CN116930475A - 中和抗体检测方法 - Google Patents
中和抗体检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116930475A CN116930475A CN202210346390.2A CN202210346390A CN116930475A CN 116930475 A CN116930475 A CN 116930475A CN 202210346390 A CN202210346390 A CN 202210346390A CN 116930475 A CN116930475 A CN 116930475A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell surface
- surface receptor
- cell
- ligand
- car
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 135
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 180
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 145
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 100
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims abstract 46
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 85
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 85
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 84
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 33
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 11
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 99
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 238000011161 development Methods 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 19
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 18
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 18
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 18
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 18
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 18
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 description 17
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 15
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 15
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 13
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 9
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 9
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 6
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- -1 CAR-T cells Substances 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- WUHBLPVELFTPQK-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WUHBLPVELFTPQK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- WTMPKZWHRCMMMT-KZVJFYERSA-N Thr-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WTMPKZWHRCMMMT-KZVJFYERSA-N 0.000 description 3
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 2
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)CN=C(N)N PQWTZSNVWSOFFK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 108010051330 Arg-Pro-Gly-Pro Proteins 0.000 description 2
- ATABBWFGOHKROJ-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ATABBWFGOHKROJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N Arg-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N Asp-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FQHBAQLBIXLWAG-DCAQKATOSA-N Asp-Lys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N FQHBAQLBIXLWAG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N Asp-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GYWQGGUCMDCUJE-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- GIKOVDMXBAFXDF-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GIKOVDMXBAFXDF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N Gln-Asn-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 2
- BIAKMWKJMQLZOJ-ZKWXMUAHSA-N His-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(O)=O BIAKMWKJMQLZOJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KLJKJVXDHVUMMZ-KKPKCPPISA-N Ile-Phe-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N KLJKJVXDHVUMMZ-KKPKCPPISA-N 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N Leu-Arg-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N Lys-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N Lys-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DRCILAJNUJKAHC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- DBOMZJOESVYERT-GUBZILKMSA-N Met-Asn-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N DBOMZJOESVYERT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JLMZKEQFMVORMA-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 JLMZKEQFMVORMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HEQPKICPPDOSIN-SRVKXCTJSA-N Ser-Asp-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HEQPKICPPDOSIN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYSFWUIXDFJUDW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- BZTSQFWJNJYZSX-JRQIVUDYSA-N Thr-Tyr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZTSQFWJNJYZSX-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- ZIGZPYJXIWLQFC-QTKMDUPCSA-N Val-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O ZIGZPYJXIWLQFC-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 2
- 208000037844 advanced solid tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108010000998 wheylin-2 peptide Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CEHZCZCQHUNAJF-AVGNSLFASA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 CEHZCZCQHUNAJF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxidanylidene-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WDIYWDJLXOCGRW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WJRXVTCKASUIFF-FXQIFTODSA-N Ala-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WJRXVTCKASUIFF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- YEELWQSXYBJVSV-UWJYBYFXSA-N Ala-Cys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YEELWQSXYBJVSV-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SOBIAADAMRHGKH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N Ala-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N FFZJHQODAYHGPO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYAVDNKUWLAFCV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N Ala-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- DGFGDPVSDQPANQ-XGEHTFHBSA-N