SK12872003A3

SK12872003A3 - Nádorové signálne znaky rakovinového nádoru obličkovej bunky

Info

Publication number: SK12872003A3
Application number: SK1287-2003A
Authority: SK
Inventors: Roland Kellner; Siegfried Matzku; Barbara Seliger; Rudolf Lichtenfels
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2001-04-03
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2004-02-03
Also published as: HUP0303749A3; RU2003130645A; CZ20032787A3; BR0208603A; ZA200308487B; JP2004531713A; KR20030086345A; CN1630819A; PL363009A1; CA2442957A1; WO2002082076A3; MXPA03009018A; US20040096916A1; HUP0303749A2; WO2002082076A2; EP1373900A2

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nádorových signálnych znakov, pre stručnosť naďalej označovaných ako markery, ktorých možno použiť k skríningu, diagnóze a prognóze rakoviny obličkovej bunky (ŔCC) a k identifikácii subtypov RCC. Ďalej sa vynález týka nádorových markerov ako imunogénov pre stimuláciu imunitnej odozvy a pre výrobu protilátok a protilátkových fúzovaných proteínov zameraných na nádorové markery.

Doterajší stav techniky

S MHC triedou I asociované peptidy sú v širokej miere odvodené z proteolytickej degradácie cytosolických proteínov. Po počiatočnom všeobecnom výskyte sú tieto proteíny štiepené velkým multikatalytickým proteázomovým komplexom. Niektoré konštitutívne β-subjednotky, menovite Y, Z a X, rovnako ako interferonen (IFN)-gama indukovatelné subjednotky, nízkomolekulárne proteínové (LMP) subjednotky LMP2, MECLl (LMP10) a LMP7 vytvárajú proteolyticky aktívne miesta proteazómového komplexu. Výsledné peptidy sú dopravované z cytosolu do endoplazmatického retikula (ER) transportérom asociovaným s antigén spracovávajúcimi (TAP), heterodimérny membránový proteín obsahujúcimi subjednotkami TAP1 a TAP2. Peptidy sú potom naložené na molekuly MHC triedy I vnútri ER,

01-1801-03-ΜΑ čo vyvoláva viacstupňový zhromažďovací proces. Nové syntetizované MHC triedy I ťažké reťazce (HC) asociované s ER rezidentným sprevádzajúcim kalnexínom potom viažu β₂mikroglobulín (β₂-η) a sú potom začlenené do velkého MHC triedy I peptidového komplexu, zostávajúceho zo sprievodného kalretikulínu, tioloxidoreduktázy ER_P57, TAP heterodiméru a transmembránového proteínového tapazínu. Okrem toho teplom šokované proteíny, lokalizované v cytosole rovnako ako v ER, môžu tiež viazať peptidy a mať význam v ich stabilizácii a transporte. Stabilné asociované komplexy MHC trieda I/peptid sa potom premiestňujú cestou prístroja trans-Golgi na povrch buniek pre prezentáciu na bunkách CD8⁺T.

U niektorých chorôb, ako sú rakovina, autoimunitné choroby alebo kardiovaskulárne poruchy, sú peptidy normálnych a abnormálnych proteínov umiestnené na povrchu buniek, ktoré nie je možné nájsť na povrchu buniek zdravých jedincov.

Preto je možno týchto peptidov a proteínov použiť ako markerov pre identifikáciu takýchto abnormálnych buniek. Okrem toho môže byť detekcie protilátok v sére alebo v iných telových tekutinách, zameranej na tieto peptidy alebo proteíny, tiež použité ako indikátora rizika alebo ako prognostického indikátora.

Rakovina obličkovej bunky (RCC) predstavuje približne 5 % úmrtia na rakovinu. Až doposial viacej ako 50 % pacientov už vyvinulo lokálne sa šíriace metastázové ochorenie s päťročným prežitím menším ako 20 %. Hoci sú pomerne rezistentné na konvenčné režimy, RCC sú čiastočne citlivé na imunoterapiu na báze T-buniek.

Proteómová analýza je významným nástrojom k štúdiu zmien v expresii proteínov a modifikačného obrazca v bunkách

01-1801-03-ΜΑ kultivovaných za definovaných podmienok počas diferenciačných stupňov alebo počas fyziologicko/patologických procesov (Pandey a kol., Náture 405, str. 837, 2000; Appella a kol.,

Exs. 88, str. 1, 2000; Gevaert a kol., Electrophoresis 21, str. 1145, 2000) .

V poslednej dobe bolo proteomík použité k hľadaniu diagnostických, prediktivných a prognostických parametrov u nádorov rôzneho pôvodu (Alaiya a kol., Electrophoresis 21, str. 1210, 2000; Unwin a kol., Electrophoresis 20, str. 3629,

1999; Jungblut a kol., Electrophoresis 20, str. 2100, 1999).

Takýchto nádorových markerov (napríklad molekúl, ktoré sú v súvise s nádorom) by mohlo byť rutinne používané k sledovaniu choroby pacientov a mohlo by byť ďalej nápomocné vo výbere nádorových pacientov pre špecificky konštruované imunoterapeutické stratégie liečenia.

Existujú početné stratégie k definovaniu potenciálnych cieľových štruktúr pre tento terapeutický spôsob, vrátane 2-D PAGE separácie (Sarto a kol., Electrophoresis 18, str. 599, 1997; Sarto a kol. Electrophoresis 20, str. 3458, 1999), analýzy SEREX (Scanlan a kol., Int. J. Cancer 83, str.456, 1999), cDNA expresného klonovania (Boon a kol., Immunol. Today 18, str. 267, 1997) a subtraktívneho hybridizačného spôsobu (Pitzer a kol., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 125, str. 487, 1999).

Svetový patentový spis číslo WO 99/00671 popisuje identifikáciu dvojrozmernou gélovou elektroforézou nasledovanú analýzou Western Blot niekoľkých špecifických p-tubulínových izoforiem ako nádorových markerov neuroblastómu v pacientove sére.

01-1801-03-ΜΑ

Vo svetovom patentovom spise číslo WO 00/20586 boli identifikované nové obličkové a s rakovinou zviazané antigény autológovým protilátkovým skríningom knižníc nukleových kyselín expresovaných v obličkových rakovinových bunkách pomocou antiséra od rakovinových pacientov, ktorých je možno použiť ako nádorových markerov.

Existuje však potreba ďalších nádorových markerov pre vývoj liečiv a pre diagnózy použiteľných u rakovinových pacientov majúcich RCC alebo iné rakoviny a pre spôsoby identifikácie RCC a diferenciácie subtypov RCC.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použitie aspoň jedného proteínu vybraného zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, atubulín, cytokeratín, cytokeratín 8 (CK 8), cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutatión-S-transferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu, PA28 a, ubiquitíntiolesterázu, triózafosfátizomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratázu, oí -enolázu, annexín II, IV a V, statmín, nikotínamid-N-metyltransferázu, B23/nukleofosmín a vimentín ako nádorového signálneho znaku.

Zvlášť sa vynález týka použitia aspoň jedného proteínu voleného zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, a tubulín, β-tubulín, cytokeratín, cytokeratín 8 (CK 8) . cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutatión-Stransferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu,

PA28a, ubiquiťíntiolesteŕázu, triózafosfátizomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratázu, <x

01-1801-03-ΜΑ

-enolázu, annexín II, IV a V, statmín, nikotínamid-Nmetyltransferázu, B23/nukleofosmín a vimentín ako nádorového markera pre rakovinu obličkovej bunky.

Vynález sa ďalej týka použitia takých nádorových markerov v imunitných testoch, určených k detekcii prítomnosti protilátok, ktoré sa špecificky viažu na identifikované nádorové markery v sére jednotlivca.

Vynález sa tiež týka imunitných skúšok k detekcii prítomnosti protilátok špecifických pre nádorové markery v sére jednotlivca. Takých imunitných skúšok je možno použiť k skrínovaniu, diagnostike a prognóze choroby. Podlá vynálezu je možno použiť meranie hladiny protilátok vo vzorke jednotlivca ku včasnej diagnóze RCC alebo iných nádorov. Okrem toho môže byť použité sledovanie hladín protilátok v sére prognosticky ku zisteniu stavu progresie choroby.

Ďalej sa vynález týka použitia nádorových markerov ako imunogénov k stimulácii imunitnej odozvy u jedinca proti nádorovým bunkám k inhibícii rastu nádorových buniek alebo k ich zabíjaniu.

Vynález sa tiež týka liečiva obsahujúceho tieto nádorové markery k stimulácii imunitnej odozvy proti nádorovým bunkám k inhibícii rastu nádorových buniek a/alebo k ich zabíjaniu.

Vynález sa týka tiež použitia nádorových markerov pre výrobu protilátok alebo protilátkových fúzovaných proteínov. Takých protilátok alebo protilátkových fúzovaných proteínov môže byť použité ako liečiva k zabíjaniu nádorových buniek alebo pre inhibíciu rastu nádoru.

Vynález sa tiež týka spôsobu a kitov pre identifikáciu RCC

01-1801-03-ΜΑ a diferenciáciu subtypov RCC imunohistochemickými spôsobmi.

Vynález podrobne objasňuje nasledujúci popis s pripojenými obrázkami.

