JPH01501518A - Ｎ‐ｍｙｃタンパク質のためのアッセイ及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍遺伝子は、活性化又は変化される場合、・腫瘍性表現型への正常な細胞の形 質転換に関与する遺伝子である。多くの腫瘍遺伝子が、ヒト及び動物の両者に同 定され、そしてそれぞれに関連する・形質転換の機構は広く異なる。しばしば、 腫瘍遺伝子は、前腫瘍遺伝子として言及される、対応する正常な細胞性遺伝子を 有し、そしてその前腫瘍遺伝子の発現又は構造のいづれかの修飾は、腫瘍性形質 転換をもた癌性にし、セしてｃ−１ｎ７　ｅ前腫瘍遺伝子のトランスポジシ、／ は、宿主の高められた発現及び腫瘍性形質転換をもたらす。もう１つのそのよう な例は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ　）に見出されるユニーク転写及びタン／？ り質をもたらすｃ−ａｂｊ前腫瘍遺伝子のトランスロケーションでおる。

Ｎ１■は、ウィルスｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子に対するその類似性のために元来同一 であるとみなされていたヒト前腫瘍遺伝子である。Ｎ−ｍｙｅの遺伝子増幅及び ／又は高められた発現は、ある腫瘍細胞系並びに−次性腫瘍及び転移性腫瘍の両 者に見出されて来た。特に、Ｎ−ｍｙｅは、神経芽腫、網膜芽腫及び小細胞肺癌 （ＳＣＬＣ）　Ｋ関連して来た。さらに、Ｎ−ｍｙｃの発現は、ウサギ線維芽細 胞の腫瘍発生転換にかける相補性交は、あるヒト悪性の病原に関与されると思わ れる。

そしてＮ−ｍｙｅが発現される腫瘍を同定し、”そして診断するため°に有用な アッセイ法及び試薬組成物を提供することが所望される。特に、Ｎ−ｍｙｃ遺伝 子生成物に対して特異的な抗体を誘発することができる抗原性試薬を得、セして Ｎ−ｍｙｃ関連癌の診断及び治療にそのような抗体を使用することが所望される 。

２、適切な参照の記載 Ｎ１■は、２５〜７００倍の遺伝子の増幅を示すヒト神経芽腫細胞系に最初に同 定された。５ｃｈｖａｂなど、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０５：２４５及び Ｋｏｈｔなと。

配列は、ＫｏｈＡなど−（１９８６）　Ｎａｔｕｒ＠３１９ニア３に報告されて いる。治療されていない一次神経芽腫及び網膜芽腫の増幅及び高められた転写は 、Ｂｒｏｄ＠ｕｒなど、（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：１１２１；　 Ｓａｅｇｅｒなど、（１９８５）ＮａｖＥｎｇｊ、Ｊ、Ｍｏａ、３１３：　１１ １１；及びＬｅａなど、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０９　：　４５Ｂ　Ｋ 報告されている。Ｎ−ｍｙｃの増幅及び高められた転写はまた、ヒト小細胞肺癌 にも観察されている。Ｎａｕなど・（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８３：１０９２〜１０９６゜ 発明の要約 本発明は、ヒト癌、特に神経又は神経内分泌性質を有する癌、たとえば神経芽腫 、網膜芽腫及び小細胞肺癌を同定し、そして監視するための方・法及び組成物を 提供する。その方法は、生物学的検体１通常細胞サンプル、たとえば組織サンプ ル又は痰サンプル中におけるＮ−ｍｙｃタンノクク質の検出による。生物学的検 体におけるＮ−ｍｙｃタンノヤク質の存在は、°癌の特徴を示し、及び／又は前 兆であることができる。

／ＩＪ、ｅグチド及びそれらに対する抗体は、Ｎ−ｍｙｃタンノやり質を検出す 、るために利用され、ここで前記ポリペプチドは、タンノ４り買上の免疫原性部 位に関係している。そのポリペプチドは、天然であシ又は合成的に製造され、そ して少なくとも６個の隣接する、天然タン／ぐり質のアミノ酸、普通少なくとも ９個の隣接するアミノ酸、より普通には少なくとも１２個の隣接するアミノ酸を 含み、そしてＮ−ｍｙｅタンＩクク質上買上出可能なエピドーグを示す。そのよ うン／臂り質及びそのフラグメントを含む。そのポリペプチドに対するモノクロ ーナル及びポリクローナル抗体は、従来の技法によって調製され、そしてそれら の抗体及びポリペプチドは、生物学的な検体におけるＮ−ｍｙｃタンパク質の検 出のために種々の従来の免疫学的アッセイ及び組織化学的染色技法に使用される 。

本発明は、形態的に類似する腫瘍タイプを見分けるために特に有用である。たと えば、子供・の種々の丸型細胞腫瘍、たとえば神経芽種、神経上皮腫、ＥＶ　ｉ 　ｎ　ｇ肉腫、ラブド筋肉腫（ｒａｈｂｄｏｍｙｏｇａｒｃｏｍａｓ　）及びリ ンパ腫を区別することは時々困難である。

必要とされる治療は腫瘍の性質に非常に依存する現する神経芽腫及び他の腫瘍の 初期同定を可能にするであろう。本発明はまた、非一次部位、たとえばリンパ節 及び骨髄におけるミクロ転移の細胞起源を同定するためにも有用であり、そして 染色の強さく濃度）Ｋよって測定される、発現されたＮ−ｍｙｃタンパク質の量 は、疾病予測と相互関係することができる。本発明はまた、％に痰及び／又は肺 洗浄サスプル中における癌細胞の検出によって、小細胞肺癌の初期検出の提供を 約束する。

