CN103597351A - 抑制pivka-ii测定试剂中非特异性反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明要解决的问题是在凝集试验中使用具有特异性结合到PIVKA-II的性质的单克隆抗体和具有特异性结合到凝血酶原的性质的单克隆抗体以及搭载这些单克隆抗体的两类载体颗粒来抑制非特异性凝集反应。可以通过向含有具有特异性结合到PIVKA-II的性质的单克隆抗体和具有特异性结合到凝血酶原的性质的单克隆抗体以及搭载这些单克隆抗体的两类载体颗粒的反应溶液加入特定二价金属离子来抑制非特异性凝集反应。
Description
技术领域
本发明涉及PIVKA-II的免疫测定,PIVKA-II测定试剂,和PIVKA-II测定试剂盒。
背景技术
PIVKA-II是指被归类为凝血酶原的一种蛋白质,其是不具有凝血因子活性的凝血因子II,并且也被称为异常凝血酶原。凝血酶原合成于肝中并且产生过程需要通过依赖维生素K的γ-谷氨酰羧化酶将谷氨酸(Glu)残基转化为γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。虽然在正常凝血酶原的N末端附近存在10个Gla残基,但是PIVKA-II的10个残基中的全部或部分未转化为Gla并且仍然是Glu残基。PIVKA-II最初发现于维生素K缺乏或用维生素K拈抗剂治疗的患者的血液中。因为血液浓度的增加与肝细胞瘤有关联,所以最近PIVKA-II作为肝细胞瘤的肿瘤标记物被测量。PIVKA-II是由维生素K缺乏或拮抗剂诱导的蛋白质-II的简写并且也被称为des-γ-羧基凝血酶原(DCP)(参见:Weitz,I.C.和Liebman,H.A.,(1993)Hepatology18,990-997;Suzuki M,Shiraha H,Fujikawa T,Takaoka N,Ueda N,Nakanishi Y,Koike K,Takaki A,Shiratori Y,J Biol Chem,2005Feb25;280(8),6409-15;A.Nakao,A.Virji,Y. Iwaki,B.Carr,S.Iwatsuki和E.Starzl,Hepatogastroenterology,1991October,38(5),450-453)。
作为特异性测量样品中PIVKA-II的方法,目前已知的有通过使用HPLC分离凝血酶原和PIVKA-II的方法(Anal Biochem,1984Feb;137(1),227-9),利用聚丙烯酰胺凝胶亲和电泳使用乳酸钙分离凝血酶原和PIVKA-II的方法(非专利文献1),使用与PIVKA-II(DCP)特异性反应的抗体的基于ELISA的方法(非专利文献2)等。
在非专利文献1的方法中,在电泳时使用乳酸钙,并且这是为了在正常凝血酶原和PIVKA-II之间在电泳迁移率方面产生差异(由于存在具有钙结合能力的Gla残基)从而分离两者。
在非专利文献2中,在存在钙离子的情况下仅使用特异性结合PIVKA-II的抗体(C4B6)来测量PIVKA-II。然而,至今仅C4B6抗体被报道为是用于需要钙离子存在下特异性测量PIVKA-II抗PIVKA-II的抗体。因此,在PIVKA-II(DCP)的测量方法中使用与PIVKA-II特异性反应的抗体通常不需要添加钙。
目前用于特异性测量样品中的PIVKA-II的主流方法是通过两步夹心法使用与PIVKA-II(DCP)特异性反应的单克隆抗体和抗凝血酶原多克隆抗体来测量的基于EIA(酶免疫测定),RIA(放射性免疫测定),或ELISA(酶联免疫测定)的方法(例如,JP H05-43357(PCT申请的翻译)和JPH09-43237A)。
钙未被用于JP H05-43357(PCT申请的翻译),JP H09-43237A和国际公布手册WO2010/104815的、基于ELISA的测量方法中,并且通常认为,钙离子不是测量PIVKA-II所必需的。
专利文献1是通过利用载体颗粒的凝集测量PIVKA-II的一个实例。专利文献1的技术的概述如下。首先,将样品加入到载有PIVKA-II特异性抗体的磁颗粒中以使样品中的PIVKA-II与抗体结合。此时,样品中的正常凝血酶原不与磁颗粒结合。通过磁铁捕获磁颗粒并洗涤以除去正常凝血酶原。然后向磁颗粒中加入载有与PIVKA-II和正常凝血酶原两者都反应的抗凝血酶原抗体的荧光标记的颗粒。结果,形成夹心结构,其中磁颗粒和荧光标记的颗粒通过两种抗体结合到PIVKA-II。该夹心结构用磁铁捕获并洗涤以除去游离的荧光标记的颗粒。最后,对该夹心结构进行碱处理以使荧光标记的颗粒从PIVKA-II解离以测量荧光强度。荧光强度与样品中的PIVKA-II浓度成比例。如上所述,专利文献1中描述的方法是具有B/F分离/洗涤的步骤的非均质测量方法,并且采用源自荧光标记的颗粒的荧光强度的测量作为检测原理而不是利用载体颗粒自身的凝集的光学测量作为检测原理。
专利文献2在实施例中教导了乳胶凝集试验的基本技术,其在均质系统中采用载体颗粒自身的凝集的光学测量作为检测原理而不需要B/F分离/洗涤的步骤。该文献教导了“高灵敏度免疫测定方法,所述方法表征为人CEA的两种不同类型的单克隆抗体由两种类型的乳胶载体搭载并且与人CEA在水溶剂中反应从而选择性地凝集乳胶载体和人CEA的缀合物,其中所述两类乳胶颗粒的平均粒径彼此不同并且在0.05至0.500μm的范围内,并且所述单克隆抗体由各自的乳胶颗粒搭载”。
