JP3568198B2

JP3568198B2 - 異常プリオンタンパク質の検出方法

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Publication number: JP3568198B2
Application number: JP2001316541A
Authority: JP
Inventors: 克洋三浦; 裕一村山
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2001-10-15
Publication date: 2004-09-22
Anticipated expiration: 2021-10-15
Also published as: JP2003121448A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の検出方法及びその検出手段に関する。特に本発明は、異常プリオンタンパク質の検出方法及びその検出手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
牛海綿状脳症（狂牛病）やクロイツフェルト・ヤコブ症（ＣＪＤ）などの致死性の神経疾患（プリオン病）は、異常プリオンタンパク質（以下、異常プリオンという。）に起因すると考えられている。プリオンとは、病気を伝播させるタンパク様感染性粒子であり、正常プリオンタンパク質（ＰｒＰ^Ｃ；以下、正常プリオンという。）と異常プリオン（ＰｒＰ^ＳＣ）が存在する。正常プリオンは通常、健康な個体の細胞質内に存在するが、これが何らかの原因で異常プリオンとなり、この異常プリオンが脳に沈着することによりプリオン病が生じると考えられている。プリオン病には、ヒトのクールー、ＣＪＤ、ゲルストマン＝ストロイスラー＝シャインカー症候群（ＧＳＳ）、ならびにヒツジのスクレイピー、それがミンク、ウシ及びネコに伝播した伝播性ミンク脳症、牛海綿状脳症、猫海綿状脳症などが含まれる。感染性異常プリオンは、臓器移植等の外科手術、輸血や血液製剤の投与、又は汚染食物の経口摂取などにより感染する。プリオン病に感染した宿主では、脳組織を中心に異常プリオンがアミロイドとして沈着し、最終的に死に至る。プリオン病の有効な予防法及び治療法は現状では存在せず、唯一の対策としては、医薬品や食品等への感染性プリオンの混入を防止することである。
【０００３】
異常プリオンの検出には、現在、ウエスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法、イムノＰＣＲ法、キャピラリー電気泳動法等が用いられているが、検出感度はｎｇ〜ｐｇオーダーであるため十分とは言えず、迅速性や再現性にも問題がある。このような抗原抗体反応を利用する方法においては、従来の抗体では極微量のプリオンを定量的に検出することはできない。
従って、感染動物の早期診断や医薬品・食品等の安全性確保の観点から、サンプル中の異常プリオンを高感度かつ定量的に検出する方法が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、サンプル中のタンパク質、特に異常プリオンタンパク質を高感度かつ定量的に検出する方法及び検出手段を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、従来のプリオン検出方法に用いられていた抗体の欠点を明らかにし、その欠点を改善するため鋭意研究を重ねた結果、プリオンに対する一価抗体との反応を利用することによってサンプル中の異常プリオンを高感度かつ定量的に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
また本発明者らは、上記の一価抗体との反応を利用する検出方法の原理を種々のタンパク質検出方法に応用することによって、タンパク質を高感度かつ定量的に検出できることを見出した。
すなわち、本発明は、検出の目的タンパク質と、該目的タンパク質に対する一価抗体とを反応させることを特徴とする、サンプル中の該目的タンパク質の検出方法である。ここで、目的タンパク質としては、ホルモン、サイトカイン、ウイルス抗原等が挙げられる。また、一価抗体はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦｖフラグメントでありうる。
【０００７】
さらに上記方法において、目的タンパク質はプリオンタンパク質でありうる。また、目的タンパク質が異常プリオンタンパク質である場合には、一価抗体と反応させる前にサンプルをプロテイナーゼＫで処理する必要がある。
【０００８】
また上記プリオンタンパク質は、哺乳動物に由来するものでありうる。例えば、ヒツジ、ウシ、ヒト、ヤギ、マウス、ハムスター等に由来するものが挙げられる。サンプルとしては、体液、医薬品又は食品などを対象とすることができる。検出は、抗原抗体反応を検出しうる任意の方法により行いうるが、フローサイトメトリーで行うことが好ましい。