Zoznam obrázkov na výkresoch

Na obr.l sú ciele zistené v skrínovacom okienku pre zložky s vysokou molekulovou hmotnosťou (7 % T/2,5 % C gélov).

Je znázornený rez koloidného coomasiovo vyfarbeného 2D gélu (7 % T/2,5 % C) predstavujúci obrazec škvŕn totálneho lyzátu z približne 5xl0⁶ neošetrených buniek MZ1257RC. Proteíny sú zamerané v prvom rozmere na nelineárnu imobilnú pásku DryStrip (hodnota pH 3 až 10; NL; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko). Relevantné cielové škvrny, detekované pozitívnym imunovyfarbením škvŕn pacientova séra, sú vyznačené šípkami. Identita týchto cielových škvŕn je analyzovaná na odpovedajúcich géloch mapovaním peptidovej hmoty a/alebo parciálnym sekvencovaním.

Na obr. 2 sú ciele zistené v skrínovacom okienku pre zložky s nízkou molekulovou hmotnosťou ( 16% T/2,5 % C gély).

Je znázornený koloidný coomasiovo vyfarbený 2D gél (16 % T/2,5 % C) predstavujúci obrazec škvŕn totálneho lyzátu z približne 2,5xl0⁶ neošetrených buniek MZ1257RC. Proteíny sú zamerané v prvom rozmere na nelineárnu imobilnú pásku DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko). Relevantné cielové škvrny, detekované pozitívnym imunovyfarbením škvŕn pacientova séra, sú vyznačené šípkami. Identita týchto cielových škvŕn je odpovedajúcich géloch mapovaním peptidovej parciálnym sekvencovaním.

analyzovaná na hmoty a/alebo

01-1801-03-ΜΑ

Na obr. 3 sú ciele zistené vo skrínovacom okienku pre zložky s nízkou molekulovou hmotnosťou (16 % T/2,5 % C gély), nasledované stimuláciou IFN-gama bunkovej línie HZ1257RC.

Je znázornený koloidný coomasiovo vyfarbený 2D gél (7 % T/2,5 % C) predstavujúci obrazec totálneho lyzátu od približne 2,5xl0⁶ IFN-gama stimulovaných buniek (48 hodín) MZ1257RC. Proteíny sú zamerané v prvom rozmere na nelineárnu imobilnú pásku DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko). Relevantné cielové škvrny, detekované pozitívnym imunovyfarbením škvŕn pacientova séra, sú vyznačené šípkami. Identita týchto cielových škvŕn je analyzovaná na odpovedajúcich géloch mapovaním peptidovej hmoty a/alebo parciálnym sekvencovaním.

Na obr. 4 je znázornená imunohistochemická analýza normálneho obličkového tkaniva a RCC pre CK 8, statmín a vimentín. Imunohistochemické vyfarbenie (400x, zlava doprava) normálneho obličkového tkaniva, RCC subtypu čírych buniek (G2) a RCC chromofóbneho subtypu (G2) sa uskutočňuje anti-CK 8, anti-statmín a antivimentín špecifickými mAb, ako je popísané v príklade 5. Je znázornené silné pozitívne vyfarbenie pre CK 8 v epiteli distálneho tubulu a zberného kanálikového systému rovnako ako v bunkách RCC prečistenej bunky a chromofóbneho subtypu. Sú znázornené stredné až silne pozitívne cytoplazmové vyfarbenia epitelu pre statmín v distálnom tubulárnom systéme; pozitívne cytoplazmové vyfarbenie buniek RCC subtypu prečistenej bunky rovnako ako rozptýlená infiltrácia zápalových buniek a negatívna reakcia buniek RCC chromofóbneho subtypu. Silné pozitívne cytoplazmové vyfarbenie intersticiálnych buniek v normálnom obličkovom tkanive a RCC buniek typu prečistenej bunky, zatial čo normálny tubulárny epitel je negatívny pre vyfarbenie vimentínom. Zisťuje sa slabá expresia vimentínu v bunkách RCC chromofóbneho subtypu.

Ο1-18Ο1-Ο3-ΜΑ

Ciela vynálezu je dosiahnuté na základe neočakávaného poznatku, že proteíny vybrané zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, oe-tubulín, β -tubulín, cytokeratín, CK 8, cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutatión-Stransferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu,

PA28a, ubiquitíntiolesterázu, trózafosfátizomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratázu, a statmín, nikotínamid-Na vimentín, s výhodou enolázu, annexín II, IV a V, metyltransferázu, B23/nukleofosmín annexín II, IV a V, statmín, vimentín a B23/nukleofosmín, sú substrátmi pre proteolytickú degradáciu velkým multikatalytickým proteazómovým komplexom v pacientoch s RCC, a preto peptidy týchto proteínov sú antigénmi zviazanými s rakovinou obličiek takých jedincov. Preto je možno týchto proteínov a ich fragmentov používať ako nádorových markerov.

Proteíny podía vynálezu boli identifikované dvojrozmernou gélovou elektroforézou (obr. 1 až 3) a následnou detekciou imunoblottingom pacientovho séra. Imunovyfarbené proteínové škvrny boli vyrezané z duplikátneho gélu, podrobené gélovej digescii a analyzované hmotovou spektrometriou. Diferenčnou analýzou pacientovho séra oproti séru zdravých dobrovoľníkov boli identifikované zhora uvedené proteíny ako nádorové markery RCC pacientov.

Tu používaným označením pre nádorový signálny znak nádorový marker podľa vynálezu sa mienia proteíny vybrané zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, a- tubulín, β tubulín, cytokeratín, CK 8, cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutatión-S-transferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu, PA28oí, ubiquitíntiolesterázu, triózafosfátizomerázu, aldózreduktázu,

01-1801-03-ΜΑ enoyl-CoA-hydratázu, cx -enolázu, annexín II, IV a V, statmín, nikotínamid-N-metyltransferázu, B23/nukleofosmín a vimentín a ich imunogenické fragmenty.

Poznatok, že sú tieto proteíny imunogénne u RCC pacientov, je základom pre vývoj diagnostických metód pre RCC a ostatnej rakoviny, u ktorých sú tieto proteíny prítomné na povrchu nádorovej bunky, rovnako ako pre vývoj prostriedkov pre prognózu rôznych terapeutických postupov pre túto chorobu. Okrem toho je na tomto poznatku založený spôsob použitia týchto proteínov ako imunogénov pre stimuláciu imunitnej odozvy voči nádorovým bunkám.

Preto sa vynález týka použitia proteínov zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, a- tubulín, β -tubulín, cytokeratín, cytokeratín 8, cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutatión-S-transferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu, PA28a, ubiquitíntiolesterázu, triózafosfátizomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratázu, a. -enolázu, annexín II, IV a V, statmín, nikotínamid-N-metyltransferázu, B23/nukleofosmín a vimentín ako nádorových markerov.

Najmä sa vynález týka použitia proteínov zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, a- tubulín, β -tubulín, cytokeratín, CK 8, cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP) , gp 96, glutatión-S-transferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu, PA28a, ubiquitíntiolesterázu, triózafosfátizomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratázu, a -enolázu, annexín II, IV a V, statmín, nikotínamid-N-metyltransferázu, B23/nukleofosmín a viméntín ako nádorových markerov rakoviny obličkovej bunky.

01-1801-03-ΜΑ

Tieto proteíny sa môžu izolovať a čistiť štandardnými spôsobmi vrátane chromatografie (napríklad ionexovej, afinitnej a stĺpcovej chromatografie s vylúčením veľkosti) odstreďovania, rozdielnej rozpustnosti, elektroforézy alebo akéhokoľvek štandardného spôsobu čistenia proteínov. Vyčistených proteínov sa môže používať pri testoch imunity určených k detekcii prítomnosti protilátok vo vzorke jedinca, alebo alternatívne môže byť takých proteínových preparátov použité k imunizácii, ako je zhora aj nižšie popísané.

Vynález sa tiež týka spôsobu detekcie a/alebo kvantitatívneho merania protilátok zameraných na nádorové markery podľa vynálezu v biologickej vzorke, ako sú sérum alebo telové tekutiny pacienta trpiaceho RCC alebo inými chorobami charakterizovanými špecifickou prítomnosťou fragmentov nádorových markerov na povrchu bunky.

Tieto spôsoby sa dajú uskutočňovať ktorýmkoľvek z početných spôsobov. Ako také spôsoby sa uvádzajú imunotesty, ktoré zahrnujú príkladne, teda bez zámeru na akomkoľvek obmedzení, konkurenčné a nekonkurenčné testovacie systémy, s použitím techník, ako sú Western-blot, rádioimunitné testy, ELISA (enzýme linked immunosorbent assay). sendvičové imunotesty, imunoprecipitačné testy, precipitínové reakcie, gélové difúzne precipitínové reakcie, imunodifúzne testy, aglutinačné testy, doplnkové fixačné testy, imunorádiometrické testy, fluorescenčné imunotesty, proteínové A imunotesty.

Pri uskutočňovaní týchto testov môžu byť nádorové markery imobilizované na membráne alebo na substráte alebo ich môže byť použité v kvapalnej fáze. Vhodnou membránou alebo substrátmi sú napríklad povrchy schopné viazať proteíny, ako

01-1801-03-ΜΑ sú jamky mikrotitračných doštičiek alebo nitrocelulózová membrána. Ďalšie vhodné testy in vitro sú pracovníkom v odbore známe.