引用列表
专利文献
专利文献1:日本公开专利公布号2003-75438(JP2003-75438A)
专利文献2:日本公开专利公布号H10-123137(JP10-123137A)
专利文献3:日本未审查专利申请公布(PCT申请的翻译)号H05-43357(JP H05-43357B)
非专利文献
非专利文献1:Des-gamma-carboxyprothrombin detection byimmunoblotting after polyacrylamide gel affinoelectrophoresis in humanplasmas(通过聚丙烯酰胺凝胶亲和电泳后的免疫印迹法检测人血浆中的des-γ-羧基凝血酶原).Belle M,Hanss M,Guillaumont M,Leclercq M,GuinetR.Electrophoresis1991Apr;12(4):294-7.
非专利文献2:Production of a new monoclonal antibody specific至human des-gamma-carboxyprothrombin in the presence of calcium ions.Application to the development of a sensitive ELISA-test.(在钙离子存在下对人des-γ-羧基凝血酶原具有特异性的新的单克隆抗体的制备。开发灵敏性ELISE测试的应用)Belle M,Brebant R,Guinet R,Leclercq M.JImmunoassay.1995May;16(2):213-29.
发明概述
技术问题
虽然使用HPLC的方法和基于ELISA的方法作为特异性测量样品中的PIVKA-II的方法被很好建立并且是高度可靠的测量方法,所述方法仍具有缺少简单性如每个分析物的长的测量时间以及需要洗去未反应的物质的问题。
在专利文献2中教导的技术在简单性方面是非常出色的。当使用该技术时,可以通过将样品添加到载有人CEA的两种不同类型的单克隆抗体的两类乳胶颗粒,并且直接测量与乳胶颗粒的凝集相关的吸光度的变化来测量样品中的人CEA浓度。
为了测量PIVKA-II,如果单克隆抗体中的至少一种具有特异性结合PIVKA-II的性质,测量系统的特异性能够得到保证并且,因此,另一种单克隆抗体不一定需要具有特异性结合PIVKA-II的特性,只要它与凝血酶原(正常的或异常的)结合。如果至少单克隆抗体中的任一个对PIVKA-II具有特异性,则在PIVKA-II的测量方法中通常不需要存在钙离子。
本发明的发明人尝试开发简单且高度可靠的PIVKA-II测量方法,所述方法采用基于专利文献2的技术的载体颗粒-凝集试验的原理。已知,在免疫测定如乳胶免疫凝集方法中,类风湿因子和异嗜性抗体(例如,抗小鼠免疫球蛋白抗体(HAMA)和抗山羊免疫球蛋白抗体(HAGA))的干扰所致的非特异性反应可能产生问题,这取决于待测的样品。为了抑制这些干扰,除去与乳胶颗粒结合的抗体的Fc位点的方法和向用于免疫反应的溶液中加入抗HAMA剂(由OMEGA Biologicals生产的Heteroblock和由Scantibodies Lab生产的HBR)等的方法是通常已知的。
然而,本发明的发明人的研究揭示:在使用分别载有两种类型的单克隆抗体(一类单克隆抗体具有特异性结合PIVKA-II的性质而另一类单克隆抗体具有特异性结合凝血酶原(正常凝血酶原和PIVKA-II)的性质)的两种类型的乳胶颗粒来测量PIVKA-II的凝集试验中,非特异性凝集的发生无法通过去除抗体的Fc位点和通过使用抗HAMA剂抑制。
因此,本发明要解决的问题是抑制使用用于测量PIVKA-II的两种类型的单克隆抗体和搭载这些单克隆抗体的两类载体颗粒的凝集测试中的非特异性凝集反应。
解决问题的方案
发明人发现,在使用分别载有两种类型的单克隆抗体(即,一类单克隆抗体具有特异性结合PIVKA-II的性质而另一类单克隆抗体具有特异性结合凝血酶原的性质)的两种类型的乳胶颗粒来测量PIVKA-II的凝集试验中,向反应溶液加入二价金属离子能够抑制非特异性凝集反应。
本发明的发明人基于以上发现完成的发明包括以下各项。
(1)一种测量生物学样品中PIVKA-II浓度的方法,所述方法包括以下步骤:
在二价金属离子存在下,使固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒和固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒与所述生物学样品接触;以及
光学测量所述第一载体颗粒和所述第二载体颗粒的凝集,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由以下各项组成的组的一种或多种离子:Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,和Ra2+,并且不是来源于所述生物学样品。
