CN105492907B - 新检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测样品中选自细胞角蛋白8、18和/或19组成的组中至少两种细胞角蛋白和/或其可溶性片段的方法,包括以下步骤:使所述样品接触其上已经固定了对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体,对细胞角蛋白8具有特异性的第二抗体,和任选的对细胞角蛋白19的第一表位具有特异性的第三抗体的固相;使所述样品中的细胞角蛋白和/或其可溶性片段结合到所述第一、第二和/或第三抗体从而形成复合物;使所述复合物接触对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体和对细胞角蛋白19的第二表位具有特异性的第二标记抗体接触;使所述第一和第二标记抗体结合到所述复合物;和检测结合到所述复合物的所述第一和第二标记抗体。本发明还涉及定量样品中细胞角蛋白8、18和19中至少两种的可溶性片段的方法和实施根据本发明的方法的组配试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及癌症和癌症检测领域。更具体地,本发明涉及对敏感指征例如肿瘤细胞活性的新检测方法。根据本发明的方法可用于对上皮源性癌,例如非小细胞肺癌,和膀胱癌患者的管理。
背景技术
在工业世界,癌症是主要致死原因中的一个。为了改善病人护理,当前致力于发现关于预测、治疗反应的早期迹象和疾病进程的其它信息。为此感兴趣的工具是癌症生物标记的使用,即表明体内存在癌症的物质。生物标记是肿瘤或人体对存在的癌症的特异反应分泌的分子。理想的是,这种生物标记能够在非侵入式收集的生物液体如尿液、血液或血清中检测。
人们感兴趣的一个领域是肺癌,它是世界范围内最普遍和最致命的癌症疾病。肺癌致死的人比结肠、乳腺和前列腺癌的总和还多(WHO统计)。大约80-85%的肺癌患者有非小细胞组织(NSCLC)。非小细胞肺癌(SCLC)占所有肺癌情况的约15-20%。大部分患者具有处于晚期且无法手术的疾病。对于早期阶段的NSCLC,切除作为仅有的有疗效的治疗方法仍然是重要的。过去的十年间,人们广泛研究了肿瘤标记物在肺癌中的价值。已经发现的对肺癌具有临床重要性的最普遍的生物标记是CEA、CYFRA、TPA、TPS和NSE。然而,灵敏性和专一性的缺乏限制了癌症生物标记在对肺癌进行检查和早期诊断中的应用。对于疾病的预后评价和过程检测,癌症生物标记显得更加有效。
所有真核细胞具有已知为中间丝的细胞质细胞骨架结构。细胞骨架网络负责细胞的机械完整性且在细胞过程如细胞分裂、运动和细胞间接触中至关重要。目前,已经确认了超过20种不同的细胞角蛋白,其中在简单上皮细胞中细胞角蛋白8、18和19是最充足的。细胞角蛋白是上皮细胞特有的且细胞角蛋白模式在正常细胞转化成恶性细胞过程中通常保留下来。
检测细胞角蛋白8、18和19上限定的表位的固相两位点免疫放射分析(IRMA)是商业上可获取的(IDL Biothch,Bromma Sweden),商标为将捕获抗体,单克隆抗体6D7(CK8)、3F3(CK18)和IDLC4(CK19)涂覆于塑料珠上。分析中使用多克隆125I-标记抗体作为示踪剂。用γ计数器检测放射活性且放射活性正比于细胞角蛋白抗原片段的浓度。MonoTotal是设计为进行患者血清检测的定量检测。MonoTotal作为预后标记对于诊断、预后,和对于监控患者的治疗是有价值的。通过跟踪患者的重复MonoTotal检测,医生能够获取有关肿瘤细胞活性的关键信息。变化的MonoTotal标记水平表明肿瘤细胞活性发生变化,且提高的水平指向肿瘤的存在。在患者管理和随访中该信息被认为特别重要,其中血液样品可用于监测治疗和对肿瘤复发的早期检测。当疾病仍限制于肺部时大约15%的肺癌患者被确诊,且早期检测对于增加生存的可能是至关重要的。通过使用MonoTotal,医生可以得到疾病过程的指征信息,其以肿瘤细胞活性而不是传统的肿瘤负荷检测来测定。MonoTotal能够向医生提供对诊断、建立预后、治疗监测和患者随访中可靠的辅助信息。
