SE538211C2 - Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav - Google Patents

Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav Download PDF

Info

Publication number
SE538211C2
SE538211C2 SE1350421A SE1350421A SE538211C2 SE 538211 C2 SE538211 C2 SE 538211C2 SE 1350421 A SE1350421 A SE 1350421A SE 1350421 A SE1350421 A SE 1350421A SE 538211 C2 SE538211 C2 SE 538211C2
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
antibody
cytokeratin
affinity
labelled
antibodies
Prior art date
Application number
SE1350421A
Other languages
English (en)
Other versions
SE1350421A1 (sv
Inventor
Ylva D Amico
Gunnar Magnusson
Original Assignee
Idl Biotech Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idl Biotech Ab filed Critical Idl Biotech Ab
Priority to SE1350421A priority Critical patent/SE538211C2/sv
Priority to EP14779691.6A priority patent/EP2981823B1/en
Priority to PCT/SE2014/050376 priority patent/WO2014163557A1/en
Priority to CN201480030302.1A priority patent/CN105492907B/zh
Priority to US14/782,527 priority patent/US10386363B2/en
Publication of SE1350421A1 publication Critical patent/SE1350421A1/sv
Publication of SE538211C2 publication Critical patent/SE538211C2/sv
Priority to US16/418,272 priority patent/US20190317087A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

SAMMANDRAG Foreliggande uppfinning hanfor sig till en metod for detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller losliga fragment darav i ett prov, innefattande stegen att man bringar provet i kontakt med en fastfas pa vilken man har immobiliserat en forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8, en andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 och en tredje antikropp med affinitet for en forsta epitop av cytokeratin 19; later cytokeratin och/eller losliga fragment darav i provet binda till namnda forsta, andra och tredje antikroppar varpa komplex bildas; bringar komplexen i kontakt med en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och en andra markt antikropp med affinitet for en andra epitop av cytokeratin 19; later namnda forsta och andra markta antikroppar bindas till komplexen; och detekterar namnda forsta markta antikropp och namnda andra markta antikropp bundna till komplexen. Den MIT& sig vidare till en metod for kvantitativ bestamning av losliga fragment av cytokeratin 8, 18 och 19 i ett prov samt till ett kit for att utfora metoden.

Description

Metod for detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller losliga fragment &ray Uppfinningsomrade Foreliggande uppfinning hanfor sig till en ny analys avsedd for kanslig avkanning av tumorcellaktivitet anvandbar vid hantering av patienter med karcinom av epitelialt ursprung, speciellt icke-smacelligt lungkarcinom.
Uppfinningens bakgrund Lungcancer är den vanligaste och mest clodliga cancersjukdomen i varlden. Lungcancer &War fler manniskor an koloncancer, brostcancer och prostatacancer sammantaget (WHO-statistik). Approximativt 80-85% av lungcancerpatienterna har sa kallad icke-smacellig cellhistologi ("NSCLC"). Smacellig lungcancer ("SCLC") utgor ca 15-20% av alla lungcancerfall. Huvuddelen av patienterna presenterar framskriden och icke-operabel sjukdom. Resektion är och forblir i princip den enda behandling som botar tidigt stadium av NSCLC. Under det senaste artiondet har en panel tumormarkorer undersokts avseende deras varde vid lungcancer. De vanligaste biomarkorer som befunnits vara av klinisk signifikans vid lungcancer var CEA, CYFRA, TPA, TPS och NSE. Bristen pa kanslighet och specificitet begransar dock anvandningen av cancerbiomarkorer for screening och tidig diagnos av lungcancer. Cancerbiomarkorerna tycks vara mer effektiva for prognostisk utvardering och uppfoljning Alla eukaryota celler har cytoplasmiska cytoskelettstrukturer kanda som intermediara filament. Cytoskelettnatverket svarar fcir cellens mekaniska integritet och är avgorande under sadana cellulara processer som celldelning, rorlighet och kontakt celler emellan. For narvarande har mer an 20 olika cytokeratiner identifierats, varav cytokeratin 8, 18 och 19 är de rikligast forekommande i enkla epitelieceller. Cytokeratinerna är specifika for epitelieceller och cytokeratinmonstret bevaras vanligen under transformationen frail normala celler till maligna celler. 1 En tvasates immunoradiometrisk analys i fastfas (IRMA) som mater definierade epitoper pa cytokeratinerna 8, 18 och 19 finns kommersiellt tillganglig (IDL Biotech, Bromma, Sverige) under varumarket MonoTotal®. De infangande antikroppama, de monoklonala antikropparna CD7 (CK8), 3F3 (CK18) och IDLC4 (CK19) har belagts pa plastparlor. Polyklonala 1I-markta antikroppar anvands som s.k. tracer i analysen. Radioaktiviteten uppmats med en gammaraknare, och är proportionell med koncentrationen cytokeratinantigenfragment. MonoTotal är ett kvantitativt test avsett for testning av patientserum. MonoTotal är vardefullt for diagnos, prognos, som prognostisk mark& och for uppfoljning av patientbehandling. Genom att folja patienten med upprepade MonoTotal-matningar kan lakaren erhalla kritisk information avseende tumorcellaktivitet. En forandring av nivan av MonoTotalmarkoren indikerar forandringar i tumorcellaktiviteten, och forhojda nivaer tyder pa narvaro av en tumor. Denna information betraktas som speciellt betydande under patienthantering och uppfoljning, dâ ett blodprov kan bidra till terapiuppfoljningen och tidig detektion av tumoraterfall. Approximativt 15% av lungcancerpatienterna diagnosticeras nar sjukdomen fortfarande är begransad till lungorna och tidig detektion ar kritisk for att Oka overlevnadschanserna. Lakaren kan genom att anvanda MonoTotal fa en indikation pa sjukdomsforloppet, matt uttryckt som tumorcellaktivitet istallet for mer konventionella matningar av tumorbelastning. MonoTotal kan forse lakaren med tillforlitlig hjalp vid diagnos, vid faststallande av prognos, vid behandlingsuppfoljning och kontroll av patienter.
