes moleculares definidos. Partindo-se deste reconhecimento, os inventores desenvolveram com sucesso uma gramatica definida pelo conjunto de regras de produgao P, de acordo com a reivindicagao 1, que reproduz os padroes estruturais de aptameros que sao ligantes efetivos para autoanticorpos GPCR.
[0068] Ate o momento, apenas um numero muito limitado de aptameros era conhecido na tecnica, que parece interferir na ligagao de autoanticorpos a receptores acoplados a proteina G. A tentativa de identificar novos aptameros que sao adequados para o tratamento e/ou diagnostic© de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G e muito trabalhosa e nao e nada promissora para finalmente determinar uma sequencia de nucleotideos adequada, em particular tendo em vista requisites estritos para a aplicagao farmaceutica de aptameros no diagnostico ou terapia em pacientes humanos. Para este firn, era altamente desejavel fornecer aptameros adicionais para uso contra estas doengas autoimunes.
[0069] Os presentes inventores identificaram agora, pela primeira vez, os pontos comuns estruturais de aptameros que sao efetivos contra doengas associadas a autoanticorpos de receptores acoplados a proteina G e foram capazes de definir um conjunto de regras de produgao para definir um conjunto de sequencias de nucleotideos que sao funcionais e efetivas como aptameros. Dessa forma, tornou-se agora possivel, pela primeira vez, fornecer um numero aumentado de aptameros que interferem nos autoanticorpos GPCR.
[0070] Uma abordagem comum para identificar sequencias que compartilham as mesmas propriedades ou quase altamente identicas e filtrar todas as sequencias que mostram uma identidade de sequencia, por exemplo, de pelo menos 80 ou 90% a uma dada sequencia que tem essas propriedades. A ideia por tras dessa abordagem e que sequencias altamente similares devem compartilhar propriedades altamente similares.
[0071] Esta relagao entre a similaridade de sequencias e a preservagao de propriedades funcionais tem sido usada e aplicada por muitos anos, por exemplo, no contexto de modelagem baseada em conhecimento. No entanto, sabe-se que existem sequencias de nucleotideos ou de aminoacidos que compartilham identidades baixas de sequencia mutua, mas que tem ainda propriedades altamente similares. Para reconhecer e descrever essas sequencias que mantem a fungao apesar da baixa similaridade de sequencia, sao necessaries metodos mais sofisticados.
[0072] O reconhecimento dos inventores apresentado no presente pedido e desenvolver e usar uma gramatica para reconhecer e definir especificamente sequencias validas e funcionais, sem consideragao de identidades de sequencia. Com o uso desta gramatica, e possivel calcular apenas sequencias que tem as propriedades das sequencias especificas procuradas. A mesma gramatica tambem pode ser usada para reconhecer especificamente sequencias que tem a propriedades desejadas em um conjunto de sequencias arbitrarias.
[0073] A precisao das gramaticas em gerai e refletida pelo fato de apenas um caracter errado ou um caracter em uma posigao errada poder levar a uma sequencia que nao pode ser reconhecida pela gramatica. Isto e altamente relevante para a presente invengao e para a sua aplicagao. Um nucleotideo errado em uma posigao crucial das sequencias de aptameros reivindicadas, e as sequencias podem nao ser reconhecidos pela gramatica.
[0074] Com o uso desta abordagem, a invengao permite excluir especificamente todas as sequencias que nao satisfazem os criterios de sequencia estabelecidos pela gramatica e levaria, dessa forma, a uma incapacidade para ligar autoanticorpos GPCR. Por outro lado, este metodo permite calcular e/ou filtrar todas as sequencias que satisfazem os criterios definidos independentemente de qualquer complexidade ou identidade de sequencia para um dado modelo.
[0075] Para demonstrar que as propriedades funcionais das sequencias calculadas nao sao uma fungao de uma identidade ou similaridade de sequencia, mas da gramatica (sequencias funcionais com identidades de sequencias mutuas baixas tem propriedades iguais ou muito similares), as regras da dada gramatica sao aplicadas em consideragao as condigoes limites para calcular varias sequencias que mostram baixas identidades de sequencia mutua. No entanto, sera demonstrado no presente pedido que todas as sequencias assim produzidas pela gramatica tern as propriedades de ligagao reivindicadas a autoanticorpos GPCR.
[0076] A Figura 9 mostra as IDs (SEQ ID No.: 25 a 45) dos aptameros calculadas de acordo com a invengao e as suas identidades de sequencia mutua. As identidades de sequencia foram determinadas com o uso do programa de computagao Kalign com penalidade aberta e os valores de penalidade de extensao definidos como maximos. Este programa de computagao foi descrito em Lassmann e Sonnhammer, Kalign--an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. (2005) BMC bioinformatics 6:298, Lassmann et al., Kalign2: high-performance multiple alignment of protein and nucleotide sequences allowing external features, (fevereiro de 2009) Nucleic acids research 37 (3):858-65, Goujon et al., A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. (2010 Jul) Nucleic acids research 38 (Web Server issue):W695-9, McWilliam et al., Analysis Tool Web Services from the EMBL- EBI. (2013 Jul) Nucleic acids research 41 (Web Server issue):W597-600 e Li et al., The EMBL-EBI bioinformatics web and programmatic tools framework. (2015 Jul 01) Nucleic acids research 43 (W1):W580-4.
[0077] De acordo com uma realizagao da presente invengao, as identidades entre duas sequencias de nucleotideos podem ser determinadas conforme descrito acima. De acordo com outra realizagao da presente invengao, as identidades entre duas sequencias de nucleotideos podem ser determinadas de acordo com um ou mais dos documentos citados acima.
[0078] Uma ampla faixa de diferentes sequencias reivindicadas de acordo com a invengao foi calculada essencialmente cobrindo a faixa completa de identidades de sequencias teoricamente possiveis. Pode-se observar a partir da Figura 9 que as identidades de sequencias mutuas entre sequencias de aptameros funcionais variam em 90% (entre SEQ ID No.: 38 e 42 ou 40 e 41) a 11% (entre SEQ ID No.: 28 e 29).
[0079] Todas as sequencias podem ser calculadas e/ou sao reconhecidas pelas dadas regras da gramatica com o uso de Shift-Reduce Parser conforme mostrado abaixo para sequencias SEQ ID No: 12, 3, 10 e 15.
[0080] Foram usados oligonucleotideos aleatorios que nao estao de acordo com a invenpao como sequencias de controle (SEQ ID No.: 46 a 50). Estas sequencias nao sao reconhecidas pela dada gramatica. Os controles mostram uma identidade de sequencia para os aptameros inventivos funcionais em uma faixa de 10% (entre SEQ ID No.: 30 e 47) a 60% (entre SEQ ID No.: 39 e48).
[0081] Notavelmente, o aptamero inventivo de SEQ ID No: 28 tem uma identidade de sequencia de 44% a sequencia de controle de SEQ ID No: 48 que e nao funcional, conforme sera mostrado abaixo (consulte Exemplo 11 e Figura 12). Ao contrario, o aptamero inventivo de SEQ ID No: 29 mostra uma identidade de sequencia muito baixa de apenas 11% para SEQ ID No.: 28, enquanto que ambas as sequencias estao ativas, conforme sera mostrado abaixo (consulte Exemplos 9 e 10 e Figuras 10 e 11). Este exemplo que mostra identidades de sequencias muito baixas entre sequencias inventivas e identidades comparativamente mais altas para uma sequencia nao funcional (isto e, quatro vezes mais elevada) indica claramente que a atividade das sequencias e uma funpao das semelhanpas das sequencias representadas pela gramatica e nao da identidade de sequencia.
[0082] Estes resultados indicam uma relapao clara entre as propriedades de sequencias codificadas pela dada gramatica e a capacidade de uma sequencia criada ou reconhecida por ela para inibir autoanticorpos. Esta relapao nao e baseada em identidades de sequencia, mas sim na propria gramatica que foi demonstrada pelo calculo de sequencias ativas com identidades de sequencias mutuas muito baixas. Do mesmo modo, a comparagao da atividade medida dos aptameros da invenQao com os resultados das sequencias de controle confirma os achados, independente da fungao de todas as sequencias de aptameros reivindicadas no presente pedido.
[0083] Os aptameros da presente invengao sao caracterizados por satisfazer uma gramatica que e definida pelo conjunto de regras de produgao conforme definido adicionalmente pela reivindicagao 1. A dita gramatica reflete os requisites estruturais para aptameros que sao efetivos contra doengas autoimunes associadas a autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
[0084] Em uma realizagao preferencial da presente invengao, o aptamero compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz uma gramatica que caracteriza uma linguagem livre de contexto (gramatica tipo 2 na hierarquia de Chomsky) ou uma linguagem sensfvel ao contexto (gramatica tipo 1 na hierarquia de Chomsky) ou uma linguagem (enumeravel de maneira recorrente) que e descrita por gramaticas de estrutura de frase (gramatica tipo 0 na hierarquia de Chomsky). Em uma realizagao mais preferencial, o aptamero compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz uma gramatica que caracteriza uma linguagem livre de contexto (gramatica tipo 2 na hierarquia de Chomsky).
[0085] Para o proposito desta invengao, o termo “aptamero” refere- se a um oligonucleotideo que se liga especificamente e com alta afinidade a uma molecula alvo. Sob condigoes definidas, os aptameros podem se dobrar em uma estrutura tridimensional especffica.
[0086] O aptamero da invengao compreende ou consiste em uma sequencia de moleculas de acidos nucleicos, os nucleotideos. De acordo com uma realizagao preferencial, o aptamero da invengao consiste em uma sequencia de nucleotideos que satisfaz a gramatica de acordo com a presente invenQao ou que consiste em uma sequencia de nucleotideos de outro modo definida no presente pedido.
[0087] O aptamero da invenQao preferencialmente compreende D- e/ou L-nucleotideos nao modificados e/ou modificados. De acordo com o codigo de uma letra comum de bases de acidos nucleicos “C” corresponde a citosina, “A” corresponde a adenina, “G” corresponde a guanina e “T” corresponde a timina se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA e “T” corresponde a um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA. Se nao for indicado abaixo em contrario, o termo “nucleotideo” deve se referir a ribonucleotideos e desoxirribonucleotideos.
[0088] O aptamero da invengao pode compreender ou consistir em uma sequencia de nucleotideos de DNA ou de RNA e, dessa forma, pode ser citado como o aptamero de DNA ou aptamero de RNA, respectivamente. Entende-se que, se o aptamero da invengao compreende uma sequencia de nucleotideos de RNA, dentro dos motivos de sequencias especificadas ao longo da presente invengao, “T” corresponde a uracila.
[0089] Por uma questao de concisao ao longo da presente invengao, e feito referenda somente para explicitar sequencias de nucleotideos de DNA. No entanto, entende-se que as respectivas sequencias de nucleotideos de RNA tambem sao compreendidas pela presente invengao.
[0090] De acordo com uma realizagao, o uso de aptameros de DNA e preferencial. Aptameros de DNA sao geralmente mais estaveis no plasma do que os aptameros de RNA. No entanto, de acordo com uma realizagao alternativa, aptameros de RNA sao preferenciais.
[0091] Os aptameros da invengao podem compreender uma sequencia de nucleotideos contendo nucleotideos 2’-modificados, por exemplo, nucleotideos 2’-fluoro-, 2’-met6xi-, 2’-metoxietil- e/ou 2’-amino-modificados. O aptamero da invengao tambem pode compreender uma mistura de desoxirribonucleotfdeos, desoxirribonucleotfdeos modificados, ribonucleotideos e/ou ribonucleotideos modificados. Respectivamente, os termos “nucleotfdeo 2’- fluoro modificado”, “nucleotfdeo 2’-met6xi modificado”, “nucleotfdeo 2’-metoxietil- modificado” e/ou “nucleotfdeo 2-amino modificado” referem-se a ribonucleotideos modificados e desoxirribonucleotfdeos modificados.