Napríklad jedným spôsobom in vitro pre diagnózu a prognózu rakoviny jedinca, spočívajúcu v detekcii pomocou imunitného testu prítomnosti protilátky získanej zo vzorky séra takého jedinca a v zameraní na proteín nádorového markera, je spôsob, pri ktorom:

a) sa imobilizuje aspoň jeden nádorový marker na membráne alebo na substráte,

b) uvádza sa do styku membrána alebo substrát so vzorkou séra jedinca,

c) zisťuje sa prítomnosť protilátok špecifických pre nádorový marker vo vzorke jedincovho séra.

K detekcii protilátok špecifických pre nádorový marker vo vzorke séra sa zvyčajne používa druhých protilátok s zistitelným označením. Zistitelným označením môže byť rádioizotop, ktorého detekcia sa uskutočňuje autorádiograficky. Obzvlášť výhodnými izotopmi k tomuto účelu sú ³H,¹²⁵J, ¹³¹ J, ³⁵S a ¹⁴C.

Druhé protilátky môžu byť tiež označené fluorescenčnou zlúčeninou. Prítomnosť fluorescenčné označenej protilátky je podmienená vystavením imunokonjugátu pôsobeniu svetla správnej vlnové dĺžky a detekciou výslednej fluorescencie. Ako príklady fluorescenčné značkujúcich zlúčenín sa uvádzajú fluoresceín, izokyanát, rodamín, fykoeryterín, fykokyanín, allofykokyanín, oftaldehyd a fluoreskamín.

01-1801-03-ΜΑ

Alternatívne môže byť druhá protilátka zistiteľné označená viazaním na chemiluminiscenčnú zlúčeninu. Prítomnosť chemiluminiscenčne označeného imunokonjugátu je detekciou prítomnosti luminiscencie, ktorá sa priebehu chemickej reakcie. Príkladom chemiluminiscenčne označených zlúčenín sú luminol, izoluminol, aromatický akridiumester, imidazol, akridíniová sol a oxalátový ester.

podmienená objaví v

Podobne možno označeniu druhej chemiluminiscencie katalytický proteín použiť bioluminiscenčné zlúčeniny k protilátky. Bioluminiscencia je typ biologických systémov, v ktorých zvyšuje účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčného proteínu detekciou prítomnosti luminiscencie, bioluminiscenčnými zlúčeninami, ktorých sa označeniu, sú luciferín, luciferáza a acquorín.

sa zisťuje Vhodnými používa k

Alternatívne môže byť druhá protilátka označená väzbou druhej protilátky na enzým. Pokial je konjugát protilátkaenzým inkubovaný v prítomnosti vhodného substrátu, reaguje enzýmový podiel so substrátom za vzniku chemického podielu, ktorý sa môže detekčne zistiť, napríklad spektrofotometricky, fluorometricky alebo vizuálne. Príklady enzýmov, ktorých sa môže použiť k detekčne označeným polyšpecifickým imunokonjugátom sú: β-galaktozidáza, glukózoxidáza, peroxidáza a alkalická fosfatáza. Pracovníkom v odbore je známe veľa ďalších spôsobov označení, ktorých sa môže používať podlá vynálezu. Väzba podielov markera na protilátky sa môže uskutočňovať štandardnými spôsobmi, známymi v odbore. Zvyčajný spôsob k tomuto účelu popísal Kennedy a kol. (Clin. Chim. Acta 70, str. 1, 1976); Schurs a kol. (Clin. Chim. Acta 81, str. 1, 1977); Shih a kol. (Intl. J. Cancer 46, str. 1101, 1990);

Stein a kol. (Cancer Res. 50, str. 1330, 1990).

01-1801-03-ΜΑ

Detekcia kvantitatívneho merania protilátok, zameraných na nádorové markery podlá vynálezu v sére alebo v inej telovej tekutine, sa môže použiť k prieskumu jedincov ohrozených RCC alebo iných porúch charakterizovaných imunogenickými vlastnosťami nádorových markerov podľa vynálezu. Okrem toho sa môže meranie protilátok použiť prognosticky k zisteniu stavu progresie choroby.

Vynález sa tiež týka súpravy (kit) k uskutočňovaniu týchto detekčných spôsobov. Taká súprava môže obsahovať všetky potrebné prvky k realizácii zhora popísanej diagnostickej skúšky. Súprava môže obsahovať tiež druhý kontajner obsahujúci protilátku alebo jej fragment majúci príslušné poznávacie miesto (napríklad antihumánnu protilátku IgG) pre protilátky pacientovho séra a detekovateľné označenie, ako je zhora popísané.

Identifikácia nádorových markerov spojených s RCC poskytuje základ pre imunoterapiu choroby. Pacient môže byť imunizovaný nádorovými markermi k vybudeniu imunitnej odozvy, ktorá uľahčí zabíjanie nádorových buniek a/alebo inhibíciu rastu nádorových buniek. Nádorové markery sa môžu pripravovať zhora popísanými spôsobmi pre čistenie proteínov.

Alternatívne môže byť pacient liečený protilátkami, s výhodou humanizovanými protilátkami alebo ich fragmentmi, zameranými na nádorové markery k vybudeniu reakcie, ktorá uľahčí zabíjanie nádorových buniek a/alebo inhibíciu rastu nádorových buniek.

Výraz protilátkový fragment v zmysle vynálezu znamená časť protilátky, ako je napríklad F(ab')₂, F(ab)₂, Fab' a Fab. Nezávisle od štruktúry sa protilátkový fragment viaže rovnakým

01-1801-03-ΜΑ antigénom, ktorý je poznaný intaktnou protilátkou. Výraz zahrnuje tiež syntetický alebo geneticky konštruovaný polypeptid, ktorý sa viaže na špecifický antigén, ako sú polypeptidy zostávajúce z variabilného úseku lahkého reťazce, Fv fragmenty zostávajúce z variabilných úsekov ťažkého a lahkého reťazca, jeden rekombinantný reťazec polypeptidových molekúl, v ktorých lahké a ťažké variabilné úseky sa spojujú peptidovým spojovníkom (scFv proteíny) a minimálne rozpoznávacie jednotky zostávajúce zo zvyškov aminokyselín, ktoré napodobňujú hypervariabilný úsek.

Výrazom humanizované protilátky sa mienia protilátky obsahujúce FR variabilné úseky a konštantné úseky aminokyselín na lahkom a ťažkom reťazci, ktoré pochádzajú z ludských zdrojov, zatial čo hypervariabilné úseky pochádzajú z neľudských zdrojov.

Výrazom FR sa mienia úseky základnej štruktúry protilátky a nachádzajú sa vnútri variabilných úsekov. V týchto úsekoch dochádza k určitej premene aminokyselín.

Polyklonálne protilátky voči nádorovým markerom podía vynálezu sa môžu pripravovať spôsobmi dobre známymi pracovníkom v odbore (Green a kol., Production of Polyclonal Antiséra , Immunochemical Protocols (vydavateľ Manson), str. 1 až 5 (Humana Press 1992); Williams a kol., Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. vydanie, Glover a kol. (vydavatelia), str. 15 (Oxford University Press 1995)).

Imunogenicita nádorových markerov môže byť zvýšená použitím adjuvans, ako je hydroxid hlinitý alebo Freundov úplný alebo neúplný adjuvans. Polypeptidy vhodné pre

Ο1-18Ο1-Ο3-ΜΑ imunizáciu obsahujú tiež fúzované polypeptidy, ako sú fúzie nádorového markera alebo jeho časti s imunoglobulínovým polypeptidom alebo s maltózou viažucim proteínom. Polypetidovým imunogénom môže byť molekula plnej dĺžky alebo jej časť. Ak je polypeptidová časť podobná hapténu (hapten like), môže byť taká časť s výhodou pripojená alebo viazaná (napríklad keyhole limpet hovädzieho séra (BSA) alebo na makromolekulárny nosič hemocyanin (KLH), albumín tetanusový toxoid) pre imunizáciu.

Monoklonálne protilátky na nádorové markery možno získať spôsobmi známymi pracovníkom v odbore (napríklad Kohler a kol., Náture 256, str.495, 1975; Coligan a kol. (vydavateľ),

2.5.1 až 2.6.7 Production of

Current Protocols in Immunology, zv. 1 str.

(John Wiley & Sons 1991; Picksley a kol., monoclonal antibodies against proteins expressed in E.coli, DNA Cloning 2. Expression Systems 2. vydanie, Glover a kol. (vydavateľ) str. 93 (Oxford University Press 1995)) .

Monoklonálne protilátky možno získať injektovaním myši prostriedkom, ktorý obsahuje jeden alebo niekoľko nádorových markerov, overením prítomnosti produkcie protilátok odobratím vzorky séra, odobratím sleziny k získaniu B-lymfocytov, fúzovaním B-lymfocytov s bunkami myelómu k vytvoreniu hybridómu, klonovaním hybridómu, selekciou pozitívnych klonov, ktoré vytvárajú protilátky na antigén, kultivovaním klonov, ktoré produkujú protilátky na antigén a izolovaním protilátok z hybridómovýčh kultúr.