MonoTotal har enligt publicerade studier visats ha en stark association med klinisk respons i patienter. MonoTotal uppvisar mycket hogre kanslighet an Cyfra i lungcancerpatienter. MonoTotals totala kanslighet vid diagnos av lungcancer, oberoende av histotyp, är ca 70-75% vid en specificitet av 95%. Kansligheten vid ickesmacellig lungcancer (NSCLC) är hogre. MonoTotal overensstammer val med tumorcellaktivitet och sjukdomens omfattning. Vidare forutser MonoTotal sjukdomsforlopp (sjukdomsfria perioder och total overlevnad) och är en tidig indikator pa aterfall under uppfoljning av NSCLC. Forandringar i MonoTotal fore& ofta detekteringen av ett aterfall med konventionella avbildningsmetoder. Behandlingssvar 2 kan detekteras Mom ett par dagar eftersom cytokeratinproteiners halveringstid i serum är mindre an en dag. MonoTotal är en kansligare tumormarkor for NSCLC an de andra cytokeratinmark8rer som for narvarande anvands rutinmassigt i klinisk praxis.
Sammanfattning av uppfinningen Aven om den befintliga metoden for att pavisa tumorcellaktivitet fungerar mycket bra är anvandningen darav beroende av radioaktivt markta antikroppar vilka är foremal for specifika regler och foreskrifter, vilket utsatter anvandaren av metoden for en administrativ och praktisk belastning. Den är vidare beroende av anvandning av polyklonala antikroppar fran en specifik kalla, vilket kan leda till problem med leverens om kallan inte tillhandahaller de polyklonala antikropparna. Foreliggande uppfinnare har salunda identifierat ett behov av en metod som inte är beroende av anvandning av radioaktivitet eller flagon speciell polyklonal antikroppskalla, och som samtidigt är kliniskt jamforbar med den existerande metoden.
En aspekt av uppfinningen är en metod for detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller losliga fragment darav i ett prov, vilken innefattar stegen att man bringar provet i kontakt med en fastfas pa vilken man har immobiliserat en forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8, en andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 och en tredje antikropp med affinitet for en forsta epitop av cytokeratin 19, dar namnda forsta immobiliserade antikropp är 6D7, namnda andra immobiliserade antikropp dr 3F3, och namnda tredje immobiliserade antikropp är IDLC4; later cytokeratin och/eller losliga fragment darav i provet binda till namnda forsta, andra och tredje antikroppar varpa, komplex bildas; bringar komplexen i kontakt med en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och en andra markt antikropp med affinitet for en andra epitop av cytokeratin 19, dar namnda forsta markta antikropp är M21, och namnda andra markta antikropp är A53-B/A2; later namnda forsta och andra markta antikroppar binda till komplexen; och detekterar namnda forsta markta antikropp och namnda andra markta antikropp bundna till komplexen. 3 I en vidare aspekt hanfor sig uppfinningen till en metod for kvantitativ bestamning av losliga fragment av cytokeratin 8, 18 och 19 i ett prov, innefattande metoden enligt aspekten ovan och vidare ett steg for att kvantitativt korrelera rnangden bunden forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och namnda andra markta antikropp med affinitet for cytokeratin 19 med mangden losliga fragment av cytokeratinerna 8, 18 och 19.
I en vidare aspekt hanfor sig uppfinningen till ett kit for att utfora metoden enligt nagon av aspektema ovan, vilket kit innefattar en fastfas pa vilken en forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8, en andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 och en tredje antikropp med affinitet for cytokeratin 19 har immobiliserats, dar namnda forsta immobiliserade antikropp är 6D7, namnda andra immobiliserade antikropp är 3F3, och namnda tredje immobiliserade antikropp är IDLC4; och en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och en andra markt antikropp med affinitet for cytokeratin 19, dar namnda forsta markta antikropp är M21, och namnda andra markta antikropp är A53-B/A2; foretradesvis i en butTrad losning Foredragna utforingsformer av uppfinningen beskrivs i de beroende patentkraven.