本発明の特定の観点においては、新規ＤＮＡ分子がＮ−ｍｙｃポリ（プテドを発 現するために提供される。

そのＤＮＡ分子は、異種プロモーターの転写制御下であシ又は合成的であること もでき、そしてぞのＤＮＡ分パ１クローンのためのヌクレオチド配列及び推定上 のアミノ酸配列を示す。

第２図は、この後の実験部分に詳細に説明されるように、種々のＮ−ｍｙｃ　１ フラグメントを発現するのに使用されるＰ　４１４／９３６デラスミドを例示す る。

本発明によれば、ヒト患者中の癌を同定するための方法は、生物学的検体、典型 的には体液、組織又は痰サンプル中にかけるヒ）　Ｎ−ｍｙｃ前腫瘍遺伝子の発 現生成物の検出によるものである。便利には、検出は、免疫学的技法、たとえば Ｎ−ｍｙｃタンパク質に対して特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体 のいづれかを用いての細胞サンプルの免疫組織化学的な染色法によって達成され る。Ｎ−ｍｙｅタン／ぐり質の検出は、形態的に類似する癌と特定の癌、たとえ ば神経芽腫とを区別することに、及び癌、たとえば小細胞肺癌の初期検出及び特 異的な診断のために特に有用である。

Ｎ−ｍｙｃは、多くのヒト腫瘍、特に神経及び神経内分泌関連腫瘍、たとえば神 経芽腫、網膜芽腫及び小細胞肺癌の病因に関連するヒト前腫瘍遺伝子である。

本明細書に報告された研究によって示される場合、Ｎ−ｍｙｅ遺伝子の発現生成 物は、それぞれ約゛６２ＫＤ及び６４ＫＤのポリペプチドを含むダブレットリン タン／臂り質であシ、ここで、その６２ＫＤ種は、リン酸化の前の遺伝子生成物 を表わすように思える。もちろんこれらの分子量は、おおよそであシ、そしてこ の後実験部分において報告される測定技法における実験的誤差に従属する。その タンパク質は、約３０〜５０分の半減期を有し、そして細胞核（その４０〜５０ 係が核マトリックスに関連する）内に位置する。

さらに本明細書に例示される場合、ある神経及び神経内分泌関連細胞の腫瘍性形 質転換は、Ｎ−ｍｙｃタンノクク質の検出可能な発現によって特徴づけられる。

本発明のポリペプチドは、天然のＮ７■タンノクク質内に隣接して見出される、 少なくとも６個のアミノ酸、昔過少なくとも９個のアミノ酸及びよシ普通には１ ２又はそれ以上のアミノ酸を含む、ハプテン又は抗原のいづれかであろう。その 隣接するアミノ酸は、ダプレットポリベグチドのいづれかの領域内に位置し、そ してそのタンノクク質の特性を示す、少なくとも１つのエピトープ部位に対応す るであろう。

特徴的には、そのエピトープ部位は、確証を持って、を可能にするであろうこと を意味する。し・かじながら、他の場合、そのエピトープ部位は、他のタンパク 質、たとえばｅ−ｍｙｃと交叉反応するであろう。

この後、実験部分でひじょうに詳しく報告されているように、推定上のＮ−ｍｙ ｃタン／母り質のカルゲキシル末端の３９４個のアミノ酸内の６個の特定の４リ ペゾチド（ＫｏｈＡなど、（１９８６）Ｉｇに報告されているように〕が、本発 明に有用な抗体を誘発することができるものであると同定されている。これらの ポリペプチドの配列（積率の１文字の指示を用いで）は、次の通シである： ＲＰＧＧＲＱＴＳＧＧ　ＤＨＫＡＬＳ　；これらの６個のポリペプチドのうち、 ■及びｍは、Ｎ−ｍｙｃタンノヤク質に対するひじょうに高い特異性及さないこ とが見出された。対照的に、ポリペプチドＶＫ対して誘発された抗体は、ｃ−ｍ ｙｃタン／ぐり質と交叉反応するように思える。すべての６個のポリペプチドに 対して誘発された抗体は、神経芽腫細胞系の分解物による免疫沈殿アッセイにお いてＮ−ｍｙｃと反応するが、■、■及びＶのみが、試験条件下で全細胞を組織 化学的に染色する抗体を誘発する。

Ｎ−ｍｙｃポリペプチドは、天然のものであシ、すなわち天然源から単離された 完全なＮ−ｍｙｅタンノ矛り質又はそのフラグメントであシ、又は合成的に製造 され得る。その天然の／ＩＪペプチドは、天然源、たとえばＮ−ｍｙｃタンパク 質を産生ずることが知られている神経芽腫及び網膜芽腫細胞系から、従来の技法 、たとえばアフィニティークロマトグラフィーにより特表千１−５０１５１８　 （４） で単離され得る。便利には、本発明によシ得られたポリクローナル又社モノクロ ーナル抗体は、良く知られた技法忙よって、適切なアフィニティーカラムを調製 するために使用され得る。そのような技法は、たとえばＨｕｄｓｏｎ及びＨａｙ ’ｓ　ＰｒａｃｔｉｃａｔＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａＢｌａｃｋｗｅｔｔＳｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｔｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒｄ　。

Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍｓ　１９８０ｔ　ｆ’ｒブタ−８に教授されてｈ る。

免疫学的に天然のＮ−ｍｙｃり／・母り質と交叉反応する合成ポリペプチドは、 ２種の一般アプローチのうちいづれかによって産生される。初めに、約５０個よ シも少ないアミノ酸、よシ普通には約２０個よシも少ないアミノ酸を有するポリ ペプチドは、アミノ酸が増大する鎖に連続的に付加される。良く知られたＭｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ、　Ａｍ、 　Ｃｈｓｍ、　Ｓａｃ、　８５　：　２１４９〜２１５６］によって合成され得 る。そのような合成ポリペプチドのアミノ酸配列は、この後、実験部分で記載さ れる第１図の配列、又はＫｏｈＡなど、（１９８６）　、前記に報告されている 完全なＮ−ｍｙｃ遺伝子についての配列に基づかれている。

