KR102101987B1 - 중화 항체를 검출하기 위한 경합 리간드 결합 분석 - Google Patents

중화 항체를 검출하기 위한 경합 리간드 결합 분석 Download PDF

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Abstract

생체치료 단백질을 필요로 하는 환자에게 투여된 생체치료 단백질에 대한 중화 항체의 존재를 검출하기 위한 면역원성 분석으로서, (a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계; (b) 샘플을 포획 시약의 존재하에 인큐베이션하는 단계; 및 (c) 검출 시약을 첨가하는 단계를 포함하고, 이때 대조 샘플에 비하여 감소된 신호는 생체치료제에 대한 중화 항체의 존재를 가리키는 것인 분석.

Description

중화 항체를 검출하기 위한 경합 리간드 결합 분석{COMPETITIVE LIGAND BINDING ASSAY FOR DETECTING NEUTRALIZING ANTIBODIES}
본 발명은 생물학적 생체치료제에 대한 중화 항체 (Nab)의 존재를 검출하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
중화 항체 (NAb)와 같은 항체들의 검출은 생체치료제 (biotherapeutic agent)로 치료된 환자에 대해 수행되는 면역원성 평가의 일부이다. 중화 항체는 약물의 기능을 중화시킴으로써 약물의 효능에 네거티브하게 영향을 미친다. 특정 생체치료제로 치료된 환자들에서 NAb의 존재는 예를 들어 비색 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 면역형광 기초 수용체 결합 분석, 가용성 및 고체상 방사선면역분석 및 센서-기초 분석을 포함하는, 여러 면역분석 방법들을 사용하여 검출될 수 있다.
NAb는 또한 세포-기초 분석법들을 사용하여 검출될 수 있다. 이들 세포-기초 분석법에서, NAb의 존재는 생체치료제의 생물학적 작용, 예를 들어 표적 세포에서 생물학적 과정의 조절을 억제하는 능력에 의해 검출될 수 있다. 이들 분석은 예를 들면 수용체 유전자, 예컨대 루시페라제 또는 베타-갈락토시다제의 활성화를 포함할 수 있다. 그러나 이들 현재의 검출 방법은 민감섬의 수준, 특이성의 수준, 매트릭스 간섭 문제, 분석의 가변성, 제한된 동적 범위 및 긴 분석 기간을 포함하여 많은 결점으로 문제를 겪는다.
사릴루맙 (Sarilumab)은 임상적으로 개발된, 인터류킨-6 (IL6) 수용체를 표적화하는 첫 번째 전체 인간 단클론성 항체이다. IL-6은 면역 반응, 급성-단계 반응 및 조혈반응에서 면역 및 비-면역 세포에 의해 생성된 다형질발현성 사이토킨이다. 그것은 가용성의 세포막 결합된 IL-6R (α 사슬)에 결합하여 2원 복합체를 형성하고, 이 복합체는 세포막 결합된 gp130 (β 사슬)과 상호작용할 수 있어서, IL-6, IL-6R 및 gp130 중 2개를 포함하는 신호화 복합체의 형성을 유도한다.
임상 샘플에서 NAb 활성을 검출하는 민감하고 재생가능한 분석을 개발할 규제성 요구가 있다. 세포-기초 분석은 NAb를 검출하기 위한 것으로 기술분야에 알려져 있는 한편, 비-세포 기초 경합성 리간드 결합 (CLB) 분석은 그것이 월등한 동적 범위와 민감성을 제공하기 때문에 더 좋은 대안으로서 작용할 수 있다. 그러나, CLB 분석은 또한 다양한 분석 및 매트릭스 성분들로부터 간섭되는 문제들을 가질 수 있다. 출원인들은 환자에서 생체치료적 약물 분자에 대해 반응하는 중화하는 항체 (NAb)를 검출할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 CLB 분석을 개발하였다.
한 측면으로, 생체치료제로 치료된 환자에서 생체치료제에 대한 중화 항체 (NAb)의 평가에 대한 방법이 제공된다. 그 방법은 생체치료제로 치료된 환자의 치료 중 및/또는 후에 NAb의 존재의 평가를 포함한다.
한 구체예에서, 생체치료 단백질을 필요로 하고 상기 단백질로 치료된 환자에서 생체치료 단백질에 대한 중화 항체의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 그 방법은 (a) 환자 샘플을 포획 시약과 조합하는 단계 및 (b) 검출 시약을 첨가하는 단계를 포함하고, 이때 대조 샘플에 비하여 감소된 신호는 생체치료제에 대한 중화 항체의 존재를 나타낸다. 한 구체예에서, 단백질 생체치료제는 단클론성 항체 (mAb), 바람직하게 항-인터류킨-6 수용체 α (IL-6Rα) 단클론성 항체이다. 한 구체예에서, 단백질 생체치료제 mAb는 사릴루맙 또는 토실리주맙이고; 보다 구체적으로 단백질 생체치료제 mAb는 사릴루맙이다.