【０００９】
また本発明は、プリオンタンパク質に対する一価抗体である。ここで、プリオンタンパク質及び一価抗体は上記と同様である。
さらに本発明は、上記一価抗体を含むことを特徴とする試薬キットである。該試薬キットはさらにプロテイナーゼＫ及び／又はプリオンペプチド固相化ビーズを含んでもよい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明者らは、従来のプリオン検出方法の欠点が、抗原結合部位が２カ所存在する抗体を用いることであり、そのため、プリオン検出の際にプリオン２分子又は１分子のみと反応した２種類の抗体が混在して生成され、これにより極微量のプリオンを正確に検出することができないと考え、この欠点を改善するため研究を重ねた結果、本発明は完成された。
【００１２】
従って、本発明のプリオン検出方法は、異常プリオンと、プリオンに対する一価抗体とを反応させることを特徴とするものである。一価抗体であるＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦｖフラグメント等は抗原結合部位が１カ所であるため、このような抗プリオン一価抗体との反応を利用すると、従来の方法よりも数十倍〜数万倍の感度で定量的にプリオンを検出することができる。また、本発明の方法は、プリオンに限らず、その他あらゆるタンパク質の検出・定量に応用することができる。以下、本発明の概要を説明する。
【００１３】
１．一価抗体の作製
本発明の検出方法では、まず一価抗体を調製する。「一価抗体」とは、１分子当たり１個の抗原結合部位しかもたない抗体であり、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント等がある。
【００１４】
（ｉ）抗原の調製
本発明の一価抗体を作製するために、まず抗原を調製する。本発明では、検出及び定量が望まれるタンパク質（以下、目的タンパク質という。）を抗原として使用しうる。目的タンパク質としては、限定するものではないが、ホルモン、サイトカイン、ウイルス抗原等を例示することができる。具体的には、インシュリン、成長ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、ＨＩＶｅｎｖタンパク質等が挙げられる。特に、高感度の検出が望まれている異常プリオンが好ましい。
【００１５】
上述した目的タンパク質は、当技術分野で公知の手法を用いて供与源から単離・精製して調製することができるし、あるいは、当該タンパク質のアミノ酸配列が公知であれば、遺伝子工学的手法により微生物で産生させて精製して調製してもよい。
【００１６】
本発明により検出することが好ましいプリオンは、正常プリオンと異常プリオンとの間でアミノ酸配列に違いはないため、哺乳動物に常在する正常プリオンのアミノ酸配列を利用して抗原を調製することができる。正常プリオンをコードするプリオン遺伝子は、ヒト、ヒツジ、ヤギ、ウシ、マウス、ハムスターなど多くの動物種で同定されており、そのアミノ酸配列は９０％以上の相同性を示し、高度に保存されていることが知られている。
【００１７】
本発明で使用しうるプリオンのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓより、例えばヒツジプリオンのアミノ酸配列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＵ６７９２２）が入手可能であるが、プリオンのアミノ酸配列であれば特に限定されない。
なお、本発明においては、精製されたタンパク質全体のみならず、その部分断片も使用することができる。「部分断片」という用語は、目的タンパク質のアミノ酸配列を含む限り、特に長さに関係なく使用する。
【００１８】
部分断片は、ペプチド断片として通常のペプチド合成等により調製することができる。ペプチドの化学合成は常法手段を採用することができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれでもよい。なお、本発明においては、市販の自動ペプチド合成装置（例えば島津製作所社の自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８）を使用して合成することもできる。
【００１９】
本発明で使用するのに適したペプチド断片は、配列番号１に示すアミノ酸配列又はその部分断片を有するものが挙げられるが、これに限定されるものではない。ペプチド部位は、例えば、タンパク質の表層にあること、αへリックス構造をとらないこと、リピート配列等の単純な配列を含まないこと、などを考慮して決定しうる。
