JPH02501828A - プローブ - Google Patents

プローブ

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JPH02501828A
JPH02501828A JP63500878A JP50087888A JPH02501828A JP H02501828 A JPH02501828 A JP H02501828A JP 63500878 A JP63500878 A JP 63500878A JP 50087888 A JP50087888 A JP 50087888A JP H02501828 A JPH02501828 A JP H02501828A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プローブ 本発明は、ヒト乳房上皮細胞により発現されるムチン糖タンパク質をエンコード する遺伝子中の直列に反復するヌクレオチド配列を検出するDNAプローブ、診 断および個体の「フィンガープリンティング(fingerprinting) Jにおけるプローブの使用、対応するムチン遺伝子により発現されるポリペプチ ド、前記ポリペプチドに対する抗体、および癌の診断および治療的処置における ポリペプチドおよび抗体の使用に関する。
正常および悪性のヒト乳房上皮細胞は高分子量の糖タンパク質(gpS)を発現 し、前記糖タンパク質は光度にグリコシフ化されており、そして非常に抗原性で ある。その結果、ヒト乳癌および他の癌との反応性について選択されるモノクロ ーナル抗体(MAbs)は、完全に分化したヒト乳房組織により豊富の産生され かつ乳脂肪小球(MFG)および乳中に見いだされる分子と反応することが発見 された。しかしながら、特定の抗原決定基の発現のレベルは、正常の分化した細 胞により産生されるgpsおよび乳癌により産生される同様な分子において異な ることがある。これは、ある抗体が腫瘍gpsとの反応についである種の特異性 を示しうろことを意味する。
これらの抗体により認識されるエピトープを有する分子は、複雑であり、そして 分析が困難であり、なぜなら、それらは大きくかつ高度にグリコシフ化されてお り(>250.000ダルトン)およびまた発現の複雑なパターをもつからであ る。MAbsの2つHMFG−1および−2は400.000ダルトンより大き いと思われるヒト乳中の成分と反応し、これに対して血清台よび腫瘍中に見いだ される分子はより小さいが、主要な成分はないイムノブロッティングで200, 000ダルトンより大きい。ヒト乳牛にまたは乳脂肪小球中に見いだされる分化 しt;乳房上皮細胞により産生される大きい糖タンパク質は、精製され、そして ムチンの特性のいくつかをもつことが示された。この成分は糖のN−アセチルガ ラクトスアミンを経てセリンおよびスレオニンの残基へ〇−結合において接合し た大量の炭水化物を含有する。そのうえ、コアタンパク質は高いレベルのセリン 、スレオニンおよびプロリン、および低いレベルの芳香族およびイオウ含有アミ ノ酸を含有する。
これらのムチン様糖タンパク質は、まt;、多数の他の正常上皮細胞により分泌 される。モノクローナル抗体HMFG−1は乳ムチンと高度に反応性であり、そ して証拠はこの抗体により認識されるエピトープは完全に処理されI;ムチン上 でより豊富に存在することを示唆し、これは正常の分化の特性である。
腫瘍において、これらの抗原決定基を有する分子の分子量は個々の腫瘍の間で異 なり、そして、HMFG−2により認識される成分の場合において、80〜40 0にダルトンの範囲であることがある。高分子量の移動度において観測される差 は遺伝子の多形性のためでであると思われるが、この可能性はより低いバンドの 大きさの変動性を説明しない。これらは多分グリコシフ化通路内の腫瘍細胞にお いて起こる異常な処理の結果でありうることが示唆された。
この群の分子と反応するモノクローナル抗体の大部分について、抗原性エビドー グの正確な性質は不明瞭のままであるが、周囲の証拠は炭水化物が少なくとも部 分的にエピトープの多くの中に含まれ得ることを示唆した。そのうえ、従来入手 可能なデータがら、ムチンが正常の分化した細胞中に見いだされかつ腫瘍中に観 測されるムチンが同一のコアタンパク質を含有するか、あるいはちょうど共通の 炭水化物の決定基を有すると゛うか知られていなかっt二。
ムチンは、今回、ヒト乳から、コアタンパク質および前記タンパク質をエンコー ドする遺伝子の同定を可能とする親和クロマトグラフィーにより分離されt;。
これは落花生床ムチン(PUM)位置により規定される高度に多形性の遺伝子で あることが発見されl;[参照、Swall。
w et a+0、Disease Markers%4s 247、(198 6)およびNature、32ヱ、82−84 (1987)]、遺伝子産生物 、これを以後ヒト多形性上皮ムチンまたはHPEMと呼ぶ、が乳癌および他の癌 ならびにある正常上皮組織において検出された。
今回、HPEMコアタンパク質は、腺癌細胞により産生される異常に処理された gpsにおいて、また、見いだされるエピトープを有することが発見されt;。
これらのエピトープのあるものは、乳汁を出す乳腺により産生される、完全に処 理されたムチン糖タンパク質において発現されなかつt二。
1つの面において、したがって、本発明は、ヒトムチンコアタンパク質に対する 抗体を提供し、この抗体は完全に処理されたヒトムチン糖タンパク質と実質的に 反応しない。
ここで使用するとき、用語「抗体」は、抗原結合部位、例えば、F(abo)、 断片を有する抗体の断片を包含することを意図する。
本発明による抗体は、ことに結腸、肺、卵巣および特定の乳癌により発現される 、HPEMコアタンパク質と反応するが、対応する完全に処理されたHPEMと の反応性が減少しているか、あるいはそれと反応しない。特定の面において、抗 体はHPEMコアタンパク質と反応するが、正常の乳汁を出すヒト乳腺により産 生されるような完全に処理されたHPEM糖タンパク質と反応しない。
本発明による抗体は、妊娠のまたは乳汁を出す乳房上皮組織により産生されるム チン糖タンパク質と有意に反応しないが、乳房上皮腺癌細胞により発現されるム チンタンパク質と反応する。これらの抗体は、良性の乳癌と非常に減少しI;反 応性を示し、したがって乳癌の診断および局在においてならびに治療法において 有用である。
抗体は他の目的、例えば、細胞培養物をヒト乳房上皮ムチン遺伝子のポリペプチ ド発現産生物、またはその断片、とくに発生期の発現産生物についてのスクリー ニングに使用することができる。この場合において、抗体は便利にはポリクロー ナル抗体またはモノクローナル抗体であろう。
本発明による抗体は、適当な動物にHPEMコアタンパク質またはその断片、例 えば、後述するペプチドを接種することによって産生ずることができる。モノク ローナル抗体はコーラ−およびミルスティン方法(Narue 256.495  497/1975)により、ムチンコアタンパク質またはその断片を接種しt ;動物からの肺細胞を不滅化することによって、通常接種した動物と同一または 異なる種の不死の細胞系(好ましくは骨髄腫細胞系)との融合により、次いで適 当なりローニングおよびスクリーニング工程により産生される。
特定の面において、本発明はHPEMコアタンパク質に対するモノクローナル抗 体、5M3と表示する、を提供する。他の面において、本発明は抗体SM3を分 泌しそしてH3M3と表示した、ハイブリドーマ細胞系を提供する。HS M  3の試料はECACCに1987年1月7日に受託誉号87010701で受託 された。
本発明の抗体を使用すると、ヒト乳癌細胞系から分離したm RN Aから構成 したファージのライブラリーをスクリーニングして、ムチンコアタンパク質の遺 伝情報を指定する配列を同定することができt;。相補的DNA配列は構成しそ して、これらから、驚くべきことには、コアタンパク質をエンコードする遺伝子 は60塩基の配列の多数の直列の反復を含有することが発見され、これらは反復 配列に対応するcDNA断片がDNAのフィンガープリンティングに有用である ように十分に広範な、かなりの多形性に導く。こうして可能となったフィンガー プリンティングは、例えば、移植後の骨髄の増殖が宿主または供与体からのもの であるかどうかの確認において、および法医学において体の組織または体液を使 用して個体を同定するために使用することができる。
したがって、本発明は、また、少なくとも17ヌクレオチド塩基がらなり、 a)DNA配列 5′本 ACCGTG GGCTGG GGG GGCGGT GGA GCCCGC, −ACCGTG GGCTGG GGG GGCGGT GGA GCCCGG −b)a)のDNAに対して相補的なりNA、すなわち、配列GTCACCTC G GCCCCG GACACCAGG CCG GCC−CCG GGCTC CACCGCCCCCCCA GCCCACGGT−GTCACCTCG GC CCGG GACACCAGG CCG GCC−*3′ CCG GGCTCCACCGCCCCCCCA CCCCACGGTのDNA 。
c)a)のDNA配列に対応する配列を有するRNA、およびd)b)のDNA 配列に対応する配列を有するRNA。
の少なくとも1つと交雑可能である核酸断片を提供する。
(a)および(b)における配列の各々は、120塩基の二重の直列反復配列を 包含する。本発明の断片は、反復の出発点を架橋する部分を含むこの配列の部分 に対応するすることができる。
本発明による断片は、低い厳格の条件下に、上のDNAおよびRNA配列(a) 〜(d)と交雑するであろう。好ましい断片は、高い厳格の条件下に、また、交 雑するものである。本発明の最も好ましい断片は、上の配列(a)〜(d)に正 確に同一であるか、あるいはそれらに対して正確に相補的であるものである。
通常、本発明による所定のDNAまたはRNAは、上のa)によるDNAおよび C)によるRNAの両者と、あるいはb)によるDNAおよびd)によるRNA の両者と交雑することができるであろう。
好ましくは、本発明による核酸断片は、上のa)〜d)の少なくとも1つと交雑 することができる少なくとも30のヌクレオチド塩基の部分、より好ましくは少 なくとも50のこのような塩基からなり、そして最も好ましくは断片は上のa) 、b)、c)またはd)の反復配列の1つに対して正確に相補的な60塩基の配 列を含有する。本発明の他の断片は、必要に応じて構成により小さい変動をもつ 、このような配列の2またはそれ以上の反復からなることができる。好ましくは 、このよう4な断片は整数のこのような反復配列を包含する。本発明の他の断片 は、直列反復配列および、HPEM遺伝子またはその一部分に対応する解読また は非解読5′および/または3′フランキング配列からなる。
直列反復配列の存在が最初に同定されたとき、配列は「*」で示す塩基の欠如を 除外して、上の(a)および(b)に示す配列に対応する59塩基対から成ると 信じられた。
英国特許出願第8700269号に最初に定義されたように本発明の多くの断片 は、また、ここに記載する断片の新しい定義と一致し、そして「*」でしるした 塩基を含まない上の(a)、(b)、(c)または(d)に定義する配列の断片 は、本発明の特定の面を形成する。このような断片は少なくとも次の配列の一部 分に対応する配列を有する:a’ ) GTG GにCTC;G GGG GG CC,GT GGA GCCa #) CGG GGCCGG CCT GGT  GTCCGG GGCCGA GGT GACACb’ ) a’ )まt; はa”)の配列に対して相補的なりNA。
C”)、’ )またはa″)の配列に対応する配列を有するRNA、および d’ )b’ )の相補的DNA配列の1つに対応する配列を有するRNA。
ヒトゲノムにおいて、DNA直列反復配列は、逆平行の二本鎖DNAからなり、 1つに鎖は配列(a)を有し、そして配列(b)を有する鎖と対をなしている。
前述したように、本発明の核酸断片は、ヒトゲノムにおけるDNA直列反復配列 の一方または他方の鎖、あるいはいずれかから転写されたRNAを検出するため の、それゆえヒトムチンコアタンパク質の1または2以上の遺伝子、それから転 写されたmRNAおよび相補的DNAおよびRNAを同定するための、プローブ として使用することができる。このような目的で、少なくとも1つ直列反復配列 、まI;はそれから転写されたmRNAからなる完全な正常遺伝子を使用するこ と、あるいは非相補的断片を本発明による断片の5′および3′末端のいずれか または双方に取り付けることおよび/または検出可能な標識(例えば、放射性同 位元素、蛍光性または酵簀の標識)をプローブに取り付けること、あるいはプロ ーブを固体の支持体に結合することは便利であることがある。
これらのすべては便利な方法により達成することができ、そして本発明の核酸断 片は普通の核酸合成技術により新たに生成することができる。
本発明の核酸断片は、また、活性免疫化技術において使用することができる。こ のような方法において、断片はムチンコアタンパク質の一部分と実質的に同一の ポリペプチド鎖の遺伝情報を指定し、そして調節およびプロモーター配列、マー カー配列およびきり継ぎまたは結合部位を包含する他の解読または非解読核酸配 列で5″および3′末端のいずれかまたは双方において伸長することができる。
解読配列はムチンコアタンパク質鎖の対応する部分または他のポリペプチド鎖の 遺伝情報を指定することができる。本発明による断片は、必要なまたは所望のフ ランキング配列と一緒に、適当なオープンリーディングフレームのレジスターに おいて、適当なベクター、例えば、プラスミドまたはウィルスゲノム(例えば、 ツクシニアウイルスゲノム)中に挿入し、次いで普通の技術によりポリペプチド 産生物として発現される。1つの面において、ポリペプチド産生物をベクターで 形質転換した適当な細胞を培養し、収穫し、そして免疫原として使用してムチン コアタンパク質に対する活性免疫を誘導することができる。他の面において、と くにウィルスの形態の、ベクターは、免疫化すべきヒトまたは動物中に直接接種 することができる。
次いで、ベクターは生体内のポリペプチドの発現を指令し、そしてこれは順次に 免疫原として働いてムチンコアタンパク質に対する活性免疫を誘導する。
したがって、本発明は、外科または治療によりヒトまたは動物を処置する方法に おいて、およびヒトまたは動物の体に実施する診断法において使用するための、 上に定義した核酸断片を提供する。本発明は、また、外科または治療によりヒト または動物を処置するこのような方法および生体内ならびに生体外および試験管 内で実施する診断法を提供する。