Okrem toho sa môže protilátka protinádorového markera podlá vynálezu odvodiť z ludskej monoklonálnej protilátky. Ľudské monoklonálne protilátky sa získajú z transgénnych myší, ktoré boli upravené k vytváraniu špecifických ľudských protilátok v odozve na antigénovú výzvu. Pri tomto spôsobe sa zavádzajú elementy miesta ludského ťažkého a ľahkého reťazca

01-1801-03-ΜΑ do kmeňov myší odvodených z embryového kmeňa bunkových línií, ktoré obsahujú cieľové prerušenia endogénnych miest ťažkého a ľahkého reťazca. Transgénne myši môžu syntetizovať ľudské protilátky špecifické pre ľudské antigény a myší sa môže použiť k vytváraniu hybridómu so sekréciou ľudských protilátok.

Spôsoby získavania ľudských protilátok od transgénnych myší sú popísané v literatúre (napríklad Green a kol., Náture Genet. 7, str. 13, 1994; Lonberg a kol., Náture 368, str. 856, 1994; a Taylor a kol., Int. Immun. 6, str. 579, 1994).

Monoklonálne protilátky sa môžu izolovať a čistiť z hybridómových kultúr rôznymi dobre zavedenými spôsobmi. Ako také izolačné spôsoby sa uvádzajú afinitná chromatografia s Protein-A-Sefarózou, chromatografia s vylúčením veľkosti a ionexová chromatografia (napríklad Coligan, str. 2.7.1-2.7.12 a str. 2.9.1-2.9.3; Baines a kol., Purification of Immunoglobulin G (IgG), Methods in Molecuiar Biology, zv.10, str. 79 až 104, The Humana Press Inc., 1992).

Pre zvláštne použitie môže byť žiaduce pripraviť fragmenty protilátok antinádorových markerov. Také fragmenty protilátok možno získať napríklad proteolytickou hydrolýzou protilátky. Fragmenty protilátok je možno získať pepsínovou alebo papaínovou digesciou úplných protilátok zvyčajnými spôsobmi, pre objasnenie sa uvádza, že fragmenty protilátok možno pripraviť enzymatickým rozštiepením protilátok pepsínom k získaniu fragmentu 5S označovaného F (ab')₂. Tento fragment môže byť ďalej rozštiepený pomocou tiol redukujúceho činidla k vytvoreniu monovalentných fragmentov 3.5S Fab'. Optimálne sa môže štiepateľná reakcia uskutočňovať blokujúcou skupinou pre sulfhydrylové skupiny, ktoré pochádzajú z rozštiepenia disulfidových väzieb. Ako alternatíva poskytuje enzymatické

01-1801-03-ΜΑ rozštiepenie s použitím pepsínu dva monovalentné Fab fragmenty a Fc fragment priamo. Tieto spôsoby popísali napríklad Goldenberg (americký patentový spis číslo US 4 331 647);

Nisonoff a kol. (Árch. Biochem. Biophys. 89, str. 230, 1960);

Porter (Biochem J. 73, str. 119, 1959); Edelman a kol.

(Methods in Enzymology zv.l, str. 422 (Academic Press 1967); a Coligan str. 2.8.1-2.8.10 a 2.10-2.10.4.

Môže sa ešte použiť iných spôsobov rozštiepenia protilátok, ako sú separácie ťažkých reťazcov k vytvoreniu monovalentných fragmentov s lahkým - ťažkým reťazcom, ďalej rozštiepenie fragmentov alebo iné enzymatické, chemické alebo genetické spôsoby, pokiaľ sa fragmenty viažu na antigén, ktorý je rozpoznaný intaktnou protilátkou. Napríklad Fv fragmenty obsahujú združenie reťazcov V_H a V_L. Toto združenie môže byť nekovalentné (Inbar a kol., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 69, str. 2659, 1972). Alternatívne môžu byť variabilné reťazce spojené intermolekulárnou disulfidovou väzbou alebo zosietené chemikáliami, ako je glutaraldehyd (napríklad Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12, str. 437, 1992).

Fragmenty Fv môžu obsahovať V_H a V_L reťazce, ktoré sú spojené peptidovým spojovníkom. Tieto proteíny s jedným reťazcom, ktoré viažu antigén (scFv), sa pripravujú konštrukciou štrukturálneho génu obsahujúceho sekvencie DNA kódujúce domény V_H a V_L, ktoré sú spojené oligonukleotidom. Štrukturálny gén sa začlení do expresného vektora, ktorý je potom zavedený do hostitelské bunky, ako je E.coli. Rekombinantné hostitelské bunky syntetizujú jediný polypeptidový reťazec so spojovníkovým peptidom premosťujúcim dve V domény. Spôsoby produkcie scFv sú popísané v literatúre (napríklad Whitlow a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2, str. 97, 1991; Bird a kol., Science 242, 423,

01-1801-03-ΜΑ

1988; Ladner a kol., americký patentový spis číslo US 4 946 778) .

Pre objasnenie sa uvádza, že scFv možno získať exponovaním lymfocytov nádorovým markerom in vitro a vyčlenením protilátkových knižníc vo táge alebo v podobných vektoroch (napríklad použitím imobilizovaných alebo označených nádorových markerov). Inou formou protilátkového fragmentu je peptid kódujúci jediný úsek podmieňujúci komplementaritu (CDR). Peptidy CDR (jednotky s minimálnym poznaním) možno získať konštrukciou génov kódujúcich CDR hladané protilátky. Také gény sa pripravia napríklad použitím reakcie polymerázového reťazca k syntetizácii variabilného úseku z RNA buniek produkujúcich protilátku (napríklad Larrick a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2, str. 106, 1991; Cortenay-Luck Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter a kol. (vydavatel) str. 166, Cambridge University Press 1995; a Ward a kol. Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, Monoclonal Antibodies Principles and Applications, Birch a kol. (vydavatel), str. 137 (Wiley-Liss Inc.) 1995).

Humani zované predovšetkým

Alternatívne môže byť protilátka nádorového markera odvodená z humanizovanej monoklonálnej protilátky.

monoklonálne protilátky sa pripravujú z myších komplementárne určujúcich úsekov z ťažkých a ľahkých variabilných reťazcov myšieho imunoglobulínu do ľudskej variabilnej domény. Typické zvyšky ľudských protilátok sa potom substituujú do rámcových úsekov myších náprotivkov. Použitie protilátkových zložiek, humanizovaných monoklonálnych protilátok, potenciálne problémy spojené konštantných úsekov. Obecné odvodených z odstraňuj e s imunogenicitou myších techniky pre klonovanie

01-1801-03-ΜΑ variabilných domén myšieho imunoglobulínu popísal napríklad Orlandi a kol. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, str. 3833, 1989. Spôsoby výroby humanizovaných monoklonálnych protilátok sú popísané v literatúre (napríklad Jones a kol., Náture 321, str. 522 1986; Carter a kol., Proc. Natl. Acad. Sei USA 89, str. 4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12, str. 437,

1992; Singer a kol., J.Immun. 150, str. 2844, 1993; Sudhir (vydavatel), Antibody Engineering Protocols (Humana Press Inc. 1995); Kelley Engineering Therapeutic Antibodies, Protein Engineering Principles and Practice, Clealand a kol. (vydavatel) str. 399 až 434 (John Wiley & Sons,Inc.) 1996; a Queen a kol., americký patentový spis číslo US 5 6937 62,

1997) .

Alternatívne môže byť pacient liečený protilátkovými fúzovanými proteínmi zameranými na proteíny nádorových markerov k vyvolaniu reakcie, ktorá ulahčí zabíjanie nádorových buniek a/ alebo inhibíciu ich rastu.

Výrazom protilátkový fúzovaný proteín sa vždy mieni fúzovaná molekula, ktorá zostáva v podstate z protilátky alebo z jej fragmentu, zameraná na nádorový marker podlá vynálezu a z terapeutického činidla, ktorého sa použije priamo alebo cestou spojovníka alebo medzerníka do imunoglobulínu alebo jeho fragmentu. Príklady vhodných terapeutických činidiel pre také fúzované proteíny sú imunomodulátory a toxíny napríklad, teda bez zámeru na akomkolvek obmedzení, cytokíny, ako sú IL1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFa alebo CSF.

Fúzované proteíny sa môžu pripravovať o sebe známymi spôsobmi pracovníkom v odbore pripravením každej zložky fúzovaného proteínu a ich chemickou konjugáciou. Alternatívne sa môže vytvoriť polynukleotid kódujúci obe zložky fúzovaného proteínu v správnom čítacom rámci za použitia známych spôsobov

01-1801-03-ΜΑ a expresuje sa spôsobmi popísanými napríklad v európskom patentovom spise číslo EP O 659439.

V jednom uskutočnení vynálezu sa použije imunogénu obsahujúceho jeden alebo zmes vyčistených nádorových markerov, voči ktorým pacientova rakovina vyvinula protilátky k vyvolaniu imunitnej odozvy.

V inej realizácii vynálezu sa môže použiť protilátok alebo protilátkových fragmentov pestovaných proti nádorovým markerom podlá vynálezu k reakcii, ktorá ulahčí zabíjanie nádorových buniek a/alebo inhibíciu ich rastu.

Nádorové markery, ich zmesi alebo protilátky a fragmenty protilátok alebo protilátkové fúzované proteíny podlá vynálezu možno aplikovať priamo alebo vo farmaceutických prostriedkoch obsahujúcich zlúčeniny a farmaceutický prijatelné riedidlo, nosič alebo ich excipient pacientovi trpiacemu RCC alebo inou chorobou charakterizovanou špecifickou prítomnosťou fragmentov nádorových markerov na povrchu bunky.