また、免疫に用いるペプチド配列は、哺乳動物間で非常に類似している可能性があるため、ＫＬＨ、ＢＳＡ等の当技術分野で公知のキャリアタンパク質と該ペプチド配列とを結合することにより免疫原性を高めて免疫を行うことが好ましい。
【００２０】
（ｉｉ）抗体の作製
本発明において「抗体」とは、抗原である目的タンパク質又はその部分断片に結合し得る抗体分子を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明において、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は例えば以下の手法により製造することができる。
【００２１】
（ｉｉａ）モノクローナル抗体
前記のようにして作製したタンパク質又はその断片を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。必要に応じてフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等のアジュバントを用いることもできる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜１０回の免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられる。
【００２２】
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００２３】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤（例えばポリエチレングリコール等）の存在のもとで融合反応を行う。また、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて細胞融合させることもできる。
【００２４】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、細胞懸濁液をウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまく。各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００２５】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的タンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、例えば酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等を採用することができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
【００２６】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００２７】
（ｉｉｂ）ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｕｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００２８】
（ｉｉｉ）一価抗体の作製
本発明の一価抗体は、上述のようにして得られた抗体をプロテアーゼで処理することにより得ることができる。本発明において使用しうる一価抗体としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦｖフラグメントが挙げられる。
【００２９】
Ｆａｂフラグメントは、上記抗体をパパインで処理することにより得ることができる。またＦａｂ’フラグメントは、上記抗体をペプシン消化して生じるＦ（ａｂ’）_２フラグメントを２−メルカプトエタノールなどの試薬を用いて還元し、続いてモノヨード酢酸を用いてアルキル化することにより得ることができる。あるいは、これらの一価抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることにより一価抗体を得てもよい。同様に、Ｆｖフラグメントは、抗体可変領域であるＶ_ＨとＶ_Ｌのみをコードする遺伝子をリンカーペプチドをコードする塩基配列で連結した融合遺伝子を作製し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることにより得ることができる。
【００３０】
２．タンパク質の検出
本発明では、上記のようにして作製された一価抗体と目的タンパク質とを反応させ、得られる反応産物から該目的タンパク質を定量的に検出する。