本発明は、さらに、DNA直列反復配列によりエンコードされるl系列の残基か らなるポリペプチドを提供し、上の(b)に示した配列は解読配列である。本発 明によるポリペプチドは、配列Val Thr Ser Ala Pro As p Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser ThrAla  Pro Pro Ala His G1y*Val Thr Ser Ala  Pro Asp Thr ArgPro Ala Pro Gly Ser  Thr Ala Pro Pro Ala )Iis Gly(「*」はペプチ ドの反復の開始を示す)に相当する配列中の5まt;はそれより多いアミノ酸残 基を有するものから選択される。
本発明によるポリペプチドは、40の上の残基配列の部分に対応する配列を有す ることができ、そして反復配列の開始点を含むことができる。
本発明による他のポリペプチドは、20アミノ酸反復配列の3またはそれ以上の 反復を含む。このようなポリペプチドは個々のアミノ酸残基の置換による小さい 変動を含むことができる。
本発明は、さらに、セリンおよび/またはスレオニン残基上のN−アセチルガラ クトサミン(結合糖)の付加により、およびオリゴ糖部分のそれへのまたは他の 連結糖および/または担体タンパク質、例えば、キーホールリンベットのへモジ アニン(keyhole limpethemocyanin)、アルジミンま たは甲状腺グロブリンへ結合しI;断片を経る付加により、修飾されt;上に定 義したポリペプチドを提供する。
好ましくは、ポリペプチドは上の配列の少なくともlOのアミノ酸残基、より好 ましくは20残基からなる。ポリペプチドは、上の完全な配列からなることがで きる。このようなポリペプチドは、さらに、追加のアミノ酸残基、好ましくはH PEMコアタンパク質のアミノ酸配列に一致する残基からなるすることができる 。
他の面において、本発明はHPEMコアタンパク質を提供する。これはPUM遺 伝子によりエンコードされ、そして組み換えDNA技術により産生され、そして ヒトまたはヒト以外の細胞中でグリコシフ化なしで発現させることができる。あ るいは、それは炭水化物を自然ヒトムチン糖タンパク質からストリッピングする ことによって得ることができ、前記ヒトムチン糖タンパク質は、それ自体、ヒト 組織または体液からの分離により、あるいはヒト細胞系中の発現および完全な処 理により産生することができる。HPEMコアタンパク質は、受動免疫化、診断 試験および腫瘍の局在において、およびヒトの活性免疫化において使用するため に動物中で抗体をレイズするt;めに使用することができる。
本発明は、さらに、前述のペプチドに対する抗体(モノクローナルまたはポリク ローナル)、およびそれらの断片を提供する。このような抗体は、普通の方法に より得ることができ、そして診断および治療の用途において有用である。
本発明は、さらに、治療学的または診断学的に有効な配位子に結合しI;、抗体 (モノクローナルまたはポリクローナル)、およびそれらの断片を提供する。抗 体の治療の使用のため、配位子は癌の乳房または他の組織に投与されて形質転換 された細胞を無能化または殺す致死因子である。致死因子は毒素、放射性同位元 素および「直接に殺す因子」、例えば、補体の成分ならびに細胞障害性または他 の薬物を包含する。抗体の他の治療の用途は受動免疫化を包含する。
本発明は、さらに、有効無毒量のこのような抗体またはその断片を投与すること からなる治療法、およびヒトまたは動物の体の治療的処置において使用するため の抗体またはその断片を提供する。ことに治療の用途において、処置すべき種か ら誘導した抗体のFc領域にそのFc領域を結合することによって抗体を修飾す る(例えば、マウスモノクローナル抗体のFc領域をヒトFc領域とともに投与 してヒト患者による免疫応答を回避する)か、あるいは抗体のアイソタイプを変 更することが考えられる。
診断の分野において、抗体は配位子、例えば、固体の支持体および検出可能な標 識、例えば、酵素の標識、発色体および蛍光体ならびに放射性同位元素および他 の直接または間接的に検出可能な標識に結合することができる。好ましくは、モ ノクローナル抗体またはその断片は診断において使用する。
本発明は、さらに、異常なヒトムチン糖タンパク質を含有することが疑われる試 料を、上に定義した抗体と接触することからなる、診断アッセイ法を提供する。
このような方法は、患者に、検出可能な標識を有する抗体またはその断片を投与 するか、あるいは抗体またはその断片および、抗体またはその断片に選択的に結 合できる標識の実在物を別に同時にあるいは順次に投与することを包含する、腫 瘍の局在を包含する。本発明は、また、ヒトまたは動物の体に実施する診断法に おいて使用する抗体またはその断片を提供する。
抗体の特定の使用は、乳房、卵巣および肺の癌を検出および/またはアッセイす るための診断アッセイを包含する。
抗体またはその断片、必要に応じて適当な標識および他の試薬および、ことに競 合的アッセイに使用するためい、標準の血清、からなる、診断アッセイにおける 使用するための、診断試験キットが提供される。
本発明を次の実施例により、そして添付図面を参照しながら説明する。
よる乳ムチンの精製。いくつかの個体からの乳を一緒にし、そして方法に記載す るようにHMFG−1−セファローズ(Sepharose)カラムに吸着させ た。低いpHで溶離する質をヨウ素化し、そしてPAGE電気泳動およびオート ラジオグラフィーにかけた(トラックl)。
ヨウ素化物質をプロティンA法により抗体HMFG−1()ラック5)、HMF G−2(トラック2)、5T254 (トラック3)およびRPMI;20%F C3()ラック4)で沈澱させた。
M211ffl:”I標識精製乳ムチンとヒトスキムミルクのイムノブロッティ ングとの比較。A1 ヒトスキムミルクをSDSポリアクリルアミドの電気泳動 にかけニトロセルロース紙に移し、プロットをモノクローナル抗体HMFG−1 とプロービングし、そして結合をELISA法で検出した。B、HMFG−1親 和性カラムで精製し、次いでG75セファデックス(S e p h a d  e x)クロマトグラフィー後、乳ムチンをポルトンおよびハンター法によりヨ ウ素化し、モしてSDSポリアクリルアミドの電気泳動およびオートラジオグラ フィーにかけた。
箪3[!U :フッ化水素の処理後のヨウ素化乳ムチンのオートラジオグラフィ ー。精製した乳ムチンをHFで室温において3時間(トラックl)または4℃に おいて1時間(トラック2)処理し、次いで得られる調製物をヨウ素化し、モし てSDSポリアクリルアミドゲルで展開した。
*411ffl:完全な、部分的にストリッピングまたは高度にストリッピング した乳ムチンのヨウ素化レクチンとの反応性。精製しI;完全な乳ムチン(トラ ックl)、HFで4℃において1時間処理したムチン(トラック2)および室温 において3時間処理したムチン(トラック3) をSDSポリアクリルアミドの 電気泳動にかけ、次いでニトロセルロース紙に移した。次いで、ニトロセルロー ス紙を”’I PNA(ビーナツツ凝集素)、1251(小麦の麦芽の凝集素) 、または12J [ヘリックス・ボマチア(Helix pomatia)凝集 素]でプロービングした。
!呈客:部分的におよび高度にストリッピングしたムチンの免疫沈澱お゛ よび イムノブロッティング。A、”!高度にストリッピングムチンを5M−3(1− ラック3) 、HMFG−2()ラック2)または対照としてNs2培地(トラ ックl)でプロティンAプレイド法により免疫沈澱させた(参照、材料および方 法)。B1部分的にストリッピングしたムチン(トラックl)または高度にスト リッピングしたムチン(トラック2)をSDSポリアクリルアミドゲルで展開し 、そしてニトロセルロース紙に移した。次いで、プロットを5M−3および5M −4モノクローナル抗体のカクテルと反応させ、そして結合をEL I SA法 で検出した。
第6図:モノクローナル抗体5M−3およびHMFG−2とメタカルン(met hacarn)固定乳房組織および腫瘍切片との、間接イムノペルオキシダーゼ 着色法による反応性。浸潤する管の癌は5M−3(A)およびHMFG−2(B )の両者よ強い反応性を示す。線維腺癌は5M−3(C)との反応性を示さず、 モしてHMFG−2(D)による上皮の強い不均質の着色を示す。乳頭腫は5M −3(E)と非常に弱い反応 。
性およびHMFG−2(F)強い陽性を示す。正常乳房(G)および乳汁を出す 乳房(I)の両者は、5M−3で着色したとき陰性であったが、両者の組織はH MFG−2で陽性に着色し、乳汁を出す乳房(J)は正常乳房(H)より非常に 強い。
着色した乳ムチン。乳ムチンをHMFG−1抗体親和性カラムで精製しくレーン l)、次いでG75セファデックスカラムに通過させ(レーン2) 、NaDo soa/ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、そして銀着色し、次いでゲ ルを0.2%の過ヨウ素酸で処理した。
寒旦図 ムチンから部分的におよび完全にストリッピングしたコアタンパク質の 銀着色。精製した乳ムチンを無水フッ化水素で0°Cにおいて1時間(レーンl )および室温において3時間(レーン2)処理し、NaDosOa/ポリアクリ ルアミドゲル(105)で電気泳動し、そして銀着色した。
り質生成物のMAbsによる免疫沈澱。MCF−7からのpoly(A)”RN Aを網状赤血球リゼイト系中で[31s] メチオニンcioooci / ミ リモル; IC1−37GBq)の存在下に製造業者の条件下に翻訳した。5X 10’酸沈澱可能なcpmを含有する試料をMAbsSM−4(レーンa)、5 M−3(レーンb) 、HMFG−2(レーン)、HMFG−1(レーンd)お よびインターフェロンに対する無関係のMAb(レーンe、24)で沈澱させ、 N a D o S Oa/ポリアクリルアミドゲル(10%)で分離し、アム プリファイ(Amp l i f y)で含浸し、モしてXAR−5フイルムに 一70°Cにおいて20日間露出した。
第10図 λmucクローンからの融合タンパク質のイムノブロッティング分析 。ファージのクローンλMUC3,4,6,7,8,9およびlOを使用して、 バクテリア菌株Y1089を溶原化した。溶原体を32°Cにおいて増殖させ、 42°Cにシフトし、次いでIPTGで誘導した。
溶原タンパク質を電気泳動によりNaDoSO4/ポリアクリルアミドゲル(7 ,5%)で分画し、ニトロセルロース紙に移し、モしてHMFc−2と反応させ た。結合をELISA法で4−クロロ−1−ナフトールを基質として使用して検 出した。数はλのクローンの数である。
第11図 pMUCクローンのcDNAインサートへのpMUclOの交雑。プ ラスミドのクローンからのDNAを制限酵素EcoRIで消化してcDNAを切 除し、1.4%のアガロースの電気泳動により分離し、ビオシン(Biodyn e)ナイロン膜に移した。フィルターを標準の条件下に(34)にpMUclo からのインサートに交雑し、これは[a−”PI dcTPでランダムプライミ ングの方法(41)により標識した。レーン:3.4.6.7.8.9、lO0 第12図 乳房ムチンmRNAのRNAプロット交雑分析。ヒト乳房癌細胞MC F−7からの102gの合計のRNA (レーン2)、正常ヒト乳房上皮細胞H uME(レーン3)、ヒト胚線維芽ICRF23 (レーン4)、ダウジ(Da udi)細胞(レーン5)および癌肉腫H3578T細胞(レーン6)を13% のアガロース/グリオキサールゲルで分離し、ニトロセルロース上ヘブロッティ ングし、そしてpMUCIOEcoRIインサートに交雑し、これをランダムプ ライミングの方法(41)により[σ−”Pl clcTPで標識した。大きさ マーカーは283 (5,4kb)および18s (2,1kb)rRNAであ った。
第13図 pMUCI Oプローブとの交雑により検出された多形性ヒ1−DN A断片。ゲノムDNA試料をlOの個体(6人無関係)からの全血細胞から調製 し、そしてこれらの細胞系をH4nflおよびEcoRIで消化し、0.7%お よび0.6%のアガロースの電気泳動により分画し、モしてビオシンナイロン膜 に移した。フィルターをpMUCI 0DNAインサートに交雑し、これをラン ダムプライミングの方法(41)により [σ−”PI cl’cTPで標識し た。X線フィルムを一70℃において強化スクリーンを通して露出した。レーン 1〜4はより速く、2つは娘および母、レーン5〜lO無関係の個体、レーン1 1はMCF−7であり、レーン12はICRF−23である。DNAの試料は大 きさの広い分布を示す。数はDNAの長さくk b)を示す。23Kbにおける 親のバンドはレーン12に存在し、モして13はオートラジオグラフィーにおい て導入した人工物である。
乳ムチンの精製 乳ムチンをヒトスキムミルクからHMFG l親和性カラムの通過、次いで大き さ排除クロマトグラフィーにより精製した。HMFG−1モノクローナル抗体を 組織培養上澄み液からプロティンAカラム(1)により精製した。精製した抗体 を、製造業者の指示従い臭化シアン活性化t−770−ス(Ph a rma  c i a)に結合した。ヒトスキムミルクを100mQのバッチで抗体カラム に通過させ、次いでPBSでよく洗浄した。結合した抗原をカラムから0.1モ ルのグリシンpH2,5で溶離し、280nmにおける光学密度を記載する分画 をプールし、0.25モルの酢酸に対して透析し、そして凍結乾燥した。約20 mgのバッチを0.25モルの酢酸に溶解し、モしてG75セファデックスカラ ム(lX100cm)(これは前置て酢酸で平衡化してあった)に通過させた。
このカラム0.25モルの酢酸で洗浄し、そして1m(2の分画を集めた。空隙 体積から溶離されI;ビーク分画をプールし、凍結乾燥し、そして乾燥粉末を4 °Cにおいて貯蔵した。アミノ酸分析をベックマン(Beckman)6530 0アミノ酸分析器で実施した。
乳ムチンの脱グリコシク化 乳ムチンから〇−結合炭水化物を除去するため、分子をモートおよびランパート に記載されているように無水フッ化水素で、4°Cにおいて1時間(これは部分 的にストリッピングされた調製物を生成する)または室温において3時間(これ は高度にストリッピングされたムチンを生成する)処理した。