샘플은 IL-6-의존성 질환에 대해 치료되고 있는 환자로부터 얻어진다. 환자로부터 얻어진 샘플은 예를 들면 조직, 타액, 모유, 혈액, 혈장, 혈청 또는 항체들이 검출될 수 있는 어떠한 다른 관련된 생물학적 유체를 포함한다. 한 구체예에서, 샘플은 그런 환자로부터 얻어진 혈청 샘플이다.
IL-6-의존성 질환의 실례는 류머티스성 관절염, 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 알츠하이머병, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 골수종, 모든 혼합 결합조직 장애, 캐슬만병 및 전립선암을 포함한다. 특정 구체예에서, 혈청 샘플은 류머티스성 관절염에 걸린 환자로부터 얻어진다.
방법의 한 구체예에서, 포획 시약은 표지된 생체치료 단백질을 포함한다. 환자가 사릴루맙으로 치료될 때 포획 시약은 표지된 사릴루맙이다. 일부 구체예에서, 포획 시약은 매트릭스, 표면 또는 대응-표지된 분자에의 결합을 촉진하기 위해 표지로 태그된다. 표지는 예를 들면 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘, FLAG, c-myc, HAT (천연 히스티딘 친화성 태그), 글루타티온 S-트란스페라제, 글루타티온 S, RNaseA의 S-단편, 말토오스-결합 단백질, 키틴-결합 도메인, 키틴, 칼모듈린, 칼모듈린-결합 펩티드 등을 포함한다. Terpe, K., "Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems," Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 60:523-533 참조. 발명의 방법의 한 구체예에서, 포획 시약은 비오티닐화된 사릴루맙이다.
방법의 한 구체예에서, 검출 시약은 표지된 가용성 IL-6 수용체 α이다. 다른 구체예에서, 검출 시약은 검출을 가능하게 하기 위해 표지를 함유한다. 표지는 예를 들면 유로피움과 같은 킬레이트화된 란타니드계 금속, 루테늄과 같은 백금족 금속, 플루오로크롬과, 무엇보다 플루오레신 및 로다민과 같은 크산텐 유도체, 그린 형광 단백질 (GFP) 및 그것의 유도체인 노란색 형광 단백질 (YFP) 및 적색 형광 단백질 (RFP)과 같은 형광 단백질, 요오드-125 및 악티늄-225와 같은 방사선표지 및 다른 유사한 검출가능한 표지들을 포함한다. 보다 구체적인 구체예에서, 검출 시약은 루테늄 표지된 가용성 IL-6 수용체 α이다.
한 구체예에서, 조합된 환자 샘플 및 포획 시약은 낮은 pH (산성)로 처리된다. 특정 구체예에서, 처리는 아세트산으로 이루어지고, 그런 다음 중화 단계가 이어진다.
한 구체예에서, 생체치료 단백질로 치료되고 있는 환자에서 중화 항체들의 존재를 검출하기 위한 발명의 분석 방법은 약 150 ng/mL의 민감성, 약 500 ng/mL의 약물 내성 및 약 1 μg/mL의 표적 간섭 내성을 나타낸다.
다른 측면으로, 상기에서 기술된 포획 및 검출 시약과, 그것들의 사용 지시서를 포함하는 키트가 제공된다.
도 1 및 2는 약물 포획 (도 1) 및 표적 포획 (도 2) 분석 방식을 예시하고 비교한다. 두 가지 분석 방식에서, 신호는 NAb의 부재시에 생성되고 신호의 억제는 NAb의 존재시에 일어난다. % 억제 = NAb의 존재에 의해 유발된 바탕 (NQC) 신호의 % 감소.
도 3 및 4는 약물 포획 (도 3) 및 표적 포획 (도 4) 분석 방식에 대한 약물 내성에 미치는 낮은 pH 처리의 효과를 보여주는 막대그래프이다. 검은색 막대 = 낮은 pH 처리; 흰색 막대 = 낮은 pH 처리 없음.
도 5 및 6은 약물 포획 (도 5) 및 표적 포획 (도 6) 분석 방식에서 약물 간섭의 효과를 나타낸다.
도 7 및 8은 폴스 포지티브의 생성에 미치는 IL6Rα 간섭의 효과를 나타낸 그래프이다. 도 7은 약물 포획과 표적 포획 방식 둘 다에 대한 결과를 나타내고; 도 8은 약물 포획 방식을 사용하는 항-표적 항체의 존재시에 표적 간섭의 결과를 나타낸다.
도 9 및 10은 약물 포획 방식에서 NAb의 검출을 간섭하는 고신호 반응 인간 샘플의 경감의 연구 결과를 도시한다. 도 9는 선택된 류머티즘 인자 포지티브 (RF+) 개체에서의 고신호 반응의 결과를 도시하고; 도 10은 고신호 RF+ 개체에서의 NAb 회복의 결과를 도시한다.
도 11은 표준 스트렙트아비딘 (채워진 막대) 또는 고결합 아비딘 (흰색 막대) 플레이트에서의 고신호 RF+ 개체를 스크리닝함으로써 얻어진 결과들을 나타낸 막대 그래프이다.
도 12는 선택된 고신호 RF+ 개체 또는 정상 신호 RF+ 개체에서 얻어진 결과들을 나타내는 막대 그래프이다; 검은색 막대 = 스파이킹 (spiking)되지 않은 샘플; 흰색 막대 = LQC로 스파이킹된 샘플.