Kort beskrivning av bifogade ritningar Figur 1 är en schematisk oversikt over hur man utfor metoden enligt uppfinningen. Figur 2 är ett diagram som visar resultaten erhallna enligt exempel 2.1. Figur 3 dr ett diagram som visar resultaten erhallna enligt exempel 2.2.
Detaljerad beskrivning av foredragna utforingsformer av uppfinningen Foreliggande uppfinnare har identifierat ett behov av att producera nya, eller hitta existerande, antikroppar fcir att mojliggora en analys utan de nackdelar som associeras med kand teknik, medan man behaller en god klinisk korrelation med den existerande analysen MonoTotal IRMA.
En ny analys for kansligt pavisande av tumorcellaktivitet vilken är anvandbar vid hantering av patienter med karcinom av epitelieursprung, speciellt icke-smacelligt lungkarcinom, utvecklades darfor. Formatet enzymkopplad immunoadsorberande analys (ELISA) valdes. Ett krav for anvandning av monoklonala antikroppar i den har 4 analysen är en bibehallen specificitet for cytokeratin 19 i forhallande till den existerande immunoradiometriska analysen, och dven en god klinisk korrelation med den existerande analysen. Analysen maste ocksa vara stabil och ha en godtagbar signalstyrka.
Detektering av cytokeratin 19 har visats vara kliniskt overldgset vid NSCLC. For att Oka kansligheten och beakta att cytokeratiner bildar heterodimerer, saint att vissa antikroppsepitoper endast finns tillgdngliga i dimer form, konstnierades en analys for detektering av cytokeratinerna 8, 18 och 19.
Man kunde overraskande uppnâ en mycket god klinisk korrelation med den kanda analysen genom att kombinera en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 med en andra markt antikropp med affinitet for cytokeratin 19. Den forsta markta antikroppen bor i princip inte uppvisa nagon affinitet for monomerer eller homodimerer av cytokeratin 8 eller 18.
Metoden enligt uppfinningen utnyttjar en forsta, andra och tredje antikropp bundna till en fastfas, sasom en mikrotiterplatta av standardtyp. Den forsta, andra och tredje antikroppen som immobiliserats till fastfasen kan tillverkas bland annat sasom beskrivs i W092/05197 med anyandning av renade fragment av cytokeratin 8, 18 respektive 19. En antikropp betecknad 6D7, som är specifik for cytokeratin 8, och en antikropp betecknad 3F3, som är specifik for cytokeratin 18, har tillverkats enligt den metod som beskrivits av Silen et al, Scand J Clin Invest, 1995, 55, 153-161 och Stigbrand et al., Tumor Biol 1998, 19, 132-152. Antikroppen IDLC4 är specifik for en epitop av cytokeratin 19 i regionen av aminosyraenheterna 340-370, sasom diskuterats i Brattstrom et al., Diseases of the esophagus, 2005, 18, 298-303.
Den forsta markta antikroppen med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 kan tillverkas enligt den metod som beskrivits av Rydlander et al., Eur J Biochem, 1996, 241, 309-315 och screenas med avseende pa affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och avsaknad av affinitet for monomera former av cytokeratin 8 och 18. Detta exemplifieras vidare i Exempel 2, dar en lamplig antikropp betecknad M21 tillverkas. Det kan ocksa, vara en kommersiellt tillganglig antikropp sasom A45-B/B3 (Biologicals Ltd., U.K.) eller DE-K18 (Fisher Scientific).
Den cellinje som producerar 6D7 deponerades hos "European Collection of Cell Cultures (ECACC, Porton Down, United Kingdom)" den 19 Mars 2013 under tilltradesnummer 13031902. Cellinj en som producerar 3F3 6D7 deponerades hos "ECACC" den 19 Mars 2013 under tilltradesnummer 13031901. Cellinjen som producerar IDLC4 deponerades hos "ECACC" den 19 Mars 2013 under tilltradesnummer 13031903. Cellinj en som producerar M21 deponerades hos "ECACC" den 21 Mars 2013 under tilltradesnummer 13032101.
Den andra markta antikroppen med affinitet for cytokeratin 19 kan vara vilken som helst antikropp med affinitet for cytokeratin 19 sasom en kommersiellt tillganglig antikropp, tex A53-B/A2 (Ventana, Tuscon Arizona, U.S.A.).
Metoden är foretradesvis en enstegs enzymkopplad immunanalys i sâ kallat "sandwichformat". Standarder, kontroller och prover reagerar under inkubationen samtidigt med monoklonala infangande antikroppar immobiliserade pa en fastfas och pepparrotsperoxidaskonjugerade (HPR-konjugerade) detektorantikroppar. Efter tvattning tillsattes ett framkallningssubstrat, tex 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) och efter en inkubationstid stoppas reaktionen och absorbansen vid 450 nm uppmats. Den framkallade fargen är direkt proportionell mot analytkoncentrationen.