Arg-Cys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O DGFGDPVSDQPANQ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- DIIGDGJKTMLQQW-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DIIGDGJKTMLQQW-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- BSYKSCBTTQKOJG-GUBZILKMSA-N Arg-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BSYKSCBTTQKOJG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VENMDXUVHSKEIN-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VENMDXUVHSKEIN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JOTRDIXZHNQYGP-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N JOTRDIXZHNQYGP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- PAXHINASXXXILC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asp-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PAXHINASXXXILC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- BIVLWXQGXJLGKG-BIIVOSGPSA-N Cys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O BIVLWXQGXJLGKG-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N Gln-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NVEASDQHBRZPSU-BQBZGAKWSA-N Gln-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O NVEASDQHBRZPSU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KCJJFESQRXGTGC-BQBZGAKWSA-N Gln-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KCJJFESQRXGTGC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ITZWDGBYBPUZRG-KBIXCLLPSA-N Gln-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ITZWDGBYBPUZRG-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N Gln-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IOFDDSNZJDIGPB-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- MSHXWFKYXJTLEZ-CIUDSAMLSA-N Gln-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MSHXWFKYXJTLEZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UTKICHUQEQBDGC-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UTKICHUQEQBDGC-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N Glu-Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BUAKRRKDHSSIKK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N Glu-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LRPXYSGPOBVBEH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HILMIYALTUQTRC-XVKPBYJWSA-N Glu-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HILMIYALTUQTRC-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DNPCBMNFQVTHMA-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O DNPCBMNFQVTHMA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN CCQOOWAONKGYKQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N Gly-Ile-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N Gly-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN FXGRXIATVXUAHO-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- ZWRDOVYMQAAISL-UWVGGRQHSA-N Gly-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN ZWRDOVYMQAAISL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MDKCBHZLQJZOCJ-STQMWFEESA-N Gly-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)CN MDKCBHZLQJZOCJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N Gly-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GLACUWHUYFBSPJ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 description 1
- DLTCGJZBNFOWFL-LKTVYLICSA-N His-Tyr-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N DLTCGJZBNFOWFL-LKTVYLICSA-N 0.000 description 1
- WSWAUVHXQREQQG-JYJNAYRXSA-N His-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WSWAUVHXQREQQG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 description 1
- 101001047681 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Lck Proteins 0.000 description 1
- HDOYNXLPTRQLAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ala-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N HDOYNXLPTRQLAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- DMHGKBGOUAJRHU-RVMXOQNASA-N Ile-Arg-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DMHGKBGOUAJRHU-RVMXOQNASA-N 0.000 description 1
- DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWWILHPVAKKLQS-QXEWZRGKSA-N Ile-Gly-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N LWWILHPVAKKLQS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JKGHDYGZRDWHGA-SRVKXCTJSA-N Leu-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JKGHDYGZRDWHGA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MPSBSKHOWJQHBS-IHRRRGAJSA-N Leu-His-Met Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N MPSBSKHOWJQHBS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MVJRBCJCRYGCKV-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCN=C(N)N NQCJGQHHYZNUDK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N Lys-Asp-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N Lys-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GQZMPWBZQALKJO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Glu Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC([O-])=O LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LOGFVTREOLYCPF-RHYQMDGZSA-N Lys-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N Met-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N Met-Gly-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KMSMNUFBNCHMII-IHRRRGAJSA-N Met-Leu-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN KMSMNUFBNCHMII-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N Phe-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BJEYSVHMGIJORT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N Phe-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FGWUALWGCZJQDJ-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- BTAIJUBAGLVFKQ-BVSLBCMMSA-N Phe-Trp-Val Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BTAIJUBAGLVFKQ-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- KUSYCSMTTHSZOA-DZKIICNBSA-N