Výrazom farmaceutický prijatelný nosič sa mieni inertné, netoxické, pevné alebo kvapalné plnivo, riedidlo alebo v kapsule uzatvorený materiál nereagujúci nepriaznivo s účinnou zlúčeninou alebo s pacientom. Vhodné, s výhodou kvapalné, nosiče sú v odbore dobre známe a príkladne sa uvádzajú sterilná voda, solanka, vodná dextróza, cukorné roztoky, etanol, glykoly a oleje, vrátane minerálneho, živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, napríklad podzemnicový, sójový a minerálny olej.

Prostriedky podlá vynálezu sa môžu podávať ako jednotkové dávky obsahujúce o sebe známe netoxické farmaceutický

01-1801-03-ΜΑ prijatelné nosiče, riedidlá, adjuvans a vehikulá, ktoré sú typické pre parenterálne podanie.

Môže sa používať početných spôsobov pre podávanie prostriedkov podlá vynálezu: príkladne, teda veru nie ako akékolvek obmedzenie, sa uvádza podanie orálne, intradermálne, intramuskulárne, intraperitoneálne, intravenózne a subkutánne.

Výrazom parenterálne sa vždy mieni podanie subkutánnou, intravenóznou, intraartikálárnou a intratracheálnou injekciou a infúziou. Vhodné sú tiež iné spôsoby podania, napríklad podanie orálne alebo topické. Parenterálne prostriedky a kombinácie sa najvýhodnejšie podávajú intravenózne buď vo forme bolu alebo konštantnou fúziou o sebe známymi spôsobmi.

Pokiaľ sú zlúčeniny podľa vynálezu formulované ako tablety, kapsuly alebo prášok, používa sa zvyčajných nosičov a excipientov zo súboru zahrnujúceho uhličitan horečnatý, uhličitan vápenatý, hydrogenuhličitan sodný, stearát horečnatý, stearát vápenatý, mastenec, laktózu, mikrokryštalickú celulózu, metylcelulózu, nátriumkarboxymetylcelulózu, škrob a bezvodný oxid kremičitý, mazadiel zo súboru zahrnujúceho hydratovaný ricínový olej, stearát horečnatý a nátriumlaurylsulfát a cukru, pektínu, dextrínu, tragakantu, nízkotopiaceho vosku, kakaového masla, alginátov, želatíny, polyvinylpyrrolidónu, polyetylénglykolov, kvartérnych amóniových zlúčenín a podobných prísad ako aj tiež spojív zo súboru zahrnujúceho príkladne škrob, glukózu, arabskú glejovinú a manitol. Tablety a kapsuly môžu byť povlečené spôsobom v odbore obecne známym.

Orálne kvapalné prostriedky môžu mať formu vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, sirupov a vodičiek alebo môžu byť v podobe suchých produktov pre rekonštitúciu vo

01-1801-03-ΜΑ vode alebo v inom vhodnom nosiči pred použitím. Také kvapalné prostriedky môžu obsahovať o sebe známe prísady, ako sú suspenzačné činidlá, emulgátory, nevodné nosiče a konzervačné prísady.

Topické prostriedky môžu byť v podobe vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, gélov alebo s výhodou emulzných mastí.

V prípade prostriedkov obsahujúcich nádorové markery sú výhodnými prostriedkami, v ktorých sú nádorové markery formulované s vhodnými adjuvans k zosilneniu imunitnej odozvy na proteínový antigén. Vhodnými adjuvans sú príkladne, teda veru nie ako akékolvek obmedzenie, minerálne gély, napríklad hydroxid hlinitý, povrchové aktívne činidlá, ako sú lyzolecitín, plurónne polyoly, polyanióny, peptidy, olejové emulzie a potenciálne použiteľné humánne adjuvans, ako BCG (bacilli Calmett-Guerin) a Corynebacterium parvum.

Jednotkové dávkovacie formy podľa vynálezu môžu obsahovať denné potrebné množstvá zlúčeniny podía vynálezu alebo ich podiely k dosiahnutiu žiadúcej dávky. Optimálne terapeuticky prijateľné dávkovanie a velkosť dávky pre určitého pacienta (cicavca vrátane ludí) závisí od rôznych faktorov, ako je aktivita určitej použitej účinnej látky, vek, telesná hmotnosť, zdravotný stav, pohlavie, strava, doba a spôsob podania, rýchlosť vylučovania, ciel ošetrovania, to znamená od terapie alebo profylaxie a povahy ošetrovanej choroby, ako je pracovníkom v odbore známe.

Preto je účinnou dennou dávkou pre ošetrovaného pacienta (in vivo) množstvo účinnej zlúčeniny podía vynálezu v podobe prostriedku alebo kombinácie približne 0,01 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti, s výhodou približne 0,1 až 10 mg/kg

01-1801-03-ΜΑ telesnej hmotnosti. Podľa spôsobu podania obsahuje jednotlivá dávka 0,01 až 10 mg účinnej zlúčeniny.

Nádorové markery, protilátky a fúzované protilátkové proteíny podľa vynálezu sú tiež užitočné spolu s inými chemoterapeutickými činidlami. Chemoterapeutické činidlá, ktoré sa môžu používať spolu so zlúčeninami podľa vynálezu, zahrnujú činidlá, ktoré majú antineoplastické pôsobenie, to znamená, že predchádzajú vývoju, zretiu alebo rozširovaniu neoplastických buniek priamo na nádorovú bunku, ktoré majú napríklad cytostatické alebo cytotoxické pôsobenie a veru nie nepriamo prostredníctvom mechanizmov, ako je modifikácia biologickej odozvy. Chemoterapeutické činidlá podľa vynálezu sú s výhodou prírodné alebo syntetické chemické zlúčeniny, nie sú ale vylúčené ani biologické molekuly, ako sú napríklad proteíny, protilátky, chemokíny, cytokíny a polypeptidy. Je veľký počet chemoterapeutických činidiel obchodne dostupných pre klinické zhodnotenie a pre predklinický vývoj, ktoré vynález môže zahrnovať.

Ako chemoterapeutické činidlá alebo prostriedky sa uvádzajú alkylačné činidlá napríklad mechlóretamíny (nitrogén mustard), zlúčeniny cisplatín etylénimínové zlúčeniny, alkylsulfonáty a iné s alkylačným pôsobením, ako sú nitrózomočovina, a dakarbazín; antimetabolity napríklad kyselina listová, purínové alebo pyrimidínoví antagonisti;

alkaloidy vinea mitotické deriváty deriváty činidlá alebo inhibítory napríklad podofyllotoxínu; cytotoxické antibiotiká kamptofecínu. Výhodné chemoterapeutické chemoterapeutiká zahrnujú amifostín (etyol), cisplatín, dakarbazín (DTIC) , daktinomycín, mechlóretamín (nitrogén mustard), streptozocín, cyklofosfamid, karmustín (BCNU), lomustín (CCNU), doxorubicín (adriamycín), doxorubicín lipo (doxil), gemcitabín (gemzar), daunorubicín, daunorubicín lipo

01-1801-03-ΜΑ (daunoxóm), metotrexát, bleomycín, aldesleukín, kamptotecín, dakarbazín, prokarbazín, mitomycín, cytarabín, etopozid, 5-fluorouracil (5-FU), vinblastín, vinkristín, docetaxel (taxotere), paclitaxel (taxol), asparagináza, busulfán, karboplatín, kladribín, CPT-11, 10-hydroxy-7-etylkamptotecín (SN38), floxuridín, fludarabín, hydroxymočovina, ifosfamid, idarubicín, mesna, interferón alfa, interferón beta, irinotekán, mitoxantrón, topotekán, leuprolid, megestrol, melfalán, merkaptopurín, mitotanpegaspargáza, pentostatín, pipobroman, streptozocín, tamoxifén, tenipozid, testolaktón, plikamycín, plikamycín, tioguanín, tiotepa, uracil mustard, vinorelbín, kombinácie.

chlórambucil ich

Vynález sa ďalej týka spôsobu identifikácie RCC a diferenciácie subtypov RCC imunohistochemickými spôsobmi na báze nižšie uvedených poznatkov a kitov pre realizáciu tohoto spôsobu.

Podía histologických charakteristík sa RCC klasifikujú na odlišné subtypy, najčastejšie prečistená bunka, chromofóbny, chromofilný a onkocytomický subtyp. Spôsoby stanovenia rôznych subtypov RCC popísal Thoenes a kol. (Path. Res. Pract. 181, str. 125, 1986) a Stôrkel a van der Berg (World J. Urol. 13, str. 153. 1995).

Zistilo sa, že expresná schéma troch selektívnych imunogénnych proteínov sa líši v normálnej obličke a v rozdielnych subtypoch RCC. Expresná schéma CK 8, statmínu a vimentínu sa imunohistochemicky analyzovala v rade chirurgicky odstránených RCC lézií odlišných subtypov a autológov normálneho obličkového epitelu. Ako je zrejmé z obr. 4, epitel proximálneho a distálneho tubulového systému ako aj tiež epitel kolektívneho vedúceho systému vykazuje silne pozitívne

01-1801-03-ΜΑ sfarbenie bunkových membrán pre CK 8, zatial čo všetky epitelové bunky normálneho obličkového tkaniva vykazujú negatívne sfarbenie pre vimentín. Na rozdiel od toho rôzne RCC subtypy vykazujú prechod k silne pozitívnemu zafarbeniu pre CK 8 a vimentín v 36 % a v 72 % chirurgicky odobratých lézií (obr. 4, tabulka I [v stĺpci RCC subtyp znamená PT prečistený typ a Ch chromofóbny typ]).