本発明のポリペプチドを合成するための第２番目の及び好ましい方法は、Ｎ−ｍ ｙｃ遺伝子の所望の部分、をコードする組換えＤＮＡ分子の培養された細胞中に おける発現を包含する。そのＮ−ｍｙｃ遺伝子はそれ自体、天然のものであシ又 は利用できるプローブ、たとえばｐＮｂ−１（５ｅｈｖａｂなど−（１９８３） 　Ｎａｔｕｒｅ　３０５：２×５〕を用いてｃＤＮＡ又はゲノムライブラリィか ら得ることができる天然の遺伝子によシ合成的に製造され得る。他方、プローブ は、この後の実験部分に記載されているように、第１図に報告されたＤＮＡ配列 に基づいて合成され得る。適切なｅＤＮＡ及びゲノムライブラリィは、Ｎ−ｍｙ ｃ遺伝子を含むことが知られているヒト細胞系、たとえばＬＡ−Ｎ−５及びＩＭ Ｒ−３２ヒト神経芽腫細胞系から得られる。他方、ポリ−（プチド社、良く知ら れた技法によって合成され得る。たとえば、短い一本鎖ＤＮＡフラグメントは、 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｒｕｔｈ＠ｒｓ　（１９８１）　Ｔ＠ｔｔ、　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ　２２：１８５９よりて調製され得る。次に、二本鎖フラグメントは 、相補的鎖を合成し、セして該鎖を一緒に適切な条件下でアニーリングすること によって、又は適切なゾライマー配列と共にＤＮＡポリマラーゼを用いて相補的 な鎖を付加するととＫよって得られる。特別なりＮＡ配列は、本明細書の第１図 又はＫｏｈＬなと、（１９８６）。

目的とするＮ−ｍｙｃフラグメントをコードする天然又は合成りＮＡフラグメン トが、（７ｔ＝ρでの細胞培養に導入することができ、そしてその培養中におい て発現することができるＤＮＡ構造体に導入され得るであろう。通常、そのＤＮ Ａ構造体は、単細胞宿主、たとえば酵母又は細菌中における複製のために適切で あるが、しかしまた、培養された哺乳類又は他の真核性細胞系のｒツム内に導入 及び組込みのためにも向けられ得る。細菌又は酵母中への導入のため罠調製され たＤＮＡ構造体は、宿主によって認“識される複製システム、目的とするポリペ プチド生成物をコードするＮ−ｍｙｃ　ＤＮＡフラグメント、該Ｎ−ｍｙｃ　Ｄ ＮＡ配列の５′端に連結された転写及び翻訳開始調節配列、及び該Ｎ−ｍｙｃ配 列の３′端に連結された転写及び翻訳終止調節配列を含むであろう。便利には、 複製システム及び転写及び翻訳調節配列並びにＮ−ｍｙｅ　ＤＮＡ配列のための 挿入部位を含む利用可能な発現ベクターが使用され得る。。

本発明の検出方法に有用であるためには、ポリペプチドは、実質的に純粋な形で 、すなわち典型的には約ｓ　ｏ　ｔｓ　（ｖ／ｗ　）又はそれ以上の純度で得ら れ、実質的には妨害性タン・ぐり質及び汚染物を含まない。

８０　％　（ｗ／ｖ　）の純度、よシ好ましくは少なくとも約９５４　（ｖ／ｖ 　）の純度で単離され又は合成される。

従来のタンＩ譬り質精製技法を用いて、少なくとも９９１　（ｗ／ｗ　）の均質 なポリペプチドを得ることができる。たとえば、そのタンノクク質は、免疫吸着 剤アフィニティークロマトグラフィーを用いて、この後に記載の抗体の使用によ シ精製され得る。そのようなアフィニティークロマトグラフィーは、固体支持体 に抗体をまず結合し、そして次に該結合された抗体ることによって行なわれる。

十分な量のＮ−ｍｙｃポリペプチドが得られた後、そのＮ−ｍｙｃタンノｆり質 に対して特異的なモノクローナル抗体がイン　ビトロ又はイン　ビが技法によっ て産生され得る。乙ど口上技法は、抗原性ポリペプチドへのリンパ球のインビト ロでの暴露を包含し、ところがインビゲ技法は、広範囲の種類の背椎動物中への そのポリペプチドの注入を必要とする。適切な背椎動物は、人間以外の動物、た とえばマウス、ウサギ、ネズミ、羊、ヤギ及び同様のものである。約３０個以上 のアミノ酸、好ましくは約５０個以上のアミノ酸を有するポリペプチドは、免疫 原として直接に作用することができる。そのポリペプチドが約１０ＫＤ。

特にＦｒ６ＫＤ以下である混合、目的の免疫応答を誘発するために大きな分子に そのポリペプチドを連結することか必要である。次に、免疫原が予定されたスケ ジュールに従って動物中に注射され、そしてそれらの動物は、改良された力価及 び特異性を有する連続的な出血により定期的に採血される。注射は、筋肉内、腹 腔内、皮下内又は同様にして行なわれ、そして通常、アジシパント、たとえば不 完全７０イントアジエパントが使用されるであろう。