본 발명을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않고, 그런 방법들 및 조건들은 달라질 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 범주가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 특정 구체예만을 기술할 목적이고, 제한되는 것으로 의도되지 않았음이 인지되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 발명이 속한 기술분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 특별히 인용된 수치를 참조로 사용될 때, 값이 인용된 값으로부터 1% 이하로 달라질 수 있는 것을 의미한다. 예를 들면 본원에서 사용되는 표현 "약 100"은 99와 101 및 둘 사이의 모든 값 (예컨대 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 물질이든지 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공보는 본원에 그것들의 전체 내용을 기술하기 위해 참조로 포함된다. 다른 구체예들은 이어지는 상세한 설명을 검토함으로써 드러나게 될 것이다.
본원에 기술된 발명이 전체적으로 이해될 수 있도록 하기 위해 다음의 상세한 설명이 제시된다.
본원에서 개발된 CLB 분석은 Meso Scale Discovery (MSD) 플랫폼을 기초로 하였다. 도 1 및 2는 조사된 2가지 분석 방식을 예시한다. 도 1은 인간 혈청 샘플의 NAb가 비오티닐화된-사릴루맙과 함께 인큐베이션되고 계속해서 스트렙트아비딘- 또는 아비딘 코팅된 미소플레이트상에서 포획되는 약물 포획 방식을 예시한다. 그런 다음 루테닐화된-IL6Rα의 첨가는 NAb의 부재시 신호 및 NAb의 존재하에 신호의 억제를 초래하였다. 그 원리는 표적 포획 방식에서도 동일하게 유지되지만, 루테닐화된-사릴루맙은 이제 플레이트 상에서 비오티닐화된-IL6Rα 표적에 의해 포획된다. 민감하고 신뢰할 수 있는 분석의 개발은 약물, 표적, 표지, pH 및 인큐베이션 시간의 최적화를 포함하였다. 2가지 분석 방식은 비교되었고 그런 다음 월등한 방식이 최적화되었으며 확인되었다.
초기의 특성확인은 표적 포획이 약물 간섭에 대해 더 민감한 한편 약물 포획 방식은 더 높은 비-특이적 신호를 초래한 것을 제시하였다. 여러 최적화 전략이 조사되었고 이어서 이 프로그램에 대한 최상의 분석을 선택하기 위해 비교 평가가 이루어졌다. RF+ 혈청으로부터 유발된 폴스 네거티브를 유도하는 높은 바탕 신호는 아비딘-코팅된 미소플레이트의 상이한 고체 기질에 대한 스위칭에 의해 효과적으로 제거되었다. 낮은 pH 처리는 약물 내성을 개선한 한편, 표적 간섭은 표적과 약물 사이의 상호작용을 특이적으로 차단하는 항-표적 항체로 경감되었다. 결과들은 약물 포획 방식이 표적 또는 약물 중 어느 하나로부터 최소한의 간섭을 받으면서 민감하고 강력한 분석을 제공하였음을 나타냈다. 확인된 분석은 1 내지 8%의 범위의 정확도를 증명하였고 다음의 특징을 나타낸다: 민감성 = ~150 ng/mL, 약물 내성= ~500 ng/mL, 표적 간섭 = ~1 μg/mL.
표적 포획 및 약물 포획 방식은 둘 다 CLB NAb 분석을 수립하기 위해 성공적으로 사용될 수 있긴 하지만, 민감성, 약물 내성 및 경감되는 표적 간섭에 대한 성공적인 전략을 고안하기 위해 약물과 표적 쌍의 특이적인 결합 특성을 연구하는 것이 중요하다. 얻어진 결과를 토대로, 약물 포획 방식이 월등하였고, 그로써 임상 샘플 생체분석에 대해 확인되고 활용되었다.
발명은 단백질 생체치료제에 대한 중화 항체의 검출에 대한 면역원성 분석을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 단백질 생체치료제는 단클론성 항체 (mAb)이다; 보다 구체적으로, 단백질 생체치료제는 인터류킨-6 수용체 알파 (IL-6Rα)에 특이적으로 결합하는 mAb이다; 보다 구체적으로 생체치료제는 사릴루맙이다. 사릴루맙 (또한 REGN88로도 불림)은 류머티스성 관절염의 치료를 위해 개발되었다. 따라서, 특정 구체예에서 발명은 류머티스성 관절염에 대해 사릴루맙으로 치료된 환자에서 중화 항체의 검출을 위한 면역원성 분석을 제시한다. 다른 항-IL-6Rα 단클론성 항체들, 예를 들면 인간화된 항-IL-6Rα 토셀리주맙이 발명의 방법에 사용될 수 있는 것으로 가시화된다.
정의
"중화 항체 (NAb)"는 생체치료 분자를 중화시키는 능력을 가지고 있는 항-약물 항체이다. 한 구체예에서, 생체치료 분자는 항-IL6Rα 항체 사릴루맙이고, NAb는 IL6Rα 항체에 결합하여 IL6Rα에 결합하는 것을 방지한다.