[0092] O aptamero da invencao pode compreender modificapoes. Essas modificapoes englobam, por exemplo, alquilapao, isto e, metilapao, arilapao ou acetilapao de pelo menos um nucleotfdeo, a inclusao de enantiomeros e/ou a fusao de aptameros com uma ou mais sequencias de nucleotideos ou acidos nucleicos. Essas modificapoes podem compreender, por exemplo, modificapoes 5’- e/ou 3’-PEG ou 5’- e/ou 3’-CAP. De maneira alternativa ou alem disso, o aptamero da invenpao pode compreender nucleotideos modificados, preferencialmente selecionados a partir de acidos nucleicos bloqueados, nucleotideos 2’-fluoro-, 2’-met6xi- e/ou 2’-amino modificados.
[0093] Acidos nucleicos bloqueados (LNA) representam analogos dos respectivos nucleotideos de RNA em que a conformapao foi corrigida. Os oligonucleotideos de acidos nucleicos bloqueados compreendem um ou mais ribonucleosideos biciclicos, em que o grupo 2’-OH e conectado ao atomo de carbono C4 atraves de um grupo metileno. Os acidos nucleicos bloqueados exibem uma estabilidade melhorada versus nucleases em comparapao as respectivas contrapartes de aptameros de RNA nao modificadas. Alem disso, as propriedades de hibridizapao sao melhoradas o que permite um aumento de afinidade e especificidade do aptamero.
[0094] Outra modificapao preferencial e a adipao de uma assim chamada estrutura 3’-CAP, uma 5’-CAP e/ou de um nucleotfdeo de guanosina modificado (por exemplo, 7-metil-guanosina) para a extremidade 3’ e/ou 5’ do aptamero. Essa modificapao da extremidade 3’ e/ou 5’ tem o efeito de que o aptamero esta protegido de uma degradagao rapida por nucleases.
[0095] De maneira alternativa ou alem disso, o aptamero da invenQao pode exibir uma extremidade 3’ ou 5’ peguilada. Uma modificaQao 3’ e/ou 5’ PEG compreende a adiQao de pelo menos uma unidade de polietileno glicol (PEG), preferencialmente o grupo PEG compreende de 1 a 900 grupos etileno, mais preferencialmente de 1 a 450 grupos etileno. Em uma realizaQao preferencial, o aptamero compreende unidades PEG lineares com HO- (CH2CH2O)n-H, em que n e um numero inteiro de 1 a 900, preferencialmente n e um numero inteiro de 1 a 450.
[0096] O aptamero da invenQao pode compreender ou consistir de uma sequencia de acido nucleico com uma cadeia principal de fosfo-tioato ou pode ser completamente ou parcialmente configurado como um acido nucleico peptidico (PNA). Os aptameros de acordo com a presente invenQao podem ser ainda modificados conforme descrito em Keefe AD et al., Nat Rev Drug Discov. 2010 Jul; 9(7):537-50 ou em Mayer G, Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(15):2672-89 ou em Mayer, G. e Famulok M., Pharmazie in unserer Zeit 2007; 36: 432-436.
[0097] Alem disso, os aptameros podem ser encapsulados em veiculos adequados para proteger a sua integridade estrutural, bem como para promover a sua liberaQao dentro das celulas. Os vefculos preferenciais incluem lipossomos, vesiculas lipidicas, microparticulas e similares.
[0098] As vesiculas lipidicas assemelham-se as membranas plasmaticas, e podem ser feitas para se fundirem as membranas celulares. A maioria dos lipossomos e vesiculas multilamelares nao sao facilmente fusogenicas, principalmente porque a energia armazenada do raio de curvature da vesicula e minima. As vesiculas lipidicas preferenciais incluem pequenas vesiculas unilamelares. As pequenas vesiculas unilamelares contempladas para encapsular os aptameros da presente invenQao sao muito fusogenicas, porque tern um raio de curvature muito estreito. O diametro medio de uma pequena vesicula unilamelar e de 5 nm a 500 nm; preferencialmente 10 nm a 100 nm, mais preferencialmente 20 nm a 60 nm, incluindo 40 nm. Este tamanho permite que as vesiculas passem atraves dos espagos entre as celulas endoteliais, permitindo assim a distribuigao sistemica de vesiculas contendo o aptamero apos administragao intravenosa. As vesiculas uteis podem variar muito em tamanho e sao selecionadas de acordo com uma aplicagao especifica com um aptamero.
[0099] Pequenas vesiculas unilamelares podem ser facilmente preparadas in vitro com o uso de procedimentos disponiveis na tecnica (como por exemplo, divulgado no documento WO 2005/037323 A2). As composigoes a partir das quais as vesiculas sao formadas contem um fosfolipideo que e um formador estavel de vesiculas, preferencialmente em conjunto com outro lipideo polar e opcionalmente com um ou mais lipideos polares adicionais e/ou formadores de balsas. Os fosfolipideos preferenciais, que sao formadores estaveis de vesiculas incluem 1-palmitoil-2-docosa-hexaenoil-sn-glicero-3- fosfocolina e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Os lipideos polares preferenciais incluem: 1- palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato, 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-etilfosfocolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dioleoil- sn-glicero-3- [fosfo-l-serina], uma esfingomielina tipica, 1,2-dimiristoil-sn-glicerol e 1 -palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina.
[00100] Outros lipideos polares preferenciais incluem fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina de cadeia mista, fosfatidiletanol e fosfolipideos contendo acidos docosa-hexaenoicos. Um exemplo de um formador de balsa preferencial e o colesterol.
[00101] Uma vantagem de modificar o aptamero da invengao por uma das formas mencionadas acima e que o aptamero pode ser estabilizado contra influencias prejudiciais, como, por exemplo, nucleases presentes no ambiente em que o aptamero e usado. As ditas modificapoes tambem sao adequadas para adaptar as propriedades farmacologicas do aptamero. As modificapoes preferencialmente, nao alteram a afinidade ou a especificidade do aptamero.
[00102] O aptamero da invenpao tambem pode ser conjugado com uma molecula carreadora e/ou a uma molecula reporter. Moleculas carreadoras compreendem essas moleculas que, quando conjugadas ao aptamero, proIongam a meia-vida do plasma do aptamero conjugado em plasma humano, por exemplo, melhorando a estabilidade e/ou afetando a taxa de excrepao. Um exemplo de uma molecula carreadora adequada e o PEG.
[00103] Moleculas reporteres compreendem moleculas que permitem a detecgao do aptamero conjugado. Exemplos dessas moleculas reporter sao GFP, biotina, colesterol, corantes como, por exemplo, corantes fluorescentes, moleculas reporter eletroquimicamente ativas e/ou compostos que compreendem residues radioativos, em particular radionuclideos adequados para deteepao de PET (tomografia por emissao de positrons) como, por exemplo, 18F, 11C, 13N, 15O, 82Rb ou 68Ga. O tecnico no assunto esta bem ciente do carreador adequado e das moleculas reporter, e das formas como conjuga-los ao aptamero da invenpao.
[00104] Em uma realizapao preferencial, a sequencia de nucleotideos do aptamero da presente invenpao tem um comprimento de pelo menos 4 nucleotideos, mais preferencialmente pelo menos 8 nucleotideos, ainda mais preferencialmente de pelo menos 12 nucleotideos e ainda mais preferencialmente pelo menos 16 nucleotideos. Em outra realizapao preferencial, a sequencia de nucleotideos do aptamero da presente invenpao tem um comprimento de no maximo 120 nucleotideos, mais preferencialmente de no maximo 100 nucleotideos, ainda mais preferencialmente de no maximo 80 nucleotideos e ainda mais preferencialmente de no maximo 60 nucleotideos. De acordo com uma realizaQao, a sequencia de nucleotideos do aptamero da presente invenQao tem um comprimento de no maximo 40 nucleotfdeos, em particular de no maximo 20 nucleotfdeos.
[00105] De acordo com a presente invenQao, o aptamero nao consiste ou compreende qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24). Esta condiQao deve ser aplicada a qualquer definiQao de um aptamero ou de um grupo de aptameros de acordo com a presente invenQao, conforme descrito ou definido no presente pedido.
[00106] De acordo com uma realizaQao preferencial, o aptamero da presente invenQao nao consiste ou compreende qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos SEQ ID NO: 22, 23 ou 24 ou qualquer sequencia que e mais de 90% identica a qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos SEQ ID NO: 22, 23 ou 24. De acordo com outra realizaQao preferencial, o aptamero da presente invenQao nao consiste ou compreende qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos SEQ ID NO: 22, 23 ou 24 ou qualquer sequencia que e mais de 85% identica a qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos SEQ ID NO: 22, 23 ou 24. De acordo com uma realizaQao especifica, o aptamero da presente invenQao nao consiste ou compreende qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos SEQ ID NO: 22, 23 ou 24 ou qualquer sequencia que e pelo menos 80% identica a qualquer uma das sequencias de nucleotfdeos SEQ ID NO: 22, 23 ou 24.
[00107] De acordo com outra realizaQao preferencial da presente invenQao, sequencias de aptameros fazem parte da invenQao que consiste ou compreende uma sequencia de acido nucleico sendo pelo menos 85% identica as sequencias de aptameros individualizadas que sao divulgadas no presente pedido, mais preferencialmente pelo menos 90% identica, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% identica.
[00108] A determinapao do percentual de identidade entre duas sequencias e realizada de acordo com a presente invencao pelo uso do algoritmo matematico de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873- 5877). Esse algoritmo e a base dos programas BLASTN e BLASTP de Altschul et al. (J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-410). As pesquisas de nucleotideos BLAST sao realizadas com o programa BLASTN. Para obter alinhamentos de gap para propositos comparatives, Gapped BLAST e utilizado conforme descrito por Altschul etal. (Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402). Ao utilizar programas BLAST e BLAST Gapped, sao usados os parametros padrao dos respectivos programas.
[00109] De acordo com uma realizapao preferencial da presente invenpao, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das seguintes sequencias: (5’-GTTGTTTGGGGTGG-3’ SEQ ID No: 1), (5’- Gl IGI I IGGGGIGGI-3' SEQ ID No: 2), (5’- GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3’ SEQ ID No: 3), (5’- I I IGGIGGIGGIGGI IGIGGIGGI GGIG-3’ SEQ ID No: 4), (5’- I I IGGIGGIGGIGGI IGIGGIGGIGGIGG-3’ SEQ ID No: 5), (5’- I I I GG I GG I GG I GG I I I I GG I GG I GG I GG-3’ SEQ ID No: 6), (5’- I I I GG I GG I GG I GG I GG I GG I GG I GG I GG-3' SEQ ID No: 7), (5’- I I I GG I GG I GG I GG I I IGGGI GG I GG I GG-3' SEQ ID No: 8), (5’- TGGTGGTGGTGGT-3’ SEQ ID No: 9), (5’-GGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 10), (5’-GGTGGTTGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 11), (5’- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 12), (5’- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTG GTGGTGG-3’ SEQ ID No: 13), (5’- GGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 14), (5’- TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’ SEQ ID No: 15), (5’-  GGTGGTGGTGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’ SEQ ID No: 16), (5’- TTTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 17), (5- TGGTGGTGGT-3’ SEQ ID No: 18), (5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO: 20). De acordo com outra realizaQao preferencial, o aptamero da invengao tern uma das sequencias de nucleotideos anteriormente mencionadas.
[00110] De acordo com uma realizagao mais preferencial, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma acordo com outra realizagao mais preferencial, o aptamero da invengao tern uma das sequencias de nucleotideos anteriormente mencionadas.
[00111] De acordo com uma realizagao particularmente preferencial, o aptamero compreende a sequencia de nucleotideos (5’- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No. 12). De acordo com outra realizagao particularmente preferencial, o aptamero tern a sequencia de nucleotideos (5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No. 12).