乳ムチンのヨウ素化 精製したムチン、部分的にまたは高度にストリッピングしたムチンのヨウ素化は 、ポルトンおよびハンター(51)の方法により実施した。
簡単に述べると、20μgの0.1モルのホウ酸塩緩衝液pH8,5中の2.5 μgのムチンを乾燥したポルトンおよびハンター試薬(1mC4%Amersh am Internat 1onal plc)に添加し、そして室温において 15分間インキュベーションした。この反応をホウ酸塩緩衝液中で0.5m4の 0.2モルのグリシンの添加により停止し、15分間のインキュベーション後、 遊離のポルトンおよびハンター試薬をG25セフアデツクスカラム(PDIOカ ラム、Pharmacia](前置てPBS中で平衡化しである)に通過させて 除去した。
レクチンのヨウ素化 小麦の麦芽の凝集素(WGA)、ビーナツツ凝集素(PNA)(Vector  Labs)およびヘリックス・ボマチア(Helix p。
matia)凝集素(HPA)(Boehringer)をカルッソンら(52 )に記載されているようにクロラミンT法によりヨウ素化した。
に記載しt;ように(1)実施した。簡単に述べると、試料を5〜15%のポリ アクリルアミドゲルで展開し、次いで電気泳動的にニトロセルロース紙(Sch leicher and 5chuell)に50ボルトで4℃において一夜移 しt;。イムノブロッティング実験において、ニトロセルロース紙をモノクロー ナル抗体と反応させ、そして結合をELISA法で基質として4−クロロ−1− ナフトールを使用して検出した。
レクチンの結合の研究のため、ウェスタン・プロットをスワロ−ら(48)に記 載されているようにヨウ素化レクチンと反応させた。
モノクローナル抗体の産生 分的にストリッピングした乳ムチンで免疫化し、3月後さらに70インド完全ア ジユバント中の5μgの同一の調製物で促進した。さらに20日後、5μgのそ の炭水化物を高度にストリッピングしI;ムチンを生理的塩類溶液中で静脈内投 与した。肺臓を4日後に取り出し、モしてNS2マウス骨髄腫細胞系と融合しく 53)。
ハイブリドーマの上澄み液のスクリーニングおよび免疫沈澱スクリーニングアッ セイは、メレロおよびゴンザレズーロドリグエウズ(54)に記載されている方 法の修正法であった。マルチウェルプレートを5071120)PBS中のO, 1mg/m+2のプロティンA(Pharmacia Fine Chemic als)で被覆し、そして37℃において一夜乾燥した。プレートを5%のウシ 血清アルブミンで37℃において1時間遮断し、次いで50μQのウサギ抗マウ ス免疫グロブリン(DAKO1PBS/BSA−PBS/BSA中で1=lOに 希釈した)。37°Cにおいて2時間インキュベーションした後、プレートを1 %のBSAを含有するPBSで2回洗浄し、そして50μgのハイブリドーマ上 澄み液を添加した。プレートを一夜4°Cにおいてインキュベーションし、2回 PBS/BSAで洗浄し、そして100.OOOcpmを含有する50pQのヨ ウ素化部分的ストリッピングムチンをウェルの各々に添加した。次いで、プレー トを室温にむいて4時間インキュベーションし、4回P B S/B S Aで 洗浄し、そして個々のウェルをガンマカウンターで計数した。免疫沈澱のため、 ジチオスレイトールを含有する50μgのSDS試料緩衝液をウェルの各々に添 加し、次いで3分間沸騰させ、そして緩衝液を5〜15%のポリアクリルアミド の勾配ゲル上へ適用した。
組織の切片の着色 一次乳癌、良性の乳房バイオプシー、正常乳房、および悪性の乳汁を出す乳房組 織からの組織をメタカルン(metacarn)(メタノール、クロロホルムお よび酢酸60:30:10)中で固定し、そしてパラフィンワックス中に埋め込 んだ。切片を、前に記載しI;ように、間接ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダー ゼ法(47)を使用して抗体で着色しtこ。
乳ムチンをヒトスキムミルクからHMFG−1抗体親和性カラムで精製した。溶 離した物質のヨウ素化は、大きい分子量の成分および68KDのバンドの存在を 明らかにした。親和性精製した物質を抗体HMF G−1およびHMFG−2( )ラック2および5)で沈澱させ、次いでゲル電気泳動にかけると、高分子量の 成分および68KDの成分の両者は両者の抗体(HMFG−2より有効性が劣る )により沈澱した。68KDの成分は、また、2つの無関係の抗体(第1図、ト ラック3および4)により沈澱し、そしてこの成分はHMFG−1と反応した精 製した物質のイムノブロッティングで明らかにされなかったので、68にの成分 はモレキュラーシーブのG75カラムのクロマトグラフィーにより除去した。最 後の精製した生成物は高分子量のバンドを示し、はんの微量の68KDのカラム および少量の14に付近の組み換え体を有した(第2B図)。
〇−結合の炭水化物の50%より多くを含有する高分子量のgpr(PAS−0 )を、シミズおよびイマウチ(8)によりヒト乳脂肪小球から精製した。この結 腸がHMFG−1親和性カラムの親和クロマトグラフィーにより乳から分離され たムチンに類似するかどうかを見るために、精製したHMFG−1反応性ムチン のアミノ酸組成を決定し、そして精製しfニー P A S −0成分のアミノ 酸組成と比較した。表1が示すように、2組のデータの間のすぐれた対応性が存 在し、PAS−0のコアタンパク質およびここで精製したムチンは同一であるこ とが示される。
乳ムチンのコアタンパク質の分離 〇−結合糖の除去に有効な容易に入手可能な酵素は存在せず、モしてβ排除はし ばしばコアタンパク質を損傷するので、オリゴ糖を無水フッ化水素でムチンを処 理することによって除去した。この処理は、モルトおよびランポート(21)に より、タンパク質のコアを損傷しないでブタ下顎ムチンからの糖の除去に有効で あることが示されている。乳ムチンのHF処理後生成しj;物質のアミノ酸分析 は、タンパク質のコアは、また、この場合損傷されないことを示唆した。なぜな ら、組成は完全な゛ ムチンにおいて見られるものと同一であったからである( 表1)。
最初に、乳ムチンをHFに4°Cにおいてわずかに1時間暴露したが、生成物の 分析はこのような処理により糖部分的に除去されたことを示し、モしてムチンを 室温において3時間処理して、レクチン結合能力を示さない骨髄腫細胞を得るこ とが必要であった。第3図は4℃において1時間(トラック2)または室温にお いて3時間(トラックl)処理後のヨウ素化生成物のオートラジオグラフィーを 示す。第3図から理解されるように、より穏やかな地理は完全なムチンより多少 小さい、高分子量の物質およびある数のより小さいバンドから構成された混合物 を生ずる。
室温においてHFにより長く暴露すると、高分子量のバンドは消失し、約68K Dおよび72KDのポリペプチドのバンドを生成する。
完全なムチンおよび異なるHF処理後に生成した生成物上の糖の存在について試 験するI;めに、調製物の各々をアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニトロ セルロース紙に移し、そしてIll 1標識レクチンと反応させた。使用したレ クチンは落花生レクチン(PNA)(N−アセチルガラクトサミンに結合したガ ラクトースと反応性である)、小麦の麦芽(WAA)(N−アセチルガラクトサ ミンと反応性である)およびヘリックス・ポマチア(He l ix poma  t i a)凝集素(HP A)(〇−結合グリコシルカにおける結合糖、N −アセチルガラクトサミン、と反応性である)であっI;。第4図は反応したプ ロットのオートラジオグラフィーを示し、そして明らかなように、4axc1時 間のHFによる処理(トラック2)はムチンのレクチン反応性を変更するが、炭 水化物はなお存在する。しかしながら、興味あることには、完全なムチン(トラ ックl)を使用して見られるより、部分的にストリッピングされたムチンの高分 子量物質へ、非常に低いレベルのPNAが結合する。そのうえ、このPNA結合 能力の損失は結合糖特異的レクチンHPAの結合を伴う。このレクチンは完全な ムチンへまったく結合せず、モしてHFで制限して処理した後のレクチンの結合 のパターンの変化は、〇−結合N−アセチルガラクトサミンをマスキングする糖 がストリッピングされt;ことを示す。完全なムチン(トラックl)および部分 的にストリッピングされた調製物(トラック2)の両者において見られる同様な 成分は、WGAと反応するが、PNAと反応しない糖タンパク質である。これは ムチンの親和クロマトグラフィー後に見られた同様な分子量(約68K)の成分 に対応させることができ、そして中間の前駆体分子を表しうる。
第4図が明瞭に示すように、HFの高度の処理(室温において3時間)後生成し た生成物は、N−アセチルガラクトサミン特異的レクチンHPAを包含する、レ クチンとの反応性を示さない(トラック3)。この観察は糖が少なくとも分子の 大部分から除去されているという強い証拠を構成し、そしてわれわれはこの調製 物を高度にストリッピングしたムチンと呼ぶ。
乳ムチンのコアタンパク質に対するモノクローナル抗体の発生部分的にストリッ ピングした乳ムチンで2回注射し、次いで高度にストリッピングしたムチンで促 進して免疫化したマウスの肺臓を使用して、融合を実施した。クローンを最初に 12′1部分的にストリッピングした物質に対して、プロティンAプレイド(参 照、方法)を使用してスクリーニングした。4つのハイブリドーマを選択し、そ してクローニングし、そして表2は完全な、部分的におよび高度にストリッピン グしたムチンとの反応性の、それらのスペクトルを示す。この表から理解できる ように、分離したハイブリドーマの3つは部分的におよび高度にストリッピング しI;ムチンとの強い反応性を示したが、完全なムチンと反応しなかった。これ らはタンパク質のコアに対するモノクローナル抗体のための優れた候補であると 思われ、そして2つ、すなわち、5M−3および5M−4をさらに特徴づけるた めに選択した。
また、表2から理解できるように、HMFG−1およびHMFG−2抗体はその 炭水化物をストリッピング除去したムチンと非常に強く反応しt;。これらの2 つの抗体は、事実、完全なムチン(乳脂肪小球から)を免疫原として使用して発 生させ、そして、HMFG−2の場合において、増殖する乳房上皮細胞を使用し た(14)。ストリッピングしたムチンとのそれらの反応は予測されなかった。
なぜなら、周囲の証拠は前景て炭水化物がそれらの抗原性エピトープの少なくと も一部分を形成するであろうという信念に導いたからである。
抗原決定基を有する分子の分子量 抗体5M−3はIgG1の亜属であることが示されたが、5M−4抗体は1gM であることが発見された。したがって、1gMクラスの抗体はある用途において 問題を表すことがあるので、5M−3抗体を引き続く実験において使用ために選 択した。5M−3で高度にストリッピングしI;物質は、レクチン非反応性68 に成分との反応性を示した(第5A図、トラック3)。モノクローナル抗体HM FG−2は、まt;、レクチン非反応性68に成分を免疫沈澱させることを理解 できる(トラック2)。抗体はイムノブロッティングで抗原と反応性であり、そ して第5B図は抗体5M−3と高度にストリッピングしI;ムチンの優勢の68 にバンドとの反応性を示す(トラック2)。
われわれは前に示したように、乳ムチン上に存在する決定基を有する乳癌細胞中 の成分の分子量は400により低く、そして腫瘍毎に変化し得る(1)。抗体5 M−3と乳癌細胞のゲル分離抽出物のウェスタン・プロットとの反応性は、この 抗体が抗体HMFG−2と反応性のものに類似する分子量の成分と反応すること を示す(データは示されていない)。抗体m3は抗体HMFG−1および2と異 なり、乳汁を出す乳腺により処理された完全なムチンと反応せず、しかも乳癌細 胞により処理された分子と反応し、5M−3とある範囲の乳癌との反応を検査す ることが考慮された。
5M−3と乳房組織および腫瘍との反応性抗体5M−3はパラフィン埋め込み組 織と、それらがメタカル(正式の生理的塩類溶液ではない)中で固定される場合 、反応した。組織の切片の調製にこの方法を使用して、抗体の反応を乳房組織お よび腫瘍へのHMFG−2のそれと、間接イムノペルオキシダーゼ着色法により 比較した。この分析は、5M−3の着色パターンとHMFG−2を使用して見ら れるそれとの間の劇的な差を示した。こうして、強い陽性の反応はSM=3で着 色した2 0/22乳癌(HMFG−2で着色した22/22に比較して)見ら れ、正常静止乳房、妊娠または乳汁を出す組織および最も良性の病変は大体5M −3で着色されなめじだが、HMFG−2で着色された。乳房組織および腫瘍の 着色パターンのいくつかの例は第6図に示されている。
22の一次癌および14の良性の病変を検査し、そして各場合において5M−3 の反応をHMFG−2による着色と比較した。−次癌において、5M−3による 着色は不均質であったが、一般に非常に強く、常に腫瘍細胞に限られていた;結 合組織および支質は反応を示さなかった(参照、第6A%B図)。検査した4つ の癌において、HMFG−2よる上皮の着色は強かったが、不均質であった。比 較して、5M−3の着色は1つの場合において陰性であり、そして3つの他の場 合において着色はただ1つの腺の要素に限られた。HMFG−2は研究した5つ の乳頭腫および嚢の病気の5つの場合について強い反応性を示し、これに対して 5M−3を使用して観測された着色は非常により弱くかつより不均質であった( 第6GSH図)。乳頭腫は1つの群として5M−3で最強の着色を示し、そして 着色は膜または細胞外であったことが理解できる。
乳汁を出す乳房および妊娠の乳房を強く着色するHMFG−1およびHMFG− 2と対照的に、5M−3は妊娠または乳汁を出す乳房の6つの場合のうち3つの 完全に陰性であった(参照、第60およびD図)。
2つの陽性の場合は、臨時の細胞の非常に弱い着色のみを示し、着色は1つの小 葉の2つの領域に限定された。再び、正常の静止の乳房のいくつかの末端管の小 葉単位と事実反応するHMFG−1およびHMFG−2と対照的に、5M−3は 試験した13の場合のうち8つに対して陰性であり、そして他の5つの場合にお いて、着色はきわめて弱くそしてしばしば組織切片の1または2つの腺房に限定 された(第6EおよびF図)。多分注意されるように、メタカルン中に固定した 正常乳房組織および良性の病変を使用して見られたHMFG−2による着色の強 度は、ホルマリン固定物質を使用して従来報告されたものより多少高かった(5 0.47)。