용어 "분석물"은 분석되는 물질, 즉 품질 대조표준에 존재하는 마우스 항-REGN88 단클론성 항체 (REGN575) 또는 인간 혈청 샘플 중의 인간 항-REGN88 NAb를 나타내기 위해 사용된다.
"차단점"은 분석에서 Nab 네거티브와 NAb 포지티브 반응 사이를 구별하기 위해 사용된 임계값 (즉 % 억제)을 나타내는 용어이다. 그것은 단순 약물병 (drug-naive diseased) 인간 샘플 세트의 분석 반응을 분석함으로써 통계적으로 측정된 상수이다.
실시예
다음의 실시예들은 기술분야의 숙련자들에게 발명의 방법 및 조성물의 제조 방법 및 사용 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하기 위해 의도되지 않았다. 사용된 숫자 (예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나 약간의 실험적 오차와 편차는 해명될 수 있을 것이다. 다르게 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1. REGN88 ( 사릴루맙 )에 대한 NAb를 검출하기 위한 경합성 리간드 결합 분석
REGN88은 인간 인터류킨-6 수용체α (IL-6Rα)에 특이적인 인간 단클론성 항체 (IgG1 하위부류)이다. 경합성 리간드 결합 분석 방식을 사용하여 항-REGN88 중화 항체 (NAb)를 검출하기 위한 방법을 하기에서 기술하는 것과 같이 개발하였다.
분석 과정은 마우스 항-REGN88 단클론성 항체 (REGN575)를 포지티브 대조표준으로서, 비오티닐화된 REGN88 (비오티닐화된-REGN88)을 포획 시약으로서, 루테늄-표지된 가용성 hIL-6α (루테늄-REGN78)를 검출 시약으로서, 그리고 리간드 간섭을 경감시키기 위하여 REGN17 (항-인간 IL-6Rα 단클론성 항체)을 사용한다.
간단하게 설명하면, 샘플과 대조표준을 낮은 pH 상태 (아세트산으로 만듬)에 희석한 후 비오티닐화된-REGN88 및 REGN17을 함유하는 트리스-염기 용액을 사용하여 중화시켰다. 낮은 pH 처리는 혈청 샘플에 존재하는 NAb:약물 및 약물:표적 복합체의 해리를 초래하여 혈청 중의 과잉 약물의 존재하에 NAb의 개선된 검출을 허용한다. 표적 간섭을 경감시키기 위하여, REGN17을 사용하여 낮은 pH 처리에 의해 방출된 자유 표적에 결합시킨다. 인큐베이션 중에 포지티브 대조표준 (REGN575) 또는 샘플 중에 존재하는 어떠한 NAb든지 비오티닐화된-REGN88에 결합한다. 그런 다음 낮은 pH로 처리된 샘플을 아비딘 사전코팅된 미소플레이트에 첨가하고, 플레이트에서 아비딘은 그것에 결합된 어떠한 NAb와 함께 비오티닐화된-REGN88을 포획하였다.
인큐베이션과 세척 후에, 루테늄-REGN78을 미소플레이트에 첨가하였다. 샘플 중의 NAb의 부재하에, 아비딘 포획된 비오티닐화된-REGN88은 루테늄-REGN78에 결합하여 미소플레이트 표면상에서 비오티닐화된-REGN88:루테늄-REGN78 복합체를 형성한다. 트라이프로필아민 (TPA) 기초 판독 완충액을 미소플레이트에 첨가하고, 그것을 Meso Scale Discovery (MSD) 전기화학발광 판독기에 의해 판독하였다. NAb의 존재하에, NAb는 비오티닐화된-REGN88에 결합하여 비오티닐화된-REGN88:루테늄-REGN78 복합체의 형성을 방지할 것이고, 그것은 계속해서 전기화학발광 신호를 감소시킬 것이다. 그러므로, 측정된 전기화학발광 (즉 카운트)은 샘플 중의 NAb의 양에 역비례한다.
80개의 단순-약물 환자 샘플을 차단점을 측정하기 위해 분석하였다. 선택된 % 억제 차단점은 0.1% 폴스 포지티브 비율을 기초로 매개변수 방법을 사용하여 계산된 바 40이었다. 퍼센트 억제 (% 억제)는 NAb의 존재로부터 유발되는 신호의 감소로서 계산하였다. 포지티브 품질 대조표준 (PQC)은 분석의 성능을 증명하기 위해 사용된, NQC로 제조된, 공지량의 REGN575를 가지는 대조 샘플이었다: HQC = 고품질 대조표준; 20X HQC: 4 μg/mL; MQC = 중간 품질 대조표준; 20 MQC: 0.4 μg/mL; LQC = 저품질 대조표준; 20X LQC: 0.2 μg/mL. 네거티브 품질 대조표준 (NQC)은 분석물이 없는 대조 샘플 (순수한 인간 혈청)이었고, % 억제를 계산하기 위해 사용하였다. 스파이킹된 네거티브 품질 대조표준 (SNQC)은 REGN17의 성능을 증명하기 위해 사용된, NQC로 제조된, 공지량의 REGN78을 가지는 대조 샘플이었다. CV% - 백분율로 표시된 변화의 계수. 검출 한계 (LOD)는 차단점보다 큰 % 억제를 가지는 포지티브 대조표준 (REGN575)의 최저 농도였다. 순수 혈청에서 분석의 LOD는 대략 150 ng/mL의 마우스 항-REGN88 단클론성 항체 (REGN575)였다. 카운트 = 전기화학발광 신호의 유닛.