根据已公开研究,MonoTotal显现出与患者的临床反应非常相关。相较于肺癌患者中的Cyfra,MonoTotal具有更高的灵敏度。在肺癌诊断中,不依赖于组织分型,MonoTotal的整体灵敏度是约70-75%,且特异性为95%。非小细胞肺癌(NSCLC)的灵敏度更高。MonoTotal与肿瘤细胞活性和疾病程度非常相关。此外,MonoTotal可预测疾病进程(无病期间和整体存活率),且在NSCLC随访中是复发的早期标志。MonoTotal中的变化通常早于传统成像方法的复发的检测。由于血清中细胞角蛋白的半衰期小于一天,所以在几天内能够进行对治疗反应的检测。MonoTotal对于NSCLC是比程序化临床实践中目前使用的其他生物角蛋白标记更灵敏的肿瘤标记。
另一个感兴趣的领域是膀胱癌,在世界范围内其是男性和女性中常见的癌症。超过70%的情况都是非肌层浸润性膀胱癌,但是很多患者发展成肌层浸润性膀胱癌或转移性疾病。为提高对膀胱癌的预后,使用有效的方法进行早期检测和常规随访对于患者而言是重要的。
非浸润性膀胱癌检测具有很多潜在应用,如帮助诊断复发,降低对侵入性检测的需求和检测患者是否落入高风险范畴。免疫检测(IDL Biotech)是一种非侵入性检测。
然而,尽管当前市场上存在一些方法和检测,但仍然存在对改进的诊断工具的需求以从患者获得关键临床数据,避免能够对疾病的早期症状进行有效检测和对患者体内的疾病状况进行快速检测时与使用多克隆抗体有关的弊端,例如通过血清或尿液分析。在该领域中产品和过程满足高质量标准,并根据标准化流程来开发、生产并供应到市场是至关重要的。
发明概述
尽管可获得的指征肿瘤细胞活性的方法运行的较好,但它取决于放射性标记抗体的使用,其受限于特定规则和预防措施,对该方法的使用者产生了管理性和实践性负担。它进一步取决于来自特定源的多克隆抗体的使用,如果来源不能提供多克隆抗体则会导致供应问题。因此本发明人确认了开发不依赖于放射活性或多克隆抗体的特定源,但同时与现存方法临床上可兼容的方法的需求。
根据本发明,使用一个、两个或三个抗体固定于固相来捕获来自液体样品的细胞角蛋白。标记的抗体与固相随后接触并使得能够结合到固定的抗体-细胞角蛋白复合物,对结合的抗体进行检测。
因此,本发明的一个方面涉及检测样品中至少两种细胞角蛋白和/或其可溶性片段的方法,所述细胞角蛋白选自细胞角蛋白8、18和/或19组成的组中,所述方法包括步骤:
-使所述样品接触其上已经固定了对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体,和/或对细胞角蛋白18具有特异性的第二抗体,和/或对细胞角蛋白19的第一表位具有特异性的第三抗体的固相;
-使所述样品中的细胞角蛋白和/或其可溶性片段结合到所述第一、第二和/或第三抗体从而形成复合物;
-使所述复合物与对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体和对细胞角蛋白19的第二表位具有特异性的第二标记抗体接触;
-使所述标记抗体结合到所述复合物;
-检测结合到所述复合物的所述标记抗体。
在另一方面,本发明涉及定量检测选自细胞角蛋白8、18和19组成的组中的至少两种细胞角蛋白的可溶性片段的方法,包