5M−3は、また、正常肝臓、肺、胸腺、汗腺、精巣上体、前立腺、膀胱、小腸 、大腸、垂、甲状腺および皮膚について陰性であることが示された。抗体は、腎 臓の温度管、胃の臨時の主要な細胞、唾液腺の臨時の導管細胞および皮脂性腺と のみ陽性の着色を示した。
配 大きい分子量のムチン分子は多くの癌により発現され、そしてモノクローナル抗 体により認識される腫瘍関連抗原決定基の多くを有する。これらのエピトープは 、また、ある正常上皮により発現され、そしてHMFG−1のようなあるモノク ローナル抗体は正常ヒト乳牛で見いだされるムチンととくによく反応する(1. 17)。ムチンの研究が定義されないエピトープと反応性の抗体を使用するそれ らの検出に限定されるかぎり、それらの構造、発現および処理の知識は、まI; 、制限されるであろう。われわれはコアタンパク質を分離し、そしてコアタンパ ク質の遺伝情報を指定する遺伝子のために部分的cDNAを選択することを可能 とする抗体を発生させることによって、乳房ムチンの構造および発現を研究し始 めた。この実施例は、これらの抗体の産生および特徴づけを記載する。
フッ化水素を使用するHMFG−1親和性精製した乳ムチンの処理は、約68に ダルトンの優勢なバンドおよび約72KDの小さい種をSDSアクリルアミドゲ ル上に出現させI;。これらのバンドは、〇−結合グリコシク化における第1糖 であるN−アセチルガラクトサミンに対して特異的であるヘソックス・ポマチア (Helix pomatia)凝集素を包含する、レクチンとの反応性を示さ なかった(55)。したがって、この68KDのポリペプチドはムチンのコアタ ンパク質を表すと思われる。これを支持する証拠は、ストリッピングした68に 成分と反応性である前述の抗体は、ムチンを発現する乳癌細胞から分離したmR NAの生体外翻訳産生物から、この大きさの分子を沈澱させることができるとい う観察から得られる。
乳ムチンは少なくとも50%の炭水化物を含有するので(16) 、完全な分子 が400KDより大きい観測される分子量を有する場合、68KDのみのタンパ ク質コアは小さすぎるように思われる。しかしながら、ムチンは小さいサブユニ ットから構成されることができ、これらのサブユニットは、なお理解されないが 、凝集し、そしである形態の非共有結合の成分により一緒に保持されている。例 えば、ヒツジ下顎ムチンの分子量はlXl0’ダルトンより大きいことが報告さ れた(45)が、それは58.300ダルトンの分子量のわずかに650アミノ 酸のタンパク質のコアを有する。
予期せざることには、乳ムチンと反応する抗体HMFG−1およびHMFG−2 は、また、レクチン結合能力を示さない、高度にストリッピングした物質と陽性 の反応を示すことが発見された。固定、沸騰および還元に対する抵抗、それらの エピトープの反復的性質、およびイムノブロッティング上のいくつかのバンドの 出現を包含する、従来の間接の証拠は、乳ムチン上の炭水化物の存在がこれらの エピトープにおいて含まれるという信念に導いた。この考えはレクチンがHMF G−1おおびHMFG−2の結合を遮断することができるという観測により強化 されt:(1)。レクチン結合の実験により検出されない、ある糖は、前述の高 度にストリッピングしたムチン上に止まるという可能性を排除することは不可能 であるが、これは抗体HMFG−1おおびHMFG−2の反応性を説明するもの と思われない。これは次の理由で言うことができる。
両者の抗体は、乳房ムチンのコアタンパク質の遺伝情報を指定するDNAを有す る7アージにより発現される、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質と積極的に 反応することが最近示されたからである。したがって、HMFG−18よびHM FG−2により認識されるエピトープの各々の少なくとも一部分はアミノ酸を含 有するように思われるが、コアタンパク質上のこれらのエピトープのあるものは 露出される、すなわち、完全にグリフシフ化された分子中にマスキングされない に違いない。しかしながら、HMFG−2エピトープはHMFG−1エピトープ より乳ムチン上で豊富ではないが、それは腫瘍により発現されるムチン分子上で 容易に検出可能である。これらの分子はより小さい分子量を有し、そしてそれほ ど高度にグリコシフ化されないか、あるいは重合しない。
ここで、ムチンのコアタンパク質および部分的にグリコシフ化した分子と反応性 であるが、乳汁を出す乳腺により産生ずる完全に処理されたムチンと反応性でな い、新しい抗体の開発をわれわれは報告した。これらの5M−3の1つ、これは IgG1である、をさらに詳しく研究した。
それは、乳癌細胞により産生され、そして完全な乳ムチンに対して発生させた多 くの抗体により認識される、ムチン分子と反応することが示された。しかしなが ら、コアタンパク質上に存在しかつ腫瘍細胞によりOrcするときムチンにおい て露出される5M−3により認識されるエピトープは、通常処理される乳ムチン 上に露出されないことを強調すべきである。この特徴は、増大した腫瘍の特異性 の可能性を与え、そして乳房の腫瘍および組織のパイロット免疫化学的研究は、 事実、5M−3抗体が、−次乳癌の大部分(91%)と強く反応するが、良性の 乳癌、静止または乳汁を出す乳房、およびほとんどの正常組織とほとんどあるい は全く反応しないことを示した。
′ 乳癌において基本的研究および臨床的研究の両者にとって重要でありうる、 ここに記載する研究のいくつかの解釈が存在する。コアタンパク質の一部分(抗 体により検出可能な)が乳癌により処理されるときムチン上に露出されるが、正 常乳房および良性腫瘍により処理されるときムチン上でマスキングされるという 観測は、悪性腫瘍におけるムチンの処理における変更が存在するということを意 味する。次いで、正常および悪性の細胞におけるムチンの処理のより詳しい研究 は、悪性細胞を定義するための基本的情報を与えることができるであろう。その うえ、腫瘍に対する抗体5M−3の反応の特異性は完全なムチンに対して発生さ せた抗体のそれよりすぐれるので、この抗体は組織切片、体液および細胞中の乳 癌細胞の検出のために、より有効な診断の道具であることを実証するであろう。
反応性成分は細胞間で同様によく関連する膜であり、そして腫瘍の生体内局在は 、また、可能であろう。
墾 使用した略語は次の通りである:HMFG、ヒト乳脂肪小球、PBS。
リン酸塩緩衝液(153ミリモルのNaC1,3ミリモルのNa2HPO゛1. 2ミリモルのKM!PO,、pH7,4):WGA、小麦の麦芽の凝集素、PN A、ビーナツツ凝集素、PHA、ヘリックス・ポマチア(Helix poma tia)凝集素、B5A1ウシ血清アルブミン;SDS、ドデシル硫酸ナトリウ ム。
実施例2 ヒト乳ムチンの精製および脱グリコシク化を実施例1におけ、るように実施し、 ムチンをHMFG−1抗体で精製した。
ストリッピングしたムチン調製物をNaDoSO+/ポリアクリルアミドゲル( 10%)の電気泳動で精製し、そして2つの方法により銀着色し、それらの方法 1つは高度にグリコシフ化したタンパク質を着色するために使用することができ る(22.23)。
ストリッピングしたコアタンパク質に対するポリクローナルウサギ抗血清の調製 1匹のニューシーラント白ウサギを70インド完全アジユバン)(Gibco) 中で100μgの部分的にストリッピングしたコアタンパク質で免疫化した。5 00μgの高度にストリッピングしt;コアタンパク質の促進注射を、最初の注 射後3および4週後、70インド完全アジユバント(Gibco)中で投与した 。lOマイクロタイターの免疫血清(75μg / mαタンパク質)は200 ngの高度にストリッピングしたコアタンパク質をプロティンAアッセイ(24 )において沈澱させ、そしてそれをイムノブロッティングにおいて検出した。ウ サギ免疫前(preimmune)の免疫グロブリンの分画およびウサギ抗ムチ ンタンパク質を、硫酸アンモニウムを50%飽和に添加することによって調製し た。得られるペレットをもとのPBSの血清体積の半分中に再懸濁し、そして同 一緩衝液に対して透析した。透析後、唯一の残留沈澱を遠心により除去した。免 疫グロブリンの分画をアリコートで一20℃において貯蔵した。
初期のスクリーニングのt;めに使用したポリクローナル抗血清に加えて、ムチ ンコアタンパク質(20)およびHMFG−1およびHMFG−2(1,14) を認識する2つのMAbs、5M−3および5M−4のカクテル(実施例1参照 )を、精製しt;プラーク、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をスクリーニ ングするためおよび生体外翻訳タンパク質の免疫沈澱のt;めに使用した[MA bs、5M−3およびSM−4(SMはストリッピングしたムチンを意味する) は部分的におよび高度にストリッピングしt;コアタンパク質と強い反応性を示 し1;が、完全にグリコシフ化したムチンと反応性をしめさなかった(20)] 。使用した他のMAbsは、モノクローナル抗β−ガラクトシダーゼ抗体(25 )[H,Durbin (ICRF% ロンドン)からの贈り物であった]、抗 インターフェロン抗体、5T254 (24)、LE61.ケラチン抗体(26 )およびM2S(これは乳ムチン上の炭水化物構造を認識する)(27)であつ t;。
タンパク質の生体外翻訳 RNAをヒト乳癌細胞系MCF−7からチルゲインらのグアニジウムインチオシ アネート法(28)を使用して分離し、そしてpoly(A)”RNAをオリゴ (dT)−セルロース(New England Bio Labs)を使用す るクロマトグラフィーにより精製した。pOl y (A)’RNAは網状赤血 球リゼイト系(Ame r s h am)中で[”S] )fオニン(100 0Ci/ミ!J%ル; Ic1−37GBq。
Ame r s h am)の存在下に翻訳した。5xio’酸不溶性cpmを 含有する試料をプロティンAアッセイ(24)において5M−3,5M−4、H MFG−1、HMFG−2およびヒトインターフェロンの対照抗体を使用して沈 澱させた。次いで、抗体選択したタンパク質をNaDosOa/ポリアクリルア ミドゲル(10%)で分離し、アンプリファイ(Am e r s h a m )で含浸し、モしてXAR−57(ルム(Kodak)に−70℃において露出 した。
λgtllライブラリーの抗体スクリーニングおよびタンパク質のプロッティン グ この研究におけるを使用したλgtllライブラリーは、ヒト乳癌細胞系MCF −7から分離したmRNAから構成し、そしてフィルッブス・ワルター・アンド ・ピアーズ(フランス国ストラスバーグ)により寛大にも提供された。ランダム プライブトライブラリーの調製に使用したpo I y (A)”RNAはm  RN Aから調製し、このmRNAは28SrRNAより速く沈降し、モしてエ ストロゲン受容体において濃縮した(29)。このライブラリーは本質的にフィ ンらおよびヤングおよびディビス(30〜32)に記載されているようにつくり 、そしてほぼ1x106組み換え体/μgのRNAを含有した。プラークの85 %〜95%はインサートを含有した。
ファージのライブラリーをバクテリア菌株Y1090上に配置し、モして42° Cにおいて3時間増殖させた。イソプロピルβ−D−チオガラクトシド(IPT G)誘導および37℃における3時間の増殖後、フィルターをプレートの各々か ら調製し、そしてヤングおよびディビス(32)の方法により抗ムチンコアタン パク質抗体をスクリーニングした。
スクリーニングにおいて使用した第1抗体は、前述したように調製しt;ストリ ッピングしI;コアタンパク質に対してレイズしたウサギ抗血清であっI;。ス クリーニングにおいて使用する前、抗血清を1%のウシ血清アルブミンを含有す るPBS (PBS/BSA)中でl : 200に希釈した。Yl 090バ クテリア層を使用する予備吸収は、不必要であることが分力)っに。ニトロセル ロースフィルタ−and Schuel+)を、5%のBSAを含有するPBS 中で室温において撹拌しながら1時間インキュベーションすることにより遮断し た。フィルターは、熱シールプラスチックバッグ内で抗血清の1=200希釈で 室温において一夜インキュベーションしt;。フィルターヲPBS/BSA中で 5×5分洗浄し、そしてPBS/BSAでl : 500に希釈したセイヨウワ サビペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ウサギ抗血清(Dako)を使用して結合し た抗体を検出し、そしてフィルターとともに2時間インキュベーションした。フ ィルターをPBS/BSA中で5×5分洗浄し、モして1×10分PBS中で洗 浄し、次いで4−り四ロー1ーナフトールを使用して色を検出した(1)。免疫 活性バクテリオファージを取り上げ、そしてクエン酸ナトリウムの2つの追加の ラウンドで精製した。引き続いて、バクテリオファージのインサートをpucB のEcoR1部位(33)中にスクリーニングして、最も頻繁に使用するプラス ミド、pMUcloを産生じた。プラスミドはDHI細胞中で維持した。
βーガラクトシダーゼcDNA融合タンパク質を免疫活性について検査するため に、細胞リゼイトを誘導した。溶原体をヤングおよびディビス(34)に記載さ れているように調製した。細胞を沈澱させ、ラエムリ試料緩衝液中に懸濁させ( 35)、そしてN a D o S O a/ポリアクリルアミドゲル(10% )で電気泳動により分離し、そして記載されているように(L 36)ニトロセ ルロース紙上に移した。フィルターを上のように抗体のスクリーニングのために 処理した。
ノザン分析 RNAを組織培養から分離し、そしてチルブラインらのグアニジニウムイソチオ シ不ート法(28)により組織を凍結した。合計のRNA (10μg/レーン )を脱イオングリオキサール中で55℃に1時間に加熱して変性し、そして1. 3%のグリオキサールゲルの電気泳動により分画しf−(38)、RNAをニト ロセルロース(Schleicherand Schue l +)に移し、予 備交雑し、そしてえトマス(34)に記載されているように交雑した。フィルタ ーをO.IXsscI:Q。
1%のSDSで65℃において洗浄し、そして増感スクリーンで一70℃におい てXAR−5フイルム(Kodak)に露出した。