本発明で対象とするサンプルとしては、検出が望まれる目的タンパク質を含有する可能性があるものなら特に限定されない。異常プリオンの検出では、異常プリオンが混入している可能性のある体液、医薬品、食品などが検出の対象となる。例えば、プリオン病感染が疑われるか又はプリオン病への非感染を証明しようとする家畜の組織、及び血液、血清、血漿、乳汁等の体液；肉骨粉等の家畜飼料に用いられる材料；家畜等で産生された物質を使用した医薬品及び食品などを例示することができる。
【００３１】
異常プリオンの検出では、上述したように、正常プリオンと異常プリオンとの間のアミノ酸配列に違いがないため、上記一価抗体は正常及び異常プリオンの両者を認識することに注意する。本発明の検出方法では、異常プリオンの検出を目的とするため、プロテイナーゼＫに対する耐性を有する異常プリオンの性質を利用する。従って、プロテイナーゼＫを用いてサンプルを処理する。その結果、正常プリオンは分解され、異常プリオンが存在する場合には、異常プリオンのみがサンプル中に存在することになる。プロテイナーゼＫによる処理は、例えば、プロテイナーゼＫを終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるようにサンプルに添加し、３７℃にて６０分間インキュベートする。
【００３２】
本発明の検出方法は、一価抗体とサンプル中の目的タンパク質との抗原抗体反応を利用するものであり、抗原抗体反応を検出することができる免疫学的手法を用いてサンプル中の目的タンパク質を検出することができる。抗原抗体反応を検出することができる手法としては、限定するものではないが、フローサイトメトリーを利用する方法、免疫電気泳動法、免疫蛍光法、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイなどが挙げられる。本発明では、フローサイトメトリーを利用する方法が好ましい。
【００３３】
フローサイトメトリーは、粒子懸濁液を高速で細管中に流し、浮遊している粒子を１個ずつ分別し、各粒子にレーザー光を照射して、レーザー光の粒子による散乱や、レーザー光によって励起される粒子の蛍光発光などを検出・測定する分析方法である。
【００３４】
本発明のフローサイトメトリーを利用する検出方法は次のようにして行う：
（１）サンプルと一価抗体とを反応させる。これによりサンプル中に含まれる目的タンパク質（抗原）の量と相関して一価抗体が消費される。
（２）ペプチド固相化ビーズを加える。これにより未反応の一価抗体とビーズとが結合する。
（３）ビーズを洗浄する。未反応の一価抗体と結合したビーズ及び未結合ビーズが残る。
（４）蛍光標識２次抗体を加える。この蛍光標識２次抗体は未反応の一価抗体と反応し、未反応一価抗体と結合したビーズが蛍光標識される。
（５）蛍光標識されたビーズをフローサイトメトリーにより検出する。
（６）添加した一価抗体量と検出された蛍光量から、間接的にサンプル中の目的タンパク質量を推定する。
【００３５】
上記の工程（１）においては、サンプルと一価抗体とを反応させるが、サンプル中に存在しうる目的タンパク質に対し、過剰の一価抗体を添加する必要がある。サンプルと一価抗体の量は、当業者であれば容易に決定することができるが、抗体量が多すぎると感度が低くなり、少なすぎると検出が困難になるため、陽性反応を明確に識別しうる（平均蛍光強度１００程度）必要最少量の抗体量を予め調べておく必要がある。
【００３６】
工程（２）に記載されている「ペプチド固相化ビーズ」とは、未反応の一価抗体と反応させるために添加するものであって、固相化するペプチドは検出目的のタンパク質の断片でありうる。例えばプリオンに対する一価抗体と反応させる場合には、プリオンペプチドを固相化する。ビーズとしては、フローサイトメトリーに適した当技術分野で公知のあらゆる粒子を用いることができ、例えば、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等が挙げられるが、特にラテックスビーズが好ましい。ペプチドをビーズに固相化する方法は、当技術分野で公知である。ペプチド固相化ビーズの添加量は、約５×１０^４個／サンプル、すなわち、フローサイトメトリーにおいて１０^４個のビーズを測定するのに十分な量である。
【００３７】
工程（３）においては、当業者に公知の手法によりビーズを洗浄する。例えば、プリオン検出においてラテックスビーズを用いる場合には、２０００ｇ、室温にて３０秒間遠心分離して洗浄する。
【００３８】
工程（４）において加える蛍光標識２次抗体は、工程（３）の洗浄後に残っている、未反応一価抗体が結合したビーズと未結合ビーズのうち、未反応一価抗体と反応する。すなわち、未反応一価抗体が結合したビーズを蛍光標識する。蛍光標識２次抗体は、未反応一価抗体と反応するものであり、未反応一価抗体がウサギにおいて生成されたものであれば、２次抗体は抗ウサギ抗体である。使用しうる蛍光標識としては、限定するものではないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコエリスリン−シアニン５（ＰＥ−Ｃｙ５）等が挙げられる。また、２次抗体を直接標識するだけではなく、間接的に２次抗体を標識してもよい。例えば、ビオチン標識２次抗体に対し、蛍光標識したストレプトアビジンを結合させることにより２次抗体を間接的に蛍光標識することもできる。