(2)根据第(1)项所述的方法,其中所述二价金属离子是选自由以下各项组成的组的一种或多种离子:Mg2+和Ca2+。
(3)根据第(1)项或第(2)项所述的方法,其中所述第一或第二载体颗粒是乳胶颗粒。
(4)根据第(1)项所述的方法,其中所述接触步骤和所述测量步骤在相同的反应溶液或相同的反应容器中进行。
(5)一种通过凝集反应测量PIVKA-II浓度的试剂,所述试剂包含:
固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒;
固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒;以及
二价金属离子,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由以下各项组成的组的一种或多种离子:Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,和Ra2+。
(6)根据第(5)项所述的试剂,其中所述第一载体颗粒和所述第二载体颗粒都不是荧光载体颗粒。
(7)一种通过凝集反应测量PIVKA-II浓度的试剂盒,所述试剂盒包含:
含有二价金属离子的第一试剂;以及
含有固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒和固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒的第二试剂,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由以下各项组成的组的一种或多种离子:Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,和Ra2+。
(8)根据第(7)项所述的试剂盒,其中所述第一载体颗粒和所述第二载体颗粒都不是荧光载体颗粒。
发明的有利效果
通过使用本发明,可以进行简单且高度可靠的PIVKA-II测量。
附图简述
图l显示添加钙离子对样品中的PIVKA-II浓度和吸光度之间的相关性的效果。
图2显示添加镁离子对样品中的PIVKA-II浓度和吸光度之间的相关性的效果。
图3显示当pH变化时,添加镁离子的效果。
图4显示添加镁离子对样品中的PIVKA-II浓度和吸光度之间的相关性的效果。
实施方案的描述
生物学样品:当在本文中使用时,″生物学样品″是指哺乳动物(优选人)的生物学样品。生物学样品可以是其中可以存在凝血酶原的任何样品(例如,来源于表达凝血酶原的组织或凝血酶原在其中循环的体液的那些)并且优选为血液、血清、血浆或淋巴液。
PIVKA-II:当在本文中使用时,″PIVKA-II″是指哺乳动物(优选人)的PIVKA-II。
凝血酶原:在本说明书中,正常凝血酶原和异常凝血酶原都被统称为″凝血酶原″。当在本文中使用时,″异常凝血酶原″是指PIVKA-II,而″正常凝血酶原″是指除PIVKA-II以外的凝血酶原。
单克隆抗体:当在本文中使用时,″单克隆抗体″可以指抗体自身,或可以指具有与抗原的结合活性的片段如Fab片段和F(ab′)2片段。单克隆抗体可以通过任何获取方法获取:其可以是通过典型的用抗原免疫非人动物获得的抗体或通过基因重组技术或基因免疫方法获得的抗体。该抗体可以结合已知的标记底物如过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、胶态金属和FITC。如果需要,″含有一种或多种抗体的试剂″也可以含有盐,缓冲剂,防腐剂,表面活性剂,还原剂和冷冻保护剂。在本发明中,需要使用两种类型的单克隆抗体;然而,这不意在排除使用三个以上的类型。也未被排除的是,在载体颗粒上固定和使用的两种类型的单克隆抗体,进一步以游离态被添加,而不被固定到载体颗粒。
固定:当在本文中使用时,术语″固定″,″固相的″,和″敏化″以相同含义被使用。
载体颗粒:用于本发明的载体颗粒(不溶性载体)包括,例如,有机聚合物粉末,无机材料粉末,微生物,血细胞和细胞碎片。
有机聚合物粉末包括,例如,天然聚合物粉末如不溶性琼脂糖,纤维素和不溶性葡聚糖,以及合成聚合物粉末如聚苯乙烯,苯乙烯-苯乙烯磺酸酯共聚物,丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物,氯乙烯-丙烯酸酯共聚物,和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物,并且特别地,通过均匀混悬合成的聚合物粉末获得的乳胶颗粒是优选的。
无机材料粉末包括,例如,金、钛、铁、镍等的金属片,二氧化硅、氧化铝和碳粉。
不溶性载体的平均粒径通常为0.05至1.0μm。载有两种类型的单克隆抗体的两类载体颗粒的粒径和材料可以是相同或不同的。
