KR101458483B1

KR101458483B1 - 신장암 진단 조성물 및 키트

Info

Publication number: KR101458483B1
Application number: KR1020080076462A
Authority: KR
Inventors: 김동수; 조남훈; 나형진; 최영득; 장재호; 김혜경; 박모열; 박원만; 김태훈; 이동희; 박경목
Original assignee: 제노마인(주)
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2014-11-10
Also published as: KR20090014979A; WO2009020343A3; WO2009020343A2; US8278058B2; US20100297661A1

Abstract

본 발명은 신장암 진단 조성물 및 진단 키트를 개시한다.

본 발명의 신장암 진단 조성물 및 진단 키트는 신장암 마커로서 니코틴아미드-N-메틸트랜스퍼라제(nicotinamide-N-methyltransferase), 엘-플라스틴(L-Plastin), 시크리타고긴(secretagogin), 엔엠23에이(NM23A), 액틴 조절단백질(CapG), 및/또는 C4 컴플리멘트의 가수분해된 산물을 이용한다.

신장암, 진단

Description

신장암 진단 조성물 및 키트{Diagnostic Composition and Kit for Renal Cell Carcinoma}

본 발명은 신장암 진단 조성물 및 키트에 관한 것이다.

신장에 발생하는 종양에는 성인에서 발생하는 신장 세포암(kindney cell cancer), 소아에게 발병하는 윌름 종양(Wilms's tumor), 및 드물게 발생하는 샤코마(sarcoma)가 있다.

신장암 진단 방법으로는 외과적 방법과 생화학적 방법을 들 수 있는데, 외과적 방법은 CT 촬영 검사법, 혈관 조영 검사법 등을 말하며, 생화학적 방법은 신장암에 특이한(즉 신장암에서만 그 발현량이 특이적으로 증가하거나 감소하는) 단백질이나 유전자 등 진단 마커에 결합하는 항체 등 프로브를 이용한 방법을 말한다.

신장암에 있어, 신장암에 특이적인 mRNA나 단백질을 이용하고자 하는 기술들로서는, 유전자 발현의 차를 이용하는 방법(WO 2005/024603호), 신장암에서 발현량이 증가하는 MMP2를 진단 마커로 사용한 방법(Lein, M. 외, International Journal of Cancer, 2000년, 제85권, p.801-804), 신장이 이상이 있을 때 발현이 증가하는 것으로 알려진 TNFRSF7(Nakatsuji, T., Clinical and Experimental Medicine, 2003년, 제2권, p.192-196)를 진단 마커로 사용하는 방법, 기타 신장암과 관련하여 그 발현이 증가하는 것으로 알려진 MCM3AP(일본공개특허 제2005-520536호), KRT19(일본공개특허 제2005-507997호), SLK4(국제공개특허 WO 2002/06339), FGF2(Miyake, H. 외, 1996년, Cancer Research, 제56권, p.2440-2445), MMP14(Kitagawa, Y. 외, 1999년, Journal of Urology, 제162권, p.905-909), ERBB2(Freeman, M. R. 외, 1989년, Cancer Research, 제49권, p.6221-6225) 등을 진단 마커로 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 기타 국제공개특허 WO 2006/099485A2, 미국공개특허 2006/0183120A1, 국제공개특허 WO 2003/046581 등도 신장암에 특이적인 진단 마커를 이용하는 방법을 개시하고 있다.

본 발명도 신장암에 특이적인 단백질을 진단 마커로 이용하고자 하는 관점에서 완성된 것이다.

본 발명의 기술적 과제는 신장암 진단 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 기술적 과제는 신장암 진단 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 기술적 과제는 신장암 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 기술적 과제는 신장암 유발 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 일 측면에 있어서, 신장암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 신장암 진단용 조성물은, 니코틴아미드-N-메틸트랜스퍼라제(nicotinamide-N-methyltransferase, NNMT), 엘-플라스틴(L-Plastin), 시크리타고긴(secretagogin, SCGN), 엔엠23에이(NM23A), 액틴 조절단백질(CapG) 및/또는 C4 컴플리멘트(C4 complement)의 가수분해된 펩티드 중의 하나로 아나필로톡신부위를 포함하는 펩티드(C4aANA)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서 NNMT는 니코틴아미드(nicotinamide)를 N-메틸화(N-methylation)시키는데 관여하는 효소이며 암과의 관련성에서는 거의 알려진 바가 없다. 264개의 아미노산으로 구성되어 있으며(서열번호 1 참조; 그것의 유전자 서열은 서열번호 2 참조), 분자량은 29.6KDa이다. 본 발명에서 수행한 이차원 전기영동분석에서는 등전점이 5.12이며, 분자량이 29.2로 측정되었다. 그것의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 본 명세서의 개시 내용 또는 Genebank 테이터베이스(Gene ID:U08021.1), Swiss-PROT의 테이터베이스(Swiss-PROT:P40261 & U08021)로부터 얻어낼 수 있다.

엘-플라스틴(LCP-1으로도 한다)은 액틴 결합 단백질 계열의 일종으로 L 형과 T 형 두 가지 형태가 있으며, 이중 L 형은 hemopoietic cell이서만 발현이 되는 것 으로 알려져 있다. 그러나 암 발생 과정에서는 다른 종류의 세포에서도 발견이 되는 것으로 알려져 있다. 신장암과 관련해서는 L-plastin이 알려진 바가 없다. 627개의 아미노산으로 구성이 되어 있으며(서열번호 3 참조; 그것의 유전자 서열은 서열번호 4 참조), 분자량은 70.8KDa이다. 본 발명에서 수행한 이차원 전기영동분석에서는 등전점이 4.83 이며, 분자량이 67.03으로 측정이 되었다. 이것의 유전자 서열 및 아미노산 서열도 본 명세서의 개시 내용 또는 Genebank 테이터베이스(Gene ID:M22300), Swiss-PROT의 테이터베이스로(Swiss-PROT:P13796)부터 얻어낼 수 있다.

SCGN은 췌장에서 주로 발현되며, 다른 조직에서는 적은 양으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 뇌의 국소빈혈이 일어날 때 혈청에서 발견되기도 한다. 276개의 아미노산으로 구성되어 있으며(서열번호 5 참조; 그것의 유전자 서열은 서열번호 6 참조) 분자량은 32.2KDa이다. 본 발명에서 수행한 이차원 전기영동분석에서는 등전점이 4.68이며, 분자량이 32.5로 측정이 되었다. SCGN은 뇌암에서 발현이 변화한다는 결과가 논문에서 보고된 적이 있다(APMIS. 2007 Apr;115(4):319-26 ). 이것의 유전자 서열 및 아미노산 서열도 본 명세서의 개시 내용 또는 Genebank 테이터베이스(Gene ID:Y16752), Swiss-PROT의 테이터베이스(Swiss-PROT:O76038)로부터 얻어낼 수 있다.

엔엠23에이는 종양의 전이가 활발하게 일어날 때 mRNA의 양이 감소하는 것으로 알려진 유전자의 단백질로 A 형태의 이성질체이다. 152개의 아미노산으로 이루어져 있으며(서열번호 7 참조; 그것의 유전자 서열은 서열번호 8 참조), 이론적인 분자량은 16.9KDa이다. 본 발명에서 수행한 이차원전기영동 분석에서는 등전점이 5.8, 분자량이 17.3KDa으로 관찰이 되었다. 신장암에서는 본 발명자에 의해 단백질의 발현이 암조직에서 증가하는 것으로 관찰되었다. 이것의 유전자 서열 및 아미노산 서열도 본 명세서의 개시 내용 또는 Genebank 테이터베이스(Gene ID: NM_198175 & NP_937818)로부터 얻어낼 수 있다.

액틴 조절단백질은 엑틴 섬유의 말단을 차단하는 기능을 가지고 있으며, 세포질과 핵의 구조를 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 종양과 관련해서는 췌장암(Gut. 2007 Jan;56(1):95-106.2006 Jul 17.)과 구강상피세포암(oral squamous-cell carcinoma)(BMC Cancer. 2008 Feb 1;8:39)에서 발현이 증가하며, 이 결과는 암세포의 이동성과 전파에 영향을 미치는 것으로 최근의 연구논문 결과로 알려졌다. 아직 신장암에서의 연구 결과는 알려지지 않고 있다. 238개의 아미노산 서열로 이루어졌으며(서열번호 9 참조; 그것의 유전자 서열은 서열번호 10 참조), 본 발명에서 수행한 이차원 전기영동분석에서는 등전점이 6.3이며, 분자량이 40.6KDa으로 측정이 되었다. 이것의 유전자 서열 및 아미노산 서열도 본 명세서의 개시 내용 또는 Genebank 테이터베이스(Gene ID:U12026), Swiss-PROT의 테이터베이스로(Swiss-PROT:P40121)로부터 얻어낼 수 있다.

C4aANA는 혈액에서 국부적인 염증반응을 매개하는 C4 컴플리멘트의 가수분해된 펩티드중의 하나로 아나필로톡신부위를 포함하는 펩티드이다. C4aANA는 신장암 환자의 혈액에서 그 양이 증가하며 Complement C4-A precursor(Swiss-PROT: P0C0L4)(서열번호 11 참조; 그것의 유전자 서열은 서열번호 12 참조)의 710~945번 째 서열에 해당하는 245개의 아미노산으로 구성된 펩티드 조각이다. 신장암을 포함해서 여러 다른 암에서도 이 펩티드가 증가한다는 보고는 없었다. 이것의 유전자 서열 및 아미노산 서열도 본 명세서의 개시 내용 또는 Swiss-PROT의 테이터베이스로(Swiss-PROT: P0C0L4 & K02403)로부터 얻어낼 수 있다.

본 명세서에서는 편의상 위 단백질들을 신장암 마커라 한다.

본 발명은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이 위 신장암 마커가 신장암 환자에서 발현되거나 그 발현량이 정상인의 신장 조직 또는 신장의 정상 조직에 비해 높은 단백질들이다.

본 발명의 신장암 진단용 조성물은 신장암 이환(罹患)의 유무, 신장암의 진행 정도 및/또 신장암의 치료 경과를 판별하기 위해서 직·간접적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 하나의 신장암 마커에 대한 하나의 항체만을 포함하거나 두 개 이상의 신장암 마커에 대한 서로 다른 항체의 혼합물을 포함할 수 있으며, 그 형태는 동결건조된 형태의 고체, 수용액이나 완충 용액 형태의 용액 등 임의의 형태일 수 있다.

본 발명의 신장암 진단용 조성물은 생체 시료에 접촉됨으로써 신장의 정상 조직 또는 정상인과 비교하여 위 신장암 마커의 발현 수준을 측정하는 데 사용된다.

위 마커의 발현 수준이 기준값보다 높다면 신장암으로 판정하게 될 것이다. 여기서 기준값은 여러 건강한 개체로부터 분리된 시료 및/또는 여러 종양을 가진 개체로부터 분리된 시료에서 측정된 위 신장암 마커의 발현량의 평균 수치로부터 산정될 수 있다.

본 명세서에서, "생체 시료"란 신장암의 발생 또는 진행 정도에 따라 상기 신장암 마커의 발현 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말한다. 상기 생체 시료에는 예컨대 신장 조직, 신장암 조직, 이들의 조직에서 유래하는 세포, 혈액, 혈장, 혈청 등 체액 등이 포함될 수 있다.

본 명세서에서, "특이적 결합"의 의미는 항체가 그 표적 단백질인 신장암 마커와 항원-항체 결합체를 형성하고, 다른 단백질과는 실질적으로 그러한 결합체를 형성하지 않는 경우를 의미한다. 여기서 "실질적으로"란 정도는 낮지만 비특이적인 결합체는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 "특이적 결합"의 의미는 달리 표현할 경우 그 결합이 단백질의 특정 구조 즉 항원의 결정 부위인 에피토프에 의해서 결정되는 결합이라고 표현될 수도 있다.

본 명세서에서, "에피토프"란, 본 발명의 신장암 마커에서 항원성 또는 면역원성을 갖는 부분의 아미노산 영역(항원 결정기)을 가리킨다. 에피토프는 통상 적어도 적어도 10개 아미노산을 포함할 것이다. 이러한 에피토프는 당업계의 공지·관용된 에피토프 해석법 예컨대, 파시 제시(phage display)법, 역면역유전학(reverse immunogenetics) 등에 의해서 동정할 수 있다.

본 명세서에서, "항체"는 본 발명의 신장암 진단 마커에 특이적으로 결합하는 것이면 모든 형태의 것을 포함하는 의미이다. 따라서 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프를 인 식하는 항체로서 예컨대 이특이적 항체 등을 말함)를 포함하는 것 이외에, 본 발명의 신장암 진단 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편, 재조합 항체, 화학적으로 수식된 항체를 포함한다. 여기서 항체의 단편의 예로서는 Fab, F(ab')₂, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체), 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편, 단편에 대한 유전자를 후술하는 바와 같이 유전자 재조합 방법으로 숙주세포에 도입·발현시켜 얻어지는 항체 단편을 포함하는 의미이다. 상기 항체의 글로불린 유형도 본 발명의 신장암 진단 마커에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않는데, 그 글로불린 유형은 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 하나일 수 있다.

