CN113588937A - 一种心肌细胞m3受体的检测方法 - Google Patents

一种心肌细胞m3受体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种心肌细胞M3受体的检测方法，属于心肌细胞M3受体技术领域。为解决现有的心肌细胞M3受体检测方法较为繁琐，耗费时间过长，准确率较低，所用检测试剂或仪器价格昂贵的问题。本发明将心肌细胞M3受体细胞外第二环功能表位肽段序列合成肽段后纯化，碳酸盐包被缓冲液溶解后进行酶标板包被，每孔加入300μL含有体积份数为5％牛奶的PBS封闭后加入酶标样本后进行显色，通过酶标仪测定OD值。由于酶的催化频率高，本发明所采用的检测方法可放大反应效果，有效提高测量结果的准确性；不需要复杂的检测环节，使用的试剂以及酶标仪均为常见试剂和仪器，方法简单，材料易得，且成本较低，易于进行常规和大规模使用的特点；同时具有灵敏高效的优点。

Description

一种心肌细胞M3受体的检测方法
技术领域
本发明涉及心肌细胞M3受体技术领域，具体而言，涉及一种心肌细胞M3受体的检测方法。
背景技术
自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体。健康个体的正常的免疫反应有保护性防御作用，可以清除体内的外来抗原。通常，普遍存在的自身体和抗原反应机体可以耐受。然而，这一过程如果缺乏选择就会造成自身组织损伤，这种损伤导致新的自身抗原持续产生，进而诱发持续的免疫反应。近年来，免疫系统异常在心力衰竭的发生和发展中的作用逐渐受到重视，如β1，β2肾上腺素受体和M2型乙酰胆碱受体等G蛋白偶联受体自身抗体。这些自身抗体的产生可能通过干扰受体的正常调节功能，引发心脏结构和功能改变，导致心肌损伤，诱发或加重心力衰竭。
乙酰胆碱能受体属于G-蛋白偶联受体，广泛分布于神经、心血管、呼吸、循环系统中，调节神经信号传递、心血管活动、平滑肌收缩及内外分泌腺功能等。M受体现已克隆出M1、M2、M3、M4、M5五个亚型，其中心脏M3受体的发现及其功能的研究是近年来心血管药理学的一大进展。心脏M3受体具有重要的生理功能和病理意义，它可以激活一种外向整流钾电流IKM3参与心脏的复极化，产生负性肌力和负性频率作用，抑制细胞内钙超载产生抗心律失常作用；作用于间隙连接蛋白43维持细胞间联系和兴奋传导抑制心律失常；调节细胞内磷脂酰肌醇水解改善心脏收缩和血流动力学功能；激活抗凋亡信号分子，增强内源性抗氧化能力，降低细胞内钙超载，影响间隙连接蛋白43表达，进而产生保护心肌缺血性损伤作用；影响房颤的发生等。而且，转基因动物实验发现，心脏M3受体过表达具有心脏保护作用。
现有的心肌细胞M3受体的检测方法较为繁琐，且耗费时间过长，准确率较低，所用检测试剂或仪器价格昂贵。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：
为了解决现有的心肌细胞M3受体的检测方法较为繁琐，耗费时间过长，准确率较低，所用检测试剂或仪器价格昂贵的问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案：
本发明提供了一种心肌细胞M3受体的检测方法，包括以下步骤：
S1肽段合成：取5-10mL样品按照心肌细胞M3受体细胞外第二环功能表位肽段序列合成肽段，所述第二环功能表位肽段序列为205-220位的CLFWQYFVGKRTVPPGEC，将合成后的肽段纯化至93％-98％，得到纯化样本；
S2酶标板包被：选取50mM，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释纯化样本，得到10μg·mL-1的稀释后样本溶液，将稀释后样本溶液按100μL每孔注入酶标板进行包被，在4℃温度下放置12h-18h；
S3封闭：将包被后的孔酶标板去除包被液，用PBST洗涤4-6次，每次3min，拍干后每孔加入300μL含有体积份数为5％牛奶的PBS，在37℃温度下封闭2h，用PBST洗涤9次，甩干后置于4℃备用；
S4加入酶标样本：每孔加入100μl稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG溶液，在温度为37℃下孵育1h，用PBST洗涤5次；
S5显色：弃去酶标板板孔中液体，用PBST洗板，每孔中加入100μL显色剂，在室温避光状态下显色15min-20min；
S6终止及测定：每孔加入100μL的终止液，用酶标仪测定OD值。
进一步地，S1中所述合成后的肽段纯化至95％。
进一步地，S2中所述酶标板为96孔中结合力酶标板。