二价金属离子:当在本文中使用时,″二价金属离子″是指Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,或Ra2+。其中,Ca2+或Mg2+是优选的,并且Mg2+是更优选的。Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,或Ra2+的浓度优选为1至50mmol/L,2至50mmol/L,3至50mmol/L,5至50mmol/L,7至50mmol/L,或10至50mmol/L,更优选为2至30mmol/L,3至30mmol/L,5至30mmol/L,7至30mmol/L,或10至30mmol/L,进一步优选为3至20mmol/L,5至20mmol/L,7至20mmol/L,或10至20mmol/L。本发明的二价金属离子不是来源于要针对PIVKA-II被测量的生物学样品。以上浓度指示在PIVKA-II和固定有抗体的载体颗粒的凝集反应时的浓度。二价金属离子可容易地获得并用作卤化物如MgCl2和CaCl2或以无机酸盐如MgSO4和CaSO4,碱盐如Mg(OH)2和Ca(OH)2以及有机酸盐如MgC2O4和CaC2O4的形式。
接触:当在本文中使用时,当载体颗粒与生物学样品″接触″时,这意味着载体颗粒和生物学样品以固体、水溶液或悬浮液的形式混合。
凝集:当在本文中使用时,″凝集″是指固定有抗体的、相同类型或不同类型的多个载体颗粒经由PIVKA-II与抗体之间的结合而彼此结合。当将光施加到含有载体颗粒的悬浮液时,该凝集导致透射或散射光的强度、波长或相位的变化。
光学测量:用于光学测量的方法优选为使用分光光度计或光散射光度计的方法。
光学测量凝集:当在本文中使用时,″光学测量颗粒的凝集″是指在多个类型的颗粒的凝集继续进行的同时进行测量。因此,″光学测量凝集″不是指一旦颗粒凝集后,将一个类型的颗粒与其他颗粒分离并且进行光学测量。
特异性结合PIVKA-II:当在本文中使用时,当抗体″特异性结合PIVKA-II"时,这是指抗体结合PIVKA-II而不结合PIVKA-II以外的物质,并且特别是指抗体不结合正常凝血酶原。
特异性结合凝血酶原:当在本文中使用时,当抗体″特异性结合凝血酶原″时,这是指抗体结合正常凝血酶原和PIVKA-II中的至少一种并且不结合正常凝血酶原和PIVKA-II以外的物质。
在以上描述中,″不结合″不是指完全没有结合,导致一些非特异性结合的抗体可用于本发明中,除非在测量PIVKA-II浓度时产生超过可接受水平的错误。
结合不同表位:当用于本发明的方法、试剂或试剂盒的多种单克隆抗体″结合不同表位″时,这是指各自的抗体识别PIVKA-II上不同的位点。这是因为,当与PIVKA-II结合时,多种单克隆抗体不应当彼此竞争。
非特异性凝集:当在本文中使用时,″非特异性凝集″或″非特异性凝集反应″是指不同于特异性凝集的聚集。实际上难以直接区分特异性凝集和非特异性凝集之间的差别,并且如果在光学测量中测量值远离预期值,则认为观察到″非特异性凝集″。
本发明的通过凝集反应测量PIVKA-II浓度的试剂包括以下组成要素:
要素1:固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒;
要素2:固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒;以及
要素3:二价金属离子,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由以下各项组成的组的一种或多种离子:Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,和Ra2+。
关于通过使用固定有抗体的载体颗粒的凝集反应测量样品中靶物质的本发明的试剂,要素1至3可以被制成各自独立的组分试剂,或者当需要时两种以上的要素可以组合从而形成组分试剂。在很多情况中,所述试剂被配置成第一试剂和第二试剂的形式。配置成第一试剂和第二试剂形式的具体实例可以是由含有要素3的第一试剂和含有要素1和2的第二试剂制备的试剂(试剂盒),这对本发明是优选的。以上配置将被进一步描述。在反应体系中,第一试剂调节(稀释)靶物质和杂质的浓度并且调节凝集反应时的pH和离子强度。在第一试剂创造测量环境后,第二试剂通过固定有抗体的载体颗粒导致凝集反应。当需要时,连同要素1至3,第一试剂或第二试剂可以含有常用的pH缓冲剂、盐、蛋白质、肽、表面活性剂、反应促进剂(敏化剂)、非特异性反应抑制剂、储存稳定剂、防腐剂等,只要固定有抗体的载体颗粒的凝集反应不被妨碍。凝集反应时的优选pH和盐浓度可以分别为,例如,pH5至9以及5至500mmol/L,和所述pH和盐浓度可以通过第一试剂和第二试剂的组合实现。在说明书中,第一试剂和第二试剂基于与生物学样品接触的次序命名并且可以以不同方式命名。例如,第一试剂可以被称为稀释溶液而第二试剂可以被称为乳胶试剂。以上说明不意在限制本发明并且,例如,要素1至3可以被适当地包含在第一和第二试剂两者中或仅在第二试剂中。本领域技术人员将容易理解,这样适当的改变是可能的。
本发明的通过凝集反应测量PIVKA-II浓度的试剂盒包括以下组成要素:
要素A:含有二价金属离子的第一试剂;
要素B:含有固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒和固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒的第二试剂;以及,任选地,