재료 및 장비. 시약: 항-REGN88 mAb로도 언급되는 마우스 항-REGN88 단클론성 항체 (Regeneron, REGN575); 비오티닐화된 REGN88 (비오틴-REGN88 또는 비오티닐화된-REGN88); 루테늄-표지된 hIL-6Rα (Ru(bpy)3 REGN78 또는 루테늄-REGN78); 마우스 항-인간 IL-6Rα 단클론성 항체 (또한 항-hIL-6Rα mAb로도 언급됨); hIL-6Rα (REGN78); 5% BSA 차단 완충액; 포스페이트 완충된 알린, pH 7.2 (1X PBS); 아비딘-코팅된 미소플레이트 - MULTI-ARRAY® 96-웰 아비딘 골드 플레이트; 300 mM 아세트산; 1.5 M Trizma-기초 용액 (트리스 또는 트리스-염기; 판독 완충액 - MSD 판독 완충액 T (4X), 계면활성제 포함 (4X 판독 완충액); 1X 세척 완충액; 정제수; 모아진 인간 혈청.
기기 및 기구. 96-웰 폴리프로필렌 플레이트 (깊은 웰 플레이트 또는 블럭); MSD Discovery Workbench 어플리케이션이 수반되는 Sector Imager 2400 (Meso Scale Discovery, Model 1250); 마이크로소프트 엑셀; SoftMax® Pro 어플리케이션, 버전 5.2 이상 (Molecular Devices).
과정. 플레이트 흔들기를 인큐베이션 단계 동안 수행하였다. 최소 10 μL를 모든 부피 전달에 사용하였다. 인간 혈청을 취급할 때 생물학적 안전성 수준 2 예방조치를 고수하였다. 품질 대조표준 (QC): QC는 실온에서 적어도 4시간 보관시 (4시간 32분), 또는 4℃ 냉장고에서 23시간까지 (23시간 20분) 보관시 10회까지의 냉동-해동 주기 동안 안정한 것으로 나타났다. QC 안정성을 연구 샘플 안정성에 대한 대용물로서 사용하였다. 네거티브 품질 대조표준 (NQC): 시판되는 정상인 혈청 풀을 NQC로서 사용하기 위해 정성하였다. 인간 혈청 모음 (NQC)을 부분표본화하고 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.
PQC - ( HQC , MQC , LQC )의 제조. PQC를 그것이 제조일 후 샘플 분석에 사용하기 위해 의도된 것인지에 대해 정성하였다. 20X PQC를 마우스 항-REGN88 단클론성 항체 (REGN575)를 NQC로 스파이킹시킴으로써, 하기 표에서 열거한 농도에서 제조하였다. 다음은 각각의 PQC의 제조를 위한 실례로서 사용할 수 있다: 실례: 10 μL의 REGN575 (0.88 mg/mL)를 166 μL의 NQC에 첨가하고 혼합하여 50 μg/mL의 REGN575 용액 (QC 전구체 A)을 얻었다. 10 μL의 50 μg/mL REGN575 영액을 490 μL의 NQC에 첨가하고 혼합하여 1 μg/mL의 REGN575 용액 (QC 전구체 B)을 얻었다. PQC를 같은 날에 사용하거나 부분표본화하여 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.
Figure 112016044362066-pct00001
스파이킹된 네거티브 품질 대조표준 ( SNQC ). SNQC를 제조일 후에 샘플 분석에 사용하기 위하여 정성하였다. 0.6 μg/mL의 hIL-6Rα (REGN78)를 NQC에서 제조하였다. 다음을 SNQC의 제조를 위한 실례로서 사용할 수 있다: 실례: 10 μL의 REGN78 (2.3 mg/mL)을 220 μL의 NQC에 첨가하고 혼합하여 100 μg/mL의 REGN78 용액을 얻었다. 100 μg/mL의 REGN78 용액 10 μL를 90 μL의 NQC에 첨가하고 혼합하여 10 μg/mL의 REGN78 용액을 얻었다. 10 μg/mL의 REGN78 용액 30 μL를 470 μL의 NQC에 첨가하고 혼합하여 0.6 μg/mL의 REGN78 용액 (SNQC)을 얻었다. SNQC를 같은 날에 사용하거나 부분표본화하여 -80℃ 냉동고에서 보관하였다.