상기 항체를 사용하여, 그 항체에 특이적으로 결합된 생체 시료의 신장암 마커의 발현량을 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법, 발광 면역 측정법 등 다양한 당업계의 공지·관용된 면역학적 측정 방법에 의해서 정량적 및/또는 정성적으로 분석하는 것이 가능하며, 그러한 정량적·정성적 분석을 통하여 신장암 이환의 유무, 신장암 진행 정도, 치료 정도를 판별할 수 있다.

상기 효소면역측정법에는 퍼옥시다제(POD), 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스옥시다제, 락트산 탈수소 효소, 아밀라제 또는 비오틴-아비딘 복합체 등의 효소가 사용될 수 있고, 형광 면역 측정법의 경우에는 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 치환 로다 민이소티오시아네이트, 디클로로트리아진이소티오시아네이트, 알렉사(Alexa) 또는 알렉사플루오로(AlexaFluoro) 등의 형광성 물질 또는 형광단이 사용될 수 있으며, 방사 면역 측정법에는 트리티움, 요오드(¹³¹I,¹²⁵I,¹²³I,¹²¹I), 인(³²P), 황(³⁵S), 금속류(예를 들면, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ge, ⁵⁴Mn, ⁹⁹Mo, ⁹⁹Tc, ¹³³Xe 등) 등의 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, 발광 면역 측정법에는 루시퍼라제 방법, 루미놀 퍼옥시다제 POD 방법 등이 디옥세탄 화합물 등의 발광성 물질 등과 함께 사용될 수 있다.

아비딘-비오틴 방법, 스트렙토아비딘-비오틴 방법 등을 이용할 때처럼 항체가 필요에 따라서는 표지 물질과 결합될 수도 있다. 표지 물질과 항체의 결합은 효소 면역 측정법에 있어서는 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법, 과요오드산법 등의 방법이 사용될 수 있으며, 방사 면역 측정법에 있어서는 클로라민 T법, 볼턴-헌터법 등의 방법이 사용될 수 있다.

면역학적 측정 방법으로는 상기 예시한 4가지 방법 이외에, 면역 침강법, 면역비탁법, 웨스턴 블로팅법, 면역 염색법, 면역 확산법 등을 추가로 예시할 수 있으나 상기 4가지 방법을 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 효소 면역 측정법, 가장 바람직하게는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하는 경우이다.

면역학적 측정 방법에 의한 결과로서 측정 대상의 신장암 여부에 대한 정확성의 판단은 ROC(Receiver Ooperating Characteristic) 방법을 이용할 수 있고 AUC(Area Under Curve)를 정확성의 척도로 사용할 수 있다. ROC는 민감성 및 특이 성을 판별하는 방법으로 대표적으로 사용하고 있는 방법이다(Zweig, M.H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). ROC의 AUC는 0.5~1사이의 값을 가지게 되며, 0.5의 값은 환자와 정상인 간에 차이가 없어 구분을 할 수 없음을 말하며, 1은 환자와 정상인이 완전히 구분되는 평가가 됨을 나타내는 것이다.

한편 폴리클로날 항체는, 조류(예를 들면, 닭 등), 포유 동물(예를 들면, 토끼, 염소, 말, 양, 쥐 등) 등의 동물에 본 발명의 신장암 진단 마커를 면역시킴으로써 제조할 수 있다. 항체는 면역된 동물의 혈액으로부터 당업계의 공지·관용된 방법 예컨대 이온교환크로마토그래피, 친화도-크로마토그래피 등의 방법을 사용하여 정제할 수 있다.

모노클로날 항체는 본 발명의 신장암 진단 마커에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 의해서 얻어질 수 있다. 이러한 하이브리도마 세포주를 생산하기 위한 방법으로서, 예컨대 동물(예컨대, 마우스)을 본 발명의 신장암 진단 마커로 면역시키고, 그 면역시킨 동물로부터 비장 세포를 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시키고, 그에 따라 하이브리도마 세포를 생성하고, 그리고 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 방법을 들 수 있다. 그러한 세포주로부터 모노클로날 항체의 분리·회수는 당업계의 공지·관용기술에 의해서 가능하다.

본 발명의 항체는 전술한 바와 같이 본 발명의 신장암 진단 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 것을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용하는 경우이다.

따라서 아래에서 본명의 모노클로날 항체의 제조 방법에 대해서 보다 자세히 설명한다.

먼저 모노클로날 항체를 얻기 위해서는 면역원인 본 발명의 신장암 진단 마커를 포유동물, 예를 들면 랫드, 마우스, 토끼, 원숭이, 염소 등에 투여할 필요가 있다. 면역원의 1회 투여량은 당업자가 면역 동물의 종류, 투여 경로 등을 고려하여 그의 통상의 능력 범위 내에서 적절하게 결정할 수 있다. 통상은 동물 1 마리당 약 50 내지 200 ㎍일 것이다. 투여는 통상 면역원을 PBS(phospate-buffered saline)나 생리 식염수 등으로 적당량 희석·현탁시키고 통상의 어쥬번트를 혼합하고 유화한 후에 피하, 복강 내에 주입함으로써 행해질 수 있다. 이러한 투여는 처음의 투여 후 수일에서 수주 간 간격으로, 바람직하게는 1 내지 4주간 간격으로 2 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 4회에 걸쳐 이루어질 것이다. 면역원의 투여를 계속하면서 ELISA 방법 등에 의해서 면역 동물의 혈청 중 항체가를 측정하여 항체가가 정점(plateau)에 도달했을 때는, 최종적으로 면역원을 정맥 내 또는 복강 내에 투여하고, 그 최종 투여일로부터 2 내지 5일 후에 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 비장 세포 또는 림프절 세포가 바람직하다.

항체 생산 세포를 채취한 후에는 투여된 면역원 즉 본 발명의 신장암 진단 마커에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마는 당업계의 공지·관용 기술에 의해서 생산하고 동정하는 것이 가능하다. 통상은 항체 생산 세포 바람직하게는, 비장 세포를 면역된 동물로부터 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조하며, 면역원에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 단계를 거치게 될 것이다. 항체 생산 세포와 융합되는데 사용되는 골수종 세포주는 마우스 등의 동물로부터 유래한 세포주를 사용할 수 있는데, 이러한 세포주는 상업적으로 입수 가능하다. 바람직한 골수종 세포주는 면역 동물과 동종계의 동물에서 유래하고, 항생제 등에 대한 약제 선택성을 지니며, 비장 세포와 융합되지 아니한 상태로는 히포크산틴, 아미노푸테린 및 티민을 포함하는 HAT 선택 배지에서 생존할 수 없고 비장 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 특성을 지니는 것이 바람직하다. 골수종 세포주의 구체적인 예로서는 BALB/c 마우스 유래의 HGPRT(hypoxantine guanine phosporibosyl-transferase) 결손 세포주인 P3X63(ATCC TIB9) 등을 들 수 있다.

항체 생산 세포인 비장 세포와 골수종 세포주의 융합은 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 적정한 비율(약 1:1 내지 20:1의 비율)로 혼합하고, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 수행함으로써 이루어지게 된다. 세포 융합 촉진제로서 평균 분자량 1500 내지 4000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 약 10 내지 80 ％의 농도로 사용할 수 있다. 또한 경우에 따라서는 융합 효율을 높이기 위해서, 디메틸술폭시드 등의 보조제를 병용할 수도 있다. 또한 시판되고 있는 세포 융합 장치를 이용하여 융합시킬 수도 있다.

세포 융합 처리 후, 목적으로 하는 하이브리도마를 선별하여야 한다. 통상 세포 현탁액을 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당히 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 세포를 웰당 200만개 정도로 분주하고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 동일한 선택 배지로 적절히 교환하여 줌으로써 신선한 배지를 공급하며 배양한다. 배양 온도는 통상 20 내지 40 ℃이다. 골수종 세포주가 HGPRT 결손주 또는 티미딘 키나제 결손주인 경우에는 히포크산틴·아미노프테린·티미딘을 포함하는 선택 배지(HAT 배지)를 이용함으로써, 항체 생산 세포와 골수종 세포주의 하이브리도마만을 선택적으로 배양하고 증식시킬 수 있다. 그러면 선택 배지에서 배양 개시 후 약 14일 전후에서 생육되는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다. 이어서, 증식된 하이브리도마의 상등 배양물에서 목적으로 하는 항체의 존재 여부를 스크리닝한다. 이러한 하이브리도마의 스크리닝은 당업계의 공지·관용 기술에 따라 이루어질 수 있다. 그러한 기술로서 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA: Enzyme Immuno Assay 및 ELISA), 방사 면역 측정법 등을 들 수 있다. 융합 세포의 클로닝은 한계 희석법(limiting dilution method) 등에 의해 이루어질 수 있다.

클로닝된 하이브리도마는 10% 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, DMEM 배지, 무혈청 배지 등 동물 세포 배양 배지에서 통상의 배양 조건(예를 들면, 37 ℃, 5 ％ CO2 농도)에서 배양하면 된다. 배양 기간은 2 내지 10일 정도이다. 모노클로날 항체는 그 상등 배양물로부터 수득할 수 있다.

모노클로날 항체는 당업계의 공지·관용 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 그러한 당업계의 공지·관용 기술로서는 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법 또는 이들을 조 합한 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체의 생산에는 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 삽입시키고 이를 적당한 숙주세포에 도입·발현시켜 수득하는 유전자 재조합 기술을 이용할 수도 있다(Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990).

구체적으로 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 본 발명의 항체의 가변 영역을 암호화하는 mRNA을 수득한다. 그 mRNA의 수득은 당업계의 공지·관용된 방법, 예를 들어 구아니딘 초원심분리법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry., Vol 18, 5294-5299, 1979), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159) 등을 사용하여 전체 RNA를 수득하고 그 전체 mRNA로부터 mRNA Purification Kit(Pharmacia 사) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 수득함으로써 이루어진다. 대안적으로는 QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품)을 이용함으로써, mRNA를 직접 수득할 수도 있다.

수득된 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. 필요하다면 cDNA 합성·증폭에 RACE PCR 방법 등을 적용할 수도 있다. 이렇게 얻어진 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 항체의 불변 영역(C 영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터에 삽입한다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 신장암 마커의 DNA 재조합 생산 방법과 관련하여 후술하는 바와 같이 프로모터, 인핸서, 복제 개시점, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위 등 조절서열을 포함할 수 있다. 이 발현벡터가 숙주 세포에 형질전환되면 항체의 생산이 가능하게 된다. 항체 유전자의 발현 은 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하며, 또는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 삽입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(WO 94/11523호 공보).

한편, 본 발명의 항체를 얻기 위하여 사용한 면역원으로서의 본 발명의 신장암 마커는 당 업계의 공지·관용된 DNA 재조합 기술에 의하여 얻을 수 있다. 통상적으로는, 본 발명의 신장암 마커의 cDNA를 제작하고 그 cDNA를 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 형질전환시키고 그 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양액 또는 세포로부터 얻게 될 것이다. 상기 cDNA는 GenBank, RefSeq, Entrez Gene, UniProtKB, Swiss-Prot 등의 유전자/단백질 테이터베이스가 제공하는 유전자 서열 또는 본 명세서가 제공하는 서열에 기초하여 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 제작 가능하다.

이러한 cDNA의 제조에는 포스포아미다이트법 등을 이용하는 DNA 합성 장치, RT-PCR 법, cDNA 라이브러리로부터 목적하는 cDNA를 얻기 위한 혼성화 방법 등이 사용될 수 있고, 필요에 따라서는 PCR 방법 등에 의해서 목적하는 cDNA를 증폭할 수도 있다.

상기에서 발현 백터는 생명공학 회사 예컨대 노바겐(Novagen) 사, 다까라슈죠 사, 키아겐(Qiagen)사, 스트라타진(Stratagene) 사, 프로메가(Promega) 사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics) 사, 인비트로겐(Invitrogen) 사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사 등으로부터 상업적으로 입수 가능하다.

이러한 발현 벡터에는 본 발명의 신장암 진단 마커를 코딩하는 DNA 이외에 조절 엘리멘트, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜, 결합 부위, 복제 개시점, 터미네이터, 선택 마커, 단리·정제를 용이하게 하기 위한 표지 펩티드 서열(예컨대 히스티딘 반복 서열을 암호화하는 염기서열) 등이 포함될 수 있다.

숙주 세포는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균), 및 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다.

숙주 세포 또는 그 배양물로부터 본 발명의 신장암 마커의 정제에는 한외 여과, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피(표지 펩티드가 결합된 경우), HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등의 방법이나 이들을 조합하는 방법이 사용될 수 있다.