要素C:描述将第一试剂和第二试剂组合以用于测量PIVKA-II浓度的文件,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由以下各项组成的组的一种或多种离子:Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+,和Ra2+。
本发明的试剂盒是指:当要素C以可理解的方式明示地/默示地描述将要素A和要素B组合以用于测量PIVKA-II时,所述试剂的一种形式。因此,显然地,不仅当要素A、要素B和要素C被置于相同的包装时或当第一试剂和第二试剂被同时经销时,而且甚至当第一和第二试剂中的每个被独立地/分开地经销时,可以形成本发明的试剂盒,只要要素C具有这样的描述。要素C的文件可以具有任何名称和形式如附件、手册和目录,并且可以是手写的或记录在电子媒介中。
所述试剂盒也可以包含用于浓度校准的物质(所谓的校准物),用于精确对照的具有已知PIVKA-II浓度的样品(所谓的对照)等,以用于计算生物学样品中的PIVKA-II浓度。
实施例
[实验材料和方法]
<单克隆抗体(抗PIVKA-II抗体):MU-3抗体>
(1)制备方法
对于抗PIVKA-II单克隆抗体(MU-3抗体),使用通过专利文献3的第一个实施例中描述的方法制备的抗体.
专利文献3的第一个实施例中描述的抗体制备方法将在下文中以部分简述的方式被引用。
″(B)将BaSO4和BaCO3以各自100mg/mL的比率添加到施用了灭鼠灵(warfarin)的患者的血浆并且搅拌120分钟以吸附和除去正常凝血酶原,并将血浆添加到DE-52纤维素用于离子交换,施用到亲和柱,使用针对正常凝血酶原和PIVKA-II两者共有部分的单克隆抗体,用4M盐酸胍洗脱,透析,并浓缩从而纯化PIVKA-II。将获得的PIVKA-II(50μg)与相同体积的弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)一起经腹膜内施用到BALB/C小鼠(雌性,四周龄);在两周后,将PIVKA-II(15μg)进一步施用到尾静脉中,并且在三天后切离脾细胞;将该细胞与肿瘤细胞系P3U1融合。细胞融合通过Watanabe等的方法使用聚乙二醇4,000进行。然后利用有限稀释法使用96孔微板进行三次克隆。对克隆的测定通过使用以上(A)的脱羧化的人凝血酶原以及最后天然PIVKA-II进行。标号...,MU-3,...施用到通过克隆建立的制备抗体的杂交瘤的各自的细胞系中。...。单克隆抗PIVKA-II抗体以通常方式获得自细胞系MU-3。″
如在引用中所述,通过利用PIVKA-II免疫获得的杂交瘤制备的抗PIVKA-II抗体的筛选如下进行:通过使用脱羧化的人凝血酶原以及最终天然PIVKA-II对制备抗体的杂交瘤的克隆的测定来进行。
作为使用基于PIVKA-II的Gla区氨基酸序列合成的不同长度的肽片段详细研究结合能力的结果,已经确定并确认,MU-3抗体的表位位点是″位于凝血酶原的氨基酸序列的第13至第23位处的脱羧-肽位点″(JPH07-20127A)。因此,除了专利文献3中的天然PIVKA-II和脱羧化的人凝血酶原以外,JP H07-20127等中所述的基于PIVKA-II的Gla区氨基酸序列合成的不同长度的肽片段可以被合适地组合以比较和确认抗体结合PIVKA-II以及除PIVKA-II以外的物质的能力,以用于筛选抗PIVKA-II抗体。结果,可以进一步获得不同于MU-3抗体的新的抗PIVKA-II抗体。专利文献3(JP H05-43357(PCT申请的翻译))和JP H07-20127通过引用完整地结合于此。
不同于MU-3的抗PIVKA-II抗体也是已知的。例如,JP H09-43237A中所述的2G4抗体和如在国际公布册WO2010/104815中所述的其表位位点是位于PIVKA-II的氨基酸序列的第13至第23位处的脱羧-肽位点的抗体被认为可以用作本发明的抗PIVKA-II抗体。
<单克隆抗体(抗凝血酶原抗体):24209-抗体,24219-抗体>
(1)制备方法
i)制备杂交瘤
将纯化自Coumadin血浆(由UNIGLOBE RESEARCH CORPORATION生产)的PIVKA-II(1mg/mL)和弗氏完全佐剂(由GIBCO生产)一比一混合并乳化并将其以50μg/100μL的剂量皮下施用到八周龄雌性BALB/C小鼠(由Charles River Laboratories Japan制备),四次,以两周为间隔并且,在最终免疫三天后,将脾切离。将获得自切离的脾的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O-Agl4以10比1的比混合以在50重量%聚乙二醇1540(由Wako PureChemical Industries生产)存在下进行细胞融合。将融合的细胞以2.5×106个细胞/mL(相对于脾细胞)悬浮在HAT培养基中,并以0.2mL分配至96孔培养板(由CORNING生产)中。将融合的细胞在37℃在5体积%CO2培养箱中培养。在约两周后,根据以下所述的ELISA法评估具有生长的杂交瘤的孔的培养物上清从而选择制备与PIVKA-II反应的抗体的杂交瘤。