Tabulka I

Expresia CK 8 a vimentínu v rôznych subtypoch RCC

CK 8 VIMENTÍN

+++	++	+	-	RCC subtyp	G	N	+++	++	+	-
3	5	7	2	PT	1	17	11	2	2	2
3	1	7	6	PT	2	17	14	1	0	2
2	3	9	3	PT	3	17	15	2	0	0

8	9	23	11	Σ		51	40	5	2	4
16%	18%	45%	22 %	%			78%	10%	4%	8%
2	1	1	1	Ch	1	5	0	1	3	1
2	1	4	1	Ch	2	8	0	0	0	8

4	2	5	2	Σ		13	0	1	3	9
31%	15%	38%	15%	%			0%	8%	23%	69%

Imunohistochemickej analýze sa podrobí napospol 64 lézií RCC rôznych subtypov RCC (prečistená bunka typ 51, chromofóbna bunka: 13) histopatologicky klasifikovaných podía Stôrkela a van der Berga (World J. Urol. 13, str. 153, 1995) s použitím anti-CK 8 a anti-vimentín mAb. Výsledky sú sumarizované pri použití klasifikačného systému popísaného v príkladoch (+++ =

01-1801-03-ΜΑ silno, ++ = stredne, + = slabo a - veľmi slabo vyfarbený alebo vôbec pozitívne nevyfarbený).

Silné alebo stredné pozitívne vyfarbenie CK 8 bunkových membrán je zistené u 16 % a u 18 % lézii RCC a slabá expresia CK 8 sa vyskytuje u 45 % analyzovaných nádorov (obr. 4) . Odlišná frekvencia CK 8 a expresia vimentínu sa nachádza v prečistených bunkách a chromofóbnej RCC (tabulka I). 78 % a 10 % prečistených buniek vykazuje silné alebo stredne pozitívne cytoplazmové vimentínové vyfarbenie. Slabá expresia vimentínu sa zisťuje u 4 % RCC tohoto subtypu. Na rozdiel od toho, vykazuje RCC chromofóbneho subtypu silné alebo stredné pozitívne vyfarbenie pre CK 8 u 31 % a u 15 % analyzovaných lézii, pričom slabá expresia CK 8 je zistiteľná u 38 % tohoto subtypu RCC. Iba 8 % a 23 % chromofóbnych RCC vykazuje stredne alebo slabo pozitívne cytoplazmové vyfarbenie pre vimentín (obr. 4, tabulka I) . Zdá sa, že pozorovaná koexpresia CK 8 a vimentínu sa vyskytuje často v RCC, zvlášť u subtypu prečistených buniek. Preto môže kombinovaná expresia oboch proteínov slúžiť ako diagnostický marker k detekcii RCC prečistených buniek.

Vyfarbenie lézii RCC a normálnych obličkových tkanív vykazuje premenlivý statmínový expresný obrazec (tabulka II) . Zatial čo antistatmínová protilátka vyfarbuje menej ako 10 % epitelu proximálneho a distálneho tubulového systému, endotelové bunky, zápalové bunky a epitelové bunky komprimovaných peritumorálnych tubulov vykazujú silné pozitívne cytoplazmové vyfarbenie. Na rozdiel od toho vykazujú nádorové bunky RCC prečistených buniek iba stredné alebo slabé pozitívne vyfarbenie u 10 % až u 33 %, zatial čo u 57 % tohoto subtypu RCC chýba úplne statmínová expresia (obr. 4, tabulka II). RCC chromofóbneho subtypu vykazuje slabé pozitívne vyfarbenie pre statmín u 60 % analyzovaných lézii, zatial čo

01-1801-03-ΜΑ % je negatívne pre statmínové vyfarbenie (obr. 4, tabuľka II [v stĺpci RCC subtyp znamená PT prečistený typ a Ch chromofóbny typ]).

Tabuľka II

Expresia statmínu v subtypoch RCC

STATMÍN
+++	++	+	-	RCC subtyp	G	n
0	1	3	3	PT	1	7
0	1	1	5	PT	2	7
0	0	3	4	PT	3	7

0	2	7	12	Σ		21
0%	10%	33%	57%	%
0	0	3	2	Ch	1	5
0	0	3	2	Ch	2	5

0	0	6	4	Σ		10
0%	0%	60%	40%	%

Imunohistochemickej analýze sa podrobia napospol 31 lézií RCC rôznych subtypov RCC a zatriedenie sa analyzuje imunohistochemicky za použitia anti-statmínu mAb. Kvantitatívna analýza sa uskutočňuje podlá hodnotiaceho systému popísaného v príkladoch (+++ = silno, ++ = stredne, + = slabo a - veľmi slabo vyfarbený alebo vôbec pozitívne nevyfarbený).

01-1801-03-ΜΑ

Tieto výsledky dokladajú, že koexpresia CK 8, vimentínu alebo statmínu sa môže používať ako diagnostických markerov pre subtypy RCC.

Vynález sa preto tiež týka spôsobu identifikácie RCC a diferenciácie subtypov RCC imunohistochemickým vyfarbením tkanivových vzoriek obličkového epitelu za použitia anti-CK 8, protilátok anti-vimentín a/alebo anti-statmín.

V podstate spočíva spôsob podlá vynálezu z nasledujúcich stupňov:

a) inkubuje sa vzorka tkaniva z obličkového epitelu získatelného od jedinca s podozrením na RCC s aspoň jednou protilátkou volenou zo súboru zahrnujúceho anticytokeratín 8, antivimentín a antistatmín (prvú protilátku) za podmienok zaručujúcich väzbu protilátky na vzorku tkaniva,

b) uvádza sa do styku prvá protilátka s druhou protilátkou obsahujúcou rozpoznávacie miesto s väzobnou afinitou k prvej protilátke a so zistitelným označením za podmienok, ktoré zaručujú väzbu na prvú protilátku za zhora popísaných podmienok,

c) uskutočňuje sa detekčný stupeň k detekcii druhej protilátky viazanej na prvú protilátku,

d) porovnávajú sa vzorky tkaniva zistené detekciou v stupni c) s referenčnými vzorkami spracovanými podía stupňa a) až c) získanými od jedincov vykazujúcich prečistenú bunku, chromofóbny, chromofilný alebo onkocytomický subtyp RCC. Určenie subtypu RCC pre referenčné vzorky sa môže realizovať napríklad spôsobom, ktorý popísal Thoenes a kol. (Path. Res.

01-1801-03-ΜΑ

Pract. 181, str., 125, 1986) a Stôrkel a van der Berg (World

J. Urol.13, str. 153, 1995).

Vynález sa tiež týka súpravy (kit) obsahujúcej zložky k identifikácii RCC a k diferenciácii subtypov RCC imunohistochemickými metódami. Týmito zložkami môžu byť aspoň

a) protilátky anti-CK 8, a anti-vimentín a/alebo anti-statmín,

b) druhá protilátka obsahujúca zistitelné označenie zamerané proti prvej protilátke.

Vynález objasňujú, nijako však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Bunková kultúra a spracovanie IFN-gama

MZ1257RC a MZ1940RC predstavujú dobre definované ludské bunkové línie charakterizované ako obličkové rakovinové bunky (RCC) typu prečistených buniek (Seliger B. a kol., Cancer Res. 56, str. 1756 až 1760, 1996), pričom MZ2733RC a MZ2733NN ich odpovedajúce normálne obličkové tkanivo bolo nedávno preukázané u pacienta s primárnou RCC typu prečistených buniek. Všetky línie RCC sa udržujú v prostredí DMEM doplnenom 10 % zárodočného teľacieho séra, 2 mM glutamínu a 100 U/ml penicilínu/ 100 pg/ml streptomycínu). Spracovanie buniek MZ1257RC IFN-gama sa uskutočňuje 48 hodín v prítomnosti 300

01-1801-03-ΜΑ

U/ml rekombinantného IFN-gama (Imukin Boehringer, Ingelheim, Ingelheim, Nemecko).

Vzorky séra

Vzorky séra sa izolujú zo vzoriek ludskej cievnej krvi odobratých náhodným pacientom s diagnózou rakoviny obličiek alebo normálnym dobrovoľným darcom krvi po informovanom súhlase každého jedinca.

Priklad 2

Dvojrozmerná gélová elektroforéza

Príprava vzorky

Bunkové línie sa rozšíria na počet buniek 5xl0⁷ až lxlO⁸na skupinu a pozberajú sa trypsináciou. Pelety buniek sa premyjú 3 až 4x vo fosfátom pufrovanej soianke (PBS) načo sa uložia do sterilných kryoskúmaviek ako suché bunkové pelety obsahujúce 5xl0⁶ alebo lxlO⁷ buniek na skúmavku v kvapalnom dusíku až do ďalšieho použitia. Bunkové pelety sa resuspendujú do lýzového pufra (7M močoviny, 2H tiomočoviny, 0,2M dimetylbenzylamóniumpropánsulfonátu (NDSB), 1 % ditiotreitolu (DTT), 4 % 3-[(3-cholamidopropyl)dimetylamino]-1propánsulfonátu (CHAPS), 0,5 % farmalytov a stopa farbiva brómfenolová modrá). Lyzát sa ozvučí ( 3x4 minúty v ultrazvukovom kúpeli) načo sa prečistúj e odstredením v mikroodstredivke (90 minút, 15 °C, otáčky 13 000/ min).