Phe-Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N KUSYCSMTTHSZOA-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DZZCICYRSZASNF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FYQSMXKJYTZYRP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LCRSGSIRKLXZMZ-BPNCWPANSA-N Pro-Ala-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O LCRSGSIRKLXZMZ-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SSSFPISOZOLQNP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZYBUKTMPPFQSHL-JYJNAYRXSA-N Pro-Asp-Trp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O ZYBUKTMPPFQSHL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PTLOFJZJADCNCD-DCAQKATOSA-N Pro-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 PTLOFJZJADCNCD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LNOWDSPAYBWJOR-PEDHHIEDSA-N Pro-Ile-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LNOWDSPAYBWJOR-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- CHYAYDLYYIJCKY-OSUNSFLBSA-N Pro-Thr-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CHYAYDLYYIJCKY-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- VVAWNPIOYXAMAL-KJEVXHAQSA-N Pro-Thr-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VVAWNPIOYXAMAL-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- DLZBBDSPTJBOOD-BPNCWPANSA-N Pro-Tyr-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DLZBBDSPTJBOOD-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- VDHGTOHMHHQSKG-JYJNAYRXSA-N Pro-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O VDHGTOHMHHQSKG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- LVVBAKCGXXUHFO-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LVVBAKCGXXUHFO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- INCNPLPRPOYTJI-JBDRJPRFSA-N Ser-Cys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N INCNPLPRPOYTJI-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- BRGQQXQKPUCUJQ-KBIXCLLPSA-N Ser-Glu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BRGQQXQKPUCUJQ-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- SFTZTYBXIXLRGQ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SFTZTYBXIXLRGQ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N Ser-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- NAXBBCLCEOTAIG-RHYQMDGZSA-N Thr-Arg-Lys Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O NAXBBCLCEOTAIG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- DKDHTRVDOUZZTP-IFFSRLJSSA-N Thr-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DKDHTRVDOUZZTP-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- MUAFDCVOHYAFNG-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MUAFDCVOHYAFNG-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N Thr-Val-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 BPGDJSUFQKWUBK-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- UIDJDMVRDUANDL-BVSLBCMMSA-N Trp-Tyr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UIDJDMVRDUANDL-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- OOEUVMFKKZYSRX-LEWSCRJBSA-N Tyr-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N OOEUVMFKKZYSRX-LEWSCRJBSA-N 0.000 description 1
- IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- PEVVXUGSAKEPEN-AVGNSLFASA-N Tyr-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PEVVXUGSAKEPEN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RYSNTWVRSLCAJZ-RYUDHWBXSA-N Tyr-Gln-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RYSNTWVRSLCAJZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- CKHQKYHIZCRTAP-SOUVJXGZSA-N Tyr-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O CKHQKYHIZCRTAP-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- UBKKNELWDCBNCF-STQMWFEESA-N Tyr-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 UBKKNELWDCBNCF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- QFXVAFIHVWXXBJ-AVGNSLFASA-N Tyr-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QFXVAFIHVWXXBJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102100024036 Tyrosine-protein kinase Lck Human genes 0.000 description 1
- AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N Val-Ala-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZSHAZJLOZQYAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VMRFIKXKOFNMHW-GUBZILKMSA-N Val-Arg-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N VMRFIKXKOFNMHW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N Val-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108010090333 leucyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及中和抗体检测方法，提供一种检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的非诊断或治疗的方法，包括步骤：(1)将待测样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体；(2)检测细胞表面受体与所述配体的结合。本发明能够高效便捷的检测生物体产生的针对基因修饰体细胞表面目的基因表达产物的中和抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及肿瘤靶向的细胞治疗产品的外周血中和性抗药抗体检测，包括CAR-T，CAR-NK，CAR-MC等免疫细胞治疗产品临床回输治疗使用后中和抗药抗体的检测使用。
背景技术
免疫原性是对生物或生物技术衍生物产生的体液或细胞介导的免疫反应。大多数生物或生物技术衍生的蛋白质(生物疗法)可诱导免疫反应，该免疫反应可能与患者、疾病或者产品的相关特性有关。生物产品的免疫反应引起的临床结果可能从无效果到良性反应、疗效丧失，甚至严重危及生命。因此，任何生物疗法药物开发计划中，进行免疫原性的测试都是至关重要的。在单克隆抗体药物使用过程中，研究人员已广泛发现其抗药物抗体(anti-drug antibody，ADA)的存在，ADA的产生能够影响抗体药物的体内药代动力学(PK)，包括药物的分布，代谢和清除。其中中和抗体的产生直接会竞争或封闭抗体药物与靶点的结合进一步影响临床疗效。
涉及基因改造的免疫细胞治疗，通过各种基因工程手段在人体细胞上引入新的蛋白表达基因，通过表达不同于常规的蛋白实现识别、结合人体内特定抗原，进而借助免疫细胞自身的功能实现各种治疗目的。嵌合抗原受体(CAR)是其中主要的代表。CAR是一种融合蛋白，它可以在不依赖于传统的T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)的相互作用下，将T细胞特异性重定向于肿瘤细胞膜表面分子。CAR通过基因转移载体被导入到T细胞中，它的抗原识别区最常是由鼠源单克隆抗体的一条连续肽链(scFv)或者来源于纳米抗体的识别抗原的可变区(VHH)组成。scFv或VHH与特定抗原目标肽段结合后通过模块化胞内信号结构域传递出活化信号。目前CAR-T细胞是外周血T细胞在体外制备而来，这个过程一般是由缺乏复制能力的载体将CAR整合到T细胞基因组，随后通过培养扩大到相当大的数量。在回输到患者体内以后，这些细胞可以识别和消除表达有靶抗原的肿瘤细胞。