분석 과정. QC를 회수하여 해동하고, 연구 샘플을 얼음위에 또는 4℃ 냉장고에서 유지하였다. 깊은 웰 폴리프로필렌 플레이트 (샘플 플레이트)에서, QC 및 연구 샘플 각각의 1:10 희석을 300 mM 아세트산에서 제조하고 혼합하였다. 실례: 10 μL의 각 QC/샘플을 90 μL의 300 mM 아세트산에 첨가하고 혼합하였다. 샘플 플레이트를 덮고 45 ± 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 1X PBS 중의 1% BSA 용액을 제조하고 혼합하였다. 실례: 8 mL의 5% BSA 차단 완충액을 32 mL의 1X PBS에 첨가하고 혼합하였다. 10 ng/mL의 비오티닐화된-REGN88, 50 μg/mL의 REGN17 및 1% BSA 중의 0.2 M 트리스를 함유하고 있는 용액을 제조하고 혼합하였다. 실례: 10 μL의 비오티닐화된-REGN88 (3.8 mg/mL)을 370 μL의 1% BSA에 첨가하고 혼합하여 100 μg/mL의 비오티닐화된-REGN88 용액을 얻었다. 10 μL의 100 μg/mL 비오티닐화된-REGN88을 190 μL의 1% BSA에 첨가하고 혼합하여 5 μg/mL의 비오티닐화된-REGN88 용액을 얻었다. 15 μL의 5 μg/mL의 비오티닐화된-REGN88, 19.3 μL의 19.5　mg/mL의 REGN17 및 1 mL의 1.5 M 트리즈마 염기를 6.5 mL의 1% BSA에 첨가하고 혼합하여 10 ng/mL의 비오티닐화된-REGN88, 50 μg/mL의 REGN17 및 1% BSA 용액 중의 0.2 M 트리스를 얻었다. 깊은 웰 폴리프로필렌 플레이트 (샘플 플레이트)에서, QC와 연구 샘플의 최종 1:2 희석 (1:20 총 희석)을 10 ng/mL의 비오티닐화된-REGN88, 50 μg/mL의 REGN17 및 1% BSA 용액 중의 0.2 M 트리스에서 제조하고 혼합하였다. 실례: 100 μL의 10 ng/mL의 비오티닐화된-REGN88, 50 μg/mL의 REGN17 및 1% BSA 용액 중의 0.2 M 트리스를 100 μL의 산성화된 QC/샘플에 첨가하고 혼합하였다. 샘플 플레이트를 덮고 60 ± 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 인큐베이션하는 동안 400 rpm에서 흔들어주었다. 분석 플레이트 3X를 300 μL/웰의 1X 세척 완충액으로 MSD PLATE 3X 세척 프로그램을 사용하여 세척하였다. 샘플 플레이트로부터 50 μL의 각각의 QC 및 연구 샘플을 분석 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 분석 플레이트를 덮고 60 ± 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 인큐베이션하는 동안 400 rpm에서 흔들어주었다. 1% BSA 중의 2 μg/mL의 루테늄-REGN78을 함유하는 용액을 제조하고 혼합하였다. 실례: 10 μL의 루테늄-REGN78 (2.9 mg/mL)을 280 μL의 1% BSA에 첨가하고 혼합하여 100 μg/mL의 루테늄-REGN78 용액을 얻었다. 100 μg/mL의 루테늄-REGN78 140 μL를 7 mL의 1% BSA에 넣고 혼합하여 1% BSA 용액 중의 2 μg/mL의 루테늄-REGN78을 얻었다. 분석 플레이트 3X를 300 μL/웰의 1X 세척 완충액으로 MSD_PLATE_3X 세척 프로그램을 사용하여 세척하였다. 1% BSA 용액 중의 2 μg/mL의 루테늄-REGN78의 50 μL/웰을 분석 플레이트에 첨가하였다. 분석 플레이트를 덮고 60 ± 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였고, 인큐베이션하는 동안 400 rpm에서 흔들어주었다. 미소플레이트 제조. 300 μL/웰의 5% BSA 차단 완충액을 아비딘-코팅된 미소플레이트 (분석 플레이트)에 첨가하였다. 미소플레이트를 밀봉하고 1 내지 4시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 2X 판독 완충액 용액을 제조하고 혼합하였다. 실례: 10 mL의 4X 판독 완충액을 10 mL의 정제수에 첨가하고 혼합하였다. 분석 플레이트 3X를 300 μL/웰의 1X 세척 완충액으로 MSD_PLATE_3X 세척 프로그램을 사용하여 세척하였다. 150 μL/웰의 2X 판독 완충액 용액을 분석 플레이트에 첨가하였다. 분석 플레이트를 Sector Imager 2400 상에서 2X 판독 완충액을 첨가한 후 10분 이내에 판독하였다.
데이터 분석. 플레이트 판독 데이터를 SoftMax 프로 파일 방식으로 전송하였다. 일단 SoftMax 파일에 들어오면, 웰을 차단하는 것이 필요한 경우 웰을 변환 데이터 섹션에서 차단하였다. 이것은 차단된 값이 가시화되는 것을 허용하지만 계산에는 사용하지 않았다. 그런 다음 평균 카운트, % 억제 및 CV% 카운트를 각각의 QC 및 연구 샘플에 대해 계산하였다.
% 억제 = 100 x [(NQC의 평균 카운트 - PQC 또는 샘플의 평균 카운트)/NQC의 평균 카운트].
분석 성능 명세: LQC % 억제 > 차단점이어야 하고; SNQC % 억제 < 차단점이어야 하며; HQC % 억제 > MQC % 억제여야 하고; MQC % 억제 > LQC % 억제여야 하며; 각각의 PQC 및 SNQC의 CV% 카운트 ≤ 20%여야 하고; NQC의 CV% 카운트 = 15%여야 한다.