サザン分析 高分子量ゲノムDNAを白血球および細胞系から調製した(39、40)。これ らのゲノムDNA(toμg)を制限酵素で製造業者の推奨する条件下に切断し 、そして0.6%〜0.7%のアガロースゲルで分画した。クローニングしたプ ラスミドDNAを切断し、そして1.3%のアガロースゲルで分画した。ゲルを 、製造業者の推奨する条件下に、変性し、中和し、そしてナイロン膜に移した。
pMUCl 0からのEcoRIインサートを1%の低い融点のアガロース(B  i r a d)ゲルで分離し、そして[σ−”P] dCTPでランダムプ ライミングの方法(41)により標識し、そして42℃においてフィルターへ交 雑した。フィルターをO.IXSSCに0.1%のSDSで55℃において洗浄 し、そして増感スクリーンで一70℃においてXAR−5フイルム(Kodak )に露出しt;。
結果 ムチン糖タンパク質の精製および脱グリコシク化モノクローナル抗体HMFG− 1と反応性のムチン糖タンパク質を、プールしt;ヒト乳房乳から、HMFG− 1抗体親和性カラムを使用して調製し、次いでG75セファデックのモレキュラ ーシーブのクロマトグラフィーにかけて低分子量の成分を除去した(第7図、レ ーンl)。精製しI;分子の相同性を立証するために、4つの別の調製物のアミ ノ酸分析を実施し、そしてアミノ酸の58%を説明するセリン、スレオニン、プ ロリン、アラニン、およびグリシンをもつかなり一定の組成が明らかにされた。
過ヨウ素酸銀着色ゲルは、銀の着色前に、ゲルを過ヨウ素酸で処理したときにの み可視の400.000ダルトンより大きい拡散バンドを明らかにした(第7図 、レーン2)。他の低分子量のバンドはゲル上で、過ヨウ素酸の予備処理なしで 銀の着色で、可視化されなかった。
精製した物質をフッ化水素で処理して、ムチン糖タンパク質に特徴的な、〇−結 合糖を除去した。2つの異なる反応条件を使用した。これらの条件は部分的に脱 グリコシク化されたコアタンパク質(0℃において1時間)および完全に脱グリ コシク化されたコアタンパク質(室温において3時間)を、ヨウ素化レクチン結 合、引き続くゲル電気泳動およびニトロセルロース紙への移しく20)により決 定して生成した。部分的に脱グリコシク化されたコアタンパク質は小麦の麦芽の 凝集素、ビーナツツ凝集素およびヘリックス・ポマチア(Helix poma tia)レクチン(これは結合糖Nーアセチルガラクトサミンを認識する)と反 応性であるが、完全に脱グリコシク化されたコアタンパク質はこれらほの3つの レクチンとの反応性を示さなかった。
フッ化水素処理したコアタンパク質をNaDoSO./ポリアクリルアミドゲル (10%)の電気泳動により分離し、そして銀着色しI;。銀の着色により、部 分的にストリッピングしたムチンの主要成分は約400kdの高分子量のバンド であるが、低分子量の淡いバンドは、また、観測されることが明らかにされた( 第8図、レーンl)。高分子量の物質はゲル中で多少増加した移動度を示し、そ して結合糖を認識するレクチンと反応したので、多少の糖が除去されたことを推 測することができる。完全にストリッピングされたムチンは約68kdおよび7 2kdから成っていた(第8図、レーン2)。
MCF−7細胞により産生されt;抗体反応性タンパク質MCFー7乳癌細胞系 は大量のHMFG−1およびHMFG−2反応性物質をその細胞表面上に発現し 、こうしてc D N AライブラリーのためのmRNAの適当な源であると判 定されI;。モノクローナル抗体でMCF−7のライブラリーをスクリーニング する前に、それらをMCF−7 mRNAから産生された生体外翻訳産生物から の成分を沈澱させる、それらの能力について試験した。翻訳反応からのタンパク 質を、モノクローナル抗体HMFG−1,HMFG−2、SM−3およびSM− 4を使用して免疫沈澱させ、そしてアクリルアミドゲルの電気泳動およびフルオ ログラフィーで表示しI;(第9図)。約68kdおよび92kdの2つのタン パク質をSM−3 (レーン2)およびSM−4 (レーン2)により免疫沈澱 させた。また、HMFG−1 (レーン4)およびHMFG−2(レーン3)は これらのタンパク質を免疫沈澱させた:しかじながら、これらの領域にバンドは ヒトインターフェロンに対する無関係の抗体(レーン5)により沈澱しなかった 。HMFG−1およびHMF G−2がこれらのタンパク質を免疫沈澱させたと いう事実は、従来これらのMAbsが炭水化物の決定基を認識すると考えられて ぃt;ので(1)、予期されざる発見であった。しかしながら5、われわれは、 また、HMFG−18よびHMFG−2が非常に強く完全にストリッピングされ 、ヨウ素化コアタンパク質と反応したことを発見しt:(20)。これらの結果 はβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質へのMAbの反応性と一緒になって(下 を参照)、HMFG−1およびHMFG−2のためのエピトープは、少なくとも 一部分、性質がタンパク質であることを実証する。
°合計の細胞のp o I y (A) ”RNA中のコアタンパク質のmRN Aの豊富さは、免疫沈澱した解き存在する( S I s )メチオニンの量を 、生体外翻訳の間に組み込まれたメチオニンの量と比較することによって4%と 推定された。
cDNAライブラリーのスクリーニング大きさ選択MCF−7mRNAから作っ たλgtll cDNAライブラリー(参照、方法)を、最初に、その炭水化物 を除去したムチンコアタンパク質に対して作ったポリクローナル抗体でスクリー ニングした。2XlO@プラークのスクリーニングは11の陽性のクローンを生 成し、これらのうちの7つを2つの追加のプラーク精製のラウンドで首尾よく採 取した。
7アージのクローンと抗体グローブとの反応性はcDNA翻訳産生物上の抗原決 定基のj;めであることを立証するために、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク 質をすべての7つのクローンから作った。タンパク質を電気泳動により分離し、 ニトロセルロース紙に移し、そしてストリッピングしたムチンに対する種々の抗 体でプロービングし、これ、らの抗体は、最初に、クローンおよび5M−3およ び5M−4のカクテルを選択するために使用しt;ポリクローナル抗血清を包含 し!;。さらに、HMFG−1およびHMFG−2、すなわち、本来この分化お よび腫瘍関連上皮ムチンを検出した2つのモノクローナル抗体(1% 14)を 試験した。
すべての7つのクローンは融合タンパク質を生じ、これらはポリクローナル抗血 清、モノクローナルカクテル、およびHMFG−2により特異的に認識された。
HMFG−1抗体は7つの融合タンパク質のうちの6つと反応し、そして最小の インサートを含有するクローン9からのタンパク質を認識することはできなかっ た。すべての場合において、最強の信号はHMFG−2抗体により得られ、この 反応は第1O図に示されている。ケラチンに対するおよびこの完全にグリコシフ 化したムチン上の炭水化物エピトープに対するモノクローナル抗体を、対照とし て使用し、そして反応性は示さなかった。
β−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体は陽性の対照であり、そして 認識されl;バンドはすべての場合において特異的抗体により認識されるバンド と相関関係を有した。融合タンパク質の大きさは、バクテリオファージ中に見い だされるcDNAインサートに比例して変化した。
cDNAおよびRNAプロット分析の特徴づけλクローンからのインサートをp MUC3−10(pMUC5を省略する)と表示し、そして取り扱いを容易にす るためにベクターpUCB中にスクリーニングした。7つのクローンをお互いに 配列の相同性にっいて比較しt;。プラスミドの各々をEcoRIで消化し、そ いてインサートを1.4%のアガロースゲルで分離した。pMUcloからの最 大のcDNAインサートを使用してインサートをプロービングし、そしてすべて の6インサートに交雑させた(第11図)。pMUC7はEc。
R1で消化後2つのインサートを含有することが分かった;しかしながら、イン サートの1つのみがpMUCl Oプローブへ交雑した。インサートのバンドは ファージDNAからから誘導されなかっj;。なぜなら、pMUc10プローブ はHindTII消化λ7アージDNAに交雑しなかったからである。
アガロースゲルの電気泳動により示されるように(第11図)、インサートは大 きさが約200から約1800bpまで変化した。pMUClOからの最大のイ ンサートは、すべての引き続く実験において交雑プローブとして使用した。
λMUCクローンは抗体の結合によってのみ同定されたので、われわれはそれら が事実乳房上皮ムチンの遺伝情報を指定するかどうかをさらに確認することを必 要とした。pMUCl 0の真性さを決定するために、われわれはクローンに交 雑するmRNAの存在を種々の細胞系におけるムチンの発現と関係付けた。第1 2図に示すように、前にHMFG−2抗原を発現することを示した(Li2)乳 癌細胞系MCF−7およびT47DからのRNAにおいて、cDNAは4.7k dおよび6.4kdの2つの転写体に交雑した。有意には、pMUcloグロー ブは乳から培養した正常乳房上皮細胞から抽出したRNAにおいて、はぼ同一の 大きさの転写体に交雑した(42)。5.7kdの第3バンドはこれらの正常細 胞からのRNAにおいて見ることができる。対照的に、ムチンを欠く3つのヒト 細胞のタイプ、乳房線維芽、ダウジ(Daudi)細胞およびH3578T、乳 房組織から誘導された癌肉腫系統(43)は、検出可能なpMUc10関連mR NAを示さなかッt;。6.4kbのバンドは最も豊富に発現されるように思わ れt;。MCF−7細胞からのmRNAの少なくとも2つの大きさの存在は、M CF−7細胞からの生体外翻訳したm RN Aからの2つのタンパク質(分子 量68kdおよび92kd)の免疫沈澱と相関関係をもつ。正常乳房上皮細胞を プールした乳試料から誘導し、そして観測された追加の転写は個体の間の多形性 ためであろう。
ゲノムDNAプロット分析および制限断片長さの多形性(RFLP)6つの無関 係のIDVおよび4つの族から成る個体のパネルから、および3つの細胞系から 、ゲノムDNAを調製した。HinflまたはEcoRIで消化し、そしてブロ ッティングし、そして放射線標識しt;pMUCIOインサートへ交雑しf−、 D N Aは、制限断片の長さの多形性を示した。10個体および2つの細胞系 からの制限断片を第13図に示す。
バターはHinfl消化における3 400 b p−6200b p (3つ のバンドを示す第13A図、レーン12におけるZR75−IDNAを除外する )あるいはEcoRI消化において8200bp−9600bp(第13B図) の範囲の単一のバンドまたは二重から成る。部位における高い生体内安定性を意 味する断片大きさの連続的分布が存在するように思われた。4つの族(レーン1 〜4)において観測される断片のパターンは、これらの断片がアレルであること を示唆する。正常な関連する個体の白血球から作ったDNAの予備的研究は、遺 伝の常染色体の相互優性のモードをもつ、ある数の独立のアレルの存在を示す。
これらの研究は別の研究の主題であろう。
材 MCF−7λgtllライブラリーから得られた、ここに記載するcDNAクロ ーンは、正常細胞産生物、その脱グリコシク化形態の乳ムチン、に対して調製さ れたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用して選択した。これら は次の理由で実施した。乳癌細胞により発現される免疫学的に関連する糖タンパ ク質の同様な量を調製することよりも、ストリッピングのI;めのムチンを大量 に得ることはより容易であったからである(44)。抗体がMCF−7細胞にお ける非グリコシク化コアタンパク質分子の遺伝情報を指定するeDNAについて 事実選択するという事実は、乳ムチンに対する抗体とのそれらの反応性により本 来検出された、これらの細胞における糖タンパク質が、このムチンと同一のコア タンパク質を含有することを強く示唆する。これは、MCF−7ライブラリーか ら分離されt;プローブの1つをを使用して、正常および悪性の細胞におけるほ ぼ同一の大きさのmRNAを検出することによって証される。したがって、われ われは乳癌細胞上の抗体反応性糖タンパク質をムチンと呼び、ここでそれらの処 理は異なり、分子量が異なるが、乳ムチンのそれと同一のコアタンパク質をもつ ことを考慮する。
7つのクローンがMCF−7ライブラリーから得られ、それらのうちの最大は1 800kbであった。このクローンを他の6つの小さいクローンと交差交雑した 。6つの交差交雑したラムダクローンにより発現されるβ−ガラクトシダーゼ融 合タンパク質は、ムチンコアタンパク質に向けられたポリクローナル抗血清と、 ならびにストリッピングしたコアタンパク質、5M−3,5M−4、HMFG− 1およびHMFG−2(14,20)上の種々のエピトープに向けられf−4つ のよく特徴づけられるモノクローナル抗体と反応性であった。最小のラムダクロ ーン、λMUC9は、4つのモノクローナル抗体の3つと、およびポリクローナ ル抗血清と反応する、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生じI;。
広範に特徴づけられるHMFG−1およびHMFG−2モノクローナル抗体はラ ムダプラークおよび融合タンパク質と強く反応し、そして生体外翻訳したmRN Aからのタンパク質を免疫沈澱去ることが出来るという、驚くべき結果は、これ らのクローンが事実ムチンコアタンパク質の一部分の遺伝情報を指定するという 強い証拠を提供する。従来の証拠、例えば、固定、佛騰、ジチオスレイトールお よびN a D o S O&による処理に対する抵抗性、および分子上の多数 のエピトープの存在はこれらが炭水化物であることをしさする(1)が、今回、 HMFG−13よびHMFG−2のモノクローナル抗体は性質が明確にタンパク 質であるということが確立された。炭水化物は、エピトープの一部分として、あ るいはタンパク質部分上の多少のフンフォメーションの変化を与えることにより 、最強の結合を得るt;めに要求されうるが、抗原決定基の一部分はアミノ酸配 列から成らなるてはならない。これらの2つのMAbsは完全にグリコシフ化さ れた乳ムチンならびにストリッピングされたコアタンパク質と反応性であるので 、このデータは完全な分子がこれらの2つの抗体のための抗原部位に寄与する裸 のペプチドの領域を含有することを意味する。