CAR-T细胞有引发针对自身的体液免疫和细胞免疫的风险，这些免疫反应可以针对CAR结构上的“非我”成分，也可以针对基因转移载体上的残留蛋白，后者有着天然的免疫原性。这种免疫反应可能会反过来限制CAR-T细胞的功能并影响其输注后的临床疗效。目前许多应用于临床的CAR-T细胞的CAR来源于小鼠或其他非人源单克隆抗体。人源或者人源化scFv/VHH也含有“非我”序列，这是因为可变结合区是通过多种基因的重排和体细胞高频突变而来。针对一种特定抗体序列(比如人源scFv上的序列，VHH上的特定序列)的抗体称为“抗独特型抗体”(anti-idiotype antibodies)。此外，多个基因编码的蛋白表达在单个CAR肽链上，在连接处的融合序列也一般不存在于人体。人们对CAR特异性免疫原性在CAR-T回输后对患者临床结局的影响依然知之甚少，而且还没有很好地研究过。针对CAR基因修饰的各类免疫细胞回输后人体产生的ADA情况，尤其是中和抗体的产生情况的检测对于基因修饰细胞药物的开发至关重要。细胞治疗药物因其前沿技术突破和更复杂的设计，目前尚未有成熟法规或指南对其免疫原性问题的检测和管理进行规范。而免疫原性对细胞治疗类产品、特别是CAR-T细胞的影响可能比对抗体药更大，因为除体液免疫外，细胞治疗类产品还会受细胞免疫的影响。
目前，临床中的免疫原性评估是通过中和抗体(NAb)检测检测生物基质(一般是血清或血浆)中的ADA是否有中和活性。关于细胞治疗产品，生物类似物和参照药的免疫原性的评估，无论是关于方法开发还是方法验证，目前都没有具体的法规指导。由于缺乏具体的指导，因此在不同的生物类似药方法开发中可能会使用不同的方法，在方法验证阶段也可能会采用不同的方法。以CAR-T为代表的基因修饰的细胞治疗产品回输后ADA的检测，同样参考蛋白药物的ADA方法进行检测，主要是将基因表达产物(CAR蛋白或ScFv)作为关键试剂，通过夹心ELISA的方法进行检测，该方法的定量必须借用基因表达产物(CAR蛋白或ScFv)进行异种动物(兔，鼠等)免疫，获得的多克隆抗体建立标准曲线进行相对定量(例如参见CN112394179A)。但是该方法存在以下问题：异种多克隆抗体免疫制备需要相当长的开发周期。细胞表达的CAR蛋白或ScFv与其他细胞系基因表达的蛋白存在一定的差异，不能够完全代表免疫细胞基因修饰后的表达情况。对应的亲和力和结合位点可能有所不同，其免疫产生的多克隆抗体结合特性存在一定的差异。
现有的免疫原性的检测方案参考蛋白药物的ADA检测方法，基于二价及二价以上抗体能够与目标蛋白药物的结合，通过显色信号标记蛋白药物显示或量化抗药抗体的产生。ADA检测的常规流程包括：ADA表征定性，包括竞争性配体结合分析、亚型分析、结合稳定性分析、抗原表位特异性分析、结合稳定性、中和能力分析；ADA抗体的定量，包括基于阳性对照抗体的标准曲线，建立相对的滴度进行定量；中和检测，包括中和抗体检测和中和能力分析，常用方法为竞争性配基结合(competitive ligand binding，CBL)，CBL是中和检测的首选方法。
采用生物大分子药物的ADA检测方法，通过修饰基因表达产物作为关键试剂来检测CAR-T细胞为代表的基因修饰免疫细胞的ADA，存在诸多不足之处。首先，ADA检测方法开发周期长，体现在相对定量的阳性对照抗体的开发需要采用修饰基因表达产物去免疫异种动物制备多克隆抗体，通过免疫，纯化制备稳定的阳性对照抗体需要很长的周期。阳性对照抗体不同免疫批次间存在明显的差异，影响检测的一致性。其次，采用不同途径表达的修饰基因产物与修饰免疫细胞药物表达的嵌合抗体存在一定的差异，ADA和中和抗体的特性与嵌合抗体的对应有所不同。再者，中和抗体的检测定量主要通过竞争性配基结合的方法来检测，检测方法的开发需要开发制备具有竞争结合的中和抗体，作为检测定量的阳性对照抗体，进行定量标准曲线的建立。中和抗体检测的阳性对照抗体需要筛选建立单克隆细胞株，保障中和抗体阳性对照抗体的持续制备。阳性对照抗体制备，方法开发，验证的周期长。同样由于采用修饰基因表达产物对中和抗体检测的结果不能完全代表基因修饰免疫细胞治疗产品嵌合抗体的中和作用。在基因修饰的免疫细胞药物开发早期面对多种不同序列，其ADA和中和抗体的产生，因检测方法的关键试剂和阳性对照抗体的开发周期，不能在开发研究的早期进行检测识别。
基因修饰免疫细胞治疗技术和药物的开发是未来生物新药的重要发展趋势，目前针对CD19和BCMA等血液瘤靶点的CAR-T产品在治疗晚期复发淋巴瘤和多发性骨髓瘤上取得了突破性的治疗效果，两个特殊靶点能够在临床上取得优异的疗效，与靶点特异性，血液瘤的肿瘤特性相关，同时也与CAR-T产品清除能够产生抗药抗体的B细胞和浆细胞有一定的相关性。然而针对血液瘤和实体瘤其他多种靶点的细胞治疗产品如CAR-T,TCR-T和CAR-Mc处在早期开发和概念临床验证阶段，实体瘤免疫细胞治疗药物潜在免疫原性对细胞的体内存留和临床疗效影响重大。针对实体瘤不同靶点的基因修饰免疫细胞产品回输人体潜在产生的中和抗体的检测，对于产品最终能否获得优异的临床疗效，基因修饰的免疫细胞能否在患者体内持续存留，具有重要的指示意义。免疫原性和中和抗体的早期检测能够为降低基因修饰免疫细胞治疗药物后期开发失败风险提供关键的早期决策支持，也为预判和提高基因修饰免疫细胞治疗药物临床疗效提供关键的改进依据。
发明内容
本发明第一方面提供一种检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的非诊断或治疗方法，包括步骤：
(1)将待测样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体；
(2)检测细胞表面受体与所述配体的结合。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物，将其水平与含所述细胞表面受体的细胞总水平相比，从而检测样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表面受体包含胞外部分和膜锚定区，所述胞外部分是胞外配体结合区，例如胞外抗原结合区。在一个或多个实施方案中，胞外抗原结合区为抗体或其抗原结合片段，优选纳米抗体。在一个或多个实施方案中，所述膜锚定区是跨膜区。
在一个或多个实施方案中，细胞表面受体是基因修饰后的体细胞表面表达的目的蛋白受体。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表面受体是CAR。在一个或多个实施方案中，所述CAR包含胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内区。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是体细胞，例如免疫细胞、红细胞，干细胞等，优选免疫细胞，进一步优选T细胞、NK细胞、MC细胞(巨噬细胞)。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是表达所述CAR的CAR-T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述配体是由CAR的胞外抗原结合区特异性结合的抗原或该抗原的能与所述CAR结合的片段。优选地，所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原。
在一个或多个实施方案中，所述样品是源自血液的样品，例如血浆、血清或全血；优选血清。
在一个或多个实施方案中，所述样品来自对象。在一个或多个实施方案中，所述对象接触过(例如具有或施用过)所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：在所述对象接触所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞之前，将来自对象的样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，并检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物。
在一个或多个实施方案中，所述配体与可检测标记物偶联。优选地，所述可检测标记物是生物素或荧光物。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括：(1)将源自血浆或血清的样品、CAR-T细胞、生物素或荧光物标记的配体混合孵育，所述血浆或血清是接触过所述CAR-T细胞的对象的血浆或血清，所述CAR的胞外部分具有针对所述配体的抗体，(2)鉴定标记的CAR-T细胞的水平，与CAR-T总细胞水平比较，从而检测样品中针对所述CAR的中和抗体。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括通过下式测定中和抗体中和效率：
中和抗体中和效率＝(Day0阳性率-DayN阳性率)/Day0阳性率，
其中，Day0阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之前检测的标记细胞水平，DayN阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之后检测的标记细胞水平，N为天数。
本发明还提供含有细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞的体内中和抗体效应，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体。
在一个或多个实施方案中，所述评估包括：检测施用过细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞的对象的样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体。在一个或多个实施方案中，所述评估还包括：在向对象施用细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞之前检测来自对象的样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体并与施用后的结果进行对比。
在一个或多个实施方案中，所述检测包括步骤：将待测样品、所述细胞和所述配体混合，并检测细胞表面受体与所述配体的结合。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表面受体包含胞外部分和膜锚定区，所述胞外部分是胞外配体结合区，例如胞外抗原结合区。在一个或多个实施方案中，胞外抗原结合区为抗体或其抗原结合片段，优选纳米抗体。在一个或多个实施方案中，所述膜锚定区是跨膜区。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表面受体是CAR。在一个或多个实施方案中，所述CAR包含胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内区。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是免疫细胞，优选T细胞、NK细胞、MC细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是表达所述CAR的CAR-T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述配体是由CAR的胞外抗原结合区特异性结合的抗原或该抗原的能与所述CAR结合的片段。优选地，所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原。
在一个或多个实施方案中，所述样品是源自血液的样品，例如血浆、血清、全血；优选血清。
在一个或多个实施方案中，所述对象接触过(例如具有或施用过)所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞。
在一个或多个实施方案中，所述配体与可检测标记物偶联。优选地，所述可检测标记物是生物素或荧光物。
本发明还提供一种用于检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的试剂盒，包含：含有所述细胞表面受体的细胞，和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表面受体包含胞外部分和膜锚定区，所述胞外部分是胞外配体结合区，例如胞外抗原结合区。在一个或多个实施方案中，胞外抗原结合区为抗体或其抗原结合片段，优选纳米抗体。在一个或多个实施方案中，所述膜锚定区是跨膜区。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表面受体是CAR。在一个或多个实施方案中，所述CAR包含胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内区。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是免疫细胞，优选T细胞、NK细胞、MC细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是表达所述CAR的CAR-T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述配体是由CAR的胞外抗原结合区特异性结合的抗原或该抗原的能与所述CAR结合的片段。优选地，所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原。