具体地,将5ng纯化的PIVKA-II首先固相固定在微平板(由NUNC生产)上。在与培养物上清反应后,将微平板与过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体反应。加入含有邻苯二胺(由Tokyo Chemical Industry生产)的过氧化物酶底物溶液以用于显色,通过加入1.5N硫酸终止显色。通过微平板读数器以492nm的波长测量吸光度从而获得生产与凝血酶原特异性反应的抗体的杂交瘤09和杂交瘤19。
ii)制备单克隆抗体
24209单克隆抗体(24209-抗体)和24219单克隆抗体(24219-抗体)分别通过以下方法制备自杂交瘤09和杂交瘤19。
将所述杂交瘤以0.5×106个细胞的量腹膜内施用到在两周前预先腹膜内注射有0.5mL的姥鲛烷的12周龄雌性BALB/c小鼠。在约14天后收集腹水,并且通过离心获得上清。将上清与相同量的吸附缓冲液(3mol/LNaCl-1.5mol/L甘氨酸-NaOH,pH8.5)混合然后过滤。使滤液通过用吸附缓冲液平衡的蛋白质A柱(HiTrap rProteinA FF,由GE Healthcare Japan生产)从而利用该柱吸附抗体。将单克隆抗体用0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH3.0)洗脱并纯化。
(2)保藏号
将杂交瘤09和19保藏在国际专利生物保藏中心,日本产业技术综合研究所(日本国茨城县筑波市东1街1-1中心6)(保藏日:2011年5月11日),保藏号分别为FERM BP-11381和FERM BP-11382。
<制备乳胶颗粒>
将配备有搅拌机、回流冷凝器、温度检测器、导氮管和外套的玻璃反应容器(容量:2L)填充以1,100g的蒸馏水、200g的苯乙烯、0.2g的苯乙烯磺酸钠和1.5g的过硫酸钾溶解在50g的蒸馏水中的水溶液,并且在容器的内部被替换为氮气后,进行聚合达48小时同时在70℃搅拌。
在聚合结束后,将溶液用滤纸过滤从而提取乳胶颗粒。获得的乳胶颗粒的粒径通过以下方式测量:使用透射电子显微镜仪器(由JEOL Ltd.生产,″型号JEM-1010″)给乳胶颗粒成像,放大率为10,000倍,并对100个以上的颗粒进行图像分析。平均粒径为0.3μm。在本说明书中,乳胶颗粒可以由Lx指示。
<制备抗体-敏化的乳胶颗粒>
i)制备24209-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液
向1mL的1.0重量%如上所述的平均粒径为0.3μm的乳胶颗粒溶液(5mmol/L Tris-盐酸缓冲液(下文中,被称为Tris-HCl),pH7.5)加入1mL的被用5mmol/L Tris-HCl(pH7.5)稀释至0.60mg/mL的24209-抗体溶液,并在4℃搅拌两小时。随后,加入1mL的含0.5重量%BSA的5mmol/LTris-HCl(pH7.5)并在4℃搅拌一小时。最后,在将溶液离心并除去上清后,将沉淀重悬在5mmol/L Tris-HCl(pH7.5)中从而产生24209-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液。
ii)制备24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液
以与以上所述相同的方法,将平均粒径为0.3μm的乳胶颗粒和24219-抗体用于制备24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液。
iii)制备MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒
以与以上所述相同的方法,将平均粒径为0.3μm的乳胶颗粒和MU3-抗体用于制备MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液。
<制备第一试剂>
通过制备含300mmol/L氯化钠、0.2重量%BSA、200μg/mLHeteroblock(由OMEGA Biologicals生产)和0.9重量%的聚乙烯吡咯烷酮K-90(下文中,PVP)的100mmol/L Bis-Tris(pH6.0)溶液获得第一试剂。
在本说明书中,为了方便,第一试剂可以被称为R1。
<制备第二试剂>
通过以下方式获得第二试剂:将MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液与24209-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液或24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液等量混合(见实施例)并用5mmol/L Tris-HCl(pH7.5)稀释该溶液至在600nm波长处吸光度为6.0Abs。
在本说明书中,为了方便,该混合的溶液(第二试剂)可以被称为R2。
<样品>
血清和血浆中的PIVKA-II浓度通过使用Picolumi(注册商标)PIVKA-II(由Sanko Junyaku Co.,Ltd.生产)测量。将PIVKA-II的测量值与来自本发明测量方法的测量值比较。Picolumi(注册商标)PIVKA-II被广泛用作体外诊断试剂并且,由于两步电化学发光免疫测定的原理,该试剂极少导致非特异性反应。