Analysen utfores foretradesvis med serumprover. Tillrackligt mycket blod bor samlas for att racka till 2 x 100 1.11 serum (dubbelprov) vid varje analys. Om analysen utfores Mom 24 h bOr serumet forvaras I kylskap (2-8 °C). om analysen fordrojes forvaras serumet foretradesvis infryst <-18°C. Man bor undvika upprepad upptining och infrysning Serumprover som har hog grad av hemolys, ett stort lipidinnehall eller är kontaminerade bor inte anvandas. 6 Analysproceduren visas schematiskt i Figur 1.
Pipettera 100 fil standarder, kontroller eller prover i varje definierad brunn. Lamna tva tomma brunnar (blankprov) for matning av bakgrundsabsorbans (valfritt).
Tillsatt 100 fil forsta och andra markt antikropp till varje brunn utom blankbrunnarna.
Inkubera under 2 h ± 10 min pa skakbord vid 450 rpm.
Aspirera och tvatta bninnarna 3 ganger med 0.3 ml tvattlosning Tillsatt 200 pl TMB-substrat per brunn, inklusive blankbrunnarna.
Inkubera I morker under 15+1 min.
Tillsatt 100 pl Stopplosning per brunn. Agitera pa skakbord under 1 min.
Avlas absorbansen vid 450 nm under 30 min efter tillsats av Stopplosningen. Berakna koncentration av cytokeratin 8/18/19 (11/1) i proverna. Prover med koncentrationer > 2600 U/1 bor lampligen spadas med spadningsmedel (Standard 0 U/1) innan analysen upprepas.
Absorbansen vid 450 nm avlases med anvandning av en mikroplattlasare av standardtyp (vaglangd 450 nm). Datorprogram anvands for att behandla radata. Den kurvpassningsalgoritm som rekommenderas är "spline smoothed". For generering av giltiga data bOr man sakerstalla att de kontroller som inkluderas ligger inom omradet. Manuel' bearbetning av resultat: Korrigera varje OD-varde (optisk densitet) genom att subtrahera blankens OD-varde. Berakna medelvarde pa OD for varje dubbelprov. Konstruera en standardkurva genom att plotta OD-medelvardet for varje standard (Yaxeln) mot motsvarande koncentration (X-axeln). Bestam provernas koncentration mot standardkurvan.
Uppfinningen hanfor sig vidare till ett kit avsett for att utfora den ovan beskrivna metoden. Ett sadant kit kan i princip innefatta ett fastfassubstrat pa vilket en forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8, en andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 och en tredje antikropp med affinitet for cytokeratin 19 har immobiliserats; och en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och en andra markt antikropp med affinitet for cytokeratin 19. 7 De markta antikropparna foreligger foretradesvis i en eller flera buffrade losningar. I en utforingsform är de markta antikropparna markta genom konjugering med pepparotsperoxidas.
Foreliggande kit kan aven innefatta medel eller material for utspadning av prover, till exempel en fardigstalld proteinstabiliserad buffert med pH 7.5, vilken eventuellt kan innefatta konserveringsmedel, eller en torr blandning for framstallning av en sadan buffert genom blandning med vatten.
Foreliggande kit kan aven innefatta medel eller material for anyandning som standarder, till exempel standardmaterial vid proteinstabiliserad buffert eller en torr blandning for framstallning av en sadan buffert genom blandning med vatten. Standarderna kan tillhandahallas i atskilliga olika koncentrationer, till exempel 60, 150, 600, 2600 (U/1).
Foreliggande kit kan vidare innefatta material eller medel for anvandning som kontroller, till exempel standardmaterial vid proteinstabiliserad buffert eller en torr blandning for framstallning av en sadan buffert genom blandning med vatten. Standarderna kan tillhandahallas i atskilliga olika koncentrationer, till exempel lag och hog.
Foreliggande kit kan vidare innefatta material eller medel for tvdttning av fastfasen (jarnfOr steg 4 i Figur 1). Namnda material eller medel for tvattning kan tillhandahallas som en fdrdigstalld tvattlosning eller som en tvattablett for upplosning i vatten.
Aven om det for narvarande foredragna formatet for analysen enligt uppfinningen är enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) kan andra immunanalysprinciper anvandas vid utovning av uppfinningen. Sadana immunanalysprinciper inkluderar bland annat radioimmunanalys, fluorescensimmunanalys, luminiscent syrekanalsanalys (LOCI), ytplasmonresonans (SPR), ellipsometri, luminescent immunanalys (luciferas/ATP)„ kemiluminescensimmunanalys (dioxetan, akridinium, estrar, luminol, isoluminol), elektrokemiluminescenceimmunanalys (ruteniumsalter), dissociationsforbattrande tidsupplost fluorimmunanalys (DELFIA), elektrisk 8 detektering (konduktans, kolnanotub, nanowire av halvledarmaterial, nanowire av kiseldioxid) och Luminex (laserfluorofor).