pMUCI Oが乳房ムチンコアタンパク質の遺伝情報を指定するという確認の 証拠は、RNAプロットにより提供される。乳癌細胞系MCF=7、T47D、 ZR−75−1におけるおよび正常乳房上皮細胞におけるmRNAの相対的豊富 さは、HMFG−1およびHMFG−2モノクローナル抗体の結合により測定し た、これらの細胞による抗原の発現に相当する。抗原の発現に対して陰性の細胞 のタイプ、例えば、ヒト線維芽、ダウジ細胞およびH5578T、乳房から誘導 される癌肉腫(14)はRNAプロット交雑において陰性である。ZR−75− 1細胞を使用して実施した偶然の観測は、pMUcloが事実ムチン糖タンパク 質コアタンパク質の遺伝情報を指定するという、間接の強い証拠を生成した。こ の細胞系は、日常的にm RN Aおよび抗原の両者を大量に発現し、プロット 交雑により予期せざることには陰性であった。RNAの1つの調製物を生成した 。驚くべきことには、RNAを作るとき使用した、特定のZR−75−1細胞は このとき同様によく抗原の発現を失っていた(HMFG−1およびHMFG−2 との反応により決定して)。ZR−75−1細胞の異なる継代培養の数は回復さ れ、そしてもう一度抗原およびメツセージの両者を発現することが示された。メ ツセージの大きさ、4.7kbおよび6.4kbは非常におおきい。なぜなら、 68kdおよび92kdのタンパク質はタンパク質の部分の遺伝情報を指定する ためにわずかに3kbを必要とするだけであるからである。これはmRNAの大 きい部分が翻訳されていないことがあることを示唆する。完全な長さのクローン を得る努力がなされている。
こうして、ここに表したcDNAクローンは、分化した乳房組織ならびにほとん どの乳癌により発現される、ヒト乳房ムチンの遺伝情報を指定する遺伝子の部分 を表す。乳ムチンコアタンパク質に対する抗体によりMCF−7細胞からのRN Aの生体外翻訳産生物から、沈澱した主なタンパク質は、68Kdおよび92K dの見掛は分子量を有する。したかって、乳癌細胞により産生されt:タンパク 質は、乳ムチンの68Kdコアタンパク質とエピトープを共有する(20)。同 様な92Kdタンパク質が、まt;、正常乳房上皮細胞により産生され、モして HF処理により切頭または破壊されるかどうかは、なお、明らかでない。14c アミノ酸で生物合成的に標識れたMCF −7細胞は、HMFG−1およびHM FG−2抗体で免疫沈澱させると、320Kdおよび430Kdの2つのグリコ シフ化タンパク質を生成し、そいてこれらの各々の糖タンパク質は68Kdまた は92Kdの1つのコアタンパク質を利用することが可能である。あるいは、糖 タンパク質の各々は、92Kdおよび68Kdのタンパク質を異なる比率で、あ るいは変化してグリコシフ化されて、含有することができるあろう。さらに、ラ イブラリーをスクリーニングすると、両者の大きさの免疫学的に冠れするコアタ ンパク質の遺伝情報を指定する、全長のcDNAを産生ずるであろう。単一の遺 伝子のびが存在するように思われる(部分的にcDNAプローブを使用してえら れたサザンプロットのデータに基づいて)ので、多数のメツセージが交互のRN Aきり継ぎにより生ずることがあり、そしてこれはそれらが共通の配列を含有す るというじじつを説明するであろう。68Kdのコアタンパク質は小さくて50 %の炭水化物を含有する300Kdより大きい完全にグリコシフ化された分子を 生成しないと思われるが、ムチンにこのような構造が可能であるどう証拠が存在 する。ヒツジ下顎ムチンはlXl0’ダルトンの分子量を有することが報告され た(45)が、しかもそのタンパク質のコアは650アミノ酸から成り、53k dの分子を生成する(46)。
腫瘍および乳癌細胞系のイムノブロッティングでHMFG−1およびHMFG− 2で検出されるムチンは、腫瘍ムチン分子の分子量における80kd〜400k dの大きさの変動を示す(L 14)。正常尿中に存在する高分子量のムチンを 検出する、これらの同一の抗体を使用すると、多形性が事実遺伝子的に決定され ることが示された(48)。非常に低い分子量の化合物は、多くの腫瘍細胞にお ける不完全に処理されると思われる、ムチンの前駆体の形態を表すように思われ る(20)が、高分子量成分における変動は遺伝的多形性のためのようである。
しかしながら、多形性の構造的基準が遺伝的に決定されるタンパク質のためであ るか、あるいはムチンの炭水化物部分のためであるかは、不明瞭であった。ムチ ンのプローブを使用するサザンブロッティングにおける制限断片の長さの多形性 の検出は、ムチンの多形性がタンパク質の遺伝情報を指定するDNAのレベルで 起こることを示唆している。予備的配列決定のデータは、この多形性の基準がタ ンパク質解読配列中に存在する可変直列反復の領域であることを示唆している。
この構造的特徴は、ムチン部位における多くのアレル制限断片の発生の原因とな りうる。われわれは、現在、尿のムチンの遺伝のパターンが決定されている、正 常の関連する個体の白血球からのDNAのサザンプロットの検査により、ムチン 多形性の基準を研究している。さらに、われわれは、個体乳癌患者の白血球およ び腫瘍から作られたDNA調製物を検査して、対になった試料中の遺伝子型の間 の不規則性が存在するかどうかを決定している。なぜなら、直列に反復するDN Aは、組み換えまたは増幅が起こりうる、不安定な部位を提供するからである。
癌の大部分におけるムチンの存在およびそれらの乳房上皮細胞の分化との関連性 は、組織特異性および遺伝子の発育の調節に含まれる領域を同定するために特に 重要である。そのうえ、細胞中への機能的ムチン遺伝子の導入は、乳房上皮分化 におけるこの分子の役割への見識を提供し、そして多分ヒト乳房における悪性の 形質転換に関係する、ムチンの機能または発現における変更の同定を可能とする であろう。
略語 略語は次の通りである: PBS、リン酸塩緩衝液、 MAb、モノクローナル 抗体、 IPTG、イソプロピルβ−D−チオガラクトシド、 bp、塩基対; kb、キロ塩基。
表−よ アミノ酸 HMFG−1精製 高度にストリッピ PAS −0乳ムチン ング しI:乳ムチン (シミズおよびヤマウチ1982) Asp 6.1 7.2 6.4 Thr 9.4 9.7 9.8 Ser 9.1 13.0 13.I Glx 6.3 9.6 8.3 Pro 14,8 14.4 12.0Gly 8.1 10.1 12.2 Ala 12.3 11.9 13.0Cys 分析せず 分析せず 0.5 Vat 6.0 6.3 5.3 Met O,50,40,8 11e 1.6 1.7 1.9 Leu 4.5 4.8 3.7 Tyr 2.0 0.9 1.6 Phe 2.0 1.6 1.7 His 3.2 2.3 3.8 Lys 2.8 3.32.2 Arg 4.0 CO3,9 表2 1251 cpm結合 抗 体 完全な分子 部分的にストリッ 完全にストリッピングしたムチン ピ ングしたムチン 5−17 8.524 11.925 5.7809、13 525 3,00 0 3,328SM−346515,4149,200SM−481616,7 509,561HMFG−132,00033,7689,494HMFG−2 29,50029,23015,832NS2 medium 397 845  650ヨウ素化完全な、部分的および完全に脱グリコジル化乳ムチンへの抗体 の結合は、材料および方法において記載するようにプロティンAプレート法を用 いてアッセイした。
参考文献 1− Burchell、 J、M−、Durbin、 H,およびTaylo r−Papadimitriou、 J。
(1983)J、 1mmuno1.131.508−513−2 、 Bra nnell、 M、E、、 Rhavanandan、 V、P、、 Wise man、 G−およびHarris。
H,(1983)Br−J、 Cancer 48.177−183゜3− M cllhinney、 R−A、、 Patel、 S、およびGore、 M −E−(1985)Biochem−J。
227、155−162゜ 4 、 Hilkens、 J、、 Buijs、 F、、 Hilgers、  J、、 Hagemann、 Ph−、Ca1afat。
J、、 Sonnenberg、 A、およびVan der Valk、 M −(1984)Int−J−Cancer34、197−206゜ 5 + Tagliabue、 E、、 Porro、 G、、 Barban ti、 P、、 Della−Torre、 G、。
Menard、 S−、R11ke、 F、、 Cerasoli、 S、およ びColnaghi、 M−(1986)Hybridoma 5.107(1 5゜6 、 Johnson、 V、G、、 Schlom、 J−、Pate rson、 A−J、、 Bennett、 J、。
Magnani、 J、L、およびCo1cher、 D、(1986)Can cer Re5−46.850−857゜7 、5ekine、 H,、0hn o、 T、およびKufe、 D−W、(1985)J、 1mmuno1.1 35゜3610−3615゜ 8 、0rmerod、 M、G−、5teele、 K、、 Edvards 、 P、A、WおよびTaylor−Papadimitriou、 J、(1 984)J、 Expt、 Path−1,263−271−9、Wilkin son、 M、J、、 Howell、 A、、 Harris、 J−、Ta ylor−Papadimitriou。
J、、 5w1ndell、 R,およびSellwood、 R,A−(19 84)Int、 J、 Cancer 33゜299−304゜ 10、 Kufe、 D、、 Inghirami、 G、、 Abe、 M、 、 Hayes、 D、、 JusLi−Wheeler。
HlおよびSchlom、 J、(1984)Hybridoma 3.223 −23:2゜11、 Pr1ce、 M、R,、Edwards、 S、、 R obins、 R,A、、 Hilgens、 J、、 HilkensB J、およびBaldwin、 R,(1986)Eur、 J、 Can、 C l1n、 0nco1.22.115−117゜ 12、 Johnston、 W、W、、 5zpak、 C,A、、 Lot tick、 S、C,、Thor、 A、およびSchlom、 J、(198 5)Cancer Res、 45. 1894(900゜13、 Rasmu ssen、 B、B、、 Pedersen、 B、V、、 Thorpe、  S、M、、 Hilkens、 J、。
Hilgers、 J、およびRose、 C−(1986)Cancer R es、 45.1424(427゜14、 Taylor−Papadimit riou、 J、、 Peterson、 J、A、、 Arklie、 J、 。
Burchell、 J、、 Ceriani、 R,L、およびBodmer 、 W、F、(1981)Int、 J。
Cancer 28. 17−21゜ 15、 Burchell、 J、、 Wang、 D、およびTaylor− Papadimitriou、 J、(1984)Int、J、 Cancer  34.763−768−16、 Shimizu、 M、およびYamauc hi、 K、(19g2)J、 Biochem、 91.515−519゜1 7、0rmerod、 M、G、、 5teele、 K、、 Westwoo d、 J、H,およびMazzini、 M、N。
(1983)Br、 J、 Cancer 48.533−541−18、7a ylor−Papadimitriou、 J−、Lane、 E、B、および Chang、 S−E、(1983)乳癌の理解:臨床的および実験室的観念( Understanding BreastCancer: C11nical  and Laboratory Concepts、XR4ch、 M、A、 + Hager。
Ic、およびFurmanski、 P−編、)Marcel Dekker、  Inc、 New YorkおよびBa5e1. pp−215−246−1 9、Chang、 S、E、およびTaylor−Papadimitriou 、 J、(1983)Cell Diff、 12+20、上の実施例10 21、 Mart、 A、およびLamport、 D−(1977)Anal 、 Biochem、 82.289−309゜22、 Wray、 W、、  Boulikas、 T−、Wray、 K−P−およびHancock、 R ,(1981)Anal、 Biochem、 118.197−203゜23 、 Dubray、 G、およびBezard、 G−(1982)Anal、  Biochem、 119.325−329−24、5hearer、 M、 、 Taylor−Papadimitriou、 J、、 Griffin、  D、およびBa1kvill、 F、(1984)J、 Tmmunol、  133.3096−3101゜25、 Durbin、 H,およびBodme r、 W、F、(1986)J、 [nnunol、 Meth、、 InPr ess。
26、 Lane、 E−B、(1982)J、 Ce1l biol、 92 .665−673゜27、 Gooi、 H,C,、Jones、 N−J、、  Hounsell、 E、F、、 5cudder、 P、。
Hilkens、 J、、 Hilgers、 J、およびFe1zi、 T、 (1985)Biochem−Biophys、 Re5− Commun−1 31,543−550゜28、 Chirgwin、 J、M、、 Przyb yla、 A、E、、 MacDonald、 R,J、およびRutter。
W、J、(1979)Biochem、 18.519+5199゜29、 W alter、 P−、(zreen、 S、、 Greene、 G2. Kr ust、 A、、 Bornert、 J、−MA。
He1tsch、 J、−M、、 5taub、 A−、Jensen、 E、 、 5crace、 G−、Waterfied。
M、およびChambon、 P、(1985)Proc−Natl、 Aca d、 Sci、 USA、 82゜7889−7893゜ 30、 Huynh、 T、V−、Young、 R−A、およびDavis、  R,W、(1985)DNAクローニング:実際的アプローチ(DNA Cl oning:A Practical Approach)。