[00112] De acordo com uma realizagao preferencial diferente da presente invengao, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das seguintes sequencias: (5’- GCGGTGGTGGGATGGGTTGGATCCGC-3’ SEQ ID No: 25), (5’- GGGTCGGGATCTAGGGTCAGG-3’ SEQ ID No: 26), (5- GGIGGGICGGIAGGGI I I -3’ SEQ ID No: 27), (5’- TTGGCTGGATCGGACGGT-3’ SEQ ID No: 28), (5’- GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3’ SEQ ID No: 29), (5’- GGGATCGGTTCGGTAGGTGGGTGGGTTGG-3’ SEQ ID No: 30), (5’- GGCCGGCGCGGCCGG -3’ SEQ ID No: 31), (5’-GGAAGGATCGGAAGG-3’ SEQ ID No: 32), (5’-GGTAGGCTCGGTAGG-3’ SEQ ID No: 33), (5’- GGATGGTTAGGATGG-3’ SEQ ID No: 34), (5’- CCGTCGGTCCGTTCGGTATTTTTTTCTGGGTGGCTGAGGATCG-3’ SEQ ID No: 35), (5-GGGTTGGTCCGTTGGGTATTTTTTTATGGGTTGCCTGGTTGGG- 3’ SEQ ID No: 36), (5’- TCCCATCGGGTAGGGTTATTTGGGTTCTGGGTGGCTGAGGATCGATC-3’ SEQ ID No: 37), (5’-TGGCGGTGGT-3’ SEQ ID No: 38), (5’-TGGAGGTGGA-3’ SEQ ID No: 39), (5’-AGGTGGTGGA-3’ SEQ ID No: 40), (5-AGGTGGCGGA-3’ SEQ ID No: 41), (5’-GTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGG-3’ SEQ ID No: 42), (5’-TGGGTTGGGTTGTTGTTGTTGGGTTGGGT-3’ SEQ ID No: 43), (5’- GGTGGTGGTGGTGGTTGGTTTTTGGTTGGTGGTGGTGGTGG-3’ SEQ ID No: 44), (5’-CTGGGGTTGGGTTTGGTTTTGTTTTGGTTTGGGTTGGGGTC-3’ SEQ ID No: 45). De acordo com outra realizagao preferencial, o aptamero da invengao tem uma das sequencias de nucleotideos anteriormente mencionadas.
[00113] De acordo com uma realizagao mais preferencial, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das sequencias a seguir: 5’- GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3’ SEQ ID No: 27), (5’- TTGGCTGGATCGGACGGT-3’ SEQ ID No: 28), (5’- GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3’ SEQ ID No: 29), (5’-TGGCGGTGGT-3’ SEQ ID No: 38), (5-TGGAGGTGGA-3’ SEQ ID No: 39), (5’-AGGTGGTGGA-3’ SEQ ID No: 40), (5-AGGTGGCGGA-3’ SEQ ID No: 41). De acordo com outra realizagao mais preferencial, o aptamero da invengao tem uma das sequencias de nucleotideos anteriormente mencionadas.
[00114] De acordo com outra realizagao mais preferencial, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das sequencias a seguir: 5’- GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3’ SEQ ID No: 27), (5’- GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3’ SEQ ID No: 29), (5’-TGGCGGTGGT-3’ SEQ ID No: 38), (5-TGGAGGTGGA-3’ SEQ ID No: 39), (5’-AGGTGGTGGA-3’ SEQ ID No: 40), (5-AGGTGGCGGA-3’ SEQ ID No: 41). De acordo com outra realizapao mais preferencial, o aptamero da invenpao tem uma das sequencias de nucleotideos anteriormente mencionadas.
[00115] De acordo com outra realizapao mais preferencial, a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das sequencias a seguir: 5’- GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3’ SEQ ID No: 27), (5’- GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3’ SEQ ID No: 29), (5’-TGGCGGTGGT-3’ SEQ ID No: 38), (5-TGGAGGTGGA-3’ SEQ ID No: 39). De acordo com outra realizapao mais preferencial, o aptamero da invenpao tem uma das sequencias de nucleotideos anteriormente mencionadas.
[00116] De acordo com uma realizapao particularmente preferencial, o aptamero compreende a sequencia de nucleotideos (5’- TGGCGGTGGT-3’ SEQ ID No: 38). De acordo com outra realizapao particularmente preferencial, o aptamero tem a sequencia de nucleotideos (5’- TGGCGGTGGT-3’ SEQ ID No: 38).
[00117] Os aptameros da presente invenpao sao uteis para o tratamento e/ou diagnostico de doenpas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G. No contexto da presente invenpao, os aptameros sao considerados uteis para seres humanos, bem como para animais. De acordo com uma realizapao, os aptameros sao para uso em sujeitos humanos. De acordo com outra realizapao, os aptameros sao para uso em sujeitos animais. De acordo com uma realizapao preferencial, os aptameros da presente invenpao sao para uso no tratamento de doenpas autoimunes conforme definido no presente pedido.
[00118] As doenpas que estao associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G sao doenpas nas quais esses autoanticorpos podem ser detectados em um doente afetado por essa doenpa com o uso de metodos convencionais conhecidos na tecnica. De acordo com uma realizagao preferencial, as doengas sao causadas por autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G. De acordo com uma realizagao, o estado de um paciente no qual os autoanticorpos contra os receptores acoplados a proteina G podem ser detectados, mas nao sao mais sintomas aparentes, podem ser considerados uma doenQa autoimune associada aos autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
[00119] Dessa forma, os aptameros da presente invenQao sao preferencialmente usados no tratamento de pacientes que tern anticorpos contra um receptor acoplado a proteina G em um fluido corporal. De acordo com uma realizaQao preferencial da presente invenQao, os pacientes a serem tratados ou diagnosticados com o uso dos aptameros da presente invengao sao pacientes nos quais podem ser detectados anticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
[00120] Varias doengas ja foram relatadas ou sao conhecidas na literatura por serem associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G. Os presentes inventores conduziram investigagoes adicionais tendo em vista essa associagao e descobriram que mais doengas do que as relatadas anteriormente estao associadas a esses autoanticorpos (dados nao mostrados).
[00121] Devido a afinidade dos aptameros reivindicados aos autoanticorpos GPCR, qualquer doenga que esta associada com a presenga desses autoanticorpos e plausivel para ser tratada de modo efetivo com os aptameros apresentados e reivindicados no presente pedido. Dessa forma, de acordo com uma realizagao preferencial da presente invengao, as doengas autoimunes sao uma dentre cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, esclerodermia, sindrome de Raynaud, doenga obstrutiva da arterial periferica (PAOD), pre-eclampsia, rejeigao de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenga de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina de peito instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE), esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilagao atrial, vitiligo, sindrome hemolitica uremica, sindrome da pessoa rigida, bloqueio cardfaco congenita, diabetes mellitus Tipo I, psoriase, doenga de Alzheimer, fadiga, neurodermatite, doenga renal, esclerose lateral amiotrofica (ALS), neuropatia optica hereditaria de Leber (sindrome de LHON), asma alergica, arritmia, hipertensao refrataria, diabetes mellitus Tipo II, demencia vascular, megacolon nao Chagas e/ou hipertensao ortostatica.
[00122] Embora os dados apresentados no presente pedido demonstrem a associagao para uma grande variedade de doengas com as moleculas alvo dos aptameros de acordo com a invengao, em principio todas as doengas mencionadas no presente pedido foram reconhecidas pelos inventores como sendo associadas aos autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G e, dessa forma, promissoras de doengas alvo a serem tratadas com os aptameros de acordo com a presente invengao.
[00123] De acordo com uma realizagao preferencial da presente invengao, a doenga autoimune e uma dentre cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, esclerodermia, sindrome de Raynaud, doenga obstrutiva da arterial periferica (PAOD), pre-eclampsia, rejeigao de aloenxerto do rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenga de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina peitoral instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE), Esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilagao atrial, vitiligo, sindrome hemolitica uremica, sindrome da pessoa rigida e/ou bloqueio cardiaco congenita, mais preferencialmente, a doenga autoimune e cardiomiopatia dilatada (DCM).
[00124] De acordo com outra realizagao da presente invengao, a doenga autoimune e uma doenga cardiaca, uma doenga neurologica, uma doenga vascular, uma doenga do tecido conjuntivo (CTD), uma doenga da pele ou uma doenga de Chagas, em particular a doenga autoimune e uma doenga cardiaca, uma doenga neurologica ou uma doenga vascular. De acordo com uma realizagao particular, a doenga autoimune e uma doenga cardiaca.
[00125] Uma cardiopatia no sentido da presente invengao pode ser cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia isquemica, cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia periparto, cardiomiopatia de Chagas, fibrilagao atrial, miocardite aguda e cronica, bloqueio cardiaco congenita, angina de peito instavel, cardiomiopatia induzida por quimioterapia ou cardiomiopatia hipertrofica.
[00126] Uma doenga neurologica no sentido da presente invengao pode ser enxaqueca, depressao, epilepsia, doenga de Parkinson, esclerose multipla, cefaleia em salvas, esquizofrenia, sindrome da pessoa rigida, neuropatia de Chagas ou sindrome de dor regional complexa.
[00127] Uma doenga de um vaso no sentido da presente invengao pode ser hipertensao, hipertensao pulmonar, doenga obstrutiva da arterial periferica, hipertensao maligna ou sindrome de Raynaud.
[00128] Uma doenga do tecido conjuntivo (CTD) dentro do significado da presente invengao pode ser esclerodermia, lupus eritematoso sistemico SLE ou sindrome de Sjogren. Uma doenga de pele, dentro do significado da presente invengao pode ser alopecia areata, alopecia ou vitiligo. Uma doenga de Chagas, dentro do significado da presente invengao, pode ser megacolon de Chagas ou megaesofago de Chagas.
[00129] Em uma realizagao alternativa, a doenga autoimune e uma dentre glaucoma, sindrome metabolica, periodontite, sindrome hemolitica uremica, pre-eclampsia, hiperplasia prostatica benigna ou rejeigao de aloenxerto de rim.
[00130] De acordo com outra realizagao alternativa, a doenga autoimune e uma dentre cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia idiopatica, miocardite aguda e cronica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia periparto, hipertensao pulmonar, hipertensao, pre-eclampsia, hipertensao maligna, angina de peito instavel, cardiomiopatia isquemica, enxaqueca, depressao, esclerose multipla, doenga de Parkinson ou epilepsia, em particular uma dentre cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia idiopatica, miocardite aguda e cronica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia periparto, hipertensao pulmonar ou hipertensao, opcionalmente cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia idiopatica ou miocardite aguda e cronica.
[00131] Em particular, os aptameros da presente invengao sao capazes de interagir com um autoanticorpo, preferencialmente um autoanticorpo que e especifico para um receptor acoplado a proteina G, preferencialmente especifico para qualquer um dos receptores acoplados a proteina G humana, receptores adrenergicos alfa 1, receptores adrenergicos beta 1, receptores adrenergicos beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3 e mais preferencialmente capaz de inibir a interagao especffica destes autoanticorpos com as suas protefnas alvo.