在一个或多个实施方案中，所述样品是源自血液的样品，例如血浆、血清、全血；优选血清。
在一个或多个实施方案中，所述样品来自对象。在一个或多个实施方案中，所述对象接触过(例如具有或施用过)所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞。
在一个或多个实施方案中，所述配体与可检测标记物偶联。优选地，所述可检测标记物是生物素或荧光物。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含样品处理试剂，例如稀释剂。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测细胞表面受体与所述配体的结合的试剂，例如缓冲液、流式抗体、PBS、二抗等。
本发明的有益效果
采用基因修饰的免疫细胞作为中和抗体检测的工具，通过免疫细胞表达的嵌合抗体，体现中和抗体直接作用。避免蛋白水平检测结果潜在的差异。
荧光标记肿瘤抗原或多肽和基因修饰免疫细胞作为检测试剂，制备方便，质量稳定，无明显的差异，制备周期短，保障检测方法的高效建立，提高检测方法的适用性。
通过流式方法检测用药血清对基因修饰免疫细胞表达的嵌合抗体与肿瘤相关抗原或多肽的结合抑制作用，通过结合阳性率和荧光强度的变化值进行定量，方法更加直接和准确。
本发明的使用，能够高效便捷的检测生物体对基因修饰免疫细胞产生的中和抗体定性和定量。尤其适用于基因修饰免疫细胞治疗药物开发过程中中和抗体检测。提升细胞治疗药物开发的效率，降低异体成分导致的中和抗体给新药开发带来的不利风险。
附图说明
图1：荧光标记肿瘤相关抗原或多肽的示意图。
图2：采用荧光标记肿瘤相关抗原或多肽检测中和抗体的检测原理图。
图3：S0105患者的MSLN_CAR-T细胞制剂的流式检测结果图。
图4：S0105患者MSLN_CAR-T首次回输前(D0)和回输后(D28)血清中和抗体的流式检测结果图。
图5：S0105患者MSLN_CAR-T二次回输前(D35)和回输后(D63)血清中和抗体的流式检测结果图。
图6：S0106患者的MSLN_CAR-T终产品的流式检测结果图。
图7：S0106患者MSLN_CAR-T首次回输前(D0)和回输后(D21)血清中和抗体的流式检测结果图。
图8：S0304患者MSLN_CAR-T首次回输前(D0)和回输后(D21)血清中和抗体的流式检测结果图。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本文中，“中和抗体”是当外源物进入机体时产生的特异性抗体。患者回输细胞治疗产品(例如CAR-T)后，由于治疗分子(例如CAR)的免疫原性，人体产生针对治疗分子的抗体，尤其是中和抗体会直接阻断治疗分子对靶蛋白的识别，降低细胞治疗产品的肿瘤杀伤功能。发明人发现，治疗分子的靶蛋白与中和抗体在结合治疗分子方面存在竞争关系。因此，治疗分子上与靶蛋白结合的位点被中和抗体占据，治疗分子不再结合靶蛋白分子。利用可检测标记物的靶蛋白与中和抗体结合治疗分子的竞争关系可快速检测血清样本中是否存在中和抗体。
本文中，“治疗分子”是具有治疗功效的细胞表面受体。本文的细胞表面受体是蛋白，通常包含胞外配体结合区(胞外部分)和跨膜区(膜锚定区)。在具体实施方案中，所述胞外配体结合区是抗MSLN(Mesothelin，间皮素)抗体，优选抗MSLN纳米抗体。优选地，细胞表面受体是胞外抗原结合区为所述抗MSLN纳米抗体的CAR。
如本文所用，“VHH”或“纳米抗体”指特异性识别和结合于抗原的单域多肽或蛋白，是重链抗体的可变区。通常，纳米抗体含有三个CDR和四个FR，是最小的功能性抗原结合片段。本文所述“重链抗体”是抗体的一种，源自骆驼科生物或软骨鱼科生物。相比传统4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
由此，本发明提供一种检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的非诊断或治疗方法，包括步骤：(1)将待测样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体，(2)检测细胞表面受体与所述配体的结合，从而检测样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体。所述非诊断或治疗方法还可包括样品预处理步骤，例如离心、稀释。所述方法中，“检测细胞表面受体与所述配体的结合”包括：检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物，与含所述细胞表面受体的细胞总水平相比可以定性或定量检测样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体。
如图1、2所示，将样品、含有所述细胞表面受体的细胞(例如CAR-T细胞)和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体(生物素或荧光标记的靶蛋白)接触后，若样品中含有中和抗体，其会与配体竞争结合细胞。通过检测细胞与配体的结合复合物，可以通过复合物的水平与总细胞水平的比较确定样品中是否含有中和抗体及其量。本文中，“细胞总水平”或“总细胞水平”指含有细胞表面受体的细胞(例如CAR-T)总水平。本文中，“水平”可以是绝对或相对值。检测所述结合复合物可通过检测配体的绝对或相对量来实现。
所述方法中，步骤(1)的孵育体系中的所述细胞的密度为1～5*107个/mL，优选为1-2*107个/mL。此外，待测样品与细胞(例如CAR-T细胞)悬液的体积比可为1:1。通常，步骤(1)的孵育为至少10分钟，优选至少20分钟。此外，步骤(1)的孵育之后还可包括分离细胞并将其与所述配体孵育至少10分钟(优选20分钟)的步骤。
在具体实施方案中，所述样品来自对象。所述对象接触过(例如具有或施用过)所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞。所以，步骤(2)的检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物获得的是对象接触含有细胞表面受体的细胞之后检测的标记细胞水平。此时，含所述细胞表面受体的“细胞总水平”可以是对象接触含有细胞表面受体的细胞之前检测的标记细胞水平，即所述接触前对象的样品进行所述方法的步骤(1)后孵育体系中与配体结合的细胞水平。由于此时样品中不含有任何针对所述细胞表面受体的中和抗体，所以孵育体系中所有细胞均与配体结合。因此，本文所述方法还可包括：在所述对象接触所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞之前，将来自对象的样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，并检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物(即，接触前对象样品进行所述孵育之后的标记的细胞水平)。
为了便于检测，所述配体与可检测标记物偶联。可检测标记物包括但不限于：生物素、抗体、荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI或CT造影剂、或能够产生可检测产物的酶。优选地，所述可检测标记物是生物素或荧光物(包括流式荧光素，例如PE)。因此，本文所述的配体和细胞的结合复合物可以是标记的细胞。标记物偶联的配体(例如PE标记的间皮素)可以商购或可以通过本领域周知的方法制备。例如，配体和生物素可以通过直接结合而偶联；配体和荧光物可以借助生物素和链霉亲和素的结合而偶联在一起。
含有(包括表达)所述细胞表面受体的细胞可以是任何用于细胞治疗的细胞，例如免疫细胞，包括但不限于T细胞、NK细胞、MC细胞。优选地，所述细胞是表达CAR作为细胞表面受体的CAR-T细胞。在知晓CAR的序列后，本领域技术人员容易通过构建CAR表达载体(例如病毒载体、非病毒载体)并导入T细胞后获得表达CAR的CAR-T细胞。将CAR表达载体导入T细胞的方法本领域周知。
所述配体是由细胞表面受体的胞外配体结合区特异性结合的抗原(抗原蛋白或多肽)或该抗原的能与所述胞外配体结合区结合的片段。优选地，所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原。本领域中的任何肿瘤相关抗原均适用于本发明。在具体实施方案中，所述抗原是MSLN(NCBI，Accession NO.:NP_001170826.1)。
本文中，样品来自对象，该对象可以是健康对象或肿瘤患者。该肿瘤患者的肿瘤可以具有或不具有上述肿瘤相关抗原。为了检测方便，所述样品可以是源自血液的样品，例如血浆、血清、全血；优选血清。血浆、血清、全血在进行本发明方法之前可经预处理。本领域技术人员知晓这些预处理方法，例如血浆样品在4℃，3000g离心10分钟后取上清。当然，任何可能含有中和抗体的其他样品也可包含在本发明的范围内。
本文中，CAR是嵌合抗原受体，其结构包括：胞外区、铰链区、跨膜区和胞内区。CAR的N段还可具有信号肽。胞内区包括胞内共刺激域和胞内信号域。CAR还可以具有本领域已知的任何可与CAR序列相连的结构。在示例性实施方案中，CAR的胞外区是MSLN抗体或其抗原结合片段，优选MSLN纳米抗体。
CAR上任选的信号肽可以根据需要选择。例如CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8信号肽可以是本领域常用于CAR的各种人CD8信号肽序列。在某些实施方案中，所述人CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸所示。
CAR的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区或IgG4 FcCH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8铰链区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8铰链区序列。在某些实施方案中，所述人CD8铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第142-196位氨基酸所示。
CAR的跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的人CD28跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD28跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第197-224位氨基酸所示。
可以根据需要选择适合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域。适用于本发明的人CD28共刺激域可以是本领域常用于CAR的各种人CD28共刺激域序列。在某些实施方案中，所述CD28共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第225-265位氨基酸序列所示。
类似地，CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。适用于本发明的CD3ζ胞内信号域可以是本领域已知的各种用于CAR的CD3ζ胞内信号域。在某些实施方案中，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第266-377位氨基酸序列所示。
形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，接头序列为(GGGGS)n连接，其中n为1～5的整数。
在示例性实施方案中，CAR从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域。在具体实施例中，具有上述结构的示例性CAR如SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第23-384位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，本发明方法包括：(1)将源自血浆或血清的样品、CAR-T细胞、生物素或荧光物标记的配体混合孵育，所述血浆或血清是接触过所述CAR-T细胞的对象的血浆或血清，所述CAR的胞外部分具有针对所述配体的抗体，(2)鉴定标记的CAR-T细胞的水平，与CAR-T总细胞水平比较可以定性或定量检测样品中针对所述CAR的中和抗体。优选地，(2)包括：鉴定标记的CAR-T细胞的水平，并与施用CAR-T细胞前所述对象的源自血浆或血清的样品进行所述孵育之后的标记的细胞水平比较，从而检测样品中针对所述CAR的中和抗体。