DNA 재조합 기술에 의한 본 발명의 신장암 마커의 생산에 대해서는 본 명세서의 기재 내용 이외에 "Samrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)", "Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Jon Willey & Sons, US(1993)" 및 "Sambrook, J. ＆ Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17" 등의 문헌을 참조할 수 있다. 이 문헌들은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 항체를 생산하기 위한 면역원으로서의 본 발명의 신장암 마커는 그 단편이 사용될 수도 있다. 단편을 사용하여 얻어지는 항체도 본 발명의 신장암 마커에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이 때문이다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 신장암 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명의 신장암 진단 키트는 본 발명의 신장암 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 신장암 진단 키트에 포함되는 항체는 단일물 또는 혼합물 형태일 수 있고, 고상 담체에 결합되어 있거나 유리된 형태일 수 있다.

본 발명의 키트는 신장암 마커의 발현량을 정량적 또는 정성적으로 확인할 수 있는 면역학적 방법에 사용되는 2차 항체(예컨대 신장암 마커의 발현량을 검출할 수 있는 형광 색소 등으로 표지된 신장암 마커에 대한 항체), 담체, 세정 버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 키트는 바람직하게는 정량적 또는 정성적으로 검출된 신장암 마커의 발현 정도로부터 신장암 이환의 유무, 개선 정도 등을 교시하는 설명서를 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 신장암 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 신장암 치료 물질의 스크리닝 방법은 신장암 세포주 또는 신장암 조직에 시험하고자 하는 물질을 접촉시키는 단계, 그러한 물질을 접촉시키지 않은 경우와 비교함으로써 신장암 세포주 또는 신장암 조직에서 본 발명의 신장암 마커 의 발현량을 감소시키는 물질을 검출하는 단계를 포함하여 이루어진다. 이러한 스크리닝 방법은 신장암이 유발된 랫드 등을 이용하거나 생체외(in vitro)에서 배양되는 신장암 세포주 또는 신장암 조직을 이용하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 신장암을 유발하는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 신장암을 유발하는 물질의 스크리닝 방법은 신장 세포주 또는 신장 조직에 시험하고자 하는 물질을 접촉시키는 단계, 그러한 물질을 접촉시키지 않은 경우와 비교함으로써 신장 세포주 또는 신장 조직에서 신장암 마커의 발현량을 증가시키는 물질을 검출하는 단계를 포함하여 이루어진다. 이 경우도 생체내 또는 생체외에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 신장암을 유발하는 물질의 스크리닝 방법은 다른 양태에 있어서 신장암 세포주 또는 신장암 조직을 이용할 수도 있다. 이 경우 본 발명의 신장암을 유발하는 물질의 스크리닝 방법은 신장암 세포주 또는 신장암 조직에 시험하고자 하는 물질을 접촉시키는 단계, 그러한 물질을 접촉시키지 않은 경우와 비교함으로써 신장암 세포주 또는 신장암 조직에서 신장암 마커의 발현량을 증가시키는 물질을 검출하는 단계를 포함하여 이루어진다. 이 경우도 마찬가지로 생체내 또는 생체외에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 신장암 진단 키트, 신장암 치료 물질의 스크리닝 방법, 신장암 유발 물질의 스크리닝 방법과 관련하여, 본 발명의 신장암 진단 조성물과 관련하여 설명한 바가 적용가능한 한 유효하다.

본 발명에 따르면 신장암 진단할 수 있는 조성물, 그 진단 키트 등을 제공할 수 있다.

<실시예 1> 신장암의 단백질 마커 발굴

<실시예 1-1> 정상인 및 환자로부터의 시료 채취

신장암에 특이적인 단백질의 발현 양상을 분석하기 위해서, 먼저 신장암 환자로부터 시료를 채취하였다.

시료는 13명의 신장암 환자로부터 채취한 총 13개의 암 조직 시료와, 암에 인접한 부위로부터 채취한 정상 신장 조직 시료 13개를 준비하였다.

또 신장암 환자 및 정상인으로부터 각각 혈액을 체취하고 이로부터 각 혈장을 수득하여 시료로 사용하였다.

또 정상 신장 조직 및 신장암 조직을 채취하여 파쇄 및 원심분리하여 세포막 분획을 시료로 사용하였다. 세포막 분획 시료는 신장암조직 200mg을 단백질 추출용 완충용액(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM benzamidin) 1ml로 조직분쇄기(파워젠125, 피셔사이언티픽사, 독일)을 이용하여 분쇄한 후 1시간 동안의 원심분리(12,000Xg)하여 상등액을 제거하고 불용성 세포막 분획을 취해서 마련하였다.

여기서 채취한 시료 중에는 3가지 타입(clear-cell RCC(renal cell carcinoma), papillary RCC, chromophobe RCC)의 신장암 환자의 시료가 포함되어 있으며, 신장암의 진행 정도(cancer mass의 size)에 따라 1~4단계(그레이드1(1개체), 그레이드2(2개체), 그레이드3(6개체), 그레이드4(4개체))의 그레이드를 갖는 환자의 시료가 포함되어 있다.

<실시예 1-2> 이차원전기영동 시료 준비

초저온 냉동고(-80℃)에 보관되어 있던 신장암(clear-cell RCC) 조직에서200mg을 수술칼로 분리하여 이차원전기영동용 단백질 추출 용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine) 0.6㎖와 혼합하고 조직분쇄기(파워젠125 ,피셔사이언티픽사, 독일)로 분쇄한 다음 교반기에서 1시간 동안 빠른 속도로 교반하여 단백질을 용해하였다. 그 다음 1시간 동안의 원심분리(12,000Xg)하여 상등액만을 취하여 이차원전기영동 분석에 사용할 시료를 준비하였다.

정상 신장 조직에 대해서도 상기와 동일한 방식으로 시료를 준비하였다.

혈장은 이차원전기영동용 단백질 추출용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%CHAPS, 1%DTT, 2% pharmalyte, 1mM benzamidine)에 1/40의 부피 비율로 섞고 교반기에서 1 시간 동안 빠른 속도로 교반하고 1시간 동안의 원심분리(12,000Xg)하여 상등액만을 취하여 단백질을 용해시켜 이차원전기영동 분석에 사용할 시료를 준비하였다.

정상 신장 및 신장암 조직의 세포막 분획 시료는 이를 이차원 전기영동용 용액(7M urea , 2M Thiourea, 4%CHAPS, 1%DTT, 2% pharmalyte, 1mM benzamidine) 0.2ml에 녹여 교반기로 상온에서 30분간 빠른 속도로 혼합한 후 원심분리(12,000Xg)하여 상등액만을 취하여 단백질을 용해시켜 이차원전기영동 분석에 사용할 시료를 준비하였다.

<실시예 1-3> 이차원 전기영동 실시

일차원 전기영동(Isoelectric focusing, IEF)을 위하여, 재수화(reswelling) 용액(7M urea, 2M thiourea, 2% CHAPS, 1% DTT, 1% pharmalyte)을 각 스트립당 0.6㎖씩 Dry Strip Reswelling Tray에 넣은 뒤, pH 4~ 10범위의 24cm Dry Strip(제노마인(주), 대한민국 포항 소재)를 장착시킨 후 상온에서 12-16시간 정도 재수화시켰다.

재수화된 각 스트립을 대상으로 상기에서 준비한 각 조직 시료 0.05㎖(단백질 0.2㎎), 각 혈장 시료 0.08㎖(단백질 0.2㎎) 및 각 세포막 분획 시료 0.08㎖(단백질 0.2mg)을 로딩하여 Amersham Biosciences 사의 Multiphore II system을 이용하여 제조회사의 사용 메뉴얼을 준수하여 20^oC에서 IEF를 수행하였다. IEF 조건은 150V에서 3,500V까지의 도달시간을 3시간 되게 하였으며, 3,500V에서 26시간 지속되도록 하여 최종적으로 96kVh 가 되도록 설정하였다.

이차원 전기영동(SDS-PAGE)를 수행하기 위해, IEF가 끝난 각 Strip을 를 1차 평형화 용액(equilibration buffer, 50mM Tris-Cl, pH6.8, 6M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 1% DTT)으로 10분간 incubation 하였으며, 곧바로 2차 평형화 용액(equilibration buffer, 50mM Tris-Cl, pH6.8, 6M urea, 2% SDS, 30% glycerol, 2.5% iodoacetamide)으로 더 incubation 하였다. 평형이 완료된 각 Strip을 SDS-PAGE gels(20x24cm, 10-16% 젤 농도구배) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D system(Amersham Biosciences)을 이용하여 20℃에서 최종적으로 1.7kVh가 되게 전개하였다.

이차원 전기영동이 완료된 젤의 단백질을 가시화하기 위하여 Oakley 등의 방법(Anal. Biochem. 1980, 105:361-363)에 따라 은 염색을 실시하였다. 전기영동이 끝난 젤을 고정용액(fixing solution; 40% Ethanol, 10% Acetic acid)에 1시간 교반 시킨 후, 재수화 용액(rehydration solution; 5% Ethanol, 5% Acetic acid )에 30분간 3차례 교반시킨다. 다음 3차 증류수로 30분간 3차례 깨끗하게 씻어준 후, 은 염색을 실시하였다. 은 염색 시약(0.8% Silver nitrate, 1.4% Ammonia solution(25%), 0.2% 10N NaOH)에 젤을 50분간 교반 후, 3차 증류수로 4분간 4차례 교반하여 씻어준다. 세척이 끝난 젤에 반응시약(development solution; 0.1% formaldehyde solution(37%용액), 0.01% citric acid)을 넣어준 후 단백질의 적당한 발색진행 상태에서 발색을 멈춘다. 이때 발색 중단시약(stop solution)으로는 재수화 용액(rehydration solution; 5% Ethanol, 5% Acetic acid )을 사용한다.

은 염색된 젤들은 이미지스캔너(Duoscan T1200 스캐너, AGFA 사, 독일)로 스캔하여 도 1 내지 도 6에 나타내었다.

도 1은 신장암 환자의 정상 신장 조직의 이차원 전기영동 사진이고, 도 2는 신장암 환자의 신장암 조직의 이차원 전기영동 사진이고, 도 3은 정상인의 혈장의 이차원 전기영동 사진이며, 도 4는 신장암 환자 혈장의 이차원 전기영동 사진이며, 도 5는 정상 신장 조직의 세포막 분획 시료의 이차원 전기영동 사진이고, 도 6은 신장암 조직의 이차원 전기영동 사진이다.

<실시예 1-4> 이미지 분석

스캐닝된 이미지로부터 단백질 spots의 발현 변화 확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software(version 7.0, BioRad)를 이용하여 수행하였다. 각 단백질 spot의 quantity는 total valid sopts의 intensity로 평준화(normalization)되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현 변화를 보여주는 단백질 spot들을 선정하였다.

여기서 120여 단백질 spot들을 잠재적인 마커 후보로 선정하고 이들에 각각의 일련 번호를 매겼다.

<실시예 1-5> 질량분석을 위한 단백질 절편화

단백질 spots은 Shevchenko 등의 방법(Anal. chem. 1996, 68:850-858)에 따라 다음과 같이 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해되었다.

먼저 유의한 발현 변화를 보여주는 단백질 spot의 젤을 오려내었다. 오려낸 젤 조각으로부터 SDS, 유기용매, 염색 시약 등의 불순물을 제거하기 위하여 50% acetonitrile로 세척하였다. 그 다음 단백질을 분해하기 위해 젤 조각에 단백질 분해 용액(8-10ng/㎕의 trypsin, trypsin digestion buffer: ACN 5%, NH₄HCO₃5%, DW 90%) 5㎕/spot)를 가하고 8-10 시간 동안 37℃에서 재수화시켜 단백질을 분해시킨 후, 0.5% trifluoroacetic acid 5㎕를 첨가하여 단백질 분해 반응을 종결시켰다. Trypsin에 의해 잘려진 단백질 단편들을 수용액 상태로 회수하고, C18ZipTips(Millipore, USA)을 이용하여 1-5㎕ 부피로 탈염 및 농축시켰다. 이 농축액을 동량의 매트리스 용액(50% aqueous acetonitrile에 포화된 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)과 혼합하고 질량 분석에 사용하였다.

<실시예 1-6> 질량분석기를 이용한 단백질 동정

질량분석기는 Ettan MALDI-TOF(Amersham Biosciences)를 사용하였다. Target plate 상에 상기 <실시예 1-5>에서 얻어진 시료를 적하하고 337nm의 N2 laser 조사시켜 기화시켰다. 다음 20Kv injection pulse에 의해 가속시켰다. 300 laser shots의 누적 peaks에 의해 각각의 단백질 spot에 대한 mass spectrum을 구하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 ion peak m/z(842.510, 2211.1046)를 표준 peaks로 이용하였다.