[00132] No presente pedido, o receptor betal adrenergico tambem pode ser indicado como receptor betal, B1-AR ou betal-R. Alem disso, o receptor beta 2 adrenergico tambem pode ser indicado como receptor beta 1, B2-AR ou beta2-R. Tambem, o receptor de angiotensina II, Tipo I pode ser denominado receptor AT1 de angiotensina II, receptor AT1 de angiotensina ou AT1-R. O receptor ETA de endotelina 1 pode ser indicado como ETA-R ou ETA- 1-R e o receptor adrenergico alfa 1 tambem pode ser indicado como receptor alfa, a1-AR ou alfa R. Os receptores ativados por protease podem ser denominados PAR-R. O receptor de ligagao a angiotensina (1-7) do metabolite da Angiotensina-ll pode ser denominado no presente pedido como receptor A, receptor MAS, MAS-R ou MAS1 acoplado a proteina G mas-relacionado. O receptor 4 de 5-hidroxitriptamina pode ser abreviado em 5HT4-R enquanto que os receptores muscannicos podem ser indicados como MX-R, com o x indicando o subtipo do receptor muscannico.
[00133] De acordo com uma realizaQao da presente invenpao, o receptor M muscannico pretende englobar os receptores M1, M2, M3 e/ou M4. De acordo com outra realizapao, os receptores muscannicos M1, M2, M3 e/ou M4 sao uteis como exemplos especificos onde o receptor M3 e dado como um exemplo para um receptor acoplado a proteina G contra o qual os autoanticorpos podem ser direcionados.
[00134] Conforme mostrado abaixo, de maneira exemplar para o aptamero que tem a sequencia de SEQ ID No: 12, os aptameros da presente invenpao podem ser usados para neutralizar todo o espectro de autoanticorpos especificos para receptores acoplados a proteina G. Nos Exemplos 12 a 20 do presente pedido, este aptamero e mostrado como neutralizando especificamente varios autoanticorpos retirados de pacientes que sofrem de doenpas autoimunes associadas a estes autoanticorpos (consulte Figuras 13 a 21). Dessa forma, e plausivel que os aptameros, de acordo com a invenpao, sao capazes de neutralizar autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G e, dessa forma, efetivos no tratamento de doengas em que esses autoanticorpos estao presentes em um paciente que sofre dessa doenga.
[00135] Por inibigao do comportamento patologico dos autoanticorpos direcionados contra os receptores acoplados a proteina G, o efeito neutralizante dos aptameros da invencao diminui, ou mesmo eliminam a ativagao permanente dos respectivos receptores acoplados a proteina G. Como consequencia, nao ha necessidade de uma remogao complicada destes anticorpos. Dessa forma, a presente invengao fornece uma colegao de compostos que sao adequados para uso em tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas a presenga de autoanticorpos que reconhecem receptores acoplados a proteina G, quer dizer, doengas autoimunes associadas a presenga de autoanticorpos especificos para receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3.
[00136] Alem disso, apos imobilizagao, os aptameros da presente invengao sao capazes de capturar ou imobilizar os autoanticorpos indicados acima. Dessa forma, e fornecida uma plataforma para estabelecer uma tecnologia de aferese para limpar o soro do paciente a partir dos autoanticorpos e para desenvolver uma ferramenta analitica para a medigao dos autoanticorpos. A ultima pode ser usada, em particular, para diagnostico de doengas autoimunes.
[00137] De acordo com uma realizagao preferencial, os aptameros da presente invengao sao para uso no diagnostico de uma doenga autoimune, conforme definido no presente pedido. Em particular, os aptameros sao para uso em detecgao in vitro de um anticorpo sendo especifico para um receptor acoplado a proteina G, humana, receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3. De acordo com outra realizagao preferencial, os aptameros da presente invengao sao para uso no diagnostico in vivo de uma doenga autoimune, conforme definido no presente pedido. De acordo com uma realizagao mais preferencial, o anticorpo a ser detectado e um autoanticorpo.
[00138] Conforme usado no presente pedido, “autoanticorpo” significa um anticorpo formado em resposta a, e que reage contra, um constituinte antigenico dos proprios tecidos do paciente. Esse anticorpo pode atacar as celulas, tecidos ou proteinas nativas do organismo no qual ele se formou e esta usualmente associado a um processo patogenico no dito organismo.
[00139] De acordo com uma realizagao preferencial, o anticorpo que e especifico para um receptor acoplado a proteina G esta presente ou deriva de um fluido corporal, preferencialmente um fluido de um corpo humano, mais preferencialmente de sangue humano, plasma, soro, urina, fezes, fluido sinovial, fluido intersticial, linfa, saliva, fluido espinhal e/ou fluido lacrimal. Mais preferencialmente, o fluido corporal e tirado de um individuo que sofre ou tern suspeita de sofrer de uma doenga autoimune, preferencialmente uma doenga autoimune associada a presenga de autoanticorpos no soro do paciente especificos para um receptor acoplado a proteina G, mais preferencialmente doengas autoimunes associadas a presenga de autoanticorpos no soro do paciente especificos para receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptores M3.
[00140] O aptamero da invengao, quando usado para tratamento ou diagnostico de uma doenga autoimune, nao necessariamente necessita ser administrado a um individuo ou paciente. O efeito terapeutico ou de diagnostico tambem pode ser obtido pelo uso do aptamero da invengao para a eliminagao de anticorpos como, por exemplo, autoanticorpos do corpo ou de fluidos corporals.
[00141] Essa eliminagao pode compreender a aplicagao do aptamero da invengao em uma configuragao em que o aptamero da invengao e colocado em contato com um fluido corporal unicamente ex vivo, por exemplo, durante a adsorgao imune e/ou aferese, de modo que o aptamero da invengao nao entre no corpo do individuo ou do paciente a ser tratado. Dessa forma, a presente invengao tambem e direcionada a uma coluna de aferese que compreende um aptamero da presente invengao.
[00142] A aferese e uma tecnologia medica na qual o sangue de um doador ou paciente e passado atraves de um aparelho que separa um constituinte particular e devolve o resto a circulagao do doador ou do paciente. Dessa forma, a aferese e conduzida ligando o plasma do paciente, o corpo do paciente e os meios atingindo o efeito terapeutico, isto e, o aptamero ligado a coluna, em um circuito fechado. O aptamero da invengao pode ser usado como ingrediente seletivo durante a aferese. O ingrediente seletivo e responsavel pela separagao especifica dos constituintes particulares desejados, principalmente os anticorpos ou autoanticorpos presentes na amostra ou no sangue que sao especificamente direcionados pelo aptamero da invengao.
[00143] Preferencialmente, o aptamero da invengao e usado para tratamento e/ou diagnostico de uma doenga autoimune, em que a doenga autoimune e cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DOM), cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, esclerodermia, sindrome de Raynaud, doenga obstrutiva da arterial periferica (PAOD), pre-eclampsia, rejeigao de aloenxerto do rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenga de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina peitoral instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE), Esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilagao atrial, vitiligo, sindrome hemolitica uremica, sindrome da pessoa rigida e/ou bloqueio cardiaco congenito. Ainda mais preferencialmente, o aptamero da invengao e usado como ingrediente seletivo para a aferese terapeutica de sangue ou partes derivadas do mesmo, de um paciente que sofre de uma doenga autoimune, conforme ainda definido no presente pedido.
[00144] A presente invengao tambem se refere a um aptamero da invengao acoplado a um suporte solido. O tecnico no assunto esta bem ciente de tecnicas e materiais que podem ser usados para produzir esses aptameros acoplados a um suporte solido. Em uma realizagao preferencial, o suporte solido compreende um material solido que e aplicavel em ensaios medicos, bioquimicos ou biologicos.
[00145] O dito material solido compreende polimeros que sao usualmente usados como suporte em ensaios medicos, bioquimicos ou biologicos. Em particular, o aptamero da invengao pode ser acoplado a um suporte solido que permite o uso do produto resultante na fabricagao de uma coluna adequada para aferese, preferencialmente uma coluna que e adequada para uso em uma aferese para remover anticorpos especificos para um receptor acoplado a proteina G a partir de uma amostra liquida, preferencialmente de um fluido corporal.
[00146] A fabricagao ou produgao em massa de aptameros da invengao e bem conhecida na tecnica e representa uma mera atividade de rotina.
[00147] A presente invengao tambem e dirigida a uma Composicao farmaceutica que compreende pelo menos uma aptamero da invenQao e, opcionalmente, pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitavel. A invenQao tambem e dirigida a uma composicao farmaceutica que compreende um aptamero da invengao ou uma mistura de diferentes aptameros da invengao e um excipiente farmaceuticamente aceitavel, como, por exemplo, um carreador ou diluente adequado.
[00148] Preferencialmente, o aptamero da invengao constitui um ingrediente ativo da Composicao farmaceutica e/ou esta presente em uma quantidade efetiva. O termo “quantidade efetiva” denota uma quantidade do aptamero da invengao que tern um efeito profilatico, diagnostico ou terapeuticamente relevante sobre uma doenga ou condigao patologica. Um efeito profilatico previne o surto de uma doenga. Um efeito terapeuticamente relevante alivia ate certo ponto um ou mais sintomas de uma doenga ou retorna ao normal, tanto parcial como completamente, um ou mais parametros fisiologicos ou bioquimicos associados ou causadores da doenga ou condigoes patologicas.
[00149] A quantidade respectiva para administrar o aptamero da invengao e suficientemente elevada para se conseguir o efeito profilatico, diagnostico ou terapeutico desejado. Sera entendido pelo tecnico no assunto que o nivel de dose especifico, a frequencia e o periodo de administragao a qualquer mamifero particular dependerao de uma variedade de fatores, incluindo a atividade dos componentes especificos empregados, a idade, o peso corporal, a saude geral, o sexo, dieta, tempo de administragao, via de administragao, combinagao de farmacos e a severidade da terapia especifica. Com o uso de meios e metodos bem conhecidos, a quantidade exata pode ser determinada por um tecnico no assunto como uma questao de experimentagao de rotina.
[00150] De acordo com uma realizagao da Composicao farmaceutica da invengao, pelo menos 20% do conteudo total de aptamero e feito de um aptamero da invengao, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 95%.
[00151] Quando usada para terapia, a composicao farmaceutica sera geralmente administrada como uma formulagao em associagao com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitaveis. O termo “excipiente” e usado no presente pedido para descrever qualquer ingrediente diferente do aptamero da invengao.
[00152] A escolha do excipiente dependera, de certa forma, do modo particular de administragao. Os excipientes podem ser carreadores e/ou diluentes adequados.
[00153] A Composicao farmaceutica da invengao pode ser administrada oralmente. A administragao oral pode envoiver a deglutigao, de modo que a Composicao entre no trato gastrointestinal, ou a administragao bucal ou sublingual pode ser empregada, para que a Composicao entre na corrente sanguinea diretamente a partir da boca.
[00154] Formulagoes adequadas para administragao oral incluem: formulagoes solidas, como comprimidos; comprimidos revestidos, capsulas contendo particulas, liquidos ou pos; pastilhas (incluindo preenchidas com liquido); e mastigaveis; multi e nanoparticulas; geis; solugoes solidas; lipossomos; peliculas, dvulos, sprays e formulagoes liquidas.
[00155] As formulagoes liquidas incluem suspensoes, solugoes, xaropes e elixires. Essas formulagoes podem ser usadas como cargas em capsulas moles ou duras e tipicamente compreendem um veiculo, por exemplo, agua, etanol, polietileno glicol, propilenoglicol, metilcelulose ou um oleo adequado e um ou mais agentes emulsificantes e/ou agentes de suspensao. As formulagoes liquidas tambem podem ser preparadas pela reconstituigao de um solido, por exemplo, a partir de um sache.
[00156] Para as formas de dosagem de comprimidos, dependendo da dose, o aptamero da invengao pode constituir-se de 0,1%, em peso, a 80%, em peso, da forma de dosagem, mais tipicamente de 5%, em peso, a 60%, em peso, da forma de dosagem. Alem disso, para o aptamero da invencao, os comprimidos contem geralmente um desintegrante.
[00157] Exemplos de desintegrantes incluem glicolato de amido sodico, carboximetilcelulose de sodio, carboximetilcelulose de calcio, croscarmelose sodica, crospovidona, polivinilpirrolidona, metilcelulose, celulose microcristalina, hidroxipropilcelulose substituida com alquila inferior, amido, amido pre-gelatinizado e alginato de sodio.