进一步地，S4中所述稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG溶液为辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG与水通过质量比为1:1000稀释后得到。
进一步地，S5中所述显色剂为TMB底物显色剂或OPD底物显色剂。
进一步地，S6中所述终止液为浓度为2mol·L-1的H2SO4溶液或浓度为2mol·L-1的HCl溶液。
进一步地，当显色剂为TMB底物显色剂时，S6中用酶标仪A490测定；当显色剂为OPD底物显色剂时，S6中用酶标仪A450测定。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明一种心肌细胞M3受体的检测方法，通过结合在固相表面的抗原和抗体的结合能够保持心肌细胞M3受体的免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。测定时，样本与固相载体表面的抗体结合起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的杂质分开，加入酶标的抗体，通过反应结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，通过酶标仪进行定量分析；由于酶的催化频率高，本发明所采用的检测方法可放大反应效果，有效提高测量结果的准确性；
相比其他检测方法，本发明不需要复杂的检测环节，使用的试剂以及酶标仪均为常见试剂和常用仪器，方法简单，材料易得，且成本相对较低，易于进行常规和大规模使用；同时具有灵敏高效的优点。
附图说明
图1为本发明健康人群样本和心力衰竭患者样本的心肌细胞M3受体自身抗体水平的对比分析图；
图2为本发明心力衰竭患者样本的心肌细胞M3受体自身抗体水平与性别相关性对比分析图；
图3为本发明心力衰竭患者样本的心肌细胞M3受体自身抗体水平与年龄相关性对比分析图；
图4为本发明心力衰竭患者样本的心肌细胞M3受体自身抗体水平与NYHA分级相关性对比分析图；
图5为本发明心力衰竭患者样本的心肌细胞M3受体自身抗体水平与EF相关性对比分析图；
图6为本发明健康人群、风湿性心脏病、缺血性心肌病及扩张型心肌病所致心力衰竭患者样本中的心肌细胞M3受体自身抗体水平的对比分析图。
具体实施方式
在本发明的描述中，应当说明的是，各实施例中的术语名词例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等指示方位的词语，只是为了简化描述基于说明书附图的位置关系，并不代表所指的元件和装置等必须按照说明书中特定的方位和限定的操作及方法、构造进行操作，该类方位名词不构成对本发明的限制。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
具体实施方案一：本发明提供了一种心肌细胞M3受体的检测方法，包括以下步骤：
S1肽段合成：取5-10mL样品按照心肌细胞M3受体细胞外第二环功能表位肽段序列合成肽段，所述第二环功能表位肽段序列为205-220位的CLFWQYFVGKRTVPPGEC，将合成后的肽段通过反向高效液相色谱法纯化至93％-98％，得到纯化样本；
S2酶标板包被：选取50mM，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释纯化样本，得到10μg·mL-1的稀释后样本溶液，将稀释后的样本溶液按100μL每孔注入酶标板进行包被，在4℃温度下放置12h-18h；
S3封闭：将包被后的孔酶标板去除包被液，用PBST洗涤4-6次，每次3min，拍干后每孔加入300μL含有体积份数为5％牛奶的PBS，在37℃温度下封闭2h，用PBST洗涤9次，甩干后置于4℃备用；
S4加入酶标样本：每孔加入100μl稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG溶液，在温度为37℃孵育1h，用PBST洗涤5次；
S5显色：弃去酶标板板孔中液体，用PBST洗板，每孔中加入100μL显色剂，在室温避光状态下显色15min-20min；
S6终止及测定：每孔加入100μL的终止液，用酶标仪测定OD值。
通过结合在固相表面的抗原和抗体的结合能够保持心肌细胞M3受体的免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。测定时，样本与固相载体表面的抗体结合起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的杂质分开，加入酶标的抗体，通过反应结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，通过酶标仪进行定量分析；由于酶的催化频率高，本发明所采用的检测方法可放大反应效果，有效提高测量结果的准确性；