【００３９】
工程（５）において、フローサイトメーターにより、上述のように蛍光標識したビーズを検出する。検出は、例えば、ＥＰＩＣＳＥｌｉｔｅＸＬフローサイトメーターにより、ＦＳ＝３００Ｖ，２．０Ｇａｉｎ、ＳＳ＝２６０Ｖ，２．０Ｇａｉｎ、ＦＬ２＝９３０Ｖ，１．０ＧａｉｎのＤｅｔｅｃｔｏｒ感度設定で行うことができる。
【００４０】
最後に、工程（６）において、工程（５）で測定された蛍光量からサンプル中の目的タンパク質量を算出する。予め既知濃度のタンパク質を含有するサンプルを用いて検量線を作成しておくことが望ましい。
【００４１】
以上のようにして、サンプル中のタンパク質量を定量的に求めることができる。本発明によると、極微量のタンパク質であっても検出することができる。図１に、ＩｇＧ抗体又は一価抗体とタンパク質抗原分子との結合反応を模式化して示す。ＩｇＧ抗体は抗原結合部位を２カ所有するため、極微量の抗原分子存在下では、抗原２分子と結合した抗体、抗原１分子とのみ反応した抗体、又はこれら両抗体が混在して存在し得るため、抗原量と結合抗体量は必ずしも比例しない。この２価抗体の特性が微量タンパク質検出の障害になっていると考えられる。一方、本発明の一価抗体は抗体１分子につき１個の結合部位しかないため、抗原分子量と結合抗体量は比例する。従って、本発明の検出方法では、サンプル中の極微量のタンパク質を高感度かつ定量的に検出することができる。
【００４２】
さらに、本発明の異常プリオン検出方法は、試薬キットを用いて非常に容易に実施することができる。ここで、試薬キットは、少なくともプリオンに対する一価抗体を含んでいる。また、該試薬キットは、さらにプロテイナーゼＫ、プリオンペプチド固相化ビーズ、蛍光標識２次抗体等を含んでもよい。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
＜実施例１＞抗プリオンＦａｂフラグメントの作製
（１）抗プリオンペプチド抗体の作製
ヒツジプリオンタンパク質のアミノ酸配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓ；ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＵ６７９２２として公開されている）を元にペプチドを設計した。すなわち、スクレイピープリオン（ＰｒＰ^ｓｃ）のコアフラグメントＰ２７−３０のＮ末端配列にＣｙｓを付加した２０アミノ酸からなるペプチド（ＮＨ_２−ＣＧＱＧＧＳＨＳＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＭ−ＣＯＯＨ；配列番号１）を合成した。さらにこのペプチドにキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を付加したものを抗原としてウサギに免疫した。数回のブースト免疫後、抗血清を回収し、プロテインＡカラムを用いてＩｇＧ抗体を精製した。
（２）Ｆａｂフラグメントの作製
精製ＩｇＧ抗体をパパイン結合カラムに通すことにより、ＩｇＧ分子をＦｃ部とＦａｂ部に切断した。次にプロテインＡビーズと混合することによって未消化ＩｇＧ分子とＦｃ部を除去した。抗体のＦａｂ化はＳＤＳ電気泳動で確認した。
【００４４】
＜実施例２＞プリオンペプチド固相化担体ビーズの作製
カルボキシル化ラテックスマイクロビーズ（直径１０μｍ、ポリサイエンス社製）に上記プリオンペプチドを固相化した。すなわち、ビーズのカルボキシル基を活性化させた後、ペプチドと一晩混合した。遠心して上清を除去した後、エタノールアミンを加えてビーズの未反応基をブロックした。遠心洗浄後、ＢＳＡ溶液を加え、ビーズの非特異的タンパク結合部位をブロックした。
【００４５】
＜実施例３＞フローサイトメトリーによる検出
既知濃度のプリオンペプチドを含む試料（１０２．４ｆｇ〜４０ｎｇ／１０μｌ）と、抗プリオンペプチドＦａｂフラグメント（１μｇ／１０μｌ）又は対照としてＩｇＧ抗体とを混合し、４℃で２０分間反応させた。１０^５個／５μｌのビーズを添加して混合した後、さらに４℃で２０分間反応させた。ビーズを遠心洗浄後、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗体）を反応させた。遠心洗浄後、フィコエリスリン標識ストレプトアビジンで染色した。蛍光反応はＥＰＩＣＳＥｌｉｔｅＸＬフローサイトメーター（ベックマン・コールター社製）を用いて検出し、ビーズ一個あたりの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。