[00158] Geralmente, o desintegrante compreendera de 1%, em peso, a 25%, em peso, preferencialmente de 5%, em peso, a 20%, em peso, da forma de dosagem.
[00159] Os comprimidos podem compreender excipientes adicionais como, por exemplo, aglutinantes, agentes tensoativos, lubrificantes e/ou outros ingredientes possiveis, como por exemplo, antioxidantes, corantes, agentes aromatizantes, conservantes e/ou agentes de mascaramento do sabor.
[00160] As misturas de comprimidos podem ser comprimidas diretamente ou por rolo para formar comprimidos. As misturas de comprimidos ou porQoes de misturas podem ser alternativamente granuladas por via umida, seca ou fundida, congeladas por fusao, ou extrudidas antes da compressao. A formulagao final pode compreender uma ou mais camadas e pode ser revestida ou nao revestida; pode ser ainda encapsulada.
[00161] As formulacoes solidas para administragao oral podem ser formuladas para serem de liberaQao imediata e/ou modificada. As formulaQoes de liberaQao modificada incluem liberaQao direcionada e programada atrasada, sustentada, pulsada, controlada.
[00162] A composicao farmaceutica da invenQao tambem pode ser administrada diretamente na corrente sanguinea, no musculo ou em um orgao interno. Os meios adequados para administraQao parenterica incluem intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraniana, intramuscular e subcutanea. Dispositivos adequados para administragao parenterica incluem injetores de agulha (incluindo micro- agulha), injetores sem agulha e tecnicas de infusao.
[00163] As formulagoes parentericas sao tipicamente solugoes aquosas que podem conter excipientes como sais, carboidratos e agentes de tamponamento (preferencialmente a um pH de 3 a 9) mas, para algumas aplicagoes, podem serformulados mais adequadamente como uma solugao nao aquosa esterilizada ou sob a forma seca para ser usada em conjunto com um veiculo adequado, como agua esteril livre de pirogenio.
[00164] A preparagao de formulagoes parentericas sob condigoes estereis, por exemplo, por liofilizagao, pode ser facilmente realizada com o uso de tecnicas farmaceuticas padroes bem conhecidos pelos teenicos no assunto.
[00165] A solubilidade da Composicao farmaceutica da invengao usada na preparagao de solugoes parentericas pode ser aumentada pelo uso de tecnicas de formulagao apropriadas, como a incorporagao de agentes que aumentam a solubilidade.
[00166] As formulagoes para administragao parenterica podem ser formuladas para serem de liberagao imediata e/ou modificada. As formulagoes de liberagao modificada incluem liberagao direcionada e programada atrasada, sustentada, pulsada, controlada. Dessa forma, os compostos da invengao podem ser formulados como um liquido, solido, semissolido ou tixotropico para administragao como um deposito implantado que fornece liberagao modificada do composto ativo. Exemplos dessas formulagoes incluem stents revestidos com farmaco e microesferas de acido PGLApoly (dl-latico-coglicolico) (PGLA).
[00167] A Composicao farmaceutica da invengao tambem pode ser administrada topicamente a pele ou mucosa, isto e, de modo dermico ou transdermico. As formulagoes tipicas para essa finalidade incluem geis, hidrogeis, logoes, solugoes, cremes, pomades, pos de pulverizagao, curativos, espumas, peliculas, adesivos dermicos, pastilhas, implantes, esponjas, fibras, bandagens e microemulsoes.
[00168] Lipossomos tambem podem ser usados. Excipientes tipicos incluem alcool, agua, oleo mineral, vaselina liquida, vaselina branca, glicerina, polietilenoglicol e propileno glicol. Intensificadores de penetragao podem ser incorporados. Outros meios de administragao topica incluem a administragao por eletroporagao, iontoforese, fonoforese, sonoforese e micro- agulha ou injegao sem agulha (por exemplo, Powderject (TM), Bioject (TM), etc.). As formulagoes para administragao topica podem ser formuladas para serem de liberagao imediata e/ou modificada. As formulagoes de liberagao modificada incluem liberagao direcionada e programada atrasada, sustentada, pulsada, controlada.
[00169] Para administragao a pacientes humanos, a dose diaria total do aptamero da invengao e/ou da Composicao farmaceutica da invengao esta tipicamente na faixa de 0,001 mg a 5000 mg, dependendo, evidentemente, do modo de administragao. Por exemplo, uma dose diaria intravenosa pode necessitar apenas de 0,001 mg a 40 mg. A dose diaria total pode ser administrada em doses unicas ou divididas e pode, a criterio do medico, ficarfora do intervalo tipico dado no presente pedido.
[00170] Estas dosagens sao baseadas em um individuo humano medio com um peso de cerca de 75 kg a 80 kg. O medico sera prontamente capaz de determinar doses para os indivlduos cujo peso esta fora desta faixa, como bebes e idosos.
[00171] A presente invengao tambem engloba um kit que compreende um aptamero da invengao, uma Composicao farmaceutica, um recipiente e, opcionalmente, instrugoes escritas para uso e/ou com meios para administragao.
[00172] Para o tratamento e/ou diagnostico de uma doenga, independentemente da via de administragao, o aptamero da invengao e administrado em uma dose diaria por ciclo de tratamento nao superior a 20 mg/kg de peso corporal, preferencialmente nao superior a 10 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente selecionada entre cerca de 1 pg/kg e 20 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente selecionada entre 0,01 e 10 mg/kg de peso corporal.
[00173] Em uma realizagao, a presente invengao e direcionada para o aptamero da invengao para uso na detecgao e/ou caracterizagao in vitro de anticorpos como, por exemplo, sendo especifico para um receptor acoplado a proteina G, preferencialmente os receptores adrenergicos alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3. Consequentemente, uma realizagao preferencial da presente invengao e direcionada para uso de um aptamero, conforme definido em qualquer uma das reivindicagoes 1 a 8, para a detecgao in vitro de um anticorpo, caracterizado pelo fato de ser especifico para um receptor acoplado a proteina G, preferencialmente o receptor acoplado a proteina G humana, receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3.
[00174] Esse uso pode compreender o teste de uma amostra em um ensaio de frequencia de batimento de cardiomiocitos de rato na presenga e ausencia de uma quantidade efetiva de um aptamero da invengao. Dependendo do efeito da amostra e do aptamero da invengao na frequencia de batimento, o tecnico no assunto pode concluir sobre a presenga dos respectivos anticorpos. Tambem podem ser obtidos dados sobre a quantidade total ou relativa desses anticorpos na amostra, bem como sobre outras propriedades desses anticorpos.
[00175] O chamado ensaio de frequencia de batimento de cardiomiocitos de rato e um ensaio bem estabelecido para a detecQao e caracterizaQao de anticorpos, por exemplo, autoanticorpos derivados de pacientes, especificos para varios receptores acoplados a proteina G humana como, por exemplo, o receptor adrenergico alfa 1 humano, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M2 muscarinico, receptor AT1 de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3.
[00176] O ensaio e descrito em detalhes em Wallukat et al. (1987) Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes, Biomed. Biochim. Acta 46, 634 - 639; Wallukat et al. (1988) Cultivated cardiac muscle cells - a functional test system for the detection of autoantibodies against the beta adrenergic receptor, Acta Histochem. Suppl. 35, 145- 149; e Wallukat et al. (2010) Distinct patterns of autoantibodies against G-protein coupled receptors in Chagas’ cardiomyopathy and megacolon. Their potential impact for early risk assessment in asymptomatic Chagas’ patients, J. Am. Col. Cardiol. 55, 463 - 468. Dessa forma, o tecnico no assunto esta bem ciente da natureza deste ensaio e sabe como aplica-lo.
[00177] Para a detecQao e/ou caracterizaQao desses anticorpos, o aptamero da invenQao pode ser usado em soluQao ou em uma forma imobilizada.
[00178] O aptamero da invenQao pode ser usado para a detecQao direta e/ou indireta e/ou a caracterizaQao dos ditos anticorpos.
[00179] De acordo com outro aspecto da presente invenQao, e fornecido um metodo para a preparaQao de um oligonucleotideo aptamero que compreende as etapas de determinaQao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero que compreende a aplicaQao dos seguintes conjuntos de regras de produgao P: p = { s M|Y|D|E|H (1) M NRM (2) M -> MR (3) M -> RM (4) N M (5) D YM (6) E VM (6a) Y K | KL | LK | LKL (7) H LV | V (8) R L (9) Z A| C| G |T (10) L ZL|Z (11) BX Gx (12) CX -> BXLBX (13) M CXLCX (14) K CXLBX (15) V -> CXL (16) } com as condigoes a.) Q e o conjunto de numeros naturais b.) F e um - subconjunto de numeros naturais definidos como F:={XeQ|(X>1)} c.) Usando F definimos: (1) \/X<EFBM:M^>CXLCX (2) VX&F1K:K^>CXLBX (3) \/XeF3V:V^>CXL (4) \/X<EF:CX^>BXLBX (5) VX&F.BX ^>Y]G d.) U e um conjunto de nao terminais definidos como U = {S, M, N, D, E, Y, H, R, Z, L, BX, CX, K, V}
[00180] Para BX e CX consulte c) e.) W e um conjunto de nao terminais definidos como W = {A, C, G, T, Gx} Gx denota todos os terminais que podem ser derivados de acordo com b.) e c.)(5) f.) S G U e o simbolo inicial.
[00181] em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanina e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de RNA, e que produz um oligonucleotideo aptamero que tem a sequencia de nucleotideos obtida na primeira etapa.
[00182] De acordo com uma realizagao preferencial, a etapa de determinagao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero compreende a aplicagao da seguinte sequencia consenso: Si-(GGG-S-GGG-S)n-(GGG-S-GGG)k-Sm (1) em que n>1; i, m, k = 0,1; S = {A,C,G,T}+ ou {A,C,G}+ ou {A,C,T}+ ou {A,G,T}+ ou {C,G,T}+ ou {A,C}+ ou {A,G}+ ou {A,T}+ ou {C,G}+ ou {C,T}+ ou {G,T}+ ou {A}+ ou {C}+ ou {T}+, em que { }+ denota o Fechamento positive de Kleene do dado conjunto do alfabeto.
[00183] O termo Fechamento positive de Kleene descreve uma forma de concatenagao de membros de um conjunto finito e nao vazio de simbolos (um vocabulario ou alfabeto). Como resultado deste processo, novas palavras (sequencias de simbolos) serao criadas. Cada palavra tern um comprimento maior que zero.
[00184] De acordo com outra realizaQao preferencial da presente invengao, e fornecido um aptamero que compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz a sequencia consenso de formula (1) para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanina e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA, em que o aptamero nao compreende a sequencia de nucleotideos CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24).
[00185] Ainda de acordo com outra realizagao preferencial, a etapa de determinagao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero compreende a aplicagao da seguinte sequencia consenso Sj-(GG-S-GG-S)n-(GG-S-GG)k-Sm (2) em que n > 1; i, m, k = 0,1; S = {A,C,G,T}+ ou {A,C,G}+ ou {A,C,T}+ ou {A,G,T}+ ou {C,G,T}+ ou {A,C}+ ou {A,G}+ ou {A,T}+ ou {C,G}+ ou {C,T}+ ou {G,T}+ ou {A}+ ou {C}+ ou {T}+, em que { }+ denota o Fechamento Positive de Kleene do dado conjunto de alfabeto.
[00186] De acordo com outra realizagao preferencial da presente invengao, e fornecido um aptamero que compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz a sequencia consenso de formula (2) para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanina e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA, em que o aptamero nao compreende a sequencia de nucleotideos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24).