Glover、 D、M、編(IRL、 0xford)、 Vol、 1.  pp、 98−121゜31、 Young、 R,A、およびDavis、  R,W、(1983)Proc、 Natl、Acad、 Sci、 USA8 0、 1194−1198゜ 32、 Young、 R,A、およびDavis、 RJ、(1983)Sc ience 222.778−782゜33、 Vieira、 J、およびM essing、 J、(1982)Gene 19.259−268゜34、  Young、 R,A、およびDavis、 R,W、(1985)遺伝子工学 、(に61et icEngineering)、 5etlov、 J、に、 およびHo1laender、 A、(Plenum。
Nev York)、 Vol、 7゜35、 Laemmli、 O,に、( 1970)Nature(Lond)227.680−685゜36、 Tov bin、 )1.、5taehelin、 Y、およびGordon、 J、( 1979) Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 USA、 76、4350−4354゜37、 Man istis、 T、、 Fr1tsch、 EJ、およびSa+nbrook、  J、(19g2)モレキュラークローニング:実験室のマニュアル(Mole cular Cloning: ALaboratory ManualXCo ldspring Harbor Laboratory、 Co1d Spr ingHarbor、 NY)。
38、 Thomas、 P、A (1980)Proc、 Natl、 Ac ad、 Sci、 USA、 77、5201−5205゜39、 Woodh ead、 J、L、、 Fallon、 R,、Figueiredo、 H, 、Langdale、 J。
およびMalco1m編、 A、D、B、(1986)、ヒト遺伝病(Huma n GeneticDiseases)、 Davies、 1.E、(IRL 、 0xford)、 p、 sa。
40、 Old、 J、M、(1986)、ヒト遺伝病()luman C+a netic Diseases)、 Davies。
K、E!!、、 (IRL、 0xford)、 p、 4゜41、 Fein berg、 A、P、およびVogelstein、 B、(1984)Ana l、 Biochem、 137゜266−267゜ 42、 Taylor−Papadimitriou、 J、、 Purkis 、 P、およびFentiman、 1.S。
(1980)J、 Ce11. Physiol、 102.317−321゜ 43、 Hackett、 A、J、、 Sm1th、 H,S、、 Spri nger、 E、L、、 0vens、 R,B、。
Ne1son−Rees、 W、A、、 Riggs、 J、L、およびGar dner、 M−B、(1977)J。
Natl、 Cancer In5t、 58.1795(800゜44、 G riffiths、 A、B、、 Burchell、 J、、 Taylor −Papadimitriou、 J、。
Gendler、 S、J、、 Lewis、 A、およびTi1ly、 R− (1987]nt、 J、 Cancer(submitted)。
45、 Gottschalk、 A、、 Bhargava、 S、およびM ury、 V、 In GoLtschalk、 A。
(編)糖タンパク質、それらの組成、構造および機能(Glycoprotei nstheir composition、 5tructure and f unction)、 pp−810−829+Elsevier、 New Y ork。
46− H41l、 M、D、Jr、、 Reynolds、 J、A、および H41l、 R,(1977)J、 Biol。
Chem、 252.3791−3798゜47、 Taylor−Papad imitriou、 J、、 Millis、 R,+ Burchell、  J、、 Na5h、 RC。
Pang、 L、およびG11bert、 J、(1986)J、 Expt、  Path、 2.247−260゜48、 Swallow、 D、、 Gr if4iths、 B、、 Bramwell、 M、、 Wiseman、  G、およびBurchell、 J、(1986)Disease Marke rs 3.刊行中。
49、 Abe、 M、およびKufe、 D、 MCF−7乳癌細胞における 2つの部分的に特徴づけられた高分子量の乳関係糖タンパク質の発現および分泌 への成熟因子の作用(Effects of maturational ag ents on expressionand 5ecretion or t wo partially characterized highmolec ular weight m1lk−related glycoprotei ns in MCF−7breastcarcino+na cells、)J 、 Ce11. Physiol、 126: 126−136.1986゜5 0、 Arklie、 J、、 Taylor−Papadimitriou、  J、、 Bodmer、 W、F、、 Egan、 MB およびMillis、 R,乳汁を分泌する乳房における上皮細胞により発現さ れた分化抗原は、また、乳癌において検出されうる(Differentiat ion antigens expressed by 5pithelial  cells 1nthe Iactating breast are al so detectable in breast cancers、)Int 、 J、 Cancer 28+23−29.1981゜51、 Bolton 、 A、E、およびHunter、 W、M、 ”’ I含有アシル化因子への 接合による高特異的放射能へのタンパク質の標識付け(The labelli ngof proteins to high 5pecific radio activities by conjugationto a ”J con taining acylating agent、) Biochem、 J 、 133:529−538、1973゜ 52、 Karlsson、 S、、 Swallow、 D、、 Griff iths、 B、、 Corney、 G、および1oplinson、 P、 ヒト尿ムチンの遺伝的多形性(A geneticpolymorphism  of a human urinary mucin、)Ann、 Hum、  Genet、 47:263−269.1983゜ 53、 Kearney、 J、F、、 Radbruch、 A、、 Lie segang、 B、およびRajewsky、 K。
免疫グロブリンの発現を失なっているが、抗体分泌雑種細胞系の構成を可能とす る、新しいマウス骨髄種細胞系(A new mouse myelomace ll 1ine that has 1ost immunoglobulin  expression butpermits the construct ion To antibody−secreting hybrid cel llines、)J、 Immunol、 123:1548(550,197 9゜54、 Melero、 J、およびGonzalez−Rodrigue s、 J、ヒト血小板の糖タンパク質maに対するモノクローナル抗体の調製( Preparation ofmonoclonal antibodies  against glycoproteins Iffa of humanp latelets、)Eur、 J、 Biochem、 141:42112 7.1984゜55、 Clamp、 J、R,、A11en、 A、、 Gi bbons、 R,A、 and Roberts、 G、ムチンの化学的面( Chemical aspects of mucins、)Br、 Med、  Bull、 34:25−41、1978゜ く 4番 寸−−− 200K〉 92・5K〉 310bpC>e 補正書の写しく翻訳文)提出書 (特許法第184条の8)平成1年7月7日署 特許庁長官 吉 1)文 毅 殿 1、特許出願の表示 PCT/GB 88100011 、発明の名称 プローブ 3、特許出願人 住 所 イギリス国すリイ シーアール92ビーエル・クロイドン・ランズダウ ンロード7−15名 称 インペリアル・キャンサー・リサーチ・テクノロジー ・リミテッド 4、代理人 〒107 住 所 東京都港区赤坂1丁目9番15号5、補正書の提出年月日 1989年3月16日、 6、添付書類の目録 (1) 補正書の写しく翻訳文) 1通請求の範囲 11配列(1) Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr ArgPro A la Pro Gly Ser Thr Ala Pr。
Pro Ala His Gly Val Thr Ser AlaPro A sp Thr Arg Pro Ala Pro GaySer Thr Al a Pro Pro Ala His Gly(I) に相当する配列中の5またはそれより多いアミノ酸残基からなるポリペプチド。
2、配列(I) Vat Thr Ser Ala Pro Asp Thr ArgPro A la Pro Gly Ser Thr Ala Pr。
Pro Ala His Gly Val Thr Ser AlaPro A sp Thr Arg Pro Ala Pro GlySer Thr Al a Pro Pro Ala His Gly(I) に相当する配列中の20またはそれより多いアミノ酸残基を有する請求の範囲第 1項記載のりペプチド。
3、少なくとも1つのアミノ酸残基は結合の糖置換基を有する、請求の範囲第1 または2項記載のポリペプチド。
4、結合の糖はオリゴ糖部分を有する請求の範囲第3項記載のポリペプチド。
5、置換基を有するアミノ酸はセリンまたはスレオニンであり、そして結合の糖 はN−アセチルガラクトサミンである、請求の範囲第3または4項記載のポリペ プチド。
6、担体タンパク質へ結合している請求の範囲第3〜5項のいずれかに記載のポ リペプチド。
7、完全に処理されたヒトムチン糖タンパク質との反応性が減少しているか、あ るいはそれと実質的に反応しない、請求の範囲第1〜6項のいずれかに記載のポ リペプチドに対する抗体またはその断片。
8、請求の範囲第7記載のモノクローナル抗体まI;はその断片。
9、請求の範囲第8項記載のモノクローナル抗体を分泌することかできるハイブ リドーマ細胞。
lO101H3(ECACC87010701)と表示された細胞系のハイブリ ドーマ細胞。
11、HSM3(ECACC87010701)により分泌されたモノクローナ ル抗体。
12、少なくとも17ヌクレオチド塩基からなり、a)DNA配列 GGCCGG CCT GGT GTCCGG GGCCGA GGT GAC 一本 ACCGTG GGCTGG GGG GGCGGT GGA GCCCGG− 3′ GGCCGG CCT GGT GTCCGG GGCCGA GGT GAC b)配列 5′本 GTCACCTCG GCCCCG GACACCAGG CCG GCC−ネ CCG GGCTCCACCGCCCCCCCA GCCCACGGT−C,T CACCTCC(1,CCCCG GACACCAGG CCG GCC−ネ  3′ CCG GGCTCCACCGCCCCCCCA GCCCACGGTのDNA 。
c)a)のDNA配列に対応する配列を有するRNA、およびd)b)のDNA 配列に対応する配列を有するRNA1の少なくとも1つと交雑可能である核酸断 片。
13、配列(a)〜(d)の少なくとも1つと交雑することができる少なくとも 30のヌクレオチド塩基の部分からなる請求の範囲第12項記載の核酸断片。
14、請求の範囲第12まt;は13項記載のDNA断片。
15、請求の範囲第12項において定義したそれぞれ配列(a)および(b)を 有する逆平行の対になった部分からなる二本鎖DNA断片。
16、検出可能な標識または治療的にまI;は診断的に有効な部分を有する請求 の範囲第7.8および11項のいずれかに記載の抗体またはその断片。
17、ヒトまたは動物の体に実施する治療または診断の方法において使用するた めの請求の範囲第7.8.11および16項のいずれかに記載の抗体またはその 断片。
18、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有するヒト多 形性上皮ムチンコアタンパク質。
19、ヒトまt;は動物の体に実施する治療まt;は診断の方法において使用す るための請求の範囲第18項記載のヒト多形性上皮ムチンコアタンパク質。
20、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有する請求の 範囲第1〜6項のいずれかに記載のポリペプチド。
21、ヒトまたは動物の体に実施する治療または診断の方法において使用するだ めの請求の範囲第1〜6および20Xjjのいずれかに記載のポリペプチド。
22、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有する請求の 範囲第12〜15項のいずれかに記載の核酸断片。
23、ヒトまたは動物の体に実施する治療まt;は診断の方法において使用する ための請求の範囲第12〜15および22項のいずれかに記載の核酸断片。
24、異常ヒトムチン糖タンパク質を含有することが疑われる試料を請求の範囲 第7.11および16項のいずれかに記載の抗体またはその断片と接触させるか らなるアッセイ法。
25、請求の範囲第7、LL、16および17項のいずれかに記載の抗体または その断片を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断または治療 の方法。
26、請求の範囲第18または19項のいずれかに記載のヒト多形性上皮ムチン コアタンパク質を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断また は治療の方法。
27、請求の範囲第1〜6.20および21”Jのいずれかに記載のポリペプチ ドを投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断または治療の方法 。
28、請求の範囲第12〜15叱’22および23項のいずれかに記載の核酸断 片を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断または治療の方法 。
国際調査報告 ””””””””””= PCT/GB 881000111QI+++jll a+jl A@61.ζ−ニー1+−、pση’GB 88/Coo!!