【００４６】
図２ＡにＩｇＧ抗体を用いてプリオンペプチドを検出した結果を示す。ＩｇＧ抗体を添加しない陰性対照（ＮＣで示す）ではビーズのバックグラウンド蛍光のみのためＭＦＩ値は低い（＜１０）。一方、ペプチドを添加せずにＩｇＧ抗体を反応させた陽性対照ではＭＦＩ値は約１１０を示した。ペプチドを添加したサンプルではおよそ１２．８ｐｇから４０ｎｇの範囲でほぼ直線的にＭＦＩが減少し、この範囲内でプリオンペプチドの検出に定量性があることがわかる。しかしながら１２．８ｐｇ以下の濃度ではＭＦＩ値はほぼプラトーになり、またバラつきも大きく定量性はない。
【００４７】
図２ＢにＦａｂフラグメントを用いて同様に解析した結果を示す。ペプチド量が１０２．４ｆｇから４０ｎｇまでほぼ直線的にＭＦＩ値が減少し、この広い濃度範囲でプリオン抗原を定量的に検出できることが判明した。
従来法のプリオンの検出限界は、ウェスタンブロッティング法で約３ｎｇ、キャピラリー電気泳動法で約６４ｐｇ、ＥＬＩＳＡで約６０ｐｇ及びイムノＰＣＲ法で約６ｐｇであり、これらの方法と比較すると本検出方法は数十倍から数万倍の検出感度を有することがわかる。
【００４８】
＜実施例４＞感染脳乳剤からの異常プリオンの検出
正常マウス脳及びヒツジスクレイピー接種マウス脳を用いて１％ホモジェネートを作製し、リンタングステン酸法でプリオンタンパクを粗精製しプロテアーゼ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）処理した。サンプルを１／５００００〜１／５０倍に希釈し、Ｆａｂフラグメントと反応させる本検出方法によりプロテアーゼ耐性の異常プリオンの検出を行った。図３に示すように、正常脳由来のサンプルでは各希釈段階でほぼ一定のＭＦＩ値（Ａ）及び陽性率（Ｂ）を示した。それに対して、スクレイピー感染脳由来サンプルでは、希釈率が下がるにつれてＭＦＩ値及び陽性率が減少し、１／５０００〜１／５０倍希釈サンプルでは、正常マウス脳と比較して低いＭＦＩ値及び陽性率を示した。これは、本検出方法のＦａｂフラグメントが異常プリオンと反応していることを示す。従って、本検出方法により、スクレイピー感染脳乳剤から異常プリオンを検出可能であると考えられる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、サンプル中のタンパク質を高感度かつ定量的に検出する方法が提供される。本発明の検出方法は、高感度な検出が望まれている異常プリオンタンパク質の検出において特に有用であり、異常プリオンタンパク質混入サンプルを検出することによってプリオン病の感染を回避することができる。
【００５０】
【配列表】

【００５１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩｇＧ抗体又は一価抗体とプリオン抗原分子との結合反応の模式図である。
【図２】抗プリオンペプチドＩｇＧ抗体（Ａ）及び抗プリオンペプチドＦａｂフラグメント（Ｂ）を用いて既知濃度のプリオンペプチドを検出した結果である。
【図３】抗プリオンペプチドＩｇＧ抗体及び抗プリオンペプチドＦａｂフラグメントを用いて、正常マウス脳及びヒツジスクレイピー接種マウス脳中の異常プリオンを検出した結果である。

Claims

プリオンタンパク質と、該プリオンタンパク質に対する一価抗体とを反応させることを特徴とする、サンプル中のプリオンタンパク質の検出方法。
一価抗体がFabフラグメント、Fab'フラグメント又はFvフラグメントである、請求項１記載の方法。
一価抗体と反応させる前にサンプルをプロテイナーゼKで処理する請求項１又は２記載の方法。
プリオンタンパク質が異常プリオンタンパク質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
プリオンタンパク質が哺乳動物に由来するものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
サンプルが、体液、医薬品又は食品である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
フローサイトメトリーにより検出を行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出方法。
プリオンタンパク質に対する一価抗体を含むことを特徴とする試薬キット。
プリオンタンパク質が哺乳動物に由来するものである、請求項８記載の試薬キット。
一価抗体がFabフラグメント、Fab'フラグメント又はFvフラグメントである、請求項８又は９記載の試薬キット。
プロテイナーゼK及び／又はプリオンペプチド固相化ビーズをさらに含む請求項８〜１０のいずれか１項に記載の試薬キット。