[00187] De acordo com outra realizagao preferencial, a etapa de determinagao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero compreende a aplicagao da seguinte sequencia consenso: Si-P-(LM)j-Ek; (3) em que i, k = 0,1; j>= 0; P = (Gm-(X)-Gm-(Y)-Gm-(Z)-Gm); M = (Gm-(X)-Gm-(Y)-Gm-(Z)-Gm); m > 1; S,L,E,X,Y,Z = {A,C,G,T}+ ou {A,C,G}+ ou {A,C,T}+ ou {A,G,T}+ ou {C,G,T }+ ou {A,C}+ ou {A,G}+ ou {A,T}+ ou {C,G}+ ou {C,T}+ ou {G,T}+ ou {A}+ ou {C}+ ou {T}+ onde {}+ denota o Fechamento positive de Kleene do dado conjunto do alfabeto.
[00188] De acordo com outra realizagao preferencial da presente invengao, e fornecido um aptamero que compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz a sequencia consenso de formula (3) para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanine e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA, em que o aptamero nao compreende a sequencia de nucleotideos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24).
[00189] De acordo com outra realizagao preferencial, a etapa de determinagao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero compreende a aplicagao da seguinte sequencia consenso: Si-P-Ej; (4) em que i, j = 0,1; P = (Gm-(X)-Gm-(Y)-Gm); m > 1; X,Y,S,E = {A,C,G,T}+ ou {A,C,G}+ ou {A,C,T}+ ou {A,G,T}+ ou {C,G,T }+ ou {A,C}+ ou {A,G}+ ou {A,T}+ ou {C,G}+ ou {C,T}+ ou {G,T}+ ou {A}+ ou {C}+ ou {T}+ onde {}+ denota o Fechamento positive de Kleene do dado conjunto do alfabeto.
[00190] De acordo com outra realizagao preferencial da presente invengao, e fornecido um aptamero que compreende uma sequencia de nucleotideos que satisfaz a sequencia consenso de formula (4) para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que “A” significa um nucleotideo adenina, “C” significa um nucleotideo citosina, “G” significa um nucleotideo guanina e “T” significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA, e “T” significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA, em que o aptamero nao compreende a sequencia de nucleotideos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24).
[00191] Com o uso do metodo da presente invencao, e possivel determinar sequencias de nucleotideos que tem os padroes estruturais que sao necessaries e suficientes para serem efetivos como aptameros terapeuticos e/ou de diagnostico para uso no tratamento e/ou diagnostico de doengas autoimunes associadas com autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
[00192] As sequencias de aptameros da presente invengao podem ser geradas pelo uso do metodo de acordo com a presente invengao. A seguir, a derivagao da sequencia de SEQ ID No.: 12 de acordo com a presente invengao e mostrada de maneira exemplar: DERIVACAO DE SEQUENCIA N° 12 (5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’) X = 2 S -> M NRM MRM C2LC2RM C2LC2RC2LC2 B2LB2LC2RC2LC2 B2LB2LB2LB2RC2LC2 B2LB2LB2LB2RB2LB2LC2 B2LB2LB2LB2RB2LB2LB2LB2 GGLB2LB2LB2RB2LB2LB2LB2 GGLGGLB2LB2RB2LB2LB2LB2 GGLGGLGGLB2RB2LB2LB2LB2 GGLGGLGGLGGRB2LB2LB2LB2 GGLGGLGGLGGRGGLB2LB2LB2 GGLGGLGGLGGRGGLGGLB2LB2 GGLGGLGGLGGRGGLGGLGGLB2 GGLGGLGGLGGRGGLGGLGGLGG GGZGGLGGLGGRGGLGGLGGLGG GGTGGLGGLGGRGGLGGLGGLGG GGTGGZGGLGGRGGLGGLGGLGG GGTGGTGGLGGRGGLGGLGGLGG GGTGGTGGZGGRGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGRGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGLGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGZLGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGZZGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGTZGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGTTGGLGGLGGLGG GGTGGTGGTGGTTGGZGGLGGLGG GGTGGTGGTGGTTGGTGGLGGLGG GGTGGTGGTGGTTGGTGGZGGLGG GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGLGG GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGZGG GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGTGG SEQ ID NO: 12
[00193] Com o uso de um Analisador Shift-Reduce a sequencia de SEQ ID No.: 12 tambem pode ser reconhecida em um conjunto de sequencias randomizadas como uma sequencia valida apos aplicar as regras da gramatica listada na tabela a seguir. Visto que a sequencia de entrada pode ser reduzida para o simbolo de inicio S a sequencia e uma sentenga valida para a gramatica definida.
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
[00194] A exemplificagao adicional de derivagao das sequencias de aptameros reivindicadas de SEQ ID No.: 3,10 e 15 de acordo com a presente invencao e mostrada abaixo: DERIVACAO DE SEQUENCIA N° 3 (5’-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3’) X = 3 S -> M RM LM LC3LC3 ZLC3LC3 ZZLC3LC3 ZZZLC3LC3 ZZZZLC3LC3 ZZZZZLC3LC3 ZZZZZZLC3LC3 ZZZZZZZLC3LC3 ZZZZZZZZLC3LC3 ZZZZZZZZZC3LC3 GZZZZZZZZC3LC3 GGZZZZZZZC3LC3 GGTZZZZZZC3LC3 GGTTZZZZZC3LC3 GGTTGZZZZC3LC3 GGTTGGZZZC3LC3 GGTTGGGZZC3LC3 GGTTGGGGZC3LC3 GGTTGGGGTB3LB3LC3 GGTTGGGGTB3LB3LB3LB3 GGTTGGGGTGGGLB3LB3LB3 GGTTGGGGTGGGZB3LB3LB3 GGTTGGGGTGGGTB3LB3LB3 GGTTGGGGTGGGTGGGLB3LB3 GGTTGGGGTGGGTGGGZLB3LB3 GGTTGGGGTGGGTGGGZZB3LB3 GGTTGGGGTGGGTGGGGZB3LB3 GGTTGGGGTGGGTGGGGTB3LB3 GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGLB3 GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGZB3 GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTB3 GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG SEQ ID NO: 3 DERIVACAO DE SEQUENCIA N° 10 (5’-GGTGGTGGTGG-3’) X = 2 S M C2LC2 B2LB2LC2 GGLB2LC2 GGZB2LC2 GGTB2LC2 GGTGGLC2 GGTGGZC2 GGTGGTC2 GGTGGTB2LB2 GGTGGTGGLB2 GGTGGTGGZB2 GGTGGTGGTB2 DERIVACAO DE SEQUENCIA N° 15 (5’- TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3’) X = 2 S M RM RNRM RNRMR RMRMR LMRMR ZLMRMR ZZLMRMR ZZZMRMR TZZMRMR TTZMRMR TTTMRMR TTTC2LC2RMR TTTB2LB2LC2RMR TTTGGLB2LC2RMR TTTGGLB2LC2RMR TTTGGZB2LC2RMR TTTGGTB2LC2RMR TTTGGTGGLC2RMR TTTGGTGGZC2RMR TTTGGTGGTC2RMR TTTGGTGGTB2LB2RMR TTTGGTGGTGGLB2RMR TTTGGTGGTGGZB2RMR TTTGGTGGTGGTGGRMR TTTGGTGGTGGTGGLMR TTTGGTGGTGGTGGZLMR TTTGGTGGTGGTGGZZLMR TTTGGTGGTGGTGGZZZLMR TTTGGTGGTGGTGGZZZZMR TTTGGTGGTGGTGGTZZZMR TTTGGTGGTGGTGGTTZZMR TTTGGTGGTGGTGGTTGZMR TTTGGTGGTGGTGGTTGTMR TTTGGTGGTGGTGGTTGTC2LC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTB2LB2LC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGLB2LC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGZB2LC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTB2LC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGLC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGZC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTC2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTB2LB2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGLB2R - » TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGZB2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTB2R TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGR TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGL - > TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGZL - > TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGZZL - > TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGZZZ TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTZ - >TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT SEQ ID NO: 15
[00195] Todas as realizagoes da presente invenQao, conforme descrito no presente pedido, sao consideradas como sendo combinaveis em qualquer combinagao, a menos que o tecnico no assunto considers essa combinagao como nao tendo qualquer significado tecnico.
EXEMPLOS ENSAIO FUNCIONAL PARA A ESTIMATIVA DA ATIVIDADE DE AUTOANTICORPO (AUTOANTICORPOS CONTRA RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEINA G, AAB)
[00196] Um ensaio funcional capaz de identificar e quantificar autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G (AAB) foi explorado para a estimativa da capacidade de neutralizagao de AAB dos aptameros da presente invengao.
[00197] Este ensaio funcional explorou os batimentos espontaneos de cardiomiocitos de ratos que foram capazes de responder aos pacientes AABs, quando adicionados com aliquotas de fragao purificada de IgG, com uma alteragao na sua frequencia de batimentos - a resposta cronotropica. A resposta cronotropica e a soma de cronotropia positiva ou cronotropia negativa causada por AABs estimulantes, como os que se direcionam aos receptores adrenergicos betal, beta2 ou alfal, receptores muscannicos M2 e o receptor tipo A de endotelina (receptor ETA) e e expressa como a diferenga para a frequencia de batimento basal, batimento/tempo delta.
[00198] Inibidores de AABs, como o adrenoceptor beta2 AAB encontrado em pacientes com asma alergica, antagonizam o efeito cronotropico positivo induzido por agonistas adrenergicos beta2.
[00199] Para diferenciar a especie AAB com relagao a sua contribuigao para a resposta cronotropica (cronotropia positiva ou negativa), a analise foi conduzida na presenga de antagonistas especificos, como ICI- 118.551 para beta2-AAB, atropina para M2-AAB, propranolol para beta1/beta2- AAB, BQ 610 ou BQ 123 para o receptor ETA, prazosina ou urapidil para o adrenoceptor alfal e Ibesartan ou Losartan para o receptor AT1. A alteragao de atividade restante e causada pelo AAB, exceto aqueles que foram especificamente bloqueados.
[00200] Alem disso, a especificidade do AAB foi analisada com mais detalhe com o uso de peptideos dos receptores acoplados a proteina G correspondentes as estruturas extracelulares dos receptores que podem neutralizar a atividade de AAB. De forma similar, os aptameros foram testados quanto a sua capacidade de neutralizagao de AAB.
[00201] Este ensaio funcional pode detectar e quantificar todos os AABs sericos humanos e outras moleculas que se direcionam a receptores na superficie celular, cujas sequencias sao homoIogas aos receptores humanos (um pre-requisito para a diregao AAB) e que estao ligadas a uma cascata de proteina que regula a frequencia de batimento (contratilidade, cronotropia) das celulas como o sistema de proteina G.
PREPARACAO DE CARDIOMIOCITOS NEONATAIS
[00202] Para a preparagao de cardiomiocitos neonatais, coragoes de ratos com 1 a 3 dias de idade foram removidos em condigoes estereis e transferidos para solugao salina tamponada com fosfato (PBS) contendo penicilina/estreptomicina. Apos a separagao do tecido do ventnculo, ele foi dissecado em pedagos e lavado duas vezes com 10 mL de PBS. Em seguida, as pegas de ventnculo dissecadas foram suspensas em 30 mL de PBS/tripsina a 0,2% e incubadas por 15 minutos a 37°C. O processo de tripsinagao foi interrompido adicionando 5 mL de soro fetal bovino neonatal inativado por calor e gelo. A suspensao resultante foi centrifugada (130 x g, 15 minutos) e o pelete transferido para 20 mL de meio SM20-I. As celulas foram contadas enquanto se dilui uma aliquota da suspensao resultante com o mesmo volume de uma solugao de azul de tripano.