연구 샘플 허용 기준. 분석 성능 - 모든 분석 성능 명세를 충족시켰고, 그렇지 않으면 연구 샘플을 재-문서화하고 재-분석하였다. 정확성 - CV% 카운트는 ≤ 20%여야 하고, 그렇지 않으면 연구 샘플을 재-문서화하고 재-분석하였다. 차단점보다 큰 % 억제를 가지는 어떠한 연구 샘플이든지 포지티브로서 기록하였다. 차단점보다 작거나 동등한 % 억제를 가지는 어떠한 연구 샘플이든지 네거티브로서 기록하였다.
실시예 2. 약물 내성에 미치는 낮은 pH 처리의 영향
약물 포획 및 표적 포획 방식 둘 다에서 약물 내성에 대한 낮은 pH 처리의 효과를 시험하기 위하여 실험을 수행하였다. 인간 혈청을 포지티브 대조표준의 표시된 농도에서 1 μg/mL의 사릴루맙으로 스파이킹시켰다. 이들 샘플을 둘 다의 분석 방식에서 모두 낮은 pH 처리가 있거나 없이 시험하였다. QC와 샘플을 아세트산 작동 스톡 농도로 희석하고 인큐베이션하였다. 그런 다음 그것들을 적절한 루테닐화된-검출 시약을 함유하고 있는 트리스 중화 완충액에 희석하였다. 그 결과를 도 3 및 4에 나타낸다.
결과: 낮은 pH 처리는 과잉 약물의 간섭을 효율적으로 경감시키고, 둘 다의 분석 방식에서 NAb의 검출을 개선시켰다.
실시예 3. 약물 간섭
NAb의 부재시에 폴스 포지티브 반응을 생성하는 약물의 능력을 약물 간섭으로서 정의한다. 둘 다의 분석 방식에서 NAb의 부재시에 약물의 간섭을 비교하기 위하여 연구를 수행하였다.
방법: 정상인 혈청을 표시된 농도의 사릴루맙으로 스파이킹시켰다. 모든 샘플을 낮은 pH에서 처리하였고 약물 포획 방식과 표적 포획 방식 둘 다로 시험하였다.
결과. 표적 포획 방식: 고농도의 유리 사릴루맙이 비오티닐화된-IL6Rα와의 결합에 대해 루테닐화된-사릴루맙과의 경합에서 이김으로써 폴스 포지티브 반응을 초래한다 (도 5). 약물 포획 방식: NAb의 부재시에 사릴루맙은 플레이트 상에서 포획하는 사릴루맙에 결합할 수 없고 따라서 분석에서 간섭할 수 없다 (도 6).
폴스 포지티브 결과의 경감에 미치는 특이적인 표적 IL6Rα의 효과를 상기에서 기술한 것과 같이 연구하였다. 정상인 혈청은 표시된 농도의 IL6Rα로 스파이킹시키고 두 가지 분석 방식으로 낮은 pH 처리로 시험하였다 (도 7). 유사한 샘플을 항-표적 (IL6Rα) 항체를 첨가하거나 첨가하지 않고 시험하였다 (도 8). 표적 간섭으로부터의 폴스 포지티브 반응을 두 가지 분석 방식으로 관찰하였다. IL6Rα:사릴루맙 복합체를 시험했을 때 유사한 결과를 관찰하였다. 항-표적 항체의 첨가는 약물 포획 방식에서 간섭을 경감시켰다. 그러나, 항-표적 항체는 포획을 차단할 것이기 때문에 표적 포획 방식에는 첨가할 수 없었다. 약물 포획 방식을 선택하여 이 지점에서 앞으로 사용하였다.
표적 (IL6Rα)에 의해 유발된 폴스 포지티브 결과를 경감시키기 위해 연구를 수행하였다. 정상인 혈청을 표시된 농도의 IL6Rα로 스파이킹시키고 두 가지 분석 방식에서 낮은 pH 처리로 시험하였다. 유사한 샘플을 항-표적 (IL6Rα) 항체를 첨가하거나 첨가하지 않고 시험하였다.
표적 간섭으로부터의 폴스 포지티브 반응을 두 가지 분석 방식으로 관찰하였다 (도 7). IL6Rα:사릴루맙 복합체를 시험했을 때 유사한 결과를 관찰하였다 (도 8). 항-표적 항체의 첨가는 약물 포획 방식에서 간섭을 경감시켰다. 그러나, 항-표적 항체는 포획을 차단할 것이기 때문에 표적 포획 방식에는 첨가할 수 없었다. 약물 포획 방식을 선택하여 이 지점에서 앞으로 사용하였다.
실시예 4. 인간 혈청 매트릭스 간섭의 경감
다음에, RF+ 혈청을 낮은 pH로 처리하고 약물 포획 방식으로 스크리닝하였다. 선택된 고신호 RF+ 개체 대 정상 신호 RF+ 개체를 비교하였다. LQC 수준의 포지티브 대조표준을 이들 단순 약물 혈청에서 낮은 pH 처리 전에 스파이킹시켰고 그런 다음 분석에서 작동시켰다.