Foreliggande uppfinning är inte begransad till de ovan beskrivna utforingsformerna. Olika alternativ, modifieringar och ekvivalenter kan anvandas. Foljaktligen bor utforingsformerna enligt ovan eller de illustrativa exemplen nedan inte uppfattas som begransande av uppfinningens skyddsomfang, vilket definieras av de bifogade patentkraven.
Vid utovande av foreliggande uppfinning kan fackmannen Mom omradet vidare anvanda sig av konventionella tekniker inom omradet farmaceutisk kemi, immunologi, molekylarbiologi, mikrobiologi, cellbiologi och rekombinant-DNA-teknik, sasom bland annat beskrivs i Sambrook et al. "Molecular cloning A laboratory manual", 3rd ed. 2001; Ausubel et al. "Short protocols in molecular biology", th ed. 1995; "Methods in enzymology", Academic Press, Inc.; MacPherson, Hames och Taylor (utg.). "PCR 2: A practical approach", 1995; "Harlow och Lane (utg.) "Antibodies, a laboratory manual" 1988; Freshney (utg.) "Culture of animal cells", 4th ed. 2000; "Methods in Molecular Biology" vol. 149 ("The ELISA Guidebook" by John Crowther) Humana Press 2001, eller senare utgavor av dessa 'locker.
Examples Exempel I For att hitta en lamplig monoklonal detektorantikropp for konjugering i ELISA-format utvarderades ett antal monoklonala antikroppar. Interaktion mellan cytokeratin 8, 18 and 19 bundna till infangande antikroppar (3F3, 6D7 och IDLC4) utvarderades i realtid med anvandning av ett sa, kallat "Quartz Crystal Microbalance"- biosensorinstrument frail Attana AB (Stockholm, Sverige), vilket ger information om bindningsstyrka, sâ kallad "on-rate", bindningsniva, och bindningsstabilitet samt epitoplikhet. 9 Sex antikroppar med affinitet for cytokeratin 19, tre med affinitet for cytokeratin 8, fyra med affinitet for cytokeratin 18 och en med affinitet for ett antal cytokeratiner utvarderades, jfr Tabell 1.
Tabell 1 Anti-CK 19 Anti-CK 8 Anti-CK 18 Pan ab IDL C3 IDL33 3F3 C 11 IDL C4 6D7 M3 IDL C2D1 M21 A53-B/A2 M34 BA 17 HCA 077 Baserat pa resultat fran biosensortesterna konjugerades antikropparna A53-B/A2, IDL33, HCA 077, M21 och C11 till HRP and testades i enzymkopplad immunadsorberande analys och utvarderades med avseende pa klinisk korrelation med den kanda analysen. 12 prover, eller samplade prover, frail cancerpatienter spadda till 1:2 eller 1:4 i MonoTotal-spadningsmedel anvandes for jamforelse. De konjugerade antikropparna eller blandningarna av antikroppas spaddes till en slutkoncentration av 1 jig/ml. En standard om 5472 I1/1 spadd till 1:2 i sex steg anvandes.
Protokoll: 100 p1 standard/prov/spatt prov 100 Ill konjugerad antikropp 2 timmars skakning vid 450 rpm Tvatt 2*3*300 tl 200 p1 TMB 15 min inkubering i morker 100 Ill stopplosning 10 1 min skakning Lasare: 450 nm.
Resultat Koncentrationema for de olika analysvarianterna genererades i Gen5 och plottades mot MonoTotal IRMA-data, varefter en linjar kurvpassning gjordes i MS Excel. Resultaten sammanfattas i Tabell 2.
Tabell 2 Konjugat R2 C 11 0.8023 M21 0.9231 A53-B/A2 0.939 HCA 077 0.84 C11+M21 0.9357 Cl 1+ A53-B/A2 0.9579 Cll+HCA 077 0.9339 M21+ A53-B/A2 0.9936 M21+HCA 077 0.86 A53-B/A2+HCA 077 0.9479 En mycket god klinisk korrelation (R2 = 0.9936) med den kanda analysen erholls overraskande genom kombination av en monoklonal antikropp (M21), med affinitet for cytokeratin 18 men utan kand affinitet for cytokeratin 8, med en monoklonal antikropp med affinitet for cytokeratin 19 (A53-B/A2).
Exempel 2 Detta exempel visar att den M21-antikropp som anvandes I Exempel 1 binder till en heterodimer av cytokeratin 8 och 18, men inte till ren cytokeratin 18. M21 har tidigare visats binda till cytokeratin 18, se Rydlander et al, Eur. J. Biochem. 1996, 241, 3009- 1 1 314, men det liar inte visats att denna bindning kraver att ifragavarande cytokeratin 18 är bunden till cytokeratin 8.