<测量方法>
将第一和第二试剂组合并且通过使用Hitachi7170自动分析仪测量样品。具体地,在将150μL的第一试剂添加到10μL的样品中并搅拌后,将温度保持在37℃达五分钟并且加入50μL的第二试剂并搅拌。然后,在570nm的主波长和800nm的次波长处,测量与由抗体-敏化的乳胶颗粒所致的凝集形成相关的吸光度的变化达五分钟。
[结果和讨论]
实施例1
制备含有浓度为4、22、617、2755或6357mAU/mL的PIVKA-II的10μL的血清样品,用含有浓度为0至50mmol/L的钙离子的150μL的R1稀释,并在37℃的温度保持五分钟。然后将样品与含有24219-抗体-敏化的乳胶颗粒和MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒的50μL的R2混合。抗体-敏化的乳胶颗粒的凝集通过在570nm的主波长和800nm的次波长处测量吸光度五分钟来检测。同样制备含有浓度为27、1177、4063或6603mAU/mL的PIVKA-II的血浆样品以用于进行相同的操作。用于实施例1的R1和R2的组成显示在表1中。通过加入CaCl2来向R1中加入钙离子。含有PVP作为抗体-敏化的乳胶颗粒的敏化剂(下同)。
[表1]
R1
100mM B i s-T r i s p H6.0
300mM NaC l
200μg/m L H e t e r o b l o c k
0.9%P V P
(以上为共有组分)
Ca浓度 | |
1 | 0mM |
2 | 1mM |
3 | 10mM |
4 | 30mM |
5 | 50mM |
R2
将等量的24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液与MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液混合,并将该混合溶液用5mM Tris-HCl(pH7.5)稀释至在600nm波长处吸光度为6.0Abs。
当将血清样品用于测量时,表示PIVKA-II浓度和吸光度之间的相关性的R2值(相关系数的平方值)为约0.52并且在对照(即,不含钙离子的R1)中观察到非特异性凝集反应。当以1mmol/L向R1加入钙离子时,R2值为约0.54并且没有观察到线性的改善。惊人地,当以10、30或50mmol/L向R1添加钙离子时,R2值分别为约0.97、约0.95或约0.96,并且观察到线性的明显改善。见图1。
当血浆样品用于测量时,R2值为约0.94至约0.98,不管是否向R1添加钙离子,并且没有观察到非特异性凝集反应。
当使用24209-抗体-敏化的乳胶颗粒代替24219-抗体-敏化的乳胶颗粒时,观察到相同的结果(数据未显示)。
实施例2
制备含有浓度为18(相同浓度的两个样品;一式两份),1063,1570,1729,或4050mAU/mL的PIVKA-II的血清样品和含有浓度为27,111,1065,或2534mAU/mL的PIVKA-II的血浆样品以进行与实施例1相同的实验。在实施例2中,使用浓度为10mmol/L的镁离子代替钙离子。为了比较,同样进行使用浓度为10mmol/L的钙离子的实验。
当使用血清样品时,R2值为约0.54,这与实施例1相当,并且在对照(即,不含钙离子或镁离子的R1)中观察到非特异性凝集反应。当将钙离子以10mmol/L添加到R1时,R2值为约0.92并且重现了实施例1中的线性的改善。当将镁离子以10mmol/L添加到R1时,R2值为约0.87,并且与钙离子的情况相同,观察到线性的明显改善。见图2。
在使用血浆样品的情况中,在对照(即,不含钙离子或镁离子的R1)中R2值为约0.89;然而,当将钙离子或镁离子以10mmol/L添加时,R2值分别为约0.99或约1.00,并且观察到线性的改善。实施例2中使用的R1和R2的组成显示在表2中。
[表2]
R1
100mM Bis-Tris pH6.0
200μg/mL Heterobl block
0.9%PVP
10mM CaCl2或MgCl2
R2
将等量的24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液与MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液混合,并将该混合溶液用5mM Tris-HCl(pH7.5)稀释至在600nm波长处吸光度为6.0Abs。
当使用24209-抗体-敏化的乳胶颗粒代替24219-抗体-敏化的乳胶颗粒时观察到相同的结果(数据未显示)。
实施例3
用于抗体-敏化的乳胶颗粒的凝集反应的溶液的pH对本发明的效果通过使R1的pH在pH6.0至pH8.0之间变化来测试,并且检查加入镁离子(10mmol/L)的效果。在pH6.0至8.0的范围中的任何pH,由于向R1添加镁离子,观察到线性的改善。见图3。实施例3中使用的R1和R2的组成显示在表3中。
[表3]
R1
300m M NaC l
200μg/mL Heteroblock
(以上为共有组分)
缓冲液、pH以及MgCl2和PVP浓度如下。
R2