所望によシ、モノクローナル抗体は、所望の特異性を有する抗体を産生ずること ができる不滅化された細胞系を調製するととＫよって得られる。そのような不滅 化された細胞系は、種々の方法によシ産生され得る。便利には、小背椎動物、た とえばマウスが、この後の方法によって所望の抗原により高度免疫化される。次 にその背椎動物は、最終免疫化の後、普通数日で殺され、膵臓が除去され、そし てその膵臓細胞が不滅化された。その不滅化の方法は臨界ではない。現在、最り とも通常の技法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉＡｓｔ＠ｉｎ　（１９７６）　Ｅｕｒ 、Ｊ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　６　：　５１１〜５１９によって初めに記載され たように、骨髄腫細胞融合ノ母−トナーとの融合である。他の技法は、ＥＢＶ形 質転換法、裸のＤＮＡ、たとえば腫瘍遺伝子、レトロウィルス、等による形質転 換法、又は細胞系の安定した維持及びモノクローナル抗体の産生を提供するいづ れか他の方法を含む。

融合／ヤートナーとの融合を使用する場合、その融合法は臨界ではなく、そして 種々の技法が使用され得る。便利には、膵臓細胞及び骨髄腫細胞が、非イオン性 界面活性剤、普通ポリエチレングリコール及び他の添加剤、たとえばＤｕｌｂ・ ｃｃｏの変性されたイーグル培地の存在下で、数分間混合される。その融合の終 シで、その非イオン性界面活性剤は、細胞を洗浄することによって急速に除去さ れる。それらの融合された細胞は、骨髄腫細胞に対して致死的であるが、ハイブ リッド細胞の増殖を支持するように選択された選択培地を含む小培養シェル（通 常マイクロタイターグレート）中に、ウェル当シ約１〜５Ｘ１０５個の細胞の範 囲である比較的低密度で即座に分散される。普通、その骨髄腫細胞系は致死剤に 対して敏感である、典型的にはＨＡＴ感受性でおるように突然変異化されている 。

十分な時間の後（通常１〜２週間）、ハイブリッドコロニーが観察され、そして ハイブリッドの陽性ウェルを含むグレートが同定される。ウェル当シたりた１個 のコロニーを有するグレート及びウェルを選択し、そしてこれらのウェルからの 上清液が。

Ｎ１■タン・ぐり質又は単離された抗原に対する結合活性について試験される。

陽性ハイツリドーマが同ｅ嘴？Ｌ、斧しモの釧胸茎は牢衣焙馨物とｌ−で凄鋏鮫 燥及び凍結針鼠によシ維持され得る。

所望によるその抗体の使用に依存して、それらのハイツリドーマはさらにスクリ ーニングされ得る。

高い力価を提供するハイツリドーマが所望される。

さらに、細胞毒性抗体、たとえばＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ＊ＩｇＧ３及びＩｇＭ が腸瘍の治療に使用され得る。免疫診断アラ七イに使用するためＫは、抗原部位 に対してひじょうに高い特異性を有する抗体が所望される。

所望のハイツリドーマが選択された後、モノクローナル抗体がその増殖コロニー の上清液から単離され得る。しかしながら、得られる抗体の収量は通常低い。そ の収量は、種々の技法、たとえば細胞を受ける背椎動物宿主の腹腔内中へのハイ ツリドーマ細胞系の注入によシ高められ得る。次に、モノクローナル抗体が腹水 又は血液から収穫され得る。タン／母の技法、たとえばクロマ・、グラフィー、 グル濾過、沈殿、抽出又は同様の方法によりてモノクローナル抗体から通常除去 されるであろう。

免疫原として使用されるポリペプチドを適切に選択することによりて、Ｎフｕタ ンＩ譬り質に対して高い特異性及び親和性を有する抗体が得られる。その選択さ れたプリペプチドは、ルジエタン／母り質に対してユニークであシ、そして密接 に関連するタンパり質、たとえばｅ　−ｍ７　ｅとＮ１Ｌとを区別することがで きる１又はそれよシも多くのエピトープ部位を示すべきである。そのようなユニ ークエピトープは、上記に示されたポリペプチド■及び■上に見出される。

本発明のプリペプチド及び抗体は、変性しても又はしないでも使用され得る。と きどき、それらのポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質 を共有又は非共有結合することによってラベルされるであろう。広い範囲の種類 のラベル及び接合技法が知られていて、そして科学誌及び特許文献にひじょうに 報告されている。適切なラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビ ター、螢光物質、化学ルミネサ−１″磁気性物質及び同様のものを含む。そのよ う表ラベルの使用を教授する特許は、アメリカ特許第３，８１７，８３７号；第 ３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第 ４，２７７，４３７号：第４．２７５，１４９号：及び第４，３６６，２４１号 を含む。

上記のようにして調製された抗体及びポリペプチドは、生物学的検体、特に細胞 サンプル、たとえば神経細胞、網膜細胞及び小肺細胞（神経内分泌由来の）及び 体液サンプル、たとえば血液、血漿、血清、尿及び同様のものからＮ！タンノク ク質を検出するための種々の免疫学的な技法に使用され得る。

サンプルの性質に依存して、液相アッセイ及び個相免疫組織化学的染色技法の両 者が使用されるであろう。便利には、免疫組織化学的染色技法は１、細胞サンプ ル、たとえば組織サンプル、痰及び肺洗浄サンプルに関して使用され得る。たと えば、組織サンプルは、病院での病理学実験室において日常であるようにして、 ホルマリン、Ｂ−５又は他の標準保存剤中に固定され、脱水され、モしてノクラ フイツに包まれる。

次に、断片が、／母うフインに包まれたブロックから切られ、そしてガラススラ イド上に載せられる。

次に、存在するなら、Ｎ−ｍｙｃタンパク質が、ラベルされた抗−？’Ｊ−シ１ 抗体による暴露又はラベルされていない抗−Ｎ−抗体及びラベルされた第二抗体 への暴露によって、核中に検出され得る。痰及び洗浄サンプルは、典型的には類 似する方法（サンプルがまず脱水剤、典型的には低分子量アルコールへの暴露に よシ脱水される）Ｋよシ調製される。