01-1801-03-ΜΑ

Kvantitácia proteínu

Kvantitácia proteínu sa uskutoční spôsobom, ktorý popísali Ramagli a Rodriguez, ktorý umožňuje použitie pôvodného Bradfordovho spôsobu aj v prítomnosti vysokých množstiev močoviny. Replikáty 2,5 μΐ až 10 μΐ podielov prečisteného lyzátu sa nastavia na konečný objem 10 μΐ a každá vzorka sa zmieša s 10 μΐ O,1M kyseliny chlorovodíkovej. Potom sa pridá 80 μΐ ddH₂O do každej vzorky a vzorky sa opäť miešajú. Do každej replikovanej vzorky (100 μΐ) sa pridá 3,5 ml 1:3 zriedenej farbivovej reakčnej zmesi (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate) a zmes sa mieša miernym vírením. Po 5 minútach sa zmeria absorbancia pri 595 nm v plastových kyvetách za použitia reakčnej slepej vzorky (10 μΐ lýzový pufor, spracovaný ako je zhora uvedené) ako referencie.

Nakladanie/izoelektrické zameranie vzoriek a vyváranie pruhov

Lyzáty sa nastavia čerstvým lýzovým pufrom na konečný objem vždy 350 μΐ, z ktorých 340 μΐ sa prenesie do držiakov pásov IPGphor (Amersham Pharmacia Biotech). Immobiline DryStrip (hodnota pH 3 až 10, NL, 180 mm, Amarsham Pharmacia Biotech) rehydratizácia a nakladanie vzoriek sa uskutoční v jednom kroku. 90 minút po pridaní DryStrips do lyzátov sa vzorkou nasiaknuté pásy pokryjú 400 μΐ kvapaliny Immobiline DryStrip Cover Fluid. Izoelektrické zameranie sa uskutoční jednotkou IPGphor (Amershan Pharmacia Biotech) pri teplote 20 °C pri použití nasledujúcich parametrov: rehydratizácia dve hodiny pri 0 V: 10 hodín pri 30 V: 1 hodina pri 500 V: 1 hodina pri 1000 V: 1 hodina pri 5000 V: 4 až 5 hodín pri 8000 V, s pridaním až 36 000 až 38 000 Vh, ak cielené proteíny (zložky s malou molekulovou hmotnosťou) sa oddelia v druhom rozmere na géloch 16 % T/2,5 % C SDS-PAGE (posledný krok 4

01-1801-03-ΜΑ hodiny pri 8000 V) alebo 44 000 až 46 000 Vh, ak vzorka lyzátu sa oddelí na géloch 7 % T/2,5 % C SDS-PAGE zameriavajúcich zložky s vysokou molekulovou hmotnosťou (posledný krok 5 hodín pri 8000 V) . Všetky kroky prebiehajú spôsobom krok a podržanie. Zamerané pruhy sa buď uložia pri teplote -80 °C alebo sa priamo podrobia vyvažovaniu pruhov, čo sa uskutočňuje inkubáciou pruhov 15 minút v 10 ml vyvažovacieho pufra (50 mM Tris-HCl hodnota pH 8,8, 6M močoviny, 30 % glycerolu, 2 % SDS) doplneného 1,5 % DTT nasledované 15 minútovou inkubáciou v 10 ml vyvažovacieho pufra doplneného 4,8% jódacetamidom.

SDS-PAGE druhého rozmeru

Separácia SDS-PAGE sa uskutočňuje pomocou systému ISO-DALT (Amersham Pharmacia Biotech) a prebieha v OAGE géloch polyakrylamid/piperazíndiakrylamid (PDA). Géiová zmes obsahuje 375 mM Tris/HCl, hodnota pH 8,8, 5 mM ditioničitanu sodného a 4 % glycerolu avšak žiadny dodecylsulfát sodný (SDS). Čerstvo vyvážené pruhy Immobiline DryStrips sa prenesú na povrch dôkladne opláchnutých gélov PAGE. Imobilizácie pruhov sa dosiahne zapustením pruhov do 1% mäkkej topiacej agarózy obsahujúcej stopy markerového farbiva (brómfenolová modrá pre gély 7 % T/2,5 % C; brómfenolová modrá plus xyléncyanol FF pre gély 16 % T/2,5 % C). Gély sa spracovávajú vo skúšobnom pufri SDS-PAGE (25 mH Tris, 192 mM glycínu, 0,1 % SDS) za prísnej kontroly teploty (<20 °C) dokiaľ farebné čelo nedosiahne konca gélu (gély 16 % T/2,5 % C prebiehajú dokial čelo farbiva xyléncyanol FF sa z gélu neeluuje). Počiatočný prenos vzorky z izoelektricky zameraného pruhu (IEF) do gélu sa uskutočňuje pri nízkom napätí (1 hodina pri konštantnom napätí 50 V) , zatial čo separácia prebieha pri konštantnom vysokom napätí (100 až 140 V).

01-1801-03-ΜΑ

Vyfarbovanie gélu

Gély sa vyfarbujú kolodiálnou Coomassiovou modrou. Všetky gély sa snímajú na zvyčajnom snímači (Hewlet Packard ScanJet 6100C) pri rozlíšení 600 dpi a ukladajú sa ako obrazy TIFF. Gély, určené pre analýzy Western-Blot alebo gély obsahujúce proteínové škvrny, ktoré boli podrobené analýze hmotovou spektrometriou, sa iba vyfarbia farbiacim roztokom kolodiálnej Coomassiovej modrej (10 % síranu amónneho, 2 % kyseliny fosforečnej, 0,1 % Coomassiovej brilantnej modrej G-250, 20 % metanolu) tak sa skipuje počiatočný fixačný krok a potom sa odfarbia extenzívnym prepraním vo vode (dd).

Príklad 3

Inun un obi o 11 i n g

Pre analýzy immunoblottingom sa koloidné gély 2-D PAGE prefarbené kolodiálnou Coomassiovou modrou nanesú na Immobilon P membrány za použitia systému ISO-DALT tank blotting (Amersham Pharmacia Biotech) pomocou skúšobného pufra SDS-PAGE doplneného 20 % metanolu ako transferového pufra a aplikáciou 500 Vhodín na transfer. Škvrny (blots) sa potom inkubujú jednu hodinu v blokujúcom roztoku (140 mH chloridu sodného, 10 mM Tris/HCl, hodnota pH 7,4, 0,4 % Tween 20, 5 % nízkotučného sušeného mlieka a 10 % koňského séra) premyjú sa dvakrát Trispufrovanou soľankou (TBS, 140 mM chloridu sodného, 10 mM Tris/HCl, hodnota pH 7,4) a inkubujú sa cez noc pri teplote 4 °C s kontrolným alebo s pacientovým sérom (20 ml na membránu) zriedeným 1:20 v protilátkovom inkubačnom pufri (TBS, 0,1 %

Tween 20, 2 % nízkotučného sušeného mlieka). Potom sa membrány premývajú 3x (vždy 10 minút) v TBS, 0,4 % Tween 20 a inkubujú

01-1801-03-ΜΑ sa pol hodiny až jednu hodinu pri izbovej teplote s chrenovou peroxidázou (HRP)-konjugovanou sekundárne roztokom mAb (20 ml na membránu, králičí anti-Iudský lgG, zriedenie 1:1000 v protilátkovom inkubačnom pufri). Po 3 stupňoch premytia TBS sa uskutoční zviditelnenie škvŕn 0,4% Tweenom 20 s detekčnou chemiluminiscenčnou súpravou (Lumi-Light Western Biotting Substráte, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) podía výrobcových inštrukcií a zaznamenajú sa na filme scientific imaging (Kodak X-Omat Blue XB-1). Signál pre zosúhlasenie škvŕn sa uskutoční prekrytím zobrazujúcich filmov a odpovedajúcich gélových otlačkov.