相比其他检测方法，本检测方法不需要复杂的检测环节，使用的试剂以及酶标仪均为常见试剂和仪器，方法简单，材料易得，且成本较低，易于进行常规和大规模使用的特点；同时具有灵敏高效的优点。
S1中的样本为血清，将血液在常温下静置2h-3h，凝固后在温度为4℃下，通过离心机4000r/min离心10min-20min后，收集血清，将收集到的血清放入-80℃的冰箱内保存待测，避免反复冻融损坏样本。
添加空白对照组，将样品替换为PBS，其他步骤不变，将空白对照组得到的结果作为本底值，在分析测量得到的OD值时，应扣除本底值后再进行分析。
具体实施方案二：S1中所述合成后的肽段纯化至95％。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案一相同。
具体实施方案三：S2中所述酶标板为96孔中结合力酶标板。选用中结合力酶标板具有检测的特异性和灵敏度高，空白孔值低的特点。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案二相同。
具体实施方案四：S4中所述稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG溶液为辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG与水通过质量比为1:1000稀释后得到。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案三相同。
具体实施方案五：S5中所述显色剂为TMB底物显色剂或OPD底物显色剂。TMB底物显色剂稳定性高，灵敏性较OPD底物显色剂低，OPD底物显色剂灵敏性高，稳定性较TMB底物显色剂低。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案四相同。
具体实施方案六：S6中所述终止液为浓度为2mol·L-1的H2SO4溶液或浓度为2mol·L-1的HCl溶液。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案五相同。
具体实施方案七：当显色剂为TMB底物显色剂时，S6中用酶标仪A490测定；当显色剂为OPD底物显色剂时，S6中用酶标仪A450测定。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案六相同。
具体实施方案八：所述酶标仪为SpectraMax iD5-多功能酶标仪。本实施方案的其他组合和连接关系与具体实施方案七相同。
为了对心肌细胞M3受体的作用进行分析，对心力衰竭患者的样本和健康人群的样本进行对比，结合图1所示，心力衰竭患者样本中的心肌细胞M3受体自身抗体水平显著高于健康人群样本中的心肌细胞M3受体自身抗体水平。
其中图1中，(A)为分布图；(B)柱形图，n健康人群样本＝25；n＝19，数据以均值±标准误表示，**P<0.01，**为通过本发明测得的心力衰竭患者样本中的心肌细胞M3受体的OD值。
由于心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体自身抗体分布跨度大，为了揭示心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体自身抗体分布规律，对其进行了更细致的统计分析。考虑到心力衰竭组患者性别、年龄、纽约心脏病协会(New York Heart Association，NYHA)心功能分级、心脏射血分数和心力衰竭诱因的不同，对数据进行了整理和统计。结合图2至图4所示，心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体自身抗体水平与性别、年龄和NYHA分级均无相关性。
其中图2中，n男＝9；女，n女＝10，R＝0，P＝1.00；
其中图3中，n＝19。R＝-0.238，P＝0.326；
其中图4中，(A)为分布图，(B)为柱形图；nNYHAⅢ级心力衰竭患者样本＝9；nNYHAⅣ级心力衰竭患者样本＝9，数据以均值±标准误表示。
心脏射血分数值是目前评价患者心力衰竭严重程度的关键指标，将检测所得心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体自身抗体水平与患者超声心动图射血分数值进行Pearson相关性分析。结合图5所示，R＝-0.467，P＝0.044＜0.05，具有统计学意义，心肌细胞M3受体自身抗体水平与心力衰竭患者心脏射血分数呈负相关性。
其中图5中，n＝13，R＝-0.467，P＝0.044<0.05。