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、完全に発現されたヒトムチン糖タンパク質との反応性が減少しているか、あ るいはそれと実質的に反応しない、ヒトムチンコアタンパク質に対する抗体また はその断片。 2、ヒト多形性上皮ムチンコアタンパク質。 3、配列(I) 【配列があります】 (I) に相当する配列中の5またはそれより多いアミノ酸残基からなるポリペプチド。 4、配列(I) 【配列があります】 (I) に相当する配列中の20またはそれより多いアミノ酸残基を有する請求の範囲第 3項記載のリペプチド。 5、少なくとも1つのアミノ酸残基は結合の糖置換基を有する、請求の範囲第3 または4項記載のポリペプチド。 6、結合の糖はオリゴ糖部分を有する請求の範囲第5項記載のポリペプチド。 7、置換基を有するアミノ酸はセリンまたはスレオニンであり、そして結合の糖 はN−アセチルガラクトサミンである、請求の範囲第5または6項記載のポリペ プチド。 8、担体タンパク質へ結合している請求の範囲第5〜7項のいずれかに記載のポ リペプチド。 9、完全に処理されたヒトムチン糖タンパク質との反応性が減少しているか、あ るいはそれと実質的に反応しない、請求の範囲第3〜8項のいずれかに記載のポ リペプチドに対する抗体またはその断片。 10、ヒト多形性上皮ムチンコアクンパク質に対する請求の範囲第1または9項 記載の抗体またはその断片。 11、ヒトの結腸、肺、卵巣または乳房の癌により発現されたヒト多形性上皮ム チンコアタンパク質に対する請求の範囲第10項記載の抗体またはその断片。 12、妊娠のまたは乳汁を出すヒト乳房上皮組織により発現されたムチン糖タン パク質と有意に反応しない、請求の範囲第1および9〜11項のいずれかに記載 の抗体またはその断片。 13、請求の範囲第1および9〜11項のいずれかに記載のモノクローナル抗体 またはその断片。 14、請求の範囲第13項記載のモノクローナル抗体を分泌することができるハ イブリドーマ細胞。 15、HSM3(ECACC 87010701)と表示された細胞糸のハイプ リドーマ細胞。 16、HSM3(ECACC 87010701)により分泌されたモノクロー ナル抗体。 17、少なくとも17ヌクレオチド塩基からなり、a)DNA配列 【配列があります】 b)配列 【配列があります】 c)a)のDNA配列に対応する配列を有するRNA、および d)b)のDNA配列に対応する配列を有するRNA、の少なくとも1つと交雑 可能である核酸断片。 18、配列(a)〜(d)の少なくとも1つと交雑することができる少なくとも 30のヌクレオチド塩基の部分からなる請求の範囲第17項記載の核酸断片。 19、請求の範囲第17または18項記載のDNA断片。 20、請求の範囲第17項において定義したそれぞれ配列(a)および(b)を 有する逆平行の対になった部分からなる二本鎖DNA断片。 21、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有する請求の 範囲第1、9〜13および16項のいずれかに記載の抗体またはその断片。 22、ヒトまたは動物の体に実施する治療または診断の方法において使用するた めの請求の範囲第1、9〜13、16および21項のいずれかに記載の抗体また はその断片。 23、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有するヒト多 形性上皮ムチンコアタンパク質。 24、ヒトまたは動物の体に実施する治療または診断の方法において使用するた めの請求の範囲第2または23項記載のヒト多形性上皮ムチンコアタンパク質。 25、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有する請求の 範囲第3〜8項のいずれかに記載のポリペプチド。 26、ヒトまたは動物の体に実施する治療または診断の方法において使用するた めの請求の範囲第3〜8および25項のいずれかに記載のポリペプチド。 27、検出可能な標識または治療的にまたは診断的に有効な部分を有する請求の 範囲第17〜20項のいずれかに記載の核酸断片。 28、ヒトまたは動物の体に実施する治療または診断の方法において使用するた めの請求の範囲第17〜20および27項のいずれかに記載の核酸断片。 29、異常ヒトムチン糖タンパク質を含有することが疑われる試料を請求の範囲 第1、9〜13、16および21項のいずれかに記載の抗体またはその断片と接 触させるからなるアッセイ法。 30、請求の範囲第1、9〜13、16、21および22項のいずれかに記載の 抗体またはその断片を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断 または治療の方法。 31、請求の範囲第2、23または24項のいずれかに記載のヒト多形性上皮ム チンコアタンパク質を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断 または治療の方法。 32、請求の範囲第3〜8、25および26項のいずれかに記載のポリペプチド を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断または治療の方法。 33、請求の範囲第17〜20、27および28項のいずれかに記載の核酸断片 を投与することからなるヒトまたは動物の体に実施する診断または治療の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010518870A (ja) * 2007-02-27 2010-06-03 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 生物材料の固定

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ222509A (en) 1986-11-19 1993-03-26 Oncogen Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen
US6054438A (en) * 1987-01-07 2000-04-25 Imperial Cancer Research Technology Limited Nucleic acid fragments encoding portions of the core protein of the human mammary epithelial mucin
WO1990005142A1 (en) * 1988-11-10 1990-05-17 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Polypeptides
JPH02273195A (ja) * 1988-11-17 1990-11-07 Univ Melbourne ヒト多型性上皮ムチンと反応するモノクローナル抗体
JPH02255097A (ja) * 1989-03-29 1990-10-15 Ikuo Yamashina 単クローン抗体nny128
GB8929097D0 (en) * 1989-12-22 1990-02-28 Imp Cancer Res Tech Mucin nucleotides
CA2040513A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-17 Robert C. Bast, Jr. Method of diagnosing cancer
GB9019553D0 (en) * 1990-09-07 1990-10-24 Unilever Plc Specific binding agents
FR2668064B1 (fr) * 1990-10-23 1994-12-16 Transgene Sa Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prevention d'une tumeur maligne.
AU685539B2 (en) * 1993-12-24 1998-01-22 The Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
US6548643B1 (en) 1994-11-16 2003-04-15 Austin Research Institute Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
CA2269349A1 (en) * 1996-10-25 1998-04-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mucin-mediated immunomodulation
US7550146B2 (en) 1997-04-16 2009-06-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glycopeptide conjugates and uses thereof
CA2286798C (en) 1997-04-16 2014-01-07 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Alpha-o-linked glycoconjugates with clustered(2,6)-st epitopes, methods of preparation and uses thereof
GB9717946D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Imp Cancer Res Tech Novel chemical entity
DE19758400A1 (de) * 1997-12-30 1999-07-01 Max Delbrueck Centrum Tumorvakzine für MUC1-positive Karzinome
DE19917195B4 (de) * 1999-04-16 2006-09-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptid zur Auslösung einer Immunreaktion gegen Tumorzellen, diese enthaltende pharmzeutische Zusammensetzungen, dessen Verwendungen, dafür codierende Nukleinsäure und diese Nukleinsäure enthaltender Expressionsvektor
DE60027905T2 (de) 1999-08-20 2007-05-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glycokonjugate, glycoaminosäure, deren zwischenprodukte, und ihre verwendung
US7824687B2 (en) 1999-08-20 2010-11-02 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Clustered multi-antigenic carbohydrate constructs, methods for their preparation, and uses thereof
US7854934B2 (en) 1999-08-20 2010-12-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glycoconjugates, glycoamino acids, intermediates thereto, and uses thereof
ES2377077T3 (es) 2000-10-18 2012-03-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacunas que comprenden al antígeno MAGE unido a un fragmento de proteína D
AU2002246791C1 (en) 2000-12-22 2008-04-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Regulation of cell growth by MUC1
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US6716627B2 (en) 2001-12-20 2004-04-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of mucin 1, transmembrane expression
US7696306B2 (en) 2003-07-11 2010-04-13 Board of Agents of the University of Nebraska Compositions and methods for preventing or treating cancer
WO2005042573A1 (en) 2003-10-24 2005-05-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulation of the interaction of muc1 with muc1 ligands
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
WO2008097840A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of muc1 by hsf1 and stat3
WO2008097844A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Dana -Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions relating to the regulation of apoptosis by muc1 and bh3- containing proapoptotic proteins
TW200911304A (en) 2007-05-24 2009-03-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Lyophillised antigen composition
WO2011140595A2 (en) 2010-05-10 2011-11-17 4G Vaccines Pty Ltd Immunostimulatory and vaccine compositions
US9074973B2 (en) 2010-08-06 2015-07-07 Ykk Corporation Cloth evaluation apparatus
RU2016133593A (ru) * 2014-02-06 2018-03-07 Медисинал Кемистри Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело против гликопептида муцина 4 (muc4) и его применение
EP4286410A1 (en) 2021-01-27 2023-12-06 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Single-domain antibody against cd16a and use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990005142A1 (en) * 1988-11-10 1990-05-17 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Polypeptides
JPH02273195A (ja) * 1988-11-17 1990-11-07 Univ Melbourne ヒト多型性上皮ムチンと反応するモノクローナル抗体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL.OF.CELL.BIOLOGY=1986 *
PROC.NATL.ACAD.SCI=1987 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010518870A (ja) * 2007-02-27 2010-06-03 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 生物材料の固定

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000333675A (ja) 2000-12-05
JPH10276773A (ja) 1998-10-20
EP0341252A1 (en) 1989-11-15
CA1339204C (en) 1997-08-05
DE3856072T2 (de) 1998-03-12
WO1988005054A1 (en) 1988-07-14
EP0823438A3 (en) 1999-09-15
EP0341252B1 (en) 1997-11-19
EP0823438A2 (en) 1998-02-11
AU1103988A (en) 1988-07-27
DE3856072D1 (de) 1998-01-02
EP1103623A1 (en) 2001-05-30
ATE160361T1 (de) 1997-12-15

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