液相イムノアッセイ又はウェスターン法分析はまた、Ｎ−タンパク質が、たとえ ば血液又は尿中に放される場合、特に体液中におけるそのタンノ譬り質の検出に も使用されるであろう。固形組織及び痰サンプルはまた、細胞内タンパク質を離 すために細胞サンプルを分解することによって、液相システムにおいても検定さ れ得る。タン／臂り質が離された後、そのタンノ４り質は適切な緩衝液中に置か れ、そしてそのサンプル緩衝液は適切なイムノアッセイにかけられるであろう。

多くの；ンイティティプ及び非コンペティティブイムノアッセイが利用でき、そ して科学文献及び特許文献に記載されている。

一本発明の抗体はまた、癌治療及び他の医療用途にも使用され得る。たとえば、 抗−Ｎ−ｍｙａ抗体、好ましくはヒト抗体は、毒素、たとえばジフテリア毒素及 びリシンＡ鎖に連結され得、そして神経筋及び神経内分泌癌を有する患者に投与 され得る。癌治療において毒素を結合する抗体の使用は、アメリカ特許第４，０ ９３，６０７号；第４，３４０，５３５号；第４，３７９，１４５号；及び第４ ，４５０，１５４号に一般的に記載されている。

抗体はまた、腫瘍性表現型の助けとなるＮ−ｍｙａタンノ譬り質の活性を特にブ ロック又は妨げることＫよりて、治療に単独で使用され得る。

次の実験は、例示的であって、制限するものでは１、Ｎ！の部分的なｅＤＮムク ローンの調製及び発現・ Ｎ１ｕ遺伝子及びその遺伝子生成物を特徴づけるために、ｃＤＮＡライブラリィ を、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇのベクター（Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ（１９ ８２）Ｍｏ１．Ｃａ１ｌＢｉｏｌ。

２：１０１　）を用いて、ＬＡ−Ｎ−５ヒト神旺芽腫細胞系（挿入基準）から構 成した。約ｇ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ個のクローンを、神経芽腫細胞系から単離された ヒ）　Ｎ−ｍｙｃフラグメントを含むプラスミドであるｐＮｂ−Ｉ（Ｓｃｈｗａ ｂなど、（１９８３）、■〕Ｋよシスクリーンした。

ツノフラグメント又は相補的ＤＮＡ鎖のいづれかを含む独立したＭ１３クローン に基づいて行なった。推定されるアミノ酸配列と共にそのヌクレオチド配列は第 １表に示されている。第１図におけるアミノ酸は、Ｋｏｈｌなど、（１９８６） 前記によりて報告されているような完全な配列決定に応じて番号が付けられてい る。

Ｎ−！！Ｌ：　Ｉ　Ｋおける最りとも大きな読み取シ枠は、１１８２個の長さの ヌクレオチドでラシ、そして推定上のＮ−ｍｙｃタンＩ臂り質のカルがキシル末 端の３９４個のアミノ酸をコードするであろう。Ｎ−ｍｙｃｌ配列の比較（’　 Ｋｏｈｌなど、（１９８６）凱風によって報告されている〕は、Ｎ−ｍｙｅｌク ローンからの最りとも大きな読み取シ枠と公開された配列との間にたった１つの 注目すべき相違を示す。Ｎ−ｍｙｃ　１クローンにおけるアミノ酸２２６のため のコドンの第３塩基がシトタンで＃Ｉシ、そしてその次のコドンの第１塩基がグ アニ／でちる。公開された配列は、これらの２個の残基の逆転を示す。この相違 は、アミノ酸２２７における変化；すなわちプロリンの代わシにアラニンをもた らす。

見、ヨにおいて推定上のＮ−ｍ）７３をコードするタンノクク質の部分を発現す るための一連のベクターが、ウシ成長ホルモン遺伝子（ｂＧＨ）の５′−領域を 、下記のようなＮ−ｇＩＨ１クローンの６種の異なり・た領域に融合することに よって構成した： 融合遺伝子　アミノ酸番号１　象　徴 −１−１−一一一曙−―――−−―■−１１、―■■−１−■―−■■−■−− −■■―■ＩｂＧＨ／′Ｎ−ｍｙｃ　Ｉ　９６−１１１　□ｂＧＨ／′Ｎ−ｍｙ ｃ　ＩＩ　１７８−２５３　−−−−−−−−−−ｂＧル乍−ｍｙｃｌｌ［１７ ８−２７７・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ｂＧ）％／Ｎ−ｍｙｃ ｆＶ　２２６−２８０　−一一−ｂＧル’Ｎ−ｍｙｃ　Ｖ　３１１−４０９ｂＧ Ｈ／Ｎ−１ｎ７　ｃ　Ｖｉ　４１０−４６４　−−−−第１図を参照のこと。

Ｎ１■特異的配列への融合のために使用されるｂＧＨ遺伝中の３個の部位は、そ れぞれｂＧＨのアミノ末端の７６．９２及び１１４残基を含む融合タンノヤク質 を生ぜしめるＳｓｔ　Ｉ　＊　Ｐｓｔ　Ｉ及びＨｉｎｄｌｌ［であった。

発現ベクターｐ４１４／９３６　（挿入基準）、すなわちトリプトファンシンテ ターゼプロモーターに連結された遺伝子の導入のために使用されるポリリンカー に隣接するすべての３個の読み枠に整合して転写終結及び翻訳終結シグナルを含 む、変性された温度感受性ランチウェイグラスミド（第２図）を、ｂｃＪｌ／Ｎ −ｍｙｅ構成体１．ＩＩＩＩＶ、Ｖ及び■のために使用した。

ｐ４１４／９３６ベクターの基本的な成分は、１）選択可能な薬物マーカー、　 Ａｍｐ　、　２）転写終結シグナル及び３）カック中に示されているすべての３ 個の読み枠に整合して翻訳終結シグナルを含むポリリンカーである。