将等量的24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液与MU3-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液混合,并将该混合溶液用5mM Tris-HCl(pH7.5)稀释至在600nm波长处吸光度为6.0Abs。
当使用24209-抗体-敏化的乳胶颗粒代替24219-抗体-敏化的乳胶颗粒时观察到相同的结果(数据未显示)。
实施例4
制备含有浓度为18(相同浓度的两个样品;一式两份),1063,1570,1729,2905或4050mAU/mL的PIVKA-II的血清样品和含有浓度为27,111,1065,或2534mAU/mL的PIVKA-II的血浆样品以进行与实施例1相同的实验。在实施例4中,使用浓度为1、5和10mmol/L的镁离子代替钙离子。
在使用血清样品的情况中,当将镁离子以1mmol/L添加到R1时,R2值为约0.58并且以与实施例2中所述的相同的方式没有观察到线性的改善。当将镁离子以5mmol/L或10mmol/L添加到R1时,R2值为约0.84或约0.82并且重现了在实施例2中观察到的线性的改善。见图4。
在使用血浆样品的情况中,当将镁离子以1mmol/L、5mmol/L或10mmol/L添加时,R2值分别为约0.91,约1.00,或约1.00,并且观察到线性的改善。实施例4中使用的R1和R2的组成显示在表4中。
[表4]
R1
100nM Bls-Tris pH5.7
300mM NaCl
500μg/mL Heteroblock
0.9%PVP
1mM,5mM,10mM MgCl2
R2
将等量的24219-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液与MU-抗体-敏化的乳胶颗粒溶液混合,并将该混合溶液用5mM Tris-HCl(pH7.5)稀释至在600nm波长处吸光度为6.0Abs。
当使用24209-抗体-敏化的乳胶颗粒代替24219-抗体-敏化的乳胶颗粒时观察到相同的结果(数据未显示)。
工业实用性
本发明的PIVKA-II的免疫测定,PIVKA-II测定试剂,和PIVKA-II测定试剂盒可用于检测婴儿维生素K缺乏出血和肝细胞瘤。
Claims (8)
1.测量生物学样品中PIVKA-II浓度的方法,所述方法包括以下步骤:
在二价金属离子存在下使固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒和固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒与所述生物学样品接触;和
光学测量所述第一载体颗粒和所述第二载体颗粒的凝集,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+和Ra2+组成的组的一种或多种离子,并且不是来源于所述生物学样品。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述二价金属离子是选自由Mg2+和Ca2+组成的组的一种或多种离子。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述第一或第二载体颗粒是乳胶颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述接触步骤和所述测量步骤在相同的反应溶液或在相同的反应容器中进行。
5.通过凝集反应测量PIVKA-II浓度的试剂,所述试剂包含:
固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒;
固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒;和
二价金属离子,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+和Ra2+组成的组的一种或多种离子。
6.根据权利要求5所述的试剂,其中所述第一载体颗粒和所述第二载体颗粒都不是荧光载体颗粒。
7.通过凝集反应测量PIVKA-II浓度的试剂盒,所述试剂盒包含:
第一试剂,其含有二价金属离子;和
第二试剂,其含有固定有第一单克隆抗体的第一载体颗粒和固定有第二单克隆抗体的第二载体颗粒,
其中所述第一和第二单克隆抗体中的一个是与PIVKA-II特异性结合的抗体,而另一个是与凝血酶原特异性结合的抗体,
其中所述两个抗体结合不同的表位,并且
其中所述二价金属离子是选自由Be2+,Mg2+,Ca2+,Sr2+,Ba2+和Ra2+组成的组的一种或多种离子。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中所述第一载体颗粒和所述第二载体颗粒都不是荧光载体颗粒。
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PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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