Exempel 2.1: Avidinremsor bestroks med biotin-kopplade antikroppar av typen M21, M34 och 3F3 vid nimstemperatur och tvattades med 3*300 il tvattlosning De bestrukna remsorna inkuberades med en standardlosning av kultursupernatant fran en tumorcellinje innehallande cytokeratinfragment frail cytoskelett, huvudsakligen cytokeratin 8, 18 och 19, i koncentrationerna 0, 120 och 1200 11/1 eller en referenslosning av ren rekombinant cytokeratin 18 i spadningar av 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. Bunden cytokeratin 18 detekterades genom HRP-konjugerad monoklonal M3- antikropp eller polyklonal anti-TPS-antikropp P03 frail hast.
Resultaten sammanfattas i Tabell 3 och visas I Figur 2A-D. Tabell 3 HRP-konjugerad M3 HRP-konjugerad P03 M34 3F3 M21 M34 3F3 11121 Blank 0,059 0,058 0,056 Blank 0,062 0,059 0,056 Std 0 0,057 0,059 0,056 Std 0 0,139 0,133 0,172 Std 10,058 0,061 0,19 Std 10,152 0,260,344 Std 1200 0,098 0,061,342 Std 1200 0,181 1,451 1,047 M34 3F3 M21 M34 3F3 M21 CK18 ref 0,828 0,058 0,062 CK18 ref 0,637 0,717 0,218 1:2 0,411 0,063 0,072 1:2 0,341 0,370,259 1:4 0,227 0,059 0,062 1:4 0,239 0,233 0,199 1:8 0,10,066 0,061:8 0,184 0,197 0,173 Resultaten visar tydligt att M21-antikroppen vasentligen saknar affinitet for ren rekombinant cytokeratin 18, men liar affinitet for en blandning av cytokeratin 8, 18 och 19. 12 Exempel 2.2: Lagerlosningar av M21-antikropp (0.65 mg/ml) och M34-antikropp (0.58 mg/me framstalldes.
Brunnarna pa en ELISA-mikrotiterplatta med 96 brunnar belades med M21-antikropp och en blandning av M21- och M34-antikropp i sex olika varianter: Referens: TPS-standard (polyklonal anti-TPS frail hast) Variant 1: 12 ttg/m1N121 + 0.5 mg/ml bovint serumalbumin Variant 2: 16 jig/ml M21+ 0.5 mg/ml BSA Variant 3: 20 jig/m1 M21+ 0.5 mg/ml BSA Variant 4: 12 jig/m1 M21 + 4 jig/m1 M34 Variant 5: 16 jig/m1 M21 + 4 iug/m1 M34 Variant 6: 20 jig/m1 M21 + 4 jig/m1 M34 Till varje variant sattes 50 ittl cancerprov (samlade prover fran brostcancerpatienter (BC-patients)), normalt prov (frail friska blodgivare (BO)), TPS-spadningsmedel (vavnadspolypeptidspecifikt antigen) (0 U/1) eller TPS-standard (1200 U/1) (IDL Biotech, Bromma, Sverige), rekombinant cytokeratin 18, eller en blandning av rekombinant cytokeratin 8 och 18. 50 jii HRP-konjugerad mAb M3 200 ng/ml tillsattes, brunnarna inkuberades pa skakbord vid rumstemperatur under 2 timmar vid —450 rpm och tvattades darefter tre ganger med 300 111 tvattlosning 200 ittl TMBsubstrat tillsattes och brunnarna inkuberades under 20 minuter I morker. 50 In stopplosning tillsattes och brunnarna skakades under 1 minut. Bundna cytokeratiner detekterades genom matning av absorbansen vid 450 nm.
Resultaten visas i Tabell 4 and Figur 3. Tabell 4 Referen s Variant 1 Variant 2 Variant 3 Variant 4 Variant Variant 6 Spadningsmede 1 0,089 0,082 0,087 0,084 0,084 0,087 0,088 TPS std 1,736 1,218 1,201 1,307 1,109 1,243 1,341 13 CK8/CK18 0,839 0,671 0,71 0,717 0,636 0,669 0,681 CK18 1,317 0,086 0,084 0,088 0,299 0,301 0,259 TPAref 0,793 0,513 0,494 0,544 0,48 0,536 0,66 BG prov 0,22 0,14 0,141 0,152 0,141 0,0,147 BC prov 0,749 0,41 0,391 0,404 0,391 0,397 0,402 Resultaten visar att M21-antikroppen ensam uppvisar affinitet for kombinationen av cytokeratin 8 och 18, men inte for ren cytokeratin 18.