为了检测心力衰竭诱因对心肌细胞M3受体自身抗体的影响，对健康人群和风湿性心脏病、缺血性心肌病及扩张型心肌病所致心力衰竭患者样本中的心肌细胞M3受体自身抗体水平进行分析。结合图6所示，上述原因所致心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体平均自身抗体水平均高于健康人群样本中心肌细胞M3受体平均自身抗体水平。其中，扩张型心肌病和缺血性心脏病所致心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体平均自身抗体水平显著高于健康人群样本中心肌细胞M3受体平均自身抗体水平(P＜0.05，P小于0.001)。
其中图6所示，n健康人群样本＝25；n风湿性心脏病所致心力衰竭患者样本＝6；n缺血性心肌病所致心力衰竭患者样本＝7；n扩张型心肌病所致心力衰竭患者样本＝6；数据以均值±标准误表示；*P<0.05与对照组相比，***P<0.001与对照组相比，*为通过本发明测得的缺血性心脏病所致心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体平均自身抗体水平的OD值；***为通过本发明测得的扩张型心肌病所致心力衰竭患者样本中心肌细胞M3受体平均自身抗体水平的OD值。
以上结果显示，心肌细胞M3受体自身抗体水平与心脏功能呈负相关，与缺血性和扩张型心肌病所致心力衰竭联系更为密切，且不受性别、年龄和NYHA分级影响。
虽然本发明公开披露如上，但本发明公开的保护范围并非仅限于此。本发明领域技术人员在不脱离本发明公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1肽段合成：取5-10mL样品按照心肌细胞M3受体细胞外第二环功能表位肽段序列合成肽段，所述第二环功能表位肽段序列为205-220位的CLFWQYFVGKRTVPPGEC，将合成后的肽段纯化至93％-98％，得到纯化样本；
S2酶标板包被：选取50mM，pH值为9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释纯化样本，得到10μg·mL-1的稀释后样本溶液，将稀释后样本溶液按100μL每孔注入酶标板进行包被，在4℃温度下放置12h-18h；
S3封闭：将包被后的孔酶标板去除包被液，用PBST洗涤4-6次，每次3min，拍干后每孔加入300μL含有体积份数为5％牛奶的PBS，在37℃温度下封闭2h，用PBST洗涤9次，甩干后置于4℃温度下保存备用；
S4加入酶标样本：每孔加入100μl稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG溶液，在温度为37℃下孵育1h，用PBST洗涤5次；
S5显色：弃去酶标板板孔中液体，用PBST洗板，每孔中加入100μL的显色剂，在室温避光状态下显色15min-20min；
S6终止及测定：每孔加入100μL的终止液，用酶标仪测定OD值。
2.根据权利要求1所述的一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于：S1中将所述合成后的肽段纯化至95％。
3.根据权利要求2所述的一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于：S2中所述酶标板为96孔中结合力酶标板。
4.根据权利要求3所述的一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于：S4中所述稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG溶液为辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG与水通过质量比为1:1000稀释后得到。
5.根据权利要求4所述的一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于：S5中所述显色剂为TMB底物显色剂或OPD底物显色剂。
6.根据权利要求5所述的一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于：S6中所述终止液为浓度为2mol·L-1的H2SO4溶液或浓度为2mol·L-1的HCl溶液。
7.根据权利要求6所述的一种心肌细胞M3受体的检测方法，其特征在于：当显色剂为TMB底物显色剂时，S6中用酶标仪A490测定；当显色剂为OPD底物显色剂时，S6中用酶标仪A450测定。
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