在具体实施方案中，本发明方法包括：将源自血浆的样品、在细胞表面具有抗MSLN纳米抗体的CAR-T细胞、生物素或荧光物偶联的MSLN混合孵育，血浆中的中和抗体与所述MSLN竞争结合CAR-T细胞上的CAR，通过流式细胞术检测MSLN和CAR-T细胞的结合复合物，与CAR-T总细胞水平相比可以定性或定量检测血浆中针对所述CAR的中和抗体。更具体的，所述方法包括：(1)在缓冲液(例如PBS)中重悬CAR-T细胞，细胞密度2～3*107/mL，(2)血浆样品在4℃，3000g离心10分钟后取上清，(3)CAR-T细胞悬液和血浆上清1:1混合孵育30分钟后，(4)将混合物与PE荧光标记的间皮素混合孵育20分钟，(5)分离细胞后与PE荧光标记的间皮素混合孵育20分钟，(6)流式细胞术鉴定荧光标记的细胞水平，并与未施用CAR-T细胞的患者血清的荧光标记的细胞水平比较，从而检测血浆中针对所述CAR的中和抗体。
在一个或多个实施方案中，所述检测样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体包括：评估中和抗体的相对含量，或评估细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞的体内中和抗体效应的方法。本文中，由“中和抗体”引起的治疗分子功效受阻称为“中和抗体效应”。
所述评估包括：利用本发明的检测中和抗体的方法，检测经治疗(例如施用过细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞)的对象的样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体。如上所述，通过治疗后结合复合物(标记的细胞)的水平与治疗前复合物水平进行比较，来确定样品中是否含有中和抗体及其量。
对于可能接触过配体的对象，例如肿瘤患者(该患者可能具有能与所述肿瘤相关抗原中和的抗体)，所述评估还可包括：在治疗之前(例如向对象施用细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞之前)检测来自对象的样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体并与治疗后(例如所述施用后)的结果进行对比。通过比较治疗前后对象体内的中和抗体的变化来评估。
中和抗体效应可通过中和效率来指示。检测不同天数的配体和细胞的结合复合物水平(例如CAR阳性率)，然后通过下式来求出中和抗体中和效率，中和抗体中和效率表示中和抗体表达的高低：
中和抗体中和效率＝(Day0阳性率-DayN阳性率)/Day0阳性率，
其中，Day0阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之前检测的结合复合物水平(例如采用未回输CAR-T细胞的患者血清封闭下的CAR阳性率)DayN阳性率表示接触含有细胞表面受体的细胞之后检测的结合复合物水平(例如采用回输CAR-T N天的血清封闭下的CAR阳性率)，N可以取任意天数。
此外，本发明还提供一种用于检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的试剂盒，包含：(1)细胞表面受体(例如CAR)或其编码序列、或含有所述细胞表面受体的细胞(例如CAR-T)，和(2)特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体(例如肿瘤表面抗原)或其编码序列。所述样品、细胞表面受体、细胞、配体等特征如本文他处所述。所述试剂盒还包含样品处理试剂，例如用于稀释血浆的稀释剂。
荧光标记的MSLN可以为：间接标记得获得，例如通过生物素(biotin-):链霉亲和素(streptavidin)实现流式荧光素与MSLN抗原结合；也可以通过直接标记获得，即流式荧光素标记直接与MSLN抗原偶联。
所述试剂盒还可包含选自以下的一种或多种：用于将细胞表面受体(例如CAR)的编码序列导入细胞(例如免疫细胞)的试剂、用于表达所述配体(例如肿瘤表面抗原)的细胞(例如哺乳动物细胞)、用于纯化配体的试剂、可检测标记(例如生物素或PE)和用于在配体上偶联可检测标记的试剂(例如偶联缓冲液)。这些试剂可根据细胞表面受体和配体的性质进行选择，这在本领域技术人员的知识范围内。
所述试剂盒还可包含用于检测细胞表面受体与所述配体的结合的试剂。这样的试剂例如是检测可检测标记的试剂，包括但不限于例如链霉亲和素偶联的荧光物或抗体、抗生物素抗体、荧光标记的二抗。可选的试剂取决于所选用的检测方法，这样的方法包括但不限于流式检测，还可以为ELISA和MSD，其所需试剂在本领域技术人员内的知识范围内。例如，可使用流式细胞术检测所述结合复合物，所需试剂例如缓冲液、流式抗体、PBS、二抗等。
本发明还提供含有细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞的体内中和抗体效应，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体。
本发明还提供本文所述方法、细胞、配体或试剂盒的用途，用于基因改造免疫细胞回输前和回输后人体产生中和抗体的检测、细胞治疗药物的早期筛选、药物安全性评价、基因修饰抗原靶向细胞治疗药物人体中存在的其他竞争性抗体的检测和预筛、以及免疫原性存在的检测。
本发明具体实施方案中，通过荧光标记技术标记各种肿瘤相关抗原或多肽，特等的蛋白，及糖蛋白等，作为中和抗体的检测关键试剂，制备便捷，质量稳定。无需常规ADA检测需要制备阳性对照抗体，开发周期长，批间差异大，检测不稳定。通过基因修饰技术(病毒载体，非病毒载体等各种基因修饰技术)编辑表达各种抗原、蛋白、多肽的特异性嵌合抗体，嵌合抗原受体的细胞。制备周期短，方便快捷，检测结果的更加直接，具有明确的指示意义。采用流式细胞检测技术，检测细胞与标记的关键试剂结合的信号，包括应该阳性比例和应该强度值，方法直接，操作方便，检测通量大，可以准确直接定量。可以实现样本的快速检测。
实施例
本实施例的检测基本原理：患者回输CAR-T细胞治疗产品后，由于CAR分子的免疫原性，人体产生针对CAR分子的抗体，尤其是中和抗体会直接阻断CAR分子对靶蛋白的识别，降低CAR-T细胞的肿瘤杀伤功能。本实验假设产生抗体为中和抗体，CAR分子和靶蛋白的结合位点被中和抗体占据，CAR分子不再结合靶蛋白分子的设想，利用标记的靶蛋白与中和抗体结合CAR分子的竞争关系，检测血清样本中是否存在中和抗体。
一、实验步骤
1.冻存基因修饰免疫细胞注射液的复苏
预先在细胞房准备37℃的水浴锅和足量的完全细胞培养基，完全培养基在37℃水浴锅中预热，超净台紫外灭菌备用。
将从液氮中取出的细胞注射液放入37℃的水浴锅中，迅速晃动，在1分钟时间内完成冻存细胞注射液的融化过程。
在超净台中将细胞悬液取出，依据冻存细胞液的浓度分配到3至5个50毫升的离心管中(离心管中预先加入适量加热到37℃的完全培养基)。细胞离心后去上清，用完全培养基重悬，再重复洗涤一次。
洗涤后取上清用完全培养基重悬，计数。如果当天继续检测实验，按照每个流式检测2-3个百万的细胞量取细胞，按照总需要细胞的120％取够细胞总量后，离心弃上清。用PBS重悬，室温静置30分钟，离心弃上清。重复一次用PBS重悬，室温静置30分钟，离心弃上清。最后用PBS重悬，细胞密度在2-3千万细胞每毫升。如果当天不继续相关实验操作，细胞按照2百万每毫升的浓度在完全培养基重悬后放于培养箱培养即可。第二天收集细胞，离心弃上清后，用PBS重悬细胞密度在2-3千万每毫升的浓度用于后续实验。
2.病人血浆(血清)样本预处理
冻存病人血浆样本在4℃融化，4℃选取合适离心机，3000g，离心10分钟，取上清于新的标记好的管子中。
对于Day0(病人未回输CAR-T细胞注射液，回输第二次及以后次数的回输当天样本不作为此处的Day0)样本，做3个检测，分别用1倍，3倍和9倍稀释作为检测对象。
对于Day28及其他样本，做5个检测，在不清楚具体稀释倍数时，采用1倍，3倍，9倍，27倍和81倍作为稀释倍数；如果在特定检测中，已经通过其他技术检测知晓ADA或Nab的浓度时，可以依据前期经验进行稀释倍数的设计。
血浆样本每个检测的用量在200微升，可以按照不少于250微升的用量进行配置，建议采用梯度稀释法进行系列的配置，提前制定好稀释的策略和操作步骤。减少出错的概率，同时提高数据的可信性。
3.实验设计
实验的主要内容有各个对照及检测管。各个对照包括3个：只标记CD3的空白或FMO对照，用于确定CAR的阴性值；直接标记CD3和CAR的检测对照，与复苏前的细胞数据对比，对于MSLN-CAR细胞应该分群明显；孵育PBS的检测对照，用于实验操作和体系检测。检测管对应血浆样本预处理的设计，一一对应。
4.检测操作
血清和细胞孵育
使用流式管标记好每一个检测名称，向每一个流式管中加入重悬好的200微升CAR-T细胞悬液；向流式管中加入待检测的血浆样本200微升，涡旋混匀，室温孵育30分钟。
细胞染色标记
使用流式管标记好每一个对照及检测的名称，向流式管中加入对应的流式抗体或试剂(Anti-human CD3和PE荧光标记的间皮素)。待细胞孵育30分钟后，再次混匀，按照顺序向加入抗体的流式管中加入对应的孵育后的细胞。迅速操作，尽可能保证孵育时间的一致性。加入细胞后涡旋混匀，4℃染色20分钟。
用3毫升的PBS洗涤细胞两遍，弃上清。涡旋后加入PE荧光标记的间皮素，4℃染色20分钟。用3毫升的PBS洗涤细胞两遍，弃上清。300微升PBS重悬，上机检测。
需要说明的是，在本步骤中，PE荧光标记的间皮素可以委托金瑞斯公司进行。
此外，也可以通过以下实验操作对待标记的蛋白进行处理：
待标记蛋白前处理：使用30KD超滤柱对待标记MSLN蛋白buffer进行置换，以除去蛋白样品中含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何自由氨基酸的添加物；
进行生物素标记：Biotin溶解：称取1份(27.27mg)Biotin用3mL的新鲜DMSO溶解混匀带完全溶解。计算抗体标记需要生物素用量(与抗体按20:1摩尔比用量计算所需体积)。
采用生物素标记MSLN蛋白，参见上述的“待标记蛋白前处理”步骤，进行Buffer置换处理。
PE荧光标记：采用链霉亲和素标记的PE荧光与生物素标记的MSLN蛋白孵育，获得PE荧光标记的MSLN蛋白。
将标记后的蛋白进行超滤并使用NANO Drop ONE检测浓度，分装后-80℃保存。
上机检测
调整好流式细胞仪，确保仪器处于正确且合理的设置，CAR的对照检测管形态良好，能够很好的区分阴阳性。依次检测各个样本管，按照对照管中CAR的阳性率，在保证CAR阳性细胞数不少于1000个的情况下计算需要收集的CD3阳性细胞数，按照此标准收集各个检测管。
5.数据分析
按照各个检测管收集后的数据，利用流式软件分析相关数据。根据CAR-T细胞的阳性比例变化和CAR-T细胞的CAR分子检测到的信号强度两个维度，同时考虑血浆样本的稀释倍数来评价血浆样本中ADA或Nab的相对含量。相对含量的值可以参考已有序列的ADA含量与流式检测数据的对应关系。
二、实验结果
1.针对MSLN抗原构建的CAR的中和抗体的快速检测。
采集符合临床入组标准的晚期实体瘤患者(患者编号S0105)的外周血单个核细胞，通过分选纯化出T淋巴细胞，通过基因转导和整合，在T细胞表面表达嵌合抗体CAR(CAR的胞外区是针对MSLN特异性结合的羊驼来源的纳米抗体，CAR的序列如SEQ ID NO:1所示。)，采用荧光标记的间皮素充分与CAR结合，通过流式检测CAR的表达，结果显示如图3所示，患者S0105的MSLN_CAR-T细胞制剂(批号：BZDS202012001)中有32.7％的T细胞表面表达1444-CAR。
CAR：CD8信号肽-(anti-MSLN)-CD8 hinge-CD28 TM-CD28IC-CD3z
序列如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQVVESGGGFVQAGGSLRLSCAASTPIISIAYMGWYRQISEKERQLVATINSGGKTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNMLKPEDTGMYYCAASNKDYNDYDPDWGQGTQVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:1)
入组患者S0105回输BZDS202012001批次的MSLN_CAR-T细胞产品，回输前D0采集外周血样本，分离血清，回输后D28天，采集外周血样，分离血清，采用前述方法检测患者回输MSLN_CAR-T前以及回输后D28天外周血中产生针对MSLN-CAR的中和抗体。通过不同的稀释度进行检测确认。检测结果如表1和图4所示：患者S0105回输MSLN_CAR-T前外周血清中未见中和抗体，对MSLN_CAR-T与荧光标记的间皮素结合无抑制作用；回输后的D28外周血清中和抗体阳性，且中和抗体作用在1:2和1:6稀释时，中和抗体的中和效率为23.3％和9.26％。
表1：S0105患者回输MSLN_CAR-T外周血中和抗体产生情况及中和效率
| 项目 | 阳性率 | 1:2 | 1:6 | 1:18 | 1:54 |
| 终产品制剂阳性率 | 32.7％ | 32.7％ | 32.7％ | 32.7％ | 32.7％ |
| Day 0阳性率 | / | 34.3％ | 36.7％ | / | / |
| Day 28阳性率 | / | 26.3％ | 33.3％ | 37.3％ | 38.0％ |
| 中和抗体中和效率 | / | 23.3％ | 9.26％ | / | / |