Analoga experiment visar att M21 inte uppvisar nagon affinitet mot ren cytokeratin 8, dvs cytokeratin 8 utan cytokeratin 18. 14

Claims (13)

Patentkrav 1. Metod for detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller losliga fragment darav i ett prov, innefattande stegen att man
1. bringar provet i kontakt med en fastfas pa vilken man har immobiliserat en forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8, en andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 och en tredje antikropp med affinitet for en forsta epitop av cytokeratin 19, dar namnda forsta immobiliserade antikropp är 6D7, namnda andra immobiliserade antikropp är 3F3, och namnda tredje immobiliserade antikropp är IDLC4; 2. later cytokeratin och/eller losliga fragment darav i provet binda till namnda forsta, andra och tredje antikroppar varpâ komplex bildas; 3. bringar komplexen i kontakt med en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och en andra markt antikropp med affinitet for en andra epitop av cytokeratin 19, dar namnda forsta markta antikropp är M21, och namnda andra markta antikropp är A53-B/A2; 4. later namnda forsta och andra markta antikroppar bindas till komplexen; och 5. detekterar namnda forsta markta antikropp och namnda andra markta antikropp bundna till komplexen.
2. Metod enligt krav 1, dar antikroppama är monoklonala antikroppar.
3. Metod enligt nagot av kraven 1-2, dar namnda forsta immobiliserade antikropp har affinitet for a-helixen 2B (aa 340-365), namnda andra immobiliserade antikropp har affinitet for a-helix 2B (aa 320-350), och namnda tredje immobiliserade antikropp har affinitet for a-helixen 2B (aa 340-370).
4. Metod enligt nagot av kraven 1-3, dar namnda forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8 utgor 20-40%, foretradesvis 30%, av den totala immobiliserade antikroppen, namnda andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 utgor 5-15%, foretradesvis 10%, av den totala immobiliserade antikroppen, och namnda tredje antikropp med affinitet for cytokeratin 19 utgor 50-70%, foretradesvis 60% av den totala immobiliserade antikroppen.
5. Metod enligt nagot av kraven 1-4, dar namnda markta antikroppar är markta med pepparrotsperoxidas och detektion utfors genom att man tillsatter ett substrat som kan omvandlas till en detekterbar substans av namnda pepparrotsperoxidas.
6. Metod enligt krav 5, dar namnda substrat omvandlas till en kromogen substans av namnda pepparrotsperoxidas, varvid substratet foretradesvis är TMB (3,3',5,5'- tetrametylbensidin).
7. Metod for kvantitativ bestamning av losliga fragment av cytokeratin 8, 18 och 19 i ett prov, innefattande metoden enligt nagot av foregaende krav och vidare innefattande stegen att man: 1. kvantitativt korrelerar mangden bunden forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och namnda andra antikropp med affinitet for cytokeratin 19 med mangden losliga fragment av cytokeratinerna 8, 18 och 19.
8. Kit for att utfora metoden enligt nagot av de foregaende kraven innefattande 1. ett fastfassubstrat pa vilket en forsta antikropp med affinitet for cytokeratin 8, en andra antikropp med affinitet for cytokeratin 18 och en tredje antikropp med affinitet for cytokeratin 19 har immobiliserats, dar namnda forsta immobiliserade antikropp är 6D7, namnda andra immobiliserade antikropp är 3F3, och namnda tredje immobiliserade antikropp är IDLC4; och 2. en forsta markt antikropp med affinitet for en dimer av cytokeratin 8 och 18 och en andra markt antikropp med affinitet for cytokeratin 19, foretradesvis i en buffrad losning, dar namnda forsta markta antikropp är M21, och namnda andra markta antikropp ar A53-B/A2.
9. Kit enligt krav 8, vilket vidare innefattar medel for utspadning, standard, kontroll, substrat, stopp, tvatt och/eller instruktioner for anvandning
10. Kit enligt kraven 8 eller 9 anpassat for enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA). 16 1/4 34
SE1350421A 2013-04-05 2013-04-05 Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav SE538211C2 (sv)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1350421A SE538211C2 (sv) 2013-04-05 2013-04-05 Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav
EP14779691.6A EP2981823B1 (en) 2013-04-05 2014-03-28 Novel assay
PCT/SE2014/050376 WO2014163557A1 (en) 2013-04-05 2014-03-28 Novel Assay
CN201480030302.1A CN105492907B (zh) 2013-04-05 2014-03-28 新检测方法
US14/782,527 US10386363B2 (en) 2013-04-05 2014-03-28 Assay
US16/418,272 US20190317087A1 (en) 2013-04-05 2019-05-21 Novel assay

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1350421A SE538211C2 (sv) 2013-04-05 2013-04-05 Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE1350421A1 SE1350421A1 (sv) 2014-10-06
SE538211C2 true SE538211C2 (sv) 2016-04-05