분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 Rockefeller 대학에서 개발한 ProFound 검색 엔진(http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe)을 이용하였다.

그 결과 신장암에서 특이적으로 발현량이 증가하는 총 9개의 단백질, 즉 니코틴아미드-N-메틸트렌스퍼레이스(nicotinamide-N-methyltransferase, NNMT), 엘 플라스틴(L-Plastin), 시크리타고긴(secretagogin, SEGN), 뉴런-특이적-에놀레이스(human neuron specific enolase, hNSE), 내피세포성장요소-1(Endotherial cell growth factor-1, ECGF-1), 페리틴(ferritin light subunit), 엔앰23A(NM23A), 액 틴 조절 단백질(CapG) 및 C4aANA을 동정할 수 있었다.

상기 단백질 중 니코틴아미드-N-메틸트렌스퍼레이스(nicotinamide-N-methyltransferase, NNMT), 엘 플라스틴(L-Plastin), 시크리타고긴(secretagogin, SEGN), 액틴 조절 단백질(CapG), 엔앰23A(NM23A) 및 C4aANA은 신장암에서 발현량이 증가한다는 것이 보고되지 아니한 단백질들이다.

한편 도 7은 신장암에서 특이적으로 발현량이 증가하는 8개의 단백질 즉 NNMT, 뉴런-특이적-에놀레이스(human neuron specific enolase, hNSE), 엘-플라스틴, 내피세포성장요소-1(Endotherial cell growth factor-1, ECGF-1), SEGN, 페리틴(ferritin light subunit), 엔앰23A(NM23A) 및 액틴 조절 단백질(CapG)의 spot을 도 1, 2, 5 및 6의 이차원 전기영동 사진에서 부분적으로 확대하여 확인한 사진이며, 도 8은 신장암에서 특이적으로 발현량이 증가하는 단백질인 C4aANA의 spot을 도 3 및 4의 이차원 전기영동 사진에서 부분적으로 확대하여 확인한 사진이다.

도 9 내지 도 17은 각각 NNMT, 엘-플라스틴, SEGN, hNSE, ECGF-1, 페리틴, NM23A, CapG 및 C4aANA의 mass spectrum 및 ProFound 검색 엔진을 이용하여 단백질을 동정한 결과이다.

상기 실험 결과는 clear-cell RCC 신장 조직을 시료로 한 것이지만, 본 발명자들은 다른 유형의 신장암(papillary RCC 및 chromophobe RCC) 조직 시료의 경우에도 상기와 동일한 방식으로 실험하였는데, 정상 신장 조직 시료에 비해 정도의 차이는 있었지만 위 7개의 단백질들의 발현량이 증가함을 확인한 바 있다.

<실시예 2> 웨스턴블랏팅을 통한 NNMT 의 신장암 조직과 정상 신장 조직에서 의 발현량 차이 확인

본 실험에서는 위 실시예에서 신장암에서 발현량이 증가하는 것으로 확인된 단백질 중 NNMT에 대해 그것이 신장암 조직과 정상 신장 조직에서 발현량의 차이를 웨스턴블랏팅을 통해 확인하였다.

<2-1> NNMT 의 재조합 항원의 제조

먼저 NNMT 유전자는 단백질 대량 발현 벡터 pBAD/Myc-His A에 클로닝하기위하여 제한효소 XhoI을 포함하는 forward primer 5'-CTC GAG AGA ATC AGG CTT CAC CTC CAA GGA-3'와 HindIII를 포함하는 reverse primer, 5'-AAG CTT CAG GGG TCT GCT CAG CTT CCT C-3'를 이용하여 PCR 과정을 거쳐 분리 하였다.

PCR을 통해 클로닝된 NNMT 유전자는 pBAD/Myc-His A 벡터에 삽입시켜, NNMT의 대량 발현을 위해 대장균(BL21)에 형질전환하였다. pBAD/Myc-His A벡터의 C-terminal의 6 histidine tag과 재조합된 NNMT 유전자를 가지는 것으로 확인된 대장균 클론은 세포 배양액(항생제 Ampicillin 100mg/L가 포함된 Luria-bertani broth medium)에서 37℃에서 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 진탕배양한 후 20% 아라비노스용액을 최종 농도가 0.2-0.0002%가 되도록 투여해 추가적으로 3시간을 더 배양해 NNMT의 과발현을 유도하였다. 배양된 대장균용액은 8,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 대장균 침전물을 분리하였으며 정제가 이루어질 때까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

<실시예 2-2> NNMT 의 정제

과발현을 유도한 대장균은 6배 부피의 완충용액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM immidazol)으로 현탁하고 초음파 세포분쇄기로 50% 동일주기 사이클로 2분씩 4번을 반복하여 대장균세포를 분쇄하였다. 불용성 물질은 고속원심분리를 통하여 제거하고 상층액은 완충용액((50mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM immidazol)으로 충진된 Ni-NTA column에 주입하여 통과시킨 후 10배 부피의 동일 완충용액으로 세척했다. 세척된 컬럼은 100mM 이미다졸(immidazol)이 포함된 동일한 완충용액으로 단백질을 용출하여 용출된 단백질은 150mM NaCl이 포함된 완충용액에 투석했다.

<실시예 2-3> 항체 제조 및 정제

NNMT 항체를 제조하기 위해 정제된 NNMT 단백질로 면역을 실시하였다. 새로 준비된 불완전 아주번트(incomplete adjuvant)와 NNMT 용액(0.1mg/ml)을 동일부피를 섞어서 현탁물을 만들고 토끼에 피하주사 하여 면역을 하였다. 1차 면역 후 1주, 2차 면역 후 2주 후에 새로 준비된 완전 아주번트(complete adjuvant)를 피하주사 해서 추가 면역을 실시했다. 채혈된 혈액은 혈구를 분리하고 남은 혈청을 항체를 분리하는데 사용하였다.

항체는 protein A column을 통하여 분리하였다. 완충용액(50mM Tris-HCl pH 7.0)으로 평형화된 컬럼에 동일 완충용액 5부피로 희석된 혈청을 주입하여 통과시킨 후 5부피의 동일 완충용액으로 세척해준 후 용출 완충용액(Glycin-HCl pH 3.0)으로 용출하고 중화용액(Tris-HCl pH8.8)을 혼합해 중화하였다. 용출된 항체는 완충용액(50mH phosphate pH7.4)으로 투석해서 다음 사용시까지 -20 ℃에서 냉동보관 하였다.

<실시예 2-4> NNMT 에 대한 면역블랏팅( western blotting )

신장암 시료에 존재하는 NNMT의 양을 항체로 검출하고 측정하는 과정을 검증하기 위해 면역블랏팅을 실시하였다.

신장암 및 정상의 조직시료(2mg/ml)을 4x 시료 완충용액(sample buffer)로 희석한 후 12% SDS-PAGE에 10㎕씩 로딩한 후 110V로 전기영동 하였다. 면역블랏은 전개된 단백질을 젤로부터 PVDF 막으로 전기적으로 트랜스퍼한 후 5% skimmed milk/PBST (0.05% Tween 20)로 블로킹 하였고 biotin과 결합된 NNMT항체(biotinylated anti-NNMT IgG)를 5% skim milk/PBST에 희석하여 1차 처리하고(1:10000) Streptavidin-HRP를 2차 처리하였다(1:10000). 발색은 ECL방법으로 수행하였다.

결과를 도 18에 나타내었다.

<실시예 3> 진단 마커 성능평가

NNMT의 성능은 14명의 신장암 환자와 15명의 정상인의 시료에서 NNMT의 발현량으로 평가하였다. 진단의 정확성은 ROC(Receiver Operating Characteristic) 방법으로 진행하였다. 신장암환자에 대한 ROC분석은 NNMT의 경우 민감도 92.3, 특이도 93.7에 이르는 높은 결과를 보여줬다. NNMT와 L-plastin, SCGN, hNSE, ECGF-1 및 ferritin중 하나 이상의 마커의 조합으로 평가한 ROC분석에서는 AUC(Area　under　the　ROC　curve)가 NNMT단독으로 사용할 경우보다 높은 결과를 보여 더 높은 정확성을 보여줬으며, 신장암 진단 마커로서의 유용성을 확인했다.

<실시예 4> 혈장에서 NNMT 를 측정하기 위한 항체면역반응( ELISA )

항체용액은 50mM 암모늄 비카보네이트 완충용액 pH9.6에 최종농도가 0.1mg/ml되게 하고, 각 웰당 10μl(10μg)을 플레이트에 넣고 4°C에서 밤샘처리하여 항체를 고정하였다. 플레이트를 세척용액(PBST,10mM sodium phosphate pH7.4, 0.9% NaCl, 0.05% Tween20) 150μl로 세 번 세척하고, blocking 용액(0.1% casein , 20mM sodium phosphate pH 7.4 0.9% NaCl)을 200μl 첨가해 항체사이의 프레이트 빈공간을 blocking 하였다. 환자 및 정상인의 혈청10μl를 반응용액( PBST, 0.1% casein)90ul로 희석해 각 웰에 첨가하고 2시간 동안 항원 항체 결합을 유도하였다. 반응 후 플레이트를 150ul 세척용액으로 3번 세척하고 비오틴컨츄게이션된 항체를 (biotin-rabbit anti h6-NNMT IgG, 1mg/ml) 반응용액으로 2,000배 희석하고 100μl를 첨가하여, 1시간 동안 반응시키고 150μl의 세척용액으로 세 번 세척하였다. 발색을 위하여 Stratavidin-HRP(1mg/ml)를 10,000배 희석한 용액을 각 웰에 100μl씩 첨가하여 한 시간 반응시키고 세척용액 150ul로 5번을 세척하였다. 발색을 위하여 TMB용액(SIGMA,미국)을 100ul 넣고 8~10분 반응 후에 50ul의 0.5N 황산용액을 첨가해 반응을 중지시키고 ELISA Reader(Molecular Dynamics, 미국)를 이용해 450nm에서 흡광을 측정하였다.

<실시예 5> NNMT 의 임상적 유용성 평가를 위한 ROC 분석

정상으로 확인된 40인의 혈장과 신장암 중, 보통 신세포암(conventional RCC), 유두상 신세포암(papillary RCC), 혐색소 신세포암(chromophobe RCC)환자 총 41인의 혈장을 대상으로 ROC분석을 하고 정확도를 평가하였다. ROC분석은 MedCalc라는 프로그램(http://www.medcalc.be/index.php)를사용하여 진행하였다. 평가결과 정상인과 신장암환자를 분간하는 정확도는 AUC기준으로 0.80을 나타났다.

도 1 및 도 2는 각각 신장암 환자의 정상 신장 조직의 이차원 전기영동 사진과, 신장암 환자의 암 조직의 이차원 전기영동 사진이다.

도 3 및 도 4는 각각 정상인의 혈장의 이차원 전기영동 사진과, 신장암 환자 혈장의 이차원 전기영동 사진이다.

도 5 및 도 6은 각각 정상 신장 조직의 세포막 분획 시료의 이차원 전기영동 사진과 신장암 조직의 이차원 전기영동 사진이다.

도 7 및 도 8은 각각 신장암에서 특이적으로 발현량이 증가하는 9개의 단백질 즉 NNMT, hNSE, L-plastin, ECGF-1, SEGN, ferritin, NM23A 및 CapG의 spot을 도 1, 2 5 및 6의 이차원 전기영동 사진에서 부분적으로 확대하여 확인할 사진과, 신장암에서 특이적으로 발현량이 증가하는 단백질인 C4aANA의 spot을 도 3 및 4의 이차원 전기영동 사진에서 부분적으로 확대하여 확인한 사진이다.

도 9 내지 도 17은 각각 NNMT, L-plastin, SEGN, hNSE, ECGF-1, ferritin, NM23A, CapG 및 C4aANA의 mass spectrum 및 ProFound 검색 엔진을 이용하여 단백질을 동정한 결과이다.

도 18은 신장암 조직과 정상 신장 조직에서 NNMT의 발현량에 대한 면역 블랏팅 결과를 보여주는 사진이다.