Príklad 4

Hmotová spektrometria

Pre hmotovú spektrometriu sa immunovyfarbené proteínové škvrny vyrežú z duplikátového gélu vyfarbeného kolodiálnou Coomassiovou modrou. Každá vzorka sa vnesie do sterilnej mikroreakčnej skúmavky, gélové prúžky sa inkubujú 30 minút v 50 mH systému hydrogénuhličitan amónny/acetonitril (60 %/40 %) pri teplote 30 °C a výsledné supernatanty sa odstránia a vyhodia. Gélové prúžky sa vysušia vo vákuu a uložia sa pri teplote -80 °C až do ďalšieho použitia. Pre in-gél digesciu sa každá vzorka napúšťa po dobu jednej hodiny v 25 až 40 μΐ 50 mM hydrogénuhličitanu amónneho obsahujúceho 0,1 pg/ml trypsínu (Promega, Madison, WI, USA). Supernatanty sa zhromaždia, pridajú sa 25 μΐ podiely hydrogénuhličitanu amónneho a vzorky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 ’C. Peptidová extrakcia sa uskutoční dvojnásobnou 20-minútovou inkubáciou vzoriek v extrakčnom pufri (voda/kyselina trifluóroctová (TFA), objemovo 50 %/50 %) a potom 2x po 20 minútach v pufri obsahujúcom systém acetonitril/TFA, objemovo 50 %/50 %) . Supernatanty z

01-1801-03-ΜΑ každej vzorky sa skoncentrujú na konečný objem približne 25 až 50 μΙ/vzorka a odsolia sa činidlom ZipTips (Millipore) podlá Jednomililitrové podiely výsledných výrobcovho protokolu.

eluátov sa nanesú na matricu MALDI a podrobia hmotovej analýze peptidovej mapy za použitia

Perseptive Biosystems Voyager RP-DE (Perseptive Biosystems, Framington, MA).

sa priamo prístroja

Príklad 5

Pacientove a tkanivové vzorky použité k imunohistochémii

Pre imunohistochemické analýzy sa nahodilo získajú chirurgicky odobraté vzorky tkanív RCC a odpovedajúce normálne obličkové epitely od pacientov, ktorí trpeli radikálnou nefrektómiou. Hispotologická klasifikácia každého nádoru sa uskutočňuje podlá kritérií popísaných v literatúre (Thones a kol., Path. Res. Pract. 181, str. 125, 1986; Stôrkel a van der Berg, World J. Urol. 13, str. 153, 1995). Tieto dáta obsahujú rod, stav choroby, inváziu nádoru a zasiahnutie miazgových uzlín podľa systému TNM (Tumor Node Metastasis) . Napospol bolo zhromaždené pri resekciách 64 primárnych obličkových nádorov, vrátane rakoviny prečistených buniek a 13 chromofóbnych karcinómov a 64 autologových obličkových vzoriek. Tieto vzorky tkanív boli fixované formalínom a zapustené v parafíne.

Imunohistochémia

Imunohistochemické vyfarbenie uskutočňuje mAbs antihumánym cytokeratínom 8 (kloň βΗΙΙ, DÁKO, Hamburg, Nemecko, zriedenie 1:25), antivimentínom mAb (kloň V9, DÁKO, zriedenie 1:40) a antistatmínom (B3745, Calbiochem, USA, zriedenie 1:500).' Pre získanie antigénu sa konzekutívne sekcie inkubujú osem hodín a

01-1801-03-ΜΑ šesť minút v citrátovom pufri v mikrovlnej rúre, s nasledujúcim premytím Tris-pufrovanou soľankou a prídavné sa inkubujú 10 minút v normálnom bravčovom sére (zriedenie 1:10). Prúžky sa inkubujú s primárnymi protilátkami jednu hodinu pri izbovej teplote. Detekcia sa uskutočňuje za použitia LASB (Labeled Streptavidin Biotin)-peroxidázovej súpravy a AEC (amino-9-etylkarbazol) podľa popisu (DÁKO Diagnostica RmbH, Hamburg, Nemecko). Negatívne kontroly sa uskutočňujú s vynechaním primárnej protilátky.

Kvantitatívne analýzy každého nádoru sa uskutočňujú podľa nasledujúceho bodového skóre:

vzorka s % pozitívnych	Hodnotenie	Klasifikácia
nádorových buniek
<5	—	negatívna
>5 a < 25	+	slabo pozitívna
>26 a < 50	++	stredne pozitívna
>50	+++	silno pozitívna

Priemyslová využiteľnosť

Rakovinové signálne znaky pre výrobu protilátok a protilátkových fúzovaných proteínov použiteľných pre skríning, diagnózu, prognózu a identifikáciu subtypov karcinómu obličkovej bunky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie aspoň jedného proteínu vybraného zo súboru zahrnujúceho β-aktín, gama-aktín, α-tubulín, cytokeratín, cytokeratín 8 (CK 8) , cytoskeletový tropomyozín, F-aktín čiapočkujúci proteín, hsp 27, hsp 60, hsp 70, hsp 90, grp 78 (BIP), gp 96, glutatión-S-transferázu, glutatiónsyntetázu, superoxiddismutázu, tioredoxínperoxidázu, PA28 a, ubiquitíntiolesterázu, triózafosfátizomerázu, aldózreduktázu, enoyl-CoA-hydratázu, a -enolázu, annexín II, IV a V, statmín, nikotínamid-N-metyltransferázu, B23/nukleofosmín a vimentín ako nádorového signálneho znaku.
2. Použitie proteínu podlá nároku 1 a/alebo β -tubulínu ako nádorového signálneho znaku pre rakovinu obličkových buniek.
3. Spôsob in vitro diagnózy a prognózy rakoviny u jedinca, vyznačujúci sa tým, že sa za použitia imunotestu uskutočňuje detekcia prítomnosti protilátky získanej zo vzorky séra jedinca a zameraná na nádorový proteín ako signálny znak podía nároku 1 a 2, ktorý je obsiahnutý v sére.
4. Spôsob podía nároku 3, vyznačujúci sa tým, že pri imunoteste

a) sa imobilizuje aspoň jeden alebo na substráte, nádorový marker na membráne

01-1801-03-ΜΑ

b) uvádza sa do styku membrána alebo substrát so vzorkou séra j edinca,

c) zisťuje sa prítomnosť protilátok špecifických pre nádorový marker vo vzorke jedincovho séra.
5. Spôsob podlá nároku 4,vyznačujúci sa tým, že detekcia špecifickej protilátky nádorového signálneho znaku vo vzorke séra sa uskutočňuje pomocou exogénnej aplikovanej označenej protilátky zameranej na uvedenú sérovú protilátku.
6. Spôsob podľa nároku 3 až 5, vyznačujúci sa t ý m, že jedinec má rakovinu obličkovej bunky.
7. Diagnostický kit k uskutočneniu spôsobu podľa nároku 3 až 6, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jeden alebo niekolko nádorových signálnych znakov podľa nároku 1 alebo 2.
8. Použitie aspoň jedného nádorového signálneho znaku podlá nároku 1 a 2 pre výrobu liečiva stimulujúceho imunitnú odozvu jedinca.
9. Použitie aspoň jednej protilátky alebo jej fragmentu, ktorý sa imunošpecificky viaže na aspoň jeden nádorový signálny znak podľa nároku 1 alebo 2 pre výrobu liečiva k vyvolaniu reakcie, ktorá uľahčuje zabíjanie nádorovej bunky a/alebo bráni jej rastu.

01-1801-03-ΜΑ
10. Použitie podlá nároku 9, pričom protilátkou alebo jej fragmentom je protilátkový fúzovaný proteín.
11. Farmaceutický prostriedok, vyznačuj úci sa t ý m , že obsahuje aspoň jeden nádorový signálny znak podľa nároku 1 alebo 2 a poprípade farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo excipient.
12. Farmaceutický prostriedok, vyznačuj úci sa t ý m, že obsahuje aspoň jednu protilátku alebo jej fragmenty, ktoré sa imunošpecificky viažu na aspoň jeden nádorový signálny znak podľa nároku 1 alebo 2, a prípadne farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo excipient.
13. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že protilátkou alebo jej fragmentom je protilátkový fúzovaný proteín.
14. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12 až 13, v yznačujúci sa tým, že obsahuje prídavné chemoterapeutické činidlo.
15. Farmaceutická súprava, vyznačujúca sa tým, že obsahuje v prvom kontajneri farmaceutický prostriedok podľa nároku 12 až 13, a v druhom kontajneri farmaceutický prostriedok obsahujúci chemoterapeutické činidlo pre súčasné alebo časovo posunuté podávanie.

01-1801-03-ΜΑ
16. Použitie aspoň jednej protilátky volenej zo súboru zahrnujúceho anti-cytokeratín 8, anti-vimentín a anti-statín k identifikácii RCC a k diferenciácii subtypov RCC imunohistochemickými spôsobmi.
17. Spôsob identifikácie RCC a diferenciácie subtypov

RCC, vyznačujúci sa tým, že sa

a) inkubuj e získatelného protilátkou sa vzorka od jedinca s tkaniva z obličkového epitelu podozrením na RCC s aspoň jednou volenou zo súboru zahrnujúceho anticytokeratín

8, antivimentín a antistatmín (prvú protilátku) za podmienok zaručujúcich väzbu protilátky na vzorku tkaniva,

b) uvádza sa do styku prvá protilátka s druhou protilátkou obsahujúcou rozpoznávacie miesto s väzobnou afinitou k prvej protilátke a so zistiteľným označením za podmienok, ktoré zaručujú väzbu na prvú protilátku,

c) uskutočňuje sa detekčný stupeň k detekcii druhej protilátky viazanej na prvú protilátku,

d) porovnávajú sa vzorky tkaniva zistené detekciou v stupni c) s referenčnými vzorkami získanými od jedincov vykazujúcich prečistenú bunku, chromofóbny, chromofilný alebo onkocytomický subtyp RCC.
18. Kit pre identifikáciu RCC a subtypov RCC, vyznačujúci obsahuj e pre diferenciáciu sa t ý m, že

01-1801-03-ΜΑ

a) aspoň jednu protilátku podlá nároku 16 (prvú protilátku)

b) aspoň jednu druhú protilátku obsahujúcu zistiteľné označenie zamerané proti prvej protilátke.