患者S0105在完成首次回输后的D35天进行BZDS202012001批次的MSLN_CAR-T细胞产品的二次回输，回输前D35采集外周血样本，分离血清，二次回输后第28天，即D63采集外周血样，分离血清，采用前述方法检测患者二次回输MSLN_CAR-T前，及回输后第28天外周血中产生针对MSLN-CAR的中和抗体。通过不同的稀释度进行检测确认。
结果如表2和图5所示。患者S0105第二次回输前的血清(D35)与第一次回输后的第28天(D28)间隔一周，期间无回输，两个时间点的血清中和抗体的水平基本一致，相同稀释度下(1:2)，对MSLN_CAR-T与荧光标记的间皮素结合抑制作用一致(23.3％和23.9％)。S0105接受二次MSLN_CAR-T细胞产品回输后，产生比首次回输更高的中和抗体，外周血清在相同的稀释比例(1:2)下，中和抗体的中和效率为56.3％。提示伴随MSLN_CAR-T细胞回输次数的增加，患者体内产生的中和抗体水平在上升。
表2：S0105患者二次回输MSLN_CAR-T外周血中和抗体产生情况及中和效率
2.针对MSLN抗原构建的CAR(2339序列)中和抗体的快速检测。
采集符合临床入组标准的晚期实体瘤患者(患者编号分别为S0106和S0304)的外周血单个核细胞，通过分选纯化出T淋巴细胞，通过基因转导和整合，在T细胞表面表达嵌合抗体2339-CAR(采用的CAR的抗原结合域是编号为2339，针对MSLN特异性结合的羊驼来源的新的抗体)。采用荧光标记的间皮素，流式检测。结果如图6所示，S0106患者的MSLN_CAR-T细胞制剂(批号：BZDS202101001)有96.8％的T细胞表面表达2339-CAR。
2339CAR：
CD8信号肽-2339(anti-MSLN)-CD8hinge-CD28TM-CD28IC-CD3z
序列如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:2)
患者S0106回输BZDS202101001批次的MSLN_CAR-T细胞产品，回输前D0采集外周血样本，分离血清，回输后D21天，采集外周血样，分离血清，采用前述方法检测患者回输MSLN_CAR-T前，回输后D21天外周血中产生针对MSLN-CAR的中和抗体。通过不同的稀释度进行检测确认。
检测结果如表3和图7所示。患者S0106回输MSLN_CAR-T前外周血清中未见中和抗体，对MSLN_CAR-T与荧光标记的间皮素结合无抑制作用；回输后的D21外周血清中和抗体阳性，且中和抗体作用在1:2和1:6稀释时，中和抗体的中和效率为44.7％和21.7％。
表3：S0106患者回输MSLN_CAR-T外周血中和抗体产生情况及中和效率
| 项目 | 阳性率 | 1:2 | 1:6 | 1:18 | 1:54 |
| 终产品制剂阳性率 | 96.8％ | 96.8％ | 96.8％ | 96.8％ | 96.8％ |
| Day 0阳性率 | / | 97.0％ | 97.1％ | / | / |
| Day 21阳性率 | / | 53.6％ | 76.0％ | 88.4％ | 93.2％ |
| 中和抗体中和效率 | / | 44.7％ | 21.7％ | 8.9％ | / |
患者S0304回输相同序列(2339)MSLN_CAR-T细胞产品，回输前D0采集外周血样本，分离血清，回输后D21天，采集外周血样，分离血清，采用本发明建立的方法检测患者回输MSLN_CAR-T前，回输后D21天外周血中产生针对MSLN-CAR的中和抗体。通过不同的稀释度进行检测确认。
检测结果如表4和图8所示。患者S0304回输MSLN_CAR-T前外周血清中未见中和抗体，对MSLN_CAR-T与荧光标记的间皮素结合无抑制作用；回输后的D21外周血清中和抗体阴性，且中和抗体作用在1:2和1:6稀释时，中和抗体的中和效率为2.9％和1.5％。
表4：S0304患者回输MSLN_CAR-T外周血中和抗体产生情况及中和效率
| 项目 | 阳性率 | 1:2 | 1:6 | 1:18 | 1:54 |
| 终产品制剂阳性率 | 96.8％ | / | / | / | / |
| Day 0阳性率 | / | 96.0％ | 96.9％ | / | / |
| Day 21阳性率 | / | 93.2％ | 95.4％ | 96.8％ | 96.9％ |
| 中和抗体中和效率 | / | 2.9％ | 1.5％ | / | / |
SEQUENCE LISTING
<110> 上海细胞治疗集团药物技术有限公司
上海细胞治疗集团有限公司
<120> 中和抗体检测方法
<130> 214027
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Phe Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr
35 40 45
Pro Ile Ile Ser Ile Ala Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ile Ser Glu
50 55 60
Lys Glu Arg Gln Leu Val Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Lys Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Asn Lys Asp Tyr Asn Asp Tyr Asp
115 120 125
Pro Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro
130 135 140
Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
165 170 175
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
180 185 190
Phe Ala Cys Asp Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
195 200 205
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
210 215 220
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
225 230 235 240
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
245 250 255
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
260 265 270
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
275 280 285
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
290 295 300
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
305 310 315 320
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
325 330 335
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
340 345 350
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
355 360 365
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 2
<211> 384
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Val Gln Leu Val Ala Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Leu Arg Glu Leu Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln
50 55 60
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly
65 70 75 80
Gly Ile Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
100 105 110
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr
115 120 125
Asp Arg Leu Ile Arg Pro Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr
145 150 155 160
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
165 170 175
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
180 185 190
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Phe Trp Val Leu
195 200 205
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
210 215 220
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
225 230 235 240
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
245 250 255
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
260 265 270
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
275 280 285
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
290 295 300
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
305 310 315 320
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
325 330 335
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
340 345 350
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
355 360 365
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
Claims (10)
1.一种检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的非诊断或治疗的方法，包括步骤：
(1)将待测样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体；
(2)检测细胞表面受体与所述配体的结合；
优选地，
所述样品来自对象，所述对象接触过所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞，和/或
所述细胞表面受体包含胞外部分和膜锚定区，所述胞外部分是胞外配体结合区，和/或
所述细胞是体细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(2)包括：检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物，与含所述细胞表面受体的细胞总水平相比，从而检测样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体，
优选地，所述方法还包括：在所述对象接触所述细胞表面受体或含所述细胞表面受体的细胞之前，将来自对象的样品、含有所述细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体混合孵育，并检测配体和含所述细胞表面受体的细胞的结合复合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
步骤(2)包括通过下式测定中和抗体中和效率：
中和抗体中和效率＝(Day0阳性率-DayN阳性率)/Day0阳性率，其中，Day0阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之前检测的结合复合物水平，DayN阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之后检测的结合复合物水平，N为天数。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，胞外配体结合区为抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述细胞表面受体是CAR，所述配体是由CAR的胞外抗原结合区特异性结合的抗原或该抗原的能与所述CAR结合的片段；