<110> Genomine, Inc. <120> Diagnostic Composition and Kit for Kidney Cancer <150> KR 10-2008-0078436 <151> 2007-08-06 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ser Gly Phe Thr Ser Lys Asp Thr Tyr Leu Ser His Phe Asn 1 5 10 15 Pro Arg Asp Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Lys Phe Gly Ser Arg His Ser 20 25 30 Ala Glu Ser Gln Ile Leu Lys His Leu Leu Lys Asn Leu Phe Lys Ile 35 40 45 Phe Cys Leu Asp Gly Val Lys Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ile Gly Ser 50 55 60 Gly Pro Thr Ile Tyr Gln Leu Leu Ser Ala Cys Glu Ser Phe Lys Glu 65 70 75 80 Ile Val Val Thr Asp Tyr Ser Asp Gln Asn Leu Gln Glu Leu Glu Lys 85 90 95 Trp Leu Lys Lys Glu Pro Glu Ala Phe Asp Trp Ser Pro Val Val Thr 100 105 110 Tyr Val Cys Asp Leu Glu Gly Asn Arg Val Lys Gly Pro Glu Lys Glu 115 120 125 Glu Lys Leu Arg Gln Ala Val Lys Gln Val Leu Lys Cys Asp Val Thr 130 135 140 Gln Ser Gln Pro Leu Gly Ala Val Pro Leu Pro Pro Ala Asp Cys Val 145 150 155 160 Leu Ser Thr Leu Cys Leu Asp Ala Ala Cys Pro Asp Leu Pro Thr Tyr 165 170 175 Cys Arg Ala Leu Arg Asn Leu Gly Ser Leu Leu Lys Pro Gly Gly Phe 180 185 190 Leu Val Ile Met Asp Ala Leu Lys Ser Ser Tyr Tyr Met Ile Gly Glu 195 200 205 Gln Lys Phe Ser Ser Leu Pro Leu Gly Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala 210 215 220 Val Lys Glu Ala Gly Tyr Thr Ile Glu Trp Phe Glu Val Ile Ser Gln 225 230 235 240 Ser Tyr Ser Ser Thr Met Ala Asn Asn Glu Gly Leu Phe Ser Leu Val 245 250 255 Ala Arg Lys Leu Ser Arg Pro Leu 260 <210> 2 <211> 952 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgaactctgg atgctgttag cctgagactc aggaagacaa cttctgcagg gtcactccct 60 ggcttctgga ggaaagagaa ggagggcagt gctccagtgg tacagaagtg agacataatg 120 gaatcaggct tcacctccaa ggacacctat ctaagccatt ttaaccctcg ggattaccta 180 gaaaaatatt acaagtttgg ttctaggcac tctgcagaaa gccagattct taagcacctt 240 ctgaaaaatc ttttcaagat attctgccta gacggtgtga agggagacct gctgattgac 300 atcggctctg gccccactat ctatcagctc ctctctgctt gtgaatcctt taaggagatc 360 gtcgtcactg actactcaga ccagaacctg caggagctgg agaagtggct gaagaaagag 420 ccagaggcct ttgactggtc cccagtggtg acctatgtgt gtgatcttga agggaacaga 480 gtcaagggtc cagagaagga ggagaagttg agacaggcgg tcaagcaggt gctgaagtgt 540 gatgtgactc agagccagcc actgggggcc gtccccttac ccccggctga ctgcgtgctc 600 agcacactgt gtctggatgc cgcctgccca gacctcccca cctactgcag ggcgctcagg 660 aacctcggca gcctactgaa gccagggggc ttcctggtga tcatggatgc gctcaagagc 720 agctactaca tgattggtga gcagaagttc tccagcctcc ccctgggccg ggaggcagta 780 gaggctgctg tgaaagaggc tggctacaca atcgaatggt ttgaggtgat ctcgcaaagt 840 tattcttcca ccatggccaa caacgaagga cttttctccc tggtggcgag gaagctgagc 900 agacccctgt gatgcctgtg acctcaatta aagcaattcc tttgacctgt ca 952 <210> 3 <211> 627 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Arg Gly Ser Val Ser Asp Glu Glu Met Met Glu Leu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Lys Val Asp Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Phe Asn 20 25 30 Glu Leu Asn Asp Leu Phe Lys Ala Ala Cys Leu Pro Leu Pro Gly Tyr 35 40 45 Arg Val Arg Glu Ile Thr Glu Asn Leu Met Ala Thr Gly Asp Leu Asp 50 55 60 Gln Asp Gly Arg Ile Ser Phe Asp Glu Phe Ile Lys Ile Phe His Gly 65 70 75 80 Leu Lys Ser Thr Asp Val Ala Lys Thr Phe Arg Lys Ala Ile Asn Lys 85 90 95 Lys Glu Gly Ile Cys Ala Ile Gly Gly Thr Ser Glu Gln Ser Ser Val 100 105 110 Gly Thr Gln His Ser Tyr Ser Glu Glu Glu Lys Tyr Ala Phe Val Asn 115 120 125 Trp Ile Asn Lys Ala Leu Glu Asn Asp Pro Asp Cys Arg His Val Ile 130 135 140 Pro Met Asn Pro Asn Thr Asn Asp Leu Phe Asn Ala Val Gly Asp Gly 145 150 155 160 Ile Val Leu Cys Lys Met Ile Asn Leu Ser Val Pro Asp Thr Ile Asp 165 170 175 Glu Arg Thr Ile Asn Lys Lys Lys Leu Thr Pro Phe Thr Ile Gln Glu 180 185 190 Asn Leu Asn Leu Ala Leu Asn Ser Ala Ser Ala Ile Gly Cys His Val 195 200 205 Val Asn Ile Gly Ala Glu Asp Leu Lys Glu Gly Lys Pro Tyr Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Trp Gln Val Ile Lys Ile Gly Leu Phe Ala Asp Ile 225 230 235 240 Glu Leu Ser Arg Asn Glu Ala Leu Ile Ala Leu Leu Arg Glu Gly Glu 245 250 255 Ser Leu Glu Asp Leu Met Lys Leu Ser Pro Glu Glu Leu Leu Leu Arg 260 265 270 Trp Ala Asn Tyr His Leu Glu Asn Ala Gly Cys Asn Lys Ile Gly Asn 275 280 285 Phe Ser Thr Asp Ile Lys Asp Ser Lys Ala Tyr Tyr His Leu Leu Glu 290 295 300 Gln Val Ala Pro Lys Gly Asp Glu Glu Gly Val Pro Ala Val Val Ile 305 310 315 320 Asp Met Ser Gly Leu Arg Glu Lys Asp Asp Ile Gln Arg Ala Glu Cys 325 330 335 Met Leu Gln Gln Ala Glu Arg Leu Gly Cys Arg Gln Phe Val Thr Ala 340 345 350 Thr Asp Val Val Arg Gly Asn Pro Lys Leu Asn Leu Ala Phe Ile Ala 355 360 365 Asn Leu Phe Asn Arg Tyr Pro Ala Leu His Lys Pro Glu Asn Gln Asp 370 375 380 Ile Asp Trp Gly Ala Leu Glu Gly Glu Thr Arg Glu Glu Arg Thr Phe 385 390 395 400 Arg Asn Trp Met Asn Ser Leu Gly Val Asn Pro Arg Val Asn His Leu 405 410 415 Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Ala Leu Val Ile Phe Gln Leu Tyr Glu Lys 420 425 430 Ile Lys Val Pro Val Asp Trp Asn Arg Val Asn Lys Pro Pro Tyr Pro 435 440 445 Lys Leu Gly Gly Asn Met Lys Lys Leu Glu Asn Cys Asn Tyr Ala Val 450 455 460 Glu Leu Gly Lys Asn Gln Ala Lys Phe Ser Leu Val Gly Ile Gly Gly 465 470 475 480 Gln Asp Leu Asn Glu Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Ala Leu Ile Trp 485 490 495 Gln Leu Met Arg Arg Tyr Thr Leu Asn Ile Leu Glu Glu Ile Gly Gly 500 505 510 Gly Gln Lys Val Asn Asp Asp Ile Ile Val Asn Trp Val Asn Glu Thr 515 520 525 Leu Arg Glu Ala Glu Lys Ser Ser Ser Ile Ser Ser Phe Lys Asp Pro 530 535 540 Lys Ile Ser Thr Ser Leu Pro Val Leu Asp Leu Ile Asp Ala Ile Gln 545 550 555 560 Pro Gly Ser Ile Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Thr Glu Asn Leu Asn Asp 565 570 575 Asp Glu Lys Leu Asn Asn Ala Lys Tyr Ala Ile Ser Met Ala Arg Lys 580 585 590 Ile Gly Ala Arg Val Tyr Ala Leu Pro Glu Asp Leu Val Glu Val Asn 595 600 605 Pro Lys Met Val Met Thr Val Phe Ala Cys Leu Met Gly Lys Gly Met 610 615 620 Lys Arg Val 625 <210> 4 <211> 1713 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggctacag gtgatctgga ccaagatgga aggatcagct ttgatgagtt tatcaagatt 60 ttccatggcc taaaaagcac agatgttgcc aagaccttta gaaaagcaat caataagaag 120 gaagggattt gtgcaatcgg tggtacttca gagcagtcta gcgttggcac ccaacactcc 180 tattcagagg aagaaaagta tgcctttgtc aactggataa acaaagccct ggaaaatgat 240 cctgattgtc ggcatgtcat cccaatgaac ccaaacacga atgatctctt taatgctgtt 300 ggagatggca ttgtcctttg taaaatgatc aacctgtcag tgccagacac aattgatgaa 360 agaacaatca acaaaaagaa gctaacccct ttcaccattc aggaaaatct gaacttggct 420 ctgaactctg cctcagccat cgggtgccat gtggtcaaca taggggctga ggacctgaag 480 gaggggaagc cttatctggt cctgggactt ctgtggcaag tcatcaagat tgggttgttt 540 gctgacattg aactcagcag aaatgaagct ctgattgctc ttttgagaga aggtgagagc 600 ctggaggatt tgatgaaact ctcccctgaa gagctcttgc tgaggtgggc taattaccac 660 ctggaaaatg caggctgcaa caaaattggc aacttcagta ctgacatcaa ggactcaaaa 720 gcttattacc acctgcttga gcaggtggct ccaaaaggag atgaagaagg tgttcctgct 780 gttgttattg acatgtcagg actgcgggag aaggatgaca tccagagggc agaatgcatg 840 ctgcagcagg cggagaggct gggctgccgg cagtttgtca cagccacaga tgttgtccga 900 gggaacccca agttgaactt ggcttttatt gccaacctct ttaacagata ccctgccctg 960 cacaaaccag agaaccagga cattgactgg ggggctcttg aaggtgagac gagagaagag 1020 cggacattta ggaactggat gaactccctg ggtgttaacc ctcgagtcaa tcatttgtac 1080 agtgacttat cagatgccct ggtcatcttc cagctctatg aaaagatcaa agttcctgtt 1140 gactggaaca gagtaaacaa accgccatac cccaaactgg gaggcaatat gaagaagctt 1200 gagaattgta actacgcggt agaattgggg aagaatcaag cgaagttctc cctggttggc 1260 atcggtggac aagatctcaa tgaaggaaac cgcactctca cactggcctt gatttggcag 1320 ctaatgagaa ggtatacact gaatatcctc gaagaaattg gtggtggcca gaaggtcaat 1380 gatgacatta ttgtcaactg ggtgaatgaa acattgaggg aagcagagaa aagttcatcc 1440 atctctagtt tcaaggaccc gaagattagt acaagtctgc ctgttctgga cctcatcgat 1500 gccatccaac caggttccat taactatgac cttctgaaga cagaaaatct gaatgatgat 1560 gagaaactca acaatgcaaa atatgccatc tctatggccc gaaaaattgg agcaagagtg 1620 tatgccctgc cagaagacct ggttgaagtg aaccccaaaa tggtcatgac cgtgtttgcc 1680 tgcctcatgg ggaaaggaat gaagagggtg tga 1713 <210> 5 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Ser Ser Arg Glu Pro Thr Leu Gly Arg Leu Asp Ala Ala Gly 1 5 10 15 Phe Trp Gln Val Trp Gln Arg Phe Asp Ala Asp Glu Lys Gly Tyr Ile 20 25 30 Glu Glu Lys Glu Leu Asp Ala Phe Phe Leu His Met Leu Met Lys Leu 35 40 45 Gly Thr Asp Asp Thr Val Met Lys Ala Asn Leu His Lys Val Lys Gln 50 55 60 Gln Phe Met Thr Thr Gln Asp Ala Ser Lys Asp Gly Arg Ile Arg Met 65 70 75 80 Lys Glu Leu Ala Gly Met Phe Leu Ser Glu Asp Glu Asn Phe Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Arg Arg Glu Asn Pro Leu Asp Ser Ser Val Glu Phe Met Gln 100 105 110 Ile Trp Arg Lys Tyr Asp Ala Asp Ser Ser Gly Phe Ile Ser Ala Ala 115 120 125 Glu Leu Arg Asn Phe Leu Arg Asp Leu Phe Leu His His Lys Lys Ala 130 135 140 Ile Ser Glu Ala Lys Leu Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Met Met Lys Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg Asn Lys Asp Gly Arg Leu Asp Leu Asn Asp Leu Ala Arg 165 170 175 Ile Leu Ala Leu Gln Glu Asn Phe Leu Leu Gln Phe Lys Met Asp Ala 180 185 190 Cys Ser Thr Glu Glu Arg Lys Arg Asp Phe Glu Lys Ile Phe Ala Tyr 195 200 205 Tyr Asp Val Ser Lys Thr Gly Ala Leu Glu Gly Pro Glu Val Asp Gly 210 215 220 Phe Val Lys Asp Met Met Glu Leu Val Gln Pro Ser Ile Ser Gly Val 225 230 235 240 Asp Leu Asp Lys Phe Arg Glu Ile Leu Leu Arg His Cys Asp Val Asn 245 250 255 Lys Asp Gly Lys Ile Gln Lys Ser Glu Leu Ala Leu Cys Leu Gly Leu 260 265 270 Lys Ile Asn Pro 275 <210> 6 <211> 1437 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cggcagcagc gctcgcgtcc tccccagcaa cagttactca aagctaatca gatagcgaaa 60 gaagcaggag agcaagtcaa gaaatacggt gaaggagtcc ttcccaaagt tgtctaggtc 120 cttccgcgcc ggtgcctggt cttcgtcgtc aacaccatgg acagctcccg ggaaccgact 180 ctggggcgct tggacgccgc tggcttctgg caggtctggc ggcgctttga tgcggatgaa 240 aaaggttaca tagaagagaa ggaactcgat gctttctttc tccacatgtt gatgaaactg 300 ggtactgatg acacggtcat gaaagcaaat ttgcacaagg tgaaacagca gtttatgact 360 acccaagatg cctctaaaga tggtcgcatt cggatgaaag agcttgctgg tatgttctta 420 tctgaggatg aaaactttct tctgctcttt cgccgggaaa acccactgga cagcagcgtg 480 gagtttatgc agatttggcg caaatatgac gctgacagca gtggctttat atcagctgct 540 gagctccgca acttcctccg agacctcttt cttcaccaca aaaaggccat ttctgaggct 600 aaactggaag aatacactgg caccatgatg aagatttttg acagaaataa agatggtcgg 660 ttggatctaa atgacttagc aaggattctg gctcttcagg aaaacttcct tctccaattt 720 aaaatggatg cttgttctac tgaagaaagg aaaagggact ttgagaaaat ctttgcctac 780 tatgatgtta gtaaaacagg agccctggaa ggcccagaag tggatgggtt tgtcaaagac 840 atgatggagc ttgtccagcc cagcatcagc ggggtggacc ttgataagtt ccgcgagatt 900 ctcctgcgtc actgcgacgt gaacaaggat ggaaaaattc agaagtctga gctggctttg 960 tgtcttgggc