[00203] 2,4x106 de celulas em suspensao em 2,0 mL de glicose contendo meio SM 20-I foi equilibrado com ar umido e suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 10%, 2 pM de fluorodeoxiuridina foram transferidos para tubos Falcon de 12,5 cm2 para cultura como monocamadas por 4 dias a 37°C. O meio foi renovado no primeiro dia e depois a cada dois dias. Os experimentos foram realizados nos frascos.
PREPARACAO DE AMOSTRAS DE SORO PARA MEDICAO DE AAB
[00204] Para a preparagao da fragao IgG, adequada para a medigao de AAB, foram misturados 1mL de soro e 660 pL de solugao saturada de sulfato de amonio (concentragao final 40% de sulfato de amonio), incubados por 18 horas a 4°C e centrifugados por 15 rninutos a 6000 x g.
[00205] O pelete foi ressuspenso em 750 pL de PBS, misturado com 750 pL de solugao saturada de sulfato de amonio (concentragao final 50% de sulfato de amonio) e centrifugado novamente. O sedimento foi suspense em 700 pL de PBS e dialisado contra o volume de 100 vezes de PBS. A fragao de IgG resultante continha os AABs e foi armazenada a -20°C ate a medigao.
PRINCIPIO DE MEDICAO DE AAB E CONFIGURACAO DO TESTE DE APTAMERO
[00206] Os experimentos foram realizados em tubos Falcon de 12,5cm2. Seis agrupamentos de celulas independentes que foram usados para a medigao foram marcados e as taxas de batimento de cardiomiocitos basais nas zonas marcadas foram registradas.
[00207] Para a medigao da atividade de AAB, as amostras de IgG preparadas foram adicionadas as celulas em uma diluigao final como indicado na figura (por exemplo, AAB 1:50 que corresponde a 40 pL da solugao de IgG preparada conforme descrito acima em 2000 pL de meio de cultura celular). Apos a adigao das amostras de IgG, os frascos foram incubados por 60 rninutos a 37°C e as taxas de batimento dos cardiomiocitos nas zonas marcadas foram novamente contadas e foram calculadas as diferengas as taxas basais de batimento que foram positivas ou negativas para atividade AAB de cronotropicos positives ou cronotropicos negatives, respectivamente.
[00208] Para o teste do efeito de aptamero, as amostras de IgG contendo AAB foram pre-incubadas com o aptamero correspondente (SEQ ID No. conforme indicado na figura) por 15 minutos antes da mistura ter sido adicionada aos cardiomiocitos. Apos um tempo de incubagao de 60 minutos (37°C), estimou-se a frequencia de batimento e calculou-se a diferenga com a taxa de batimento basal.
[00209] A adigao de 2 pL de aptamero correspondeu a adigao de 100nM de aptamero no frasco de celulas final (volume total de 2000 pL).
EXEMPLO 1
[00210] A atividade de AABs adrenoceptores alphal foi monitorada atraves de gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais (consulte a Figura 1, coluna 1: AAB 1:50). As colunas 2 a 5, e 7 da Figura 1 mostra atividade AAB reduzida apos pre-incubagao de AABs com 100 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. ID No 2, 3, 10, 15 e 20, respectivamente). Os resultados da Coluna 6 da Figura 1 foram obtidos usando 100 nM de uma sequencia de aptamero de controle (Seq. ID No. 19: TCGAGAAAAACTCTCCTCTCCTTCCTTCCTCTCCA) que nao e uma sequencia de aptamero de acordo com a presente invengao.
EXEMPLO 2
[00211] A atividade de AABs adrenoceptores betal foi monitorada atraves de gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais (consulte a Figura 2, coluna 1: AAB 1:50). As colunas 2 a 5, e 7 da Figura 2 mostra atividade AAB reduzida apos pre-incubagao de AABs com 100 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. ID No 2, 3, 10, 15 e 20, respectivamente). Os resultados da Coluna 6 da Figura 2 foram obtidos usando 100 nM de uma sequencia de aptamero de controle (Seq. ID No. 19) que nao e uma sequencia de aptamero de acordo com a presente invenQao.
EXEMPLO 3
[00212] A atividade de AABs receptor PAR1/PAR2 foi monitorada atraves de gravapao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais (consulte a Figura 3, coluna 1: AAB 1:50). As colunas 2 a 5, e 7 da Figura 3 mostra atividade AAB reduzida apos pre-incubapao de AABs com 100 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. ID No 2, 3, 10, 15 e 20, respectivamente). Os resultados da Coluna 6 da Figura 3 foram obtidos usando 100 nM de uma sequencia de aptamero de controle (Seq. ID No. 19) que nao e uma sequencia de aptamero de acordo com a presente invenpao.
EXEMPLO 4
[00213] A atividade de AABs receptor ETA de endotelina 1 foi monitorada atraves de gravapao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais (consulte a Figura 3, coluna 1: AAB 1:50). As colunas 2 a 5, e 7 da Figura 3 mostra atividade AAB reduzida apos pre-incubapao de AABs com 100 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. ID No 2, 3, 10, 15 e 20, respectivamente). Os resultados da Coluna 6 da Figura 4 foram obtidos usando 100 nM de uma sequencia de aptamero de controle (Seq. ID No. 19) que nao e uma sequencia de aptamero de acordo com a presente invenpao.
EXEMPLO 5
[00214] A influencia dependente de concentrapao dos aptameros de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 20 em AABs adrenoceptores B1 foi monitorada atraves de gravapao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais (ponto de dados “sem” na marcapao do eixo x corresponde a: AAB 1:50). As curvas visualizam a dependencia de dose do efeito aptamero do aptamero SEQ ID NO 10 e 20. A curva obtida com o uso da SEQ ID NO 19 serviu para controle desde que SEQ ID NO 19 nao seja uma sequencia de aptameros de acordo com a presente invencao.
EXEMPLO 6
[00215] No Exemplo 6, sao mostrados os efeitos por si mesmos dos aptameros da invengao (SEQ ID NO 2, 3, 10, 15, 20 e 12 mostrados na coluna.1,2,3,4,6 e 7 respectivamente) na taxa de batimento basal de cardiomiocitos. Os resultados da Coluna 5 da Figura 6 foram obtidos usando uma sequencia de aptamero de controle (Seq. ID No. 19) que nao e uma sequencia de aptamero de acordo com a presente invengao.
EXEMPLO 7
[00216] A atividade de AABs foi monitorada atraves de gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais (consulte a Figura 7, coluna 1: B1-AAB No. 1, 1:50, coluna 3: B1-AAB No. 2, 1:50, coluna 5: B1-AAB No. 3, 1:50, coluna 7: alfa1-AAB No. 1, 1:50, coluna 8: alfa1-AAB No. 2, 1:50, coluna 11: B2-AAB No. 1, 1:50, coluna 13: B2-AAB No. 2, 1:50). As colunas 2, 4, 6, 8,10,12,14 da Figura 7 apresentam atividade reduzida de AAB (B1 AAB1, B1 AAB2, B1 AAB 3, alfa 1 AAB1, alfal AAB 2, B2-AAB 1, B2-AAB 2) em 100 nM de aptamero de SEQ ID NO: 12. AAB No. 1,2 e 3 correspondem a AABs preparados a partir de diferentes materiais do paciente.
EXEMPLO 8
[00217] O Exemplo 8 foi realizado como no Exemplo 2 acima. A atividade de AABs adrenoceptores betal foi monitorada por gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais sem adigao de aptameros (consulte a Figura 8, coluna 1: AAB 1:50) e mediante adigao de aptameros de acordo com a invengao. Todas as amostras tratadas com aptamero inventivo apresentam atividade AAB reduzida apos pre-incubagao de AABs com 100 nM, 400 nM ou 1000 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. IDNo1,4a7a9, 11 a14e16a18na Figura 8, respectivamente).
EXEMPLO 9
[00218] O Exemplo 9 foi realizado como no Exemplo 2 acima. A atividade de AABs adrenoceptores betal foi monitorada por gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais sem adigao de aptameros (consulte a Figura 10, coluna 1: AAB 1:50) e mediante adigao de aptameros de acordo com a invengao. Todas as amostras tratadas com aptamero inativo apresentam atividade AAB reduzida apos pre-incubagao de AABs com 100 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. ID No 25 a 45 na Figura 8, respectivamente; para identidades mutuas dessas sequencias, consulte a Figura 9). Os experimentos com aptameros das sequencias SEQ ID No.: 31 a 34, 44 e 45 ainda tern sido relatados com o uso de 400 nM de cada aptamero (consulte abaixo no Exemplo 10).
EXEMPLO 10
[00219] O Exemplo 10 foi realizado como no Exemplo 2 acima. A atividade de AABs adrenoceptores betal foi monitorada por gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais sem adigao de aptameros (consulte a Figura 11, coluna 1: AAB 1:50) e mediante adigao de aptameros de acordo com a invengao. Todas as amostras tratadas com aptamero inativo apresentam atividade AAB reduzida apos pre-incubagao de AABs com 400 nM de aptamero da respectiva sequencia (Seq. ID No 31 a 34, 44 e 45, respectivamente).
EXEMPLO 11
[00220] O Exemplo 11 foi realizado como no Exemplo 2 acima. A atividade de AABs adrenoceptores betal foi monitorada por gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais sem adigao de aptameros (consulte a Figura 12, coluna 1: AAB 1:50) e mediante adigao de sequencias de controle que nao estao de acordo com a invengao. Todas as amostras tratadas com sequencias de controle apresentam atividade AAB nao afetada apos pre-incubaQao de AABs com 100 nM, 400 nM ou 1000 nM de controle da respectiva sequencia (Seq. ID No 46: 5’- ACCTCTCCTTCCTTCCTCTCCTCTCAAAAAGAGCT-3’, SEQ ID No 47: 5’- TCCCATCTATTATTTTTCTTCTAATCATC-3’, SEQ ID No 48: 5’- ATCTCATGAACGTAAAGCCATTCAAACG-3’, SEQ ID No 49: 5’- ACACTAGTAGCCACACTGAG-3’, SEQ ID No 50: 5’-CCTGCCCCCTAAA-3’, respectivamente).
EXEMPLO 12
[00221] O Exemplo 12 foi realizado como no Exemplo 2 acima. A atividade de AABs adrenoceptores betal isolados a partir de pacientes que sofrem de depressao ou cardiomiopatia de Chagas (da esquerda para a direita na Figura 13) foi monitorada por gravagao do aumento da taxa de batimento de cardiomiocitos neonatais sem adiQao de aptamero (consulte a Figura 13, coluna 1: AAB 1:50) e mediante adiQao de 100 nM de aptamero de SEQ ID NO: 12 de acordo com a invenQao. As amostras tratadas com aptamero inventivo apresentam atividade AAB reduzida apos pre-incubaQao de AABs com 100 nM de SEQ ID No: 12, em comparaQao a amostra de controle a qual nenhum aptamero foi adicionado.
EXEMPLO 13
[00222] O Exemplo 13 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs adrenoceptores beta 2 isolados de pacientes que sofrem de glaucoma, esquizofrenia, cardiomiopatia de Chagas, sindrome hemolitica uremica (EHEC) ou doenQa de Alzheimer (da esquerda para a direita na Figura 14) na ausencia ou presenQa de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 14
[00223] O Exemplo 14 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs AT1 isolados de pacientes que sofrem de alopecia, rejeigao de aloenxerto de rim ou pressao sangufnea alta em doenga renal (da esquerda para a direita na Figura 15) na ausencia ou na presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 15
[00224] A Figura 12 mostra a atividade de ETA AABs isolados de pacientes que sofrem de hipertensao arterial pulmonar, doenga de Raynaud, angina de peito ou pressao sanguinea alta em doenga renal (da esquerda para a direita) na ausencia ou na presenga de 100nM do aptamero da invengao de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 16
[00225] O Exemplo 16 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs alfa 1 isolados de pacientes que sofrem de hipertensao arterial pulmonar, quimioterapia, esclerose multipla, alopecia, alopecia areata, sindrome hemolitica uremica (EHEC), sindrome de Sjogren, doenga de Alzheimer, neurodermatite, Diabetes mellitus Tipo I ou psonase (da esquerda para a direita na Figura 17) na ausencia ou presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 17
[00226] O Exemplo 17 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs PAR isolados de pacientes que sofrem de doenga de Raynaud, angina de peito ou sindrome de Sjogren (da esquerda para a direita na Figura 18) na ausencia ou presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 18
[00227] O Exemplo 18 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs MAS isolados de pacientes que sofrem de quimioterapia, esclerose multipla ou Diabetes mellitus Tipo I (da esquerda para a direita na Figura 19) na ausencia ou presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 19
[00228] O Exemplo 19 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs 5HT4 isolados de pacientes que sofrem de depressao, esquizofrenia ou enxaqueca/doenga de Parkinson (da esquerda para a direita na Figura 20) na ausencia ou presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.