このベクターを用いて発現されるすべての５種の融合遺伝子は、黒のがグラスに よって示されているトリプトファンシンテターゼプロモーターによって促進され た。そのプロモーターを含むｂＧＨ／Ｎ−ｍｙｃ　遺伝子は、該プロモーターの ５′側にある。引速Ｒ（部位中に及び該遺伝子の３′端での１（ｐａｌ、Ｂａｍ Ｈｌ又はＳｓｔ　ｎ部位（下線が引かれている）のいづれかでそれぞれ挿入され た。その特定の３′−クローニング部位は、それぞれの構造体のそばに〔〕で示 されている。それぞれのパー構造体の斜線部は、ｂＧＨドメインを表わし、そし てその開放部はＮ−ｍｙｃドメインを示す。

それぞれの構造体においてｂＧＨ又はＮ−ｍｙｃのいづれかを示すアミノ酸の数 が、それぞれのパー構造体内に（）で示されている。さらに、斜線部における（ 　）内の数の横の文字は、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子セグメントが融合されるｂＧＨ中の 制限エンドヌクレアーゼ部位：　Ｈ（ＨＬｌｄｌｌＩ）、　ｓ（随Ｉ）及びＰ（ 世りを言及する。

ｂＧル’Ｎ　−！！Ｌ！　Ｉは、Ｍ１３ｍｐ２０中にＮ１■の一１７ｍａｎｆ（ ［フラグメント（第１図）をクローニングすることによって構成された。次に、 　Ｎ−ｍｙｅフラグメン初（適切なりＧＨフラグメント（ＥｅｏＲＩ／１（ｉｎ ｄｌｌＩ）　ｔ’　有スるｐ　４１４／９３６発現ベクター中にクローニングす るためにＨｌｎｄｌｌ［及び５ｓｔＵ　Ｋよ多切断するととによりて回収さレタ 。”ＱＩＩＩＣヨ１）Ｎ−ｍ■１を切断し、そ−してフレノウフラグメントによ シ適切なヌクレオチドをフィルインすることによシ前記部位をプラント末端化す ることによって、ｂＧ′ＩＶＮ−■■を得た。次にＮ！１ントを、上記に示され るようなベクターに連結した。

小Ｎ１鏝拗１フラグメントをＭ１３ｍｐｌＯ（拍１．１　）中にクローニングし 、そしてＰｓｔ　Ｉ及びＢａｍＨＩによる切断によりそれを回収することＫより て−ｂＧＨ／Ｎ−！！！Ｌｇ■を構成した。Ｎ−？！Ｌ：１の大Ｍｓｐ　！フラ グメンを用いて、　ｂＧル乍！■と同じ方法によシｂＧル乍ぎＶを形成した。最 後に、Ｍ１３ｍｐ８（ＡｃｃＩＡｉｎｄｌｌ）中にクローンされ九Ｎ−ｒＡＬ！ ：１のＭｇＨＩ／ｌ（ｉ　ｎ　ｄＩｆフラグメントを用いて、ｂＧル〜−９１■ を生成した。そのフラグメントを、ベクター中にクローニングするためにＨｉｎ ｄｌｌ及びＨｌｎｄｌｌを用いて回収した。ｂＧＨ７′Ｎ−ｍｙｃ　Ｍに関する パー構造体の点在部分は、この構成において存在する１−非翻訳配列を示す。

融合遺伝子ｂＧル乍−１を、ヒ）ｅ−”！ａ抗原の発現を得るために前に記載さ れたベクターｐｃＦＭ４１４を用いて発現せしめた。ｂＧＨ遺伝子におけるＳｓ ｔ　Ｉ部位と整合してＮ！１の５ｓｔｌ、４ｔｓａＩフラグメントを連結し、そ してそのコードされた生成物をベクターに付与された停止コドンで終結せしめる ことによりて、ｂＧル水−■を構成した。

次に、上記ベクターを、次のようにしてシ三ユ中に発現せしめた。

２、　ウサギにおける抗血清の調製。

上記のようにして得られたｂＧＶＮ−！！Ｚ！融合タンノクク質が、Ｓｌａｍｏ ｎなど、　（１９８５）　５ｃｌｅｎｃ＠２２８：　１４２７によって記載され た方法によってウサギ中にポリクローナル抗血清を産生ずるために使用された。

３、そのポリクローナル抗血清を用いての“Ｎ−ｍｙｃタンパク質の特徴化。

た抗血清が、Ｎ−ｍｙｃ転写物（ｅ−ｆｆ１７ｅではない）を発現することが知 られているヒト神経芽腫細胞系（ＬＡ−Ｎ−５及びＩＭＲ−３２）を用いて液相 免疫沈殿アッセイによシ試験された。ヒト前骨髄球細胞系、厄−６０を、負の対 照として使用した。なぜならば、これらの細胞は、高レベルのｃ−ｍｙｃ転写物 （Ｎ−ｍｙｅではない）を発現するからである。さらに、２種の他のヒト細胞系 、ＨＴ２９（結腸癌腫）及びＵ２５１（芽腫）が、Ｎ−４転写物を発現しないの で、負の対照として使用された。コードされたＮ−ｍｙｃとしてタンパク質を同 定するために使用される基準は２部上のアミノ酸配列の個々の領域を示す少なく とも２種の異なったＮ−ｍｙｅコード性フラグメントに対する抗血清によって、 神経芽腫細胞破壊物から免疫沈殿されるべきであシ、従ってその免疫沈殿は、ベ クターによシ発現されたフラグメンとＮ−ｍｙｅよシも他の細胞タンパク質との 間の偶然の配列相同によるものである可能性をひじょうに減じる。第２に、その タンパク質は、Ｎ−ｍｙｃ転写物が見出されない他のヒト腫瘍細胞系（神経由来 の芽腫細胞を含む）に見出されるべきでない。