更优选地，
所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原，和/或
所述样品是源自血液的样品，例如血浆、血清、全血，和/或
所述配体与可检测标记物偶联。
5.含有细胞表面受体的细胞和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞的体内中和抗体效应，所述中和抗体与所述配体竞争结合所述细胞表面受体；
优选地，
所述评估包括：检测施用过细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞的对象的样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体；和/或
所述评估还包括：在向对象施用细胞表面受体或含有细胞表面受体的细胞之前检测来自对象的样品中针对所述细胞表面受体的中和抗体并与施用后的结果进行对比；和/或
所述检测包括步骤：将待测样品、所述细胞和所述配体混合，并检测细胞表面受体与所述配体的结合。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述评估还包括通过下式测定中和抗体中和效率：
中和抗体中和效率＝(Day0阳性率-DayN阳性率)/Day0阳性率，其中，Day0阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之前检测的结合复合物水平，DayN阳性率表示对象接触含有细胞表面受体的细胞之后检测的结合复合物水平，N为天数。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，
所述细胞表面受体包含胞外部分和膜锚定区，所述胞外部分是胞外配体结合区；和/或
所述细胞是体细胞。
8.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，胞外配体结合区为抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述细胞表面受体是CAR，所述配体是由CAR的胞外抗原结合区特异性结合的抗原或该抗原的能与所述CAR结合的片段；
更优选地，
所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原，和/或
所述样品是源自血液的样品，例如血浆、血清、全血，和/或
所述配体与可检测标记物偶联。
9.一种用于检测样品中的针对细胞表面受体的中和抗体的试剂盒，包含：含有所述细胞表面受体的细胞，和特异性识别所述细胞表面受体的胞外部分的配体；
优选地，
所述细胞表面受体包含胞外部分和膜锚定区，所述胞外部分是胞外配体结合区，和/或
所述细胞是体细胞。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，胞外配体结合区为抗体或其抗原结合片段，
优选地，所述细胞表面受体是CAR，所述配体是由CAR的胞外抗原结合区特异性结合的抗原或该抗原的能与所述CAR结合的片段；
更优选地，
所述抗原是肿瘤相关抗原，例如肿瘤表面抗原；和/或
所述样品是源自血液的样品，例如血浆、血清或全血；和/或
所述配体与可检测标记物偶联；和/或
所述试剂盒还包含样品处理试剂；和/或
所述试剂盒还包含用于检测细胞表面受体与所述配体的结合的试剂。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210346390.2A CN116930475A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 中和抗体检测方法 |
| PCT/CN2023/085530 WO2023186106A1 (zh) | 2022-03-31 | 2023-03-31 | 中和抗体检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210346390.2A CN116930475A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 中和抗体检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116930475A true CN116930475A (zh) | 2023-10-24 |
Family
ID=88199491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210346390.2A Pending CN116930475A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 中和抗体检测方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116930475A (zh) |
| WO (1) | WO2023186106A1 (zh) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9416671D0 (en) * | 1994-08-17 | 1994-10-12 | Biocine Spa | Assay |
| CN1444044A (zh) * | 2002-06-18 | 2003-09-24 | 帕弗瑞生物技术(北京)有限公司 | 以酶联免疫测定为基础的hla补体依赖性细胞毒性抗体检测方法和试剂盒 |
| DK2262905T3 (en) * | 2008-03-04 | 2015-05-26 | Centre Nat Rech Scient | Cell, method and kit for carrying out a test for neutralizing antibodies |
| EP3063543B1 (en) * | 2013-10-31 | 2020-03-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Competitive ligand binding assay for detecting neutralizing antibodies |
| AU2016349528A1 (en) * | 2015-11-06 | 2018-05-17 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Cell-based assays for detection of antibodies or other factors that neutralize uptake of lysosomal enzymes |
| CN111100199B (zh) * | 2018-12-29 | 2021-02-12 | 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 | 一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用 |
| CN112394179B (zh) * | 2021-01-18 | 2021-04-09 | 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 | Fmc63 car-t细胞免疫原性elisa检测试剂盒 |
-
2022
- 2022-03-31 CN CN202210346390.2A patent/CN116930475A/zh active Pending
-
2023
- 2023-03-31 WO PCT/CN2023/085530 patent/WO2023186106A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023186106A1 (zh) | 2023-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103224562B (zh) | 促甲状腺素受体的表位区域和针对该区域的抗体 | |
| CN114127091B (zh) | 肿瘤新抗原多肽及其用途 | |
| AU617980B2 (en) | Cell-free t cell antigen receptor and its clinical utilities | |
| CN105392800A (zh) | 抗cxcl1、cxcl7和cxcl8抗体及其应用 | |
| MX2014013590A (es) | Anticuerpos monoclonales multiespecificos. | |
| JPS62272990A (ja) | リガンド、そのアンタゴニストまたはアゴニストの効率的な測定のためのハイブリツドリセプタ− | |
| CN108884155A (zh) | 转化生长因子-β应答多肽及其使用方法 | |
| CN107108733B (zh) | 抗活性型gip抗体 | |
| JP6896057B2 (ja) | 抗原結合分子及びその使用方法 | |
| JP2010536043A (ja) | 尿ゲルゾリンの検出および定量化 | |
| US6642007B1 (en) | Assays for measurement of type II collagen fragments in urine | |
| Tite et al. | Inverse Ir gene control of the antibody and T cell proliferative responses to human basement membrane collagen. | |
| AU652024B2 (en) | IgE-receptor-antibodies | |
| JPH06505011A (ja) | ｅｒｂＢ−２受容体タンパク質に結合し且つ細胞性応答を誘導するリガンド成長因子 | |
| CN110850067B (zh) | 嵌合抗原受体亲和力检测方法 | |
| CN116930475A (zh) | 中和抗体检测方法 | |
| AU2016213702B2 (en) | Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof | |
| US20100028917A1 (en) | A neuroglobin enzyme-linked immunosorbent assay kit and the use of it | |
| US20210277149A1 (en) | Anti-idiotype antibodies and methods of using the same | |
| CN115843256A (zh) | 抗erbb3抗体或其抗原结合片段及其医药用途 | |
| JPH01501518A (ja) | Ｎ‐ｍｙｃタンパク質のためのアッセイ及び抗体 | |
| JP3888695B2 (ja) | ヒトｌｅｃｔ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット | |
| EP1765867B1 (en) | Monoclonal antibodies to hiv-1 vpr and methods of using same | |
| JP3568198B2 (ja) | 異常プリオンタンパク質の検出方法 | |
| CN117285637B (zh) | 一种抗独特型抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: Room 201, Building 8, No. 1585 Yuanguo Road, Anting Town, Jiading District, Shanghai, 201805 Applicant after: Shanghai Cell Therapy Group Pharmaceutical Technology Co.,Ltd. Applicant after: Shanghai Cell Therapy Group Co.,Ltd. Address before: Room 201, Building 8, No. 1585 Yuanguo Road, Anting Town, Jiading District, Shanghai, 201805 Applicant before: Shanghai Cell Therapy Group Pharmaceutical Technology Co.,Ltd. Country or region before: China Applicant before: SHANGHAI CELL THERAPY GROUP Co.,Ltd. |