tgaaaatcaa cccataatcc cagactgctt tgccttttgc tcttactatg 1020 tttctgtgat cttgctggta gaattgtatc tgtgcattga tgttgggaac acagtgggca 1080 aactcacaaa tggtgtgcta ttcttgggca agaagaggga cgctagggcc ttccttccac 1140 cggcgtgatc tatccctgtc tcactgaaag cccctgtgta gtgtctgtgt tgttttccct 1200 tgaccctggg ctttcctatc ctcccaaaga ctcagctccc ctgttagatg gctctgcctg 1260 tccttcccca gtccaccagg gtggggggga caggggcagc tgagtgcatt cattttgtgc 1320 ttttgttgtg ggctttctgc ttagtctgaa aggtgtgtgg cattcatggc aatcctgtaa 1380 cttcaacata gatttttttt gtgtgtgtgg aaataaatct gcaattggaa acaaccg 1437 <210> 7 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Ile Val Phe Gln Gly Glu Gly Pro 1 5 10 15 Pro Ile Ser Ser Cys Asp Thr Gly Thr Met Ala Asn Cys Glu Arg Thr 20 25 30 Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu 35 40 45 Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe Arg Leu Val Gly Leu Lys 50 55 60 Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu His Tyr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu Val Lys Tyr Met His Ser Gly 85 90 95 Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu Asn Val Val Lys Thr Gly 100 105 110 Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr 115 120 125 Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly Arg Asn Ile Ile His Gly 130 135 140 Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu Ile Gly Leu Trp Phe His 145 150 155 160 Pro Glu Glu Leu Val Asp Tyr Thr Ser Cys Ala Gln Asn Trp Ile Tyr 165 170 175 Glu <210> 8 <211> 1031 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gcagaagcgt tccgtgcgtg caagtgctgc gaaccacgtg ggtcccgggc gcgtttcggg 60 tgctggcggc tgcagccgga gttcaaacct aagcagctgg aagggccctg tggctaggta 120 ccatagagtc tctacacagg actaagtcag cctggtgtgc aggggaggca gacacacaaa 180 cagaaaattg gactacagtg ctaagatgct gtaagaagag gttaactaaa ggacaggaag 240 atggggccaa gagatggtgc tactgtctac tttagggatc gtctttcaag gcgaggggcc 300 tcctatctca agctgtgata caggaaccat ggccaactgt gagcgtacct tcattgcgat 360 caaaccagat ggggtccagc ggggtcttgt gggagagatt atcaagcgtt ttgagcagaa 420 aggattccgc cttgttggtc tgaaattcat gcaagcttcc gaagatcttc tcaaggaaca 480 ctacgttgac ctgaaggacc gtccattctt tgccggcctg gtgaaataca tgcactcagg 540 gccggtagtt gccatggtct gggaggggct gaatgtggtg aagacgggcc gagtcatgct 600 cggggagacc aaccctgcag actccaagcc tgggaccatc cgtggagact tctgcataca 660 agttggcagg aacattatac atggcagtga ttctgtggag agtgcagaga aggagatcgg 720 cttgtggttt caccctgagg aactggtaga ttacacgagc tgtgctcaga actggatcta 780 tgaatgacag gagggcagac cacattgctt ttcacatcca tttcccctcc ttcccatggg 840 cagaggacca ggctgtagga aatctagtta tttacaggaa cttcatcata atttggaggg 900 aagctcttgg agctgtgagt tctccctgta cagtgttacc atccccgacc atctgattaa 960 aatgcttcct cccagcatag gattcattga gttggttact tcatattgtt gcattgcttt 1020 tttttccttc t 1031 <210> 9 <211> 348 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Tyr Thr Ala Ile Pro Gln Ser Gly Ser Pro Phe Pro Gly Ser Val 1 5 10 15 Gln Asp Pro Gly Leu His Val Trp Arg Val Glu Lys Leu Lys Pro Val 20 25 30 Pro Val Ala Gln Glu Asn Gln Gly Val Phe Phe Ser Gly Asp Ser Tyr 35 40 45 Leu Val Leu His Asn Gly Pro Glu Glu Val Ser His Leu His Leu Trp 50 55 60 Ile Gly Gln Gln Ser Ser Arg Asp Glu Gln Gly Ala Cys Ala Val Leu 65 70 75 80 Ala Val His Leu Asn Thr Leu Leu Gly Glu Arg Pro Val Gln His Arg 85 90 95 Glu Val Gln Gly Asn Glu Ser Asp Leu Phe Met Ser Tyr Phe Pro Arg 100 105 110 Gly Leu Lys Tyr Gln Glu Gly Gly Val Glu Ser Ala Phe His Lys Thr 115 120 125 Ser Thr Gly Ala Pro Ala Ala Ile Lys Lys Leu Tyr Gln Val Lys Gly 130 135 140 Lys Lys Asn Ile Arg Ala Thr Glu Arg Ala Leu Asn Trp Asp Ser Phe 145 150 155 160 Asn Thr Gly Asp Cys Phe Ile Leu Asp Leu Gly Gln Asn Ile Phe Ala 165 170 175 Trp Cys Gly Gly Lys Ser Asn Ile Leu Glu Arg Asn Lys Ala Arg Asp 180 185 190 Leu Ala Leu Ala Ile Arg Asp Ser Glu Arg Gln Gly Lys Ala Gln Val 195 200 205 Glu Ile Val Thr Asp Gly Glu Glu Pro Ala Glu Met Ile Gln Val Leu 210 215 220 Gly Pro Lys Pro Ala Leu Lys Glu Gly Asn Pro Glu Glu Asp Leu Thr 225 230 235 240 Ala Asp Lys Ala Asn Ala Gln Ala Ala Ala Leu Tyr Lys Val Ser Asp 245 250 255 Ala Thr Gly Gln Met Asn Leu Thr Lys Val Ala Asp Ser Ser Pro Phe 260 265 270 Ala Leu Glu Leu Leu Ile Ser Asp Asp Cys Phe Val Leu Asp Asn Gly 275 280 285 Leu Cys Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Lys Gly Arg Lys Ala Asn Glu Lys 290 295 300 Glu Arg Gln Ala Ala Leu Gln Val Ala Glu Gly Phe Ile Ser Arg Met 305 310 315 320 Gln Tyr Ala Pro Asn Thr Gln Val Glu Ile Leu Pro Gln Gly Arg Glu 325 330 335 Ser Pro Ile Phe Lys Gln Phe Phe Lys Asp Trp Lys 340 345 <210> 10 <211> 944 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 atctgaagac agcatgtaca cagccattcc ccagaggtaa gctgcatgcc ccatctcctt 60 tcacaacttc cccttcttta cctccaagcg ctgcccctcc ccactgctct ccgcctgccc 120 agggctgtgc ttgggcaagt gggtccaggc tgctgtcaac cctctctctt ctcgcagtgg 180 ctctccattc ccaggctcag tgcaggatcc aggcctgcat gtgtggcggg tggagaagct 240 gaagccggtg cctgtggcgc aagagaacca gggcgtcttc ttctcggggg actcctacct 300 agtgctgcac aatggcccag aagaggtttc ccatctgcac ctgtggatag gtaaggggat 360 ctggatgggg gaaggttggg cccaggaagg ggagggaggg ggctggtatg gatcacaagc 420 cttgccctgc cctctcccac ttgtcccagg ccagcagtca tcccgggatg agcagggggc 480 ctgtgccgtg ctggctgtgc acctcaacac gctgctggga gagcggcctg tgcagcaccg 540 cgaggtgcag ggcaatgagt ctgacctctt catgagctac ttcccacggg gcctcaagta 600 ccaggtcaga gcccacctct aggcaccccc accctgcttc tggctggttc tcaccctgca 660 gaagacccgg gtgcctttgg agccgggtcc ccacctttct gcccgtcttc cagtgggatg 720 gggtgcagag ggctctgggt ctcctgtcag tccactcaga tgggccgtct gggctgcagg 780 aaggtggtgt ggagtcagca tttcacaaga cctccacagg agccccagct gccatcaaga 840 aactctacca ggtgaagggg aagaagaaca tccgtgccac cgagcgggca ctgaactggg 900 acagcttcaa cactggggac tgcttcatcc tggacctggg ccag 944 <210> 11 <211> 1744 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Arg Leu Leu Trp Gly Leu Ile Trp Ala Ser Ser Phe Phe Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Gln Lys Pro Arg Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Val Val His 20 25 30 Leu Gly Val Pro Leu Ser Val Gly Val Gln Leu Gln Asp Val Pro Arg 35 40 45 Gly Gln Val Val Lys Gly Ser Val Phe Leu Arg Asn Pro Ser Arg Asn 50 55 60 Asn Val Pro Cys Ser Pro Lys Val Asp Phe Thr Leu Ser Ser Glu Arg 65 70 75 80 Asp Phe Ala Leu Leu Ser Leu Gln Val Pro Leu Lys Asp Ala Lys Ser 85 90 95 Cys Gly Leu His Gln Leu Leu Arg Gly Pro Glu Val Gln Leu Val Ala 100 105 110 His Ser Pro Trp Leu Lys Asp Ser Leu Ser Arg Thr Thr Asn Ile Gln 115 120 125 Gly Ile Asn Leu Leu Phe Ser Ser Arg Arg Gly His Leu Phe Leu Gln 130 135 140 Thr Asp Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Gly Gln Arg Val Arg Tyr Arg Val 145 150 155 160 Phe Ala Leu Asp Gln Lys Met Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ile Thr Val 165 170 175 Met Val Glu Asn Ser His Gly Leu Arg Val Arg Lys Lys Glu Val Tyr 180 185 190 Met Pro Ser Ser Ile Phe Gln Asp Asp Phe Val Ile Pro Asp Ile Ser 195 200 205 Glu Pro Gly Thr Trp Lys Ile Ser Ala Arg Phe Ser Asp Gly Leu Glu 210 215 220 Ser Asn Ser Ser Thr Gln Phe Glu Val Lys Lys Tyr Val Leu Pro Asn 225 230 235 240 Phe Glu Val Lys Ile Thr Pro Gly Lys Pro Tyr Ile Leu Thr Val Pro 245 250 255 Gly His Leu Asp Glu Met Gln Leu Asp Ile Gln Ala Arg Tyr Ile Tyr 260 265 270 Gly Lys Pro Val Gln Gly Val Ala Tyr Val Arg Phe Gly Leu Leu Asp 275 280 285 Glu Asp Gly Lys Lys Thr Phe Phe Arg Gly Leu Glu Ser Gln Thr Lys 290 295 300 Leu Val Asn Gly Gln Ser His Ile Ser Leu Ser Lys Ala Glu Phe Gln 305 310 315 320 Asp Ala Leu Glu Lys Leu Asn Met Gly Ile Thr Asp Leu Gln Gly Leu 325 330 335 Arg Leu Tyr Val Ala Ala Ala Ile Ile Glu Ser Pro Gly Gly Glu Met 340 345 350 Glu Glu Ala Glu Leu Thr Ser Trp Tyr Phe Val Ser Ser Pro Phe Ser 355 360 365 Leu Asp Leu Ser Lys Thr Lys Arg His Leu Val Pro Gly Ala Pro Phe 370 375 380 Leu Leu Gln Ala Leu Val Arg Glu Met Ser Gly Ser Pro Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ile Pro Val Lys Val Ser Ala Thr Val Ser Ser Pro Gly Ser Val Pro 405 410 415 Glu Val Gln Asp Ile Gln Gln Asn Thr Asp Gly Ser Gly Gln Val Ser 420 425 430 Ile Pro Ile Ile Ile Pro Gln Thr Ile Ser Glu Leu Gln Leu Ser Val 435 440 445 Ser Ala Gly Ser Pro His Pro Ala Ile Ala Arg Leu Thr Val Ala Ala 450 455 460 Pro Pro Ser Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp Ser 465 470 475 480 Arg Pro Pro Arg Val Gly Asp Thr Leu Asn Leu Asn Leu Arg Ala Val 485 490 495 Gly Ser Gly Ala Thr Phe Ser His Tyr Tyr Tyr Met Ile Leu Ser Arg 500 505 510 Gly Gln Ile Val Phe Met Asn Arg Glu Pro Lys Arg Thr Leu Thr Ser 515 520 525 Val Ser Val Phe Val Asp His His Leu Ala Pro Ser Phe Tyr Phe Val 530 535 540 Ala Phe Tyr Tyr His Gly Asp His Pro Val Ala Asn Ser Leu Arg Val 545 550 555 560 Asp Val Gln Ala Gly Ala Cys Glu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Val Asp 565 570 575 Gly Ala Lys Gln Tyr Arg Asn Gly Glu Ser Val Lys Leu His Leu Glu 580 585 590 Thr Asp Ser Leu Ala Leu Val Ala Leu Gly Ala Leu Asp Thr Ala Leu 595 600 605 Tyr Ala Ala Gly Ser Lys Ser His Lys Pro Leu Asn Met Gly Lys Val 610 615 620 Phe Glu Ala Met Asn Ser Tyr Asp Leu Gly Cys Gly Pro Gly Gly Gly 625 630 635 640 Asp Ser Ala Leu Gln Val Phe Gln Ala Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp 645 650 655 Gly Asp Gln Trp Thr Leu Ser Arg Lys Arg Leu Ser Cys Pro Lys Glu 660 665 670 Lys Thr Thr Arg Lys Lys Arg Asn Val Asn Phe Gln Lys Ala Ile Asn 675 680 685 Glu Lys Leu Gly Gln Tyr Ala Ser Pro Thr Ala Lys Arg Cys Cys Gln 690 695 700 Asp Gly Val Thr Arg Leu Pro Met Met Arg Ser Cys Glu Gln Arg Ala 705 710 715 720 Ala Arg Val Gln Gln Pro Asp Cys Arg Glu Pro Phe Leu Ser Cys Cys 725 730 735 Gln Phe Ala Glu Ser Leu Arg Lys Lys Ser Arg Asp Lys Gly Gln Ala 740 745 750 Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gln Glu Glu Asp Leu Ile Asp 755 760 765 Glu Asp Asp Ile Pro Val Arg Ser Phe Phe Pro Glu Asn Trp Leu Trp 770 775 780 Arg Val Glu Thr Val Asp Arg Phe Gln Ile Leu Thr Leu Trp Leu Pro 785 790 795 800 Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile His Gly Leu Ser Leu Ser Lys Thr 805 810 815 Lys Gly Leu Cys Val Ala Thr Pro Val Gln Leu Arg Val Phe Arg Glu 820 825 830 Phe His Leu His Leu Arg Leu Pro Met Ser Val Arg Arg Phe Glu Gln 835 840 845 Leu Glu Leu Arg Pro Val Leu Tyr Asn Tyr Leu Asp Lys Asn Leu Thr 850 855 860 Val Ser Val His Val Ser Pro Val Glu Gly Leu Cys Leu Ala Gly Gly 865 870 875 880 Gly Gly Leu Ala Gln Gln Val Leu Val Pro Ala Gly Ser Ala Arg Pro 885 890 895 Val Ala Phe Ser Val Val Pro Thr Ala Ala Ala Ala Val Ser Leu Lys 900 905 910 Val Val Ala Arg Gly Ser Phe Glu Phe Pro Val Gly Asp Ala Val Ser 915 920 925 Lys Val Leu Gln Ile Glu Lys Glu Gly Ala Ile His Arg Glu Glu Leu 930 935 940 Val Tyr Glu Leu Asn Pro Leu Asp His Arg Gly Arg Thr Leu Glu Ile 945 950 955 960 Pro Gly Asn Ser Asp Pro Asn Met Ile Pro