これらの基準を用いて、６２ＫＤ及び６４ＫＤのダツ詩表千１−５０１５１８（ ９） レフトとして出現するタン／４′り質が、旦、已」中に産生される６個のＮ−ｍ ｙｃフラグメントのそれぞれに同胞から一定して免疫沈殿せしめられた。類似す る結−抗体反応を示す、適切なＮ−ｍｙｅフラグメントとのさらに、６２−６４ ＷＤのダブレットの免疫沈殿は、非相同性抗体及び抗原の組合せが使用される場 合、阻止されず；すなわちフラグメン）Ｉ抗原と共にフラグメント■に対する抗 血清によシ仲介される沈殿を阻止する試みは好結果をもたらさず、そして再び、 その沈殿が特異的な抗原−抗体反応によることを示唆した。最後に、６２−６４ ＫＤのタン／やり質の沈殿が、融合タンパク質のＮ−ｍｙｃ部分（ｂＧＨ部分で はない）に向けられた抗体によってであることを確証するために、　ｂＧＨが単 独で反応混合物に添加された。この場合、そのｂＧＨは、６２−６４ＫＤのタン ノ臂り質の沈殿を抑制しなかりた。

Ｃ−エタンバク質は、Ｎ−ｍｙｃタンノぐり質とサイズ（６４〜６７ＫＤ　）及 び外観（ダブレット）で類似する（　Ｈａｎｎ及びＥｌｓｅｎｍａｎ　（１９８ ４）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、４：でない証拠は、２種のデータセットに よシ提供され〈細胞に見出される。第２に、６種の抗血清のうち５種の抗血清は 、ｅ−ｍ７ｅ転写物に富むＨＬ−６０細胞系からの破壊物による免疫沈殿アッセ イにおいて使用される場合、いづれかの特異的夕７ノ４り質を同けられた抗血清 が、免疫沈殿オートラジオグラフの長期暴露（９６時間）に基づいて、ＨＬ−６ ０細胞からの破壊物中に６４〜６７ＫＤのダブレットを認識ためのこの抗血清の 能力を説明するであろう有意な配列相同性を示す。抗−ｂＧＨ／Ｎ−ｍｙｃ抗血 清は、Ｕ２５１又はＨＴ−２９対照細胞系における６２〜６４ＫＤのタンノ９り 質を沈殿せしめなかった。従って、そのデータは、６２〜６４ＫＤのタンノ臂り 質がＮ−ｍｙｅをコードするタン／臂り質であることを示す。

られた。Ｎ−ｍｙｃタンΔり質がリン酸化されるかどうかを決定するために、Ｌ Ａ−Ｎ−５細胞が、Ｏｓｔｅｒｍａｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ ＠ｉｎ　ａｎｄ　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｍｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 、１９８４　、１４４〜１５０ページ〕によって（リン酸を含まない培地中にお いて）　５２ｐ−オルトホスフェ−）　（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　 Ｉｎｃ、、Ｉｒｖｉｎ＊、囚によシ代謝的にうけ、そしてＳＤＳ　−ＰＡＧＥダ ル上で分析した。６２〜６４ＫＤでのバンドは、３２Ｐ−オルトホスフェートに よシラベルされたことが見出された。従りて、Ｃ−！と同様、Ｎ−ｍｙｃタンパ ク質はリンタン／母り質である。

他の細胞タンパク質に比較されるＬＡ−Ｎ−５神経芽腫細胞におけるＮ−ｍｙｅ タン／４り質合成のレベルが、免疫沈殿アッセイを用いて算定された。これらか けられた。次に、その得られた沈殿タンノ４り質がＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　（ドデ シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル）分析にかげられ、そして６２〜 ６４ＫＤでのダブレットバンドがそのｒルから溶離され、計数され、セしてＳｌ ａｍｏｎなど−（１９８５）　＃　ｔｍＥによって記載されているように、全細 胞破壊物中における合計のトリクロロ酢酸沈殿性計数と比較した。これらの細胞 における合計の３ｓｓ−メチオニン結合の約スーチェイスラベリング実験によっ て決定された。

ＬＡ−Ｎ−５ヒト神経芽腫細胞を、６０分間、３５Ｓ−メチオニンによシラベル し、そして過剰のラベルされていないメチオニンによシ追跡した（　Ｓｌａｍｏ ｎ半減期は、３０〜５０分の間であった。再び、このＮ−ｍｙｃタンパク質の特 徴は、２０〜３０分の半減期を有するｅ−ｉｎ）ｒｅと共有される。

細胞の免疫細胞化学的分析に使用した。間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色法及 び１：２０００〜１：４０００（体積）ＯＮ−ｍｙｅ抗血清の希釈を用いて、強 い染色反応がその細胞の核中に示された。すべての細胞は核染色を示した。しか しながら、細胞から細胞への染色の種々の強さは、Ｎ−ｍｙｃタンノクク質内容 物における異質性を示した。すべての６種の抗−Ｎ−ｍｙｃ抗血清は、免疫沈殿 アッセイによってＬＡ−Ｎ−５細胞中に６２〜６４ＫＤのタンパク質を認識した が、その試験された条件下でこれらの血清のうちたった３種の血清、すなわち抗 −Ｎ−ｍｙｃｎ、ｍ及びＶが、神経芽腫細胞を組織化学的に染色した。□抗−Ｎ −ｍｙｃ血清１、■及び■が免疫細胞化学的に反応しなかったという事実は、非 反応性抗血清が向けられる抗原決定基の、固定液によシ仲介された変更によるも のである。反対に、そのタンパク質のこれらの領域は、抗原性領域と他の細胞性 高分子との相互作用又は損われていない細胞内のＮ−ｍｙｃの三次構造のために 、特定の抗血清による認識のために利用され得ない。細胞化学的な反応の特異性 を決定するために、ＨＬ−６０細胞を対照細胞系として使用した。３種の抗血清 のた抗血清は、ＬＡ−Ｎ−５及びＭＬ−６０細胞の両この抗血清の能力は、この 領域における２種のタンノクク質の間の高度の相同性によるらしい。