EXEMPLO 20
[00229] O Exemplo 20 foi realizado como no Exemplo 12 acima, em que neste Exemplo a atividade de AABs M2 isolados de pacientes que sofrem de cardiomiopatia de Chagas, alopecia areata, enxaqueca/doenga de Parkinson ou sindrome de Sjogren (da esquerda para a direita na Figura 21) na ausencia ou presenga de 100 nM do aptamero inventivo de SEQ ID No.: 12 foi monitorada.

Claims (17)

1. Uso de um aptamero compreendendo uma sequencia de nucleotideos que satisfaz uma gramatica definida pelo conjunto de regras de produgao P: P = { s » M | Y | D | E | H (1) M » NRM (2) M > MR (3) M > RM (4) N > M (5) D » YM (6) E » VM (6a) Y > K | KL | LK | LKL (7) H > LV | v (8) R > L (9) Z > A | c I G | T (10) L » ZL | Z (ID BX » Gx (12) CX > BXLBX (13) M > CXLCX (14) K » CXLBX (15) V » CXL (16) com as condigoes: a.) Q e o conjunto de numeros naturals; b.) F e um subconjunto de numeros naturals definidos como: F := {X e Q | (X > 1)} c) Usando F definimos: (1) VXeFBM:M^>CXLCX (2) YX e FBK: KCXLBX (3) VX e FSV :V CXL (4) X/XeF-CX^>BXLBX X (5) i d) U e um conjunto de nao terminals definidos como: U = {S, M, N, D, E, Y, H, R, Z, L, BX, CX, K, V} Para BX e CX consulte c); e) We um conjunto de terminals definidos como: W = {A, C, G, T, Gx} Gx denota todos os terminals que podem ser derivados de acordo com b) e c)(5); f.) S 6 U e o simbolo inicial; caracterizado pelo fato de que e na fabricagao de um medicamento para uso no tratamento de doengas autoimunes associadas a autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que "A" significa um nucleotideo adenina, "C"significa um nucleotideo citosina, "G" significa um nucleotideo guanina e "T" significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de DNA, e "T" significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de RNA, em que o aptamero e livre da sequencia de nucleotideos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24), em que o aptamero e para uso no tratamento de um paciente no qual os autoanticorpos contra os receptores acoplados a proteina G podem ser detectados, e em que a sequencia de nucleotideos tem um comprimento de no maximo 593 nucleotideos.
2. Uso, de acordo com a reivindicapao 1, caracterizado pelo fato de que o aptamero e usado para inibir a interapao de autoanticorpos especificos para um receptor acoplado a proteina G com suas proteinas alvo.
3. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicapdes 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de DNA, ou em que a sequencia de nucleotideos e uma sequencia de RNA.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicapdes 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequencia de nucleotideos compreendida no aptamero e qualquer uma das seguintes sequencias: (5'-GTTGTTTGGGGTGG-3' SEQ ID No: 1), (5'-GTTGTTTGGGGTGGT-3' SEQ ID No: 2) (5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3' SEQ ID No: 3), (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3' SEQ ID No: 4), (5' -TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 5), (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 6), (5'-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 7), (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 8), (5'-TGGTGGTGGTGGT-3' SEQ ID No: 9), (5'-GGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 10), (5'-GGTGGTTGTGGTGG-3' SEQ ID No: 11), (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 12), (5'- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG TGCS' SEQ ID No: 13), (5'-GGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3' SEQ IDNo:14), (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3' SEQ ID No: 15), (5'-GGTGGTGGTGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3' SEQ ID No: 16), (5'-TTTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No: 17), (5'-TGGTGGTGGT-3' SEQ ID No: 18), (5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO: 20).
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequencia de nucleotideos do aptamero tem um comprimento de pelo menos 4 nucleotideos, preferencialmente pelo menos 8 nucleotideos, mais preferencialmente pelo menos 12 nucleotideos e/ou em que a sequencia de nucleotideos do aptamero tem um comprimento de no maximo 120 nucleotideos, preferencialmente no maximo 100 nucleotideos, mais preferencialmente no maximo 80 nucleotideos.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o aptamero e capaz de interagir com um autoanticorpo, preferencialmente um autoanticorpo que e especifico para um receptor acoplado a proteina G, preferencialmente especifico para qualquer um do receptor adrenergico alfa 1 do receptor acoplado a proteina G humana, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor ATI de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o aptamero e para uso como ingrediente seletivo durante aferese terapeutica de sangue ou constituintes do mesmo, de um paciente que sofre de uma doenga autoimune associada com a ocorrencia de autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicagoes 1 a 7, caracterizado pelo fato e que a doenga autoimune e uma dentre cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, esclerodermia, sindrome de Raynaud, pre-eclampsia, doenga obstrutiva da arterial periferica (PAOD), rejeigao de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenga de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina de peito instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE), esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilagao atrial, vitiligo, sindrome hemolitica uremica, sindrome da pessoa rigida e/ou bloqueio cardiaco congenito.
9. Uso de um aptamero conforme descrito em qualquer uma das reivindicagdes 1 a 7 caracterizado pelo fato de que e para a detecgao in vitro de um anticorpo especifico para um receptor acoplado a proteina G, preferencialmente receptor adrenergico alfa 1 do receptor acoplado a proteina G humana, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor ATI de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptor M3, em que o anticorpo a ser detectado e um autoanticorpo.
10. Uso de um aptamero, de acordo com a reivindicapao 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo esta presente ou ser derivado de um fluido corporal, preferencialmente um fluido de um corpo humano, mais preferencialmente de sangue humano, plasma, soro, urina, fezes, fluido sinovial, fluido intersticial, linfa, saliva, fluido espinhal e/ou fluido lacrimal.
11. Uso de um aptamero, de acordo com a reivindicapao 10, caracterizado pelo fato de que o fluido corporal e coletado de um individuo que sofre ou tem suspeita de sofrer de uma doenpa autoimune, preferencialmente doenpas autoimunes associadas a presenpa de autoanticorpos no soro do paciente especificos para um receptor acoplado a proteina G, mais preferencialmente doenpas autoimunes associadas a presenpa de autoanticorpos no soro do paciente especificos para receptor adrenergico alfa 1, receptor adrenergico beta 1, receptor adrenergico beta 2, receptor ETA de endotelina 1, receptor M muscarinico, receptor ATI de angiotensina II, receptores PAR, receptor MAS, receptor 5HT4 e/ou receptores M3.
12. Uso de um aptamero, de acordo com qualquer uma das reivindicapbes 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o aptamero compreende a seguinte sequencia de nucleotideos (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID No. 12).
13. Composipao farmaceutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um aptamero conforme descrito em qualquer uma das reivindicapoes 1 a 7 ou 12 e, opcionalmente, pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitavel, para uso no tratamento de doenpas autoimunes associadas a autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G, em que o aptamero e para uso no tratamento de um paciente no qual autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G podem ser detectados.
14. Composipao farmaceutica, de acordo com a reivindicapao 13, caracterizada pelo fato de que a composipao farmaceutica que compreende o aptamero e usada para inibir a interapao de autoanticorpos especificos para um receptor acoplado a proteina G com suas proteinas alvo.
15. Coluna de aferese caracterizada pelo fato de que compreende um aptamero conforme descrito em qualquer uma das reivindicapoes 1 a 7 ou 12, para uso no tratamento de uma doenpa autoimune, em que a doenpa autoimune e cardiomiopatia, cardiomiopatia dilatada (DCM), cardiomiopatia periparto (PPCM), cardiomiopatia idiopatica, cardiomiopatia isquemica (iCM), cardiomiopatia de Chagas, cardiomiopatia induzida por quimioterapia, megacolon de Chagas, megaesofago de Chagas, neuropatia de Chagas, hiperplasia prostatica benigna, esclerodermia, sindrome de Raynaud, doenpa obstrutiva da arterial periferica (PAOD), pre-eclampsia, rejeipao de aloenxerto de rim, miocardite, glaucoma, hipertensao, hipertensao pulmonar, hipertensao maligna, sindrome metabolica, Alopecia, Alopecia areata, enxaqueca, doenpa de Parkinson, epilepsia, cefaleia em salvas, esclerose multipla, depressao, sindrome de dor regional, angina de peito instavel, lupus eritematoso sistemico (SLE), esquizofrenia, sindrome de Sjogren, periodontite, fibrilagao atrial, vitiligo, sindrome hemolitica uremica, sindrome da pessoa rigida e/ou bloqueio cardiaco congenito, em que o aptamero e para uso no tratamento de um paciente no qual autoanticorpos contra receptores acoplados a proteina G podem ser detectados.
16. Coluna de aferese, de acordo com a reivindicapao 15, caracterizada pelo fato de que o aptamero e usado como ingrediente seletivo para separar especificamente os autoanticorpos que sao direcionados especificamente pelo aptamero.
17. Metodo para a preparagao de um oligonucleotideo aptamero caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: I) determinapao de uma sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero que compreende a aplicapao do seguinte conjunto de regras de produpao P: P = { S M | Y | D | E | H (1) NRM M MR (3) M -> RM (4) N -> M (5) D YM (6) E VM (6a) Y K | KL | LK | LKL (7) H LV | V (8) R L (9) Z A | C | G | T (10) L ZL | Z (ID BX Gx (12) CX BXLBX (13) M -> CXLCX (14) K CXLBX (15) V CXL (16) } com as condigoes a.) Q e o conjunto de numeros naturais; b.) F e um subconjunto de numeros naturais definidos como: F := {X e Q | (X > 1)} c.) Usando F definimos: (1) VX&F3M\M -+CXLCX (2) YXGF3K:K->CXLBX (3) VX<EF3V:V^>CXL (4) YX e F :CX—> BXLBX x (5) VXGF:5X^]“[G i d.) U e um conjunto de nao terminals definidos como: U = {S, M, N, D, E, Y, H, R, Z, L, BX, CX, K, V} Para BX e CX consulte c); e.) We um conjunto de nao terminals definidos como: W = {A, C, G, T, Gx} Gx denota todos os terminals que podem ser derivados de acordo com b) e c)(5); f) S 6 U e o simbolo inicial; em que "A" significa um nucleotideo adenina, "C" significa um nucleotideo citosina, "G" significa um nucleotideo guanina e "T" significa um nucleotideo timina se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de DNA, e "T" significa um nucleotideo uracila se a sequencia de nucleotideos for uma sequencia de RNA, em que a sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero e livre da sequencia de nucleotideos GGTTGGTGTGGTTGG (SEQ ID No: 22), GGTTGGTGTGGT (SEQ ID NO: 23) ou CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG (SEQ ID No: 24), em que a sequencia de nucleotideos para uso como uma sequencia de aptamero tem um comprimento de no maximo 5 93 nucleotideos, e II) produqao de um oligonucleotideo aptamero que tem a sequencia de nucleotideos obtida na etapa I).
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