Family

ID=51658717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE1350421A SE538211C2 (sv) 2013-04-05 2013-04-05 Metod för detektering av cytokeratin 8, 18 och/eller 19 och/eller lösliga fragment därav

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10386363B2 (sv)
EP (1) EP2981823B1 (sv)
CN (1) CN105492907B (sv)
SE (1) SE538211C2 (sv)
WO (1) WO2014163557A1 (sv)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104583422A (zh) 2012-06-27 2015-04-29 博格有限责任公司 标志物在诊断和治疗前列腺癌中的用途
EP4242329A3 (en) 2014-12-08 2023-10-25 Berg LLC Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
SE538541C2 (sv) 2015-01-19 2016-09-13 Fogelstrand Per Method for preparing a biological sample for use in an immunolabeling process
CN106866820B (zh) * 2017-02-17 2020-04-03 艾比玛特医药科技（上海）有限公司 一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用
CN111018984B (zh) * 2019-11-26 2021-09-21 山东立菲生物产业有限公司 抗ck8单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5660994A (en) * 1986-11-10 1997-08-26 Progen Biotechnik Gmbh Method of detecting tissue-specific, insoluble cytoskeletal proteins
US6596476B1 (en) * 1989-12-22 2003-07-22 Abbott Laboratories Hepatitis C assay
SE470273B (sv) * 1990-09-24 1993-12-20 Idl Immunodeveloplab Ab Cytokeratinfragment, deras framställning och användning, framställning av monoklonala antikroppar och testkit för epitelialcancer
DE4208422A1 (de) * 1992-03-16 1993-09-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Mikrometastasen ekto- oder entodermaler Tumoren
BR0208603A (pt) * 2001-04-03 2004-03-02 Merck Patent Gmbh Marcadores de tumor para carcinoma de células renais
US20050221399A1 (en) 2004-03-30 2005-10-06 Sysmex Corporation Method for screening cervical cancer
WO2007119111A2 (en) * 2005-11-10 2007-10-25 Aurelium Biopharma Inc. Tissue diagnostics for ovarian cancer
CN101377501A (zh) * 2007-08-31 2009-03-04 北京科美东雅生物技术有限公司 细胞角蛋白19片段化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
WO2012112013A2 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology A marker comprising anti-ck8/18 complex autoantibody and its use for diagnosing cancer

Also Published As

Publication number Publication date
EP2981823B1 (en) 2018-05-23
US20190317087A1 (en) 2019-10-17
WO2014163557A1 (en) 2014-10-09
SE1350421A1 (sv) 2014-10-06
CN105492907A (zh) 2016-04-13
US20160025718A1 (en) 2016-01-28
CN105492907B (zh) 2017-10-31
US10386363B2 (en) 2019-08-20
EP2981823A1 (en) 2016-02-10
EP2981823A4 (en) 2016-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190317087A1 (en) Novel assay
WO2017107974A1 (zh) 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用
EP1913391B1 (en) QUANTITATIVE ASSAYS FOR PDGFR-beta IN BODY FLUIDS
Granato et al. Role of HE4, CA72. 4, and CA125 in monitoring ovarian cancer
US20080254481A1 (en) Methods and kits for detecting prostate cancer biomarkers
Oh et al. Point-of-care fluorescence immunoassay for prostate specific antigen
Lupoli et al. Prognostic significance of thyroglobulin antibody epitopes in differentiated thyroid cancer
US11719697B2 (en) Immunoassay and antibodies for the detection of chromogranin A
TW201643429A (zh) 前列腺抗原標準品及其用途
Zhao et al. Dual‐labeled chemiluminescence enzyme immunoassay for simultaneous measurement of total prostate specific antigen (TPSA) and free prostate specific antigen (FPSA)
CN106645756A (zh) 一种检测nmp22的试剂盒及其制备方法
JP6578119B2 (ja) 前立腺特異抗原の測定方法及び測定キット
US20140087400A1 (en) Diagnosis and prognosis of triple negative breast and ovarian cancer
Wang et al. Development of a novel immunoassay for the simple and fast quantitation of neutrophil gelatinase-associated lipocalin using europium (III) chelate microparticles and magnetic beads
Broughton et al. Characterization of a new highly sensitive immunometric assay for thyroglobulin with reduced interference from autoantibodies
Wu et al. Development of a microplate assay for serum chromogranin A (CgA): establishment of normal reference values and detection of elevated CgA in malignant diseases
Sun et al. Development of two ELISA for estrogen and progesterone receptor with sufficient sensitivity for fine needle aspirate and core biopsy
JP2021535392A (ja) Ｄｌｂｃｌについての予後指標におけるチミジンキナーゼ（ｔｋ−１）
Cohen et al. Automated immunohistochemical estrogen receptor in fixed embedded breast carcinomas
US20240210402A1 (en) Method for detecting oral neoplastic lesion, test reagent, test kit and therapeutic composition
WO2023191046A1 (ja) Ｈｒｇに対するモノクローナル抗体を用いたｈｒｇの測定方法
WO2023068249A1 (ja) Ｉ型コラーゲン架橋ｎ－テロペプチドの測定試薬、その調製方法、及びそれを用いた免疫測定方法
Shen et al. Establishment of a multi-line immunochromatography based on magnetic nanoparticles for simultaneous screening of multiple biomarkers
JP2003527607A (ja) 乳癌の検出および診断のための新規バイオマーカーとしてのリソソームペプスタチン非感受性タンパク質分解酵素
CN109613247A (zh) 用于检测组织多肽特异性抗原的试剂盒