Asp Gly Asp Phe Asn Ser 965 970 975 Tyr Val Arg Val Thr Ala Ser Asp Pro Leu Asp Thr Leu Gly Ser Glu 980 985 990 Gly Ala Leu Ser Pro Gly Gly Val Ala Ser Leu Leu Arg Leu Pro Arg 995 1000 1005 Gly Cys Gly Glu Gln Thr Met Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ala Ala 1010 1015 1020 Ser Arg Tyr Leu Asp Lys Thr Glu Gln Trp Ser Thr Leu Pro Pro Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Lys Asp His Ala Val Asp Leu Ile Gln Lys Gly Tyr Met Arg Ile 1045 1050 1055 Gln Gln Phe Arg Lys Ala Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Trp Leu Ser Arg 1060 1065 1070 Asp Ser Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Val Leu Lys Val Leu Ser Leu 1075 1080 1085 Ala Gln Glu Gln Val Gly Gly Ser Pro Glu Lys Leu Gln Glu Thr Ser 1090 1095 1100 Asn Trp Leu Leu Ser Gln Gln Gln Ala Asp Gly Ser Phe Gln Asp Pro 1105 1110 1115 1120 Cys Pro Val Leu Asp Arg Ser Met Gln Gly Gly Leu Val Gly Asn Asp 1125 1130 1135 Glu Thr Val Ala Leu Thr Ala Phe Val Thr Ile Ala Leu His His Gly 1140 1145 1150 Leu Ala Val Phe Gln Asp Glu Gly Ala Glu Pro Leu Lys Gln Arg Val 1155 1160 1165 Glu Ala Ser Ile Ser Lys Ala Asn Ser Phe Leu Gly Glu Lys Ala Ser 1170 1175 1180 Ala Gly Leu Leu Gly Ala His Ala Ala Ala Ile Thr Ala Tyr Ala Leu 1185 1190 1195 1200 Ser Leu Thr Lys Ala Pro Val Asp Leu Leu Gly Val Ala His Asn Asn 1205 1210 1215 Leu Met Ala Met Ala Gln Glu Thr Gly Asp Asn Leu Tyr Trp Gly Ser 1220 1225 1230 Val Thr Gly Ser Gln Ser Asn Ala Val Ser Pro Thr Pro Ala Pro Arg 1235 1240 1245 Asn Pro Ser Asp Pro Met Pro Gln Ala Pro Ala Leu Trp Ile Glu Thr 1250 1255 1260 Thr Ala Tyr Ala Leu Leu His Leu Leu Leu His Glu Gly Lys Ala Glu 1265 1270 1275 1280 Met Ala Asp Gln Ala Ser Ala Trp Leu Thr Arg Gln Gly Ser Phe Gln 1285 1290 1295 Gly Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asp Thr Val Ile Ala Leu Asp Ala Leu 1300 1305 1310 Ser Ala Tyr Trp Ile Ala Ser His Thr Thr Glu Glu Arg Gly Leu Asn 1315 1320 1325 Val Thr Leu Ser Ser Thr Gly Arg Asn Gly Phe Lys Ser His Ala Leu 1330 1335 1340 Gln Leu Asn Asn Arg Gln Ile Arg Gly Leu Glu Glu Glu Leu Gln Phe 1345 1350 1355 1360 Ser Leu Gly Ser Lys Ile Asn Val Lys Val Gly Gly Asn Ser Lys Gly 1365 1370 1375 Thr Leu Lys Val Leu Arg Thr Tyr Asn Val Leu Asp Met Lys Asn Thr 1380 1385 1390 Thr Cys Gln Asp Leu Gln Ile Glu Val Thr Val Lys Gly His Val Glu 1395 1400 1405 Tyr Thr Met Glu Ala Asn Glu Asp Tyr Glu Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu 1410 1415 1420 Leu Pro Ala Lys Asp Asp Pro Asp Ala Pro Leu Gln Pro Val Thr Pro 1425 1430 1435 1440 Leu Gln Leu Phe Glu Gly Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Glu Ala Pro 1445 1450 1455 Lys Val Val Glu Glu Gln Glu Ser Arg Val His Tyr Thr Val Cys Ile 1460 1465 1470 Trp Arg Asn Gly Lys Val Gly Leu Ser Gly Met Ala Ile Ala Asp Val 1475 1480 1485 Thr Leu Leu Ser Gly Phe His Ala Leu Arg Ala Asp Leu Glu Lys Leu 1490 1495 1500 Thr Ser Leu Ser Asp Arg Tyr Val Ser His Phe Glu Thr Glu Gly Pro 1505 1510 1515 1520 His Val Leu Leu Tyr Phe Asp Ser Val Pro Thr Ser Arg Glu Cys Val 1525 1530 1535 Gly Phe Glu Ala Val Gln Glu Val Pro Val Gly Leu Val Gln Pro Ala 1540 1545 1550 Ser Ala Thr Leu Tyr Asp Tyr Tyr Asn Pro Glu Arg Arg Cys Ser Val 1555 1560 1565 Phe Tyr Gly Ala Pro Ser Lys Ser Arg Leu Leu Ala Thr Leu Cys Ser 1570 1575 1580 Ala Glu Val Cys Gln Cys Ala Glu Gly Lys Cys Pro Arg Gln Arg Arg 1585 1590 1595 1600 Ala Leu Glu Arg Gly Leu Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Arg Met Lys Phe 1605 1610 1615 Ala Cys Tyr Tyr Pro Arg Val Glu Tyr Gly Phe Gln Val Lys Val Leu 1620 1625 1630 Arg Glu Asp Ser Arg Ala Ala Phe Arg Leu Phe Glu Thr Lys Ile Thr 1635 1640 1645 Gln Val Leu His Phe Thr Lys Asp Val Lys Ala Ala Ala Asn Gln Met 1650 1655 1660 Arg Asn Phe Leu Val Arg Ala Ser Cys Arg Leu Arg Leu Glu Pro Gly 1665 1670 1675 1680 Lys Glu Tyr Leu Ile Met Gly Leu Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Glu 1685 1690 1695 Gly His Pro Gln Tyr Leu Leu Asp Ser Asn Ser Trp Ile Glu Glu Met 1700 1705 1710 Pro Ser Glu Arg Leu Cys Arg Ser Thr Arg Gln Arg Ala Ala Cys Ala 1715 1720 1725 Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gln Glu Tyr Gly Thr Gln Gly Cys Gln Val 1730 1735 1740 <210> 12 <211> 5406 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gaccagatca gcccccagag cagcctcatg gctggaggat ccaagagagg ttagatccgt 60 ctgtctgtct gctaccttct tcaccttatc tctgcagaag cccaggttgc tcttgttctc 120 tccttctgtg gttcatctgg gggtccccct atcggtgggg gtgcagctcc aggatgtgcc 180 ccgaggacag gtagtgaaag gatcagtgtt cctgagaaac ccatctcgta ataatgtccc 240 ctgctcccca aaggtggact tcacccttag ctcagaaaga gacttcgcac tcctcagtct 300 ccaggtgccc ttgaaagatg cgaagagctg tggcctccat caactcctca gaggccctga 360 ggtccagctg gtggcccatt cgccatggct aaaggactct ctgtccagaa cgacaaacat 420 ccagggtatc aacctgctct tctcctctcg ccgggggcac ctctttttgc agacggacca 480 gcccatttac aaccctggcc agcgggttcg gtaccgggtc tttgctctgg atcagaagat 540 gcgcccgagc actgacacca tcacagtcat ggtggagaac tctcacggcc tccgcgtgcg 600 gaagaaggag gtgtacatgc cctcgtccat cttccaggat gactttgtga tcccagacat 660 ctcagagcca gggacctgga agatctcagc ccgattctca gatggcctgg aatccaacag 720 cagcacccag tttgaggtga agaaatatgt ccttcccaac tttgaggtga agatcacccc 780 tggaaagccc tacatcctga cggtgccagg ccatcttgat gaaatgcagt tagacatcca 840 ggccaggtac atctatggga agccagtgca gggggtggca tatgtgcgct ttgggctcct 900 agatgaggat ggtaagaaga ctttctttcg ggggctggag agtcagacca agctggtgaa 960 tggacagagc cacatttccc tctcaaaggc agagttccag gacgccctgg agaagctgaa 1020 tatgggcatt actgacctcc aggggctgcg cctctacgtt gctgcagcca tcattgagtc 1080 tccaggtggg gagatggagg aggcagagct cacatcctgg tattttgtgt catctccctt 1140 ctccttggat cttagcaaga ccaagcgaca ccttgtgcct ggggccccct tcctgctgca 1200 ggccttggtc cgtgagatgt caggctcccc agcttctggc attcctgtca aagtttctgc 1260 cacggtgtct tctcctgggt ctgttcctga agcccaggac attcagcaaa acacagacgg 1320 gagcggccaa gtcagcattc caataattat ccctcagacc atctcagagc tgcagctctc 1380 agtatctgca ggctccccac atccagcgat agccaggctc actgtggcag ccccaccttc 1440 aggaggcccc gggtttctgt ctattgagcg gccggattct cgacctcctc gtgttgggga 1500 cactctgaac ctgaacttgc gagccgtggg cagtggggcc accttttctc attactacta 1560 catgatccta tcccgagggc agatcgtgtt catgaatcga gagcccaaga ggaccctgac 1620 ctcggtctcg gtgtttgtgg accatcacct ggcaccctcc ttctactttg tggccttcta 1680 ctaccatgga gaccacccag tggccaactc cctgcgagtg gatgtccagg ctggggcctg 1740 cgagggcaag ctggagctca gcgtggacgg tgccaagcag taccggaacg gggagtccgt 1800 gaagctccac ttagaaaccg actccctagc cctggtggcg ctgggagcct tggacacagc 1860 tctgtatgct gcaggcagca agtcccacaa gcccctcaac atgggcaagg tctttgaagc 1920 tatgaacagc tatgacctcg gctgtggtcc tgggggtggg gacagtgccc ttcaggtgtt 1980 ccaggcagcg ggcctggcct tttctgatgg agaccagtgg accttatcca gaaagagact 2040 aagctgtccc aaggagaaga caacccggaa aaagagaaac gtgaacttcc aaaaggcgat 2100 taatgagaaa ttgggtcagt atgcttcccc gacagccaag cgctgctgcc aggatggggt 2160 gacacgtctg cccatgatgc gttcctgcga gcagcgggca gcccgcgtgc agcagccgga 2220 ctgccgggag cccttcctgt cctgctgcca atttgctgag agtctgcgca agaagagcag 2280 ggacaagggc caggcgggcc tccaacgagc cctggagatc ctgcaggagg aggacctgat 2340 tgatgaggat gacattcccg tgcgcagctt cttcccagag aactggctct ggagagtgga 2400 aacagtggac cgctttcaaa tattgacact gtggctcccc gactctctga ccacgtggga 2460 gatccatggc ctgagcctgt ccaaaaccaa aggcctatgt gtggccaccc cagtccagct 2520 ccgggtgttc cgcgagttcc acctgcacct ccgcctgccc atgtctgtcc gccgctttga 2580 gcagctggag ctgcggcctg tcctctataa ctacctggat aaaaacctga ctgtgagcgt 2640 ccacgtgtcc ccagtggagg ggctgtgcct ggctgggggc ggagggctgg cccagcaggt 2700 gctggtgcct gcgggctctg cccggcctgt tgccttctct gtggtgccca cggcagccgc 2760 cgctgtgtct ctgaaggtgg tggctcgagg gtccttcgaa ttccctgtgg gagatgcggt 2820 gtccaaggtt ctgcagattg agaaggaagg ggccatccat agagaggagc tggtctatga 2880 actcaacccc ttggaccacc gaggccggac cttggaaata cctggcaact ctgatcccaa 2940 tatgatccct gatggggact ttaacagcta cgtcagggtt acagcctcag atccattgga 3000 cactttaggc tctgaggggg ccttgtcacc aggaggcgtg gcctccctct tgaggcttcc 3060 tcgaggctgt ggggagcaaa ccatgatcta cttggctccg acactggctg cttcccgcta 3120 cctggacaag acagagcagt ggagcacact gcctcccgag accaaggacc acgccgtgga 3180 tctgatccag aaaggctaca tgcggatcca gcagtttcgg aaggcggatg gttcctatgc 3240 ggcttggttg tcacgggaca gcagcacctg gctcacagcc tttgtgttga aggtcctgag 3300 tttggcccag gagcaggtag gaggctcgcc tgagaaactg caggagacat ctaactggct 3360 tctgtcccag cagcaggctg acggctcgtt ccaggacccc tgtccagtgt tagacaggag 3420 catgcagggg ggtttggtgg gcaatgatga gactgtggca ctcacagcct ttgtgaccat 3480 cgcccttcat catgggctgg ccgtcttcca ggatgagggt gcagagccat tgaagcagag 3540 agtggaagcc tccatctcaa aggcaaactc atttttgggg gagaaagcaa gtgctgggct 3600 cctgggtgcc cacgcagctg ccatcacggc ctatgccctg tcactgacca aggcgcctgt 3660 ggacctgctc ggtgttgccc acaacaacct catggcaatg gcccaggaga ctggagataa 3720 cctgtactgg ggctcagtca ctggttctca gagcaatgcc gtgtcgccca ccccggctcc 3780 tcgcaaccca tccgacccca tgccccaggc cccagccctg tggattgaaa ccacagccta 3840 cgccctgctg cacctcctgc ttcacgaggg caaagcagag atggcagacc aggcttcggc 3900 ctggctcacc cgtcagggca gcttccaagg gggattccgc agtacccaag acacggtgat 3960 tgccctggat gccctgtctg cctactggat tgcctcccac accactgagg agaggggtct 4020 caatgtgact ctcagctcca caggccggaa tgggttcaag tcccacgcgc tgcagctgaa 4080 caaccgccag attcgcggcc tggaggagga gctgcagttt tccttgggca gcaagatcaa 4140 tgtgaaggtg ggaggaaaca gcaaaggaac cctgaaggtc cttcgtacct acaatgtcct 4200 ggacatgaag aacacgacct gccaggacct acagatagaa gtgacagtca aaggccacgt 4260 cgagtacacg atggaagcaa acgaggacta tgagtacgat gagcttccag ccaaggatga 4320 cccagatgcc cctctgcagc ccgtgacacc cctgcagctg tttgagggtc ggaggaaccg 4380 ccgcaggagg gaggcgccca aggtggtgga ggagcaggag tccagggtgc actacaccgt 4440 gtgcatctgg cggaacggca aggtggggct gtctggcatg gccatcgcgg acgtcaccct 4500 cctgagtgga ttccacgccc tgcgtgctga cctggagaag ctgacctccc tctctgaccg 4560 ttacgtgagt cactttgaga ccgaggggcc ccacgtcctg ctgtattttg actcggtccc 4620 cacctcccgg gagtgcgtgg gctttgaggc tgtgcaggaa gtgccggtgg ggctggtgca 4680 gccggccagc gcaaccctgt acgactacta caaccccgag cgcagatgtt ctgtgtttta 4740 cggggcacca agtaagagca gactcttggc caccttgtgt tctgctgaag tctgccagtg 4800 tgctgagggg aagtgccctc gccagcgtcg cgccctggag cggggtctgc aggacgagga 4860 tggctacagg atgaagtttg cctgctacta cccccgtgtg gagtacggct tccaggttaa 4920 ggttctccga gaagacagca gagctgcttt ccgcctcttt gagaccaaga tcacccaagt 4980 cctgcacttc accaaggatg tcaaggccgc tgctaatcag atgcgcaact tcctggttcg 5040 agcctcctgc cgccttcgct tggaacctgg gaaagaatat ttgatcatgg gtctggatgg 5100 ggccacctat gacctcgagg gacaccccca gtacctgctg gactcgaata gctggatcga 5160 ggagatgccc tctgaacgcc tgtgccggag cacccgccag cgggcagcct gtgcccagct 5220 caacgacttc ctccaggagt atggcactca ggggtgccag gtgtgagggc tgccctccca 5280 cctccgctgg gaggaacctg aacctgggaa ccatgaagct ggaagcactg ctgtgtccgc 5340 tttcatgaac acagcctggg accagggcat attaaaggct tttggcagca aagtgtcagt 5400 gttggc 5406