６２〜６４ＫＤのタンパク質の核局在化は、Ｓｌａｍｏｎなど、（１９８５）前 記によシ記載されているようにして、核、細胞質及び膜画分へのＬＡ−Ｎ−５細 胞の生化学的な分別によりて確認された。このデータは、神め、そして従って免 疫細胞化学的な分析によって得在下を評価するための実験を、ＬＡ−Ｎ−５細胞 からの損なわれていない核を得、そしてそれらを分別にかけることによって行な った。その核を、　Ｂｏｙｌｅなど−（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、　５　：　３０１７によって記載されているようにして、３種の成分、す なわち核原形質、これらの画分を、Ｎ−！特異性抗−Ｎ−ｍｙｅｌ抗血清を用い て免疫沈殿アッセイによシそれぞれ試験した。

Ｎ−ｍｙｃタン、ｐ４り質の大部分は、核マトリックスに関連していることが見 出された。さらに、これは、Ｎ−ために、−次性ヒト神経芽腫の断片を、免疫組 織化学的技法を用いて試験した。これらの実験においては、Ｎ−ｍｙｃ特異性抗 血清のみ、すなわち抗−Ｎ−ｍｙ＠７ラグメント■が使用された。培養された細 胞染色に関する場合、その抗血清は、１：２０００〜１：４０００からの組織（ １つは段階■疾病からであシ、そして他は段階■疾病からである）を試験した。

両者の場合、隣接する血管又はストロマ組織の実質的な染色染色が行なわれた。

段階■の疾病の患者からの腫瘍は、未分化性細胞の結節状部分に富んだストロマ でありた。この腫瘍は、サデン法分析によってＮ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子の１つのコ ピーを含むことが示された（　Ｓｅ５ｇ＠ｒなど、（１９８５）、前記〕。段階 ■疾病を有する患者からの腫瘍は、周囲の血管及びストロマ成分を有する未分化 性神経芽腫から主に成りた。それは、Ｎ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子の２００個のコピー を含むことが示された（Ｉｄ、）。

前述の発明°は、明確に理解するために、例によっていくらか詳しく記載された けれども、請求の範囲内でいくらかの変更及び修飾を行なうことができることは 明確であろう。

特表平１−５０１５１８（１０） 符表平１−５０１５１８　（１１） ＦＩＧ、−２゜ 国際調香ｔｌＩ４失 −輸ｎ−−哨−Ａ−＋ａｃａａｉｗｍ、　ＰＣｒ１０ｓ８フ１０１０４６１ｍＮ −ＲａｌＡｔ１０１Ｏ４６１，ｐ−／６ｇＱ７／ＱｌＱ４ｇ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子の少なくとも一部を、培養された細胞中に発現するこ とによって産生されたポリペプチド。
2. ２．前記ヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子の一部がＮ−ｍｙｃタンパク質のカルボキシル端 でのアミノ酸に対応する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
3. ３．少なくとも６個のアミノ酸（但し、Ｎ−ｍｙｃタンパク質のすべてのアミノ 酸よりも少ない）を含んで成る抗原性又はハプテンポリペプチド。
4. ４．下記のもの： （Ｉ）【配列があります】； （ＩＩ）【配列があります】； （ＩＩＩ）【配列があります】； （ＩＶ）【配列があります】； （Ｖ）【配列があります】；及び （ＶＩ）【配列があります】 から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第３項記載のポリペ プチド。
5. ５．請求の範囲第３項記載のポリペプチドに対して引き起こされた抗体。
6. ６．ヒトＮ−ｍｙｃタンパク質に対して特異的た抗体。
7. ７．ヒトＮ−ｍｙｃタンパク質においてエピトープ部位を表わし、そして下記の 配列： 【配列があります】 に見出される少なくとも６個の隣接するアミノ酸を有するポリペプチド。
8. ８．生物学的検体におけるヒトＮ−ｍｙｃタンパク質を検出することを含んで成 る、腫瘍性転換を診断するための方法。
9. ９．前記Ｎ−ｍｙｃタンパク質が、抗−Ｎ−ｍｙｃ抗体に対して細胞を暴露する ことによって検出される請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．細胞サンプル中におけるヒトＮ−ｍｙｃタンパク質の存在を免疫学的に検 出することを含んで成る、神経芽腫細胞、網膜芽腫細胞及び小細胞肺癌細胞を同 定するための方法。
11. １１．前記細胞サンプルを、神経細胞、網膜細胞、及び小肺細胞（神経内分泌由 来の）から成る群から選択する請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．異種プロモーターの転写制御下でＮ−ｍｙｃ抗原性を示すポリペプチドを コードする構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子。
13. １３．原核宿主によって認識される複製の起点をさらに含む請求の範囲第１２項 記載の組換えＤＮＡ分子。
14. １４．実質的に純粋なＮ−ｍｙｃタンパク質及びそのフラグメント。
15. １５．約６０〜６５ＫＤの範囲での分子量を有する請求の範囲第１４項記載のタ ンパク質。
16. １６．請求の範囲第１４項記載のリン酸化されたタンパク質。
17. １７．ヒトＮ−ｍｙｃタンパク質の少なくとも１つのエピトープと反応性である そのフラグメントの抗体を患者に投与することを含んで成る、腫瘍性疾病を治療 するための方法。
18. １８．前記抗体が毒素に接合されている請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記抗体が接合されていない請求の範囲第１７項記載の方法。