결과: 특정 RF+ 개체에 의해 생성된 신호는 NQC의 신호보다 컸고 고도로 네거티브한 % 억제를 초래하였다. 이들 개체에서, 포지티브 대조표준으로의 스파이킹은 여전히 폴스 네거티브 결과를 초래하였다 (도 9 및 10).
표준 스트렙트아비딘-코팅된 플레이트 대 고결합 아비딘-코팅된 플레이트를 비교하는 연구를 수행하였다. 2개의 고신호 RF+ 개체를 낮은 pH로 처리하고 분석에서 시험하였다. 그런 다음 선택된 고신호 RF+ 개체 대 정상 신호 RF+ 개체 사이의 비교를 수행하였다. LQC 수준의 포지티브 대조표준을 이들 단순 약물 혈청에서 낮은 pH 처리 전에 스파이킹시켰고 그런 다음 고결합 아비딘-코팅된 플레이트에서 작동시켰다.
결과: 고신호 RF+ 개체를 고결합 아비딘-코팅된 플레이트로 바꿈으로서 규준화할 수 있었다 (도 11). 신호를 규준화함으로써, 이들 플레이트는 이들 "고신호" RF+ 개체에서 NAb의 검출을 허용하였다 (도 12).

Claims (29)

  1. 생체치료 단백질을 필요로 하는 환자에게 투여된 생체치료 단백질에 대한 중화 항체의 존재를 검출하는 방법으로서, (a) 환자 샘플의 pH를 산성 pH로 감소시키는 단계, (b) 생체치료 단백질의 표적 및 표지된 생체치료 단백질을 포함하는 포획 시약에 결합하는 항체와 환자 샘플을 조합하는 단계, 여기서 생체치료 단백질 상의 표지는 생체치료 단백질의 표면에의 결합을 용이하게 하는 단계, 및 (c) 생체치료 단백질의 표지된 표적을 포함하는 검출 시약을 첨가하는 단계를 포함하고, 여기서 대조 샘플에 비하여 감소된 신호는 생체치료 단백질에 대한 중화 항체의 존재를 가리키는 것인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질 생체치료제는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 단백질 생체치료제는 항-인터류킨-6 수용체 α (IL-6Rα) 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 단백질 생체치료제는 사릴루맙 또는 토실리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 단백질 생체치료제는 사릴루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 환자는 IL-6-의존성 질환에 대해 치료되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, IL-6-의존성 질환은 류머티스성 관절염, 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 알츠하이머병, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 골수종, 결합조직 장애, 캐슬만병 및 전립선암 중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, IL-6-의존성 질환은 류머티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 포획 시약은 표지된 사릴루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 표지된 사릴루맙은 비오티닐화된 사릴루맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 비오티닐화된 사릴루맙은 아비딘-코팅된 플레이트에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 표적은 가용성 IL-6 수용체 α인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 표지된 표적은 루테늄 표지된 가용성 IL-6 수용체 α인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 환자 샘플의 pH는 산성 용액으로의 처리에 의해 산성 pH로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 환자 샘플의 산성 pH로의 감소에 이어서 환자 샘플의 pH를 중성 pH로 증가시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 방법은 150 ng/mL 또는 그의 1% 내의 증감치의 민감성 내성, 500 ng/mL 또는 그의 1% 내의 증감치의 약물 내성, 및 1 μg/mL 또는 그의 1% 내의 증감치의 표적 간섭 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 사릴루맙을 필요로 하는 환자에게 투여된 사릴루맙에 대한 중화 항체의 존재를 검출하는 방법으로서, (a) 혈청 샘플의 pH를 산성 pH로 감소시키는 단계, (b) 환자 혈청 샘플을 비오티닐화된 사릴루맙을 포함하는 포획 시약과 조합하는 단계, (c) 조합된 혈청 샘플과 포획 시약의 pH를 중성 pH로 증가시키는 단계; 및 (d) 검출 시약을 첨가하는 단계를 포함하고, 이때 검출 시약은 표지된 가용성 IL-6 수용체 α를 포함하며, 대조 샘플에 비하여 감소된 신호는 사릴루맙에 대한 중화 항체의 존재를 가리키는 것인, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 검출 시약은 루테늄 표지된 가용성 IL-6 수용체 α인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 환자는 류머티스성 관절염에 걸린 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 방법은 150 ng/mL 또는 그의 1% 내의 증감치의 민감성 내성, 500 ng/mL 또는 그의 1% 내의 증감치의 약물 내성, 및 1 μg/mL 또는 그의 1% 내의 증감치의 표적 간섭 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 14 항에 있어서, 산성 용액은 아세트산인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 15 항에 있어서, pH는 염기성 용액으로의 처리에 의해 중성 pH로 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 염기성 용액은 트리스 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 17 항에 있어서, pH는 산성 용액으로의 처리에 의해 산성 pH로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 산성 용액은 아세트산인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 17 항에 있어서, pH는 염기성 용액으로의 처리에 의해 중성 pH로 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 염기성 용액은 트리스 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 표지된 생체치료 단백질의 표지는 비오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 항체는 낮은 pH 처리에 의해 방출된 생체치료 단백질의 자유 표적에 결합하여 표적 간섭을 경감시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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