Claims

신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도를 활용하여 신장암 진단에 유용한 정보를 제공하기 위하여,

(a) 피검자에서 채취된 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료와 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)에 특이적인 항체를 반응시켜, 상기 시료 중에 존재하는 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)와 이에 특이적인 항체의 결합체를 형성시키는 단계,

(b) 상기 결합체를 검출하여 상기 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도를 검출하는 단계, 및

(c) 상기 피검자의 NNMT 혈중 농도를 정상인의 NNMT 혈중 농도와 비교하여 정상인의 NNMT 혈중 농도보다 높은 NNMT 혈중 농도를 가진 피검자를 신장암으로 가지는 것으로 분류하는 단계를

포함하는 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제1항에 있어서,

상기 항체는 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체, 항체의 단편, 재조합 항체 및 화학적으로 수식된 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제2항에 있어서,

상기 항체의 단편은 Fab, F(ab')₂, scFv, Fv, Fab/c, 항체를 단백질 절단 효소로 절단시켜 얻어진 항체 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 항체인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제1항에 있어서,

상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제4항에 있어서,

상기 모노클로날 항체는 포유동물에 상기 신장암 혈액 마커를 면역시키고 항체 생산 세포를 채취하는 단계, 그 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 그 하이브리도마로부터 상기 모노클로날 항체를 얻는 단계를 포함하는 모노클로날 항체의 생산 방법에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 항체 생산 세포는 비장 세포, 림프절 세포 또는 말초혈 세포인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 포유동물은 랫트, 마우스, 토끼 또는 원숭이인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 골수종 세포주는 상기 포유동물과 동종계의 동물에서 유래하고, 약제 선택성을 지니며, 비장 세포와 융합되지 아니한 상태로는 히포크산틴, 아미노푸테린 및 티민을 포함하는 HAT 선택 배지에서 생존할 수 없고, 비장 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 특성을 지니는 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 신장암 혈액 마커는 전장의 단백질의 절편인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혈액의 가공 시료는 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 혈중 농도의 검출 방법.
(a) 신장암 혈액 마커인 NNMT(nicotinamide-N-methyltransferase)에 특이적인 항체와,

(b) 상기 특이적인 항체로 검출하여 얻어진 피검자의 신장암 혈액 마커인 NNMT(nicotinamide-N-methyltransferase)의 혈중 농도를 신장암 진단에 사용하는 방법을 교시한 설명서를 포함하되,

상기 설명서에서 교시된 방법은 피검자의 NNMT의 혈중 농도를 정상인의 NNMT 혈중 농도와 비교하여, 정상인의 NNMT 혈중 농도보다 높은 NNMT 혈중 농도를 가진 피검자를 신장암으로 가지는 것으로 분류하는 단계를 포함하는 방법인 것을 특징으로 하는

신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제11항에 있어서,

상기 항체는 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체, 항체의 단편, 재조합 항체 및 화학적으로 수식된 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제11항에 있어서,

상기 항체의 단편은 Fab, F(ab')₂, scFv, Fv, Fab/c, 항체를 단백질 절단 효소로 절단시켜 얻어진 항체 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 항체인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제11항에 있어서,

상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제14항에 있어서,

상기 모노클로날 항체는 포유동물에 상기 신장암 혈액 마커를 면역시키고 항체 생산 세포를 채취하는 단계, 그 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 그 하이브리도마로부터 상기 모노클로날 항체를 얻는 단계를 포함하는 모노클로날 항체의 생산 방법에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제15항에 있어서,

상기 항체 생산 세포는 비장 세포, 림프절 세포 또는 말초혈 세포인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제15항에 있어서,

상기 포유동물은 랫트, 마우스, 토끼, 염소 또는 원숭이인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제15항에 있어서,

상기 골수종 세포주는 상기 포유동물과 동종계의 동물에서 유래하고, 약제 선택성을 지니며, 비장 세포와 융합되지 아니한 상태로는 히포크산틴, 아미노푸테린 및 티민을 포함하는 HAT 선택 배지에서 생존할 수 없고, 비장 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 특성을 지니는 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제14항에 있어서,

상기 신장암 혈액 마커는 전장의 단백질의 절편인 것을 특징으로 하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제11항에 있어서,

상기 진단 키트는 2차 항체, 담체, 세정 버퍼, 시료 희석액, 효소 기질 및 반응 정지액으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것을 추가로 포함하는, 신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체는 혈액, 혈청 또는 혈장에 접촉되어 사용되는 것을 특징으로 하는신장암 혈액 마커인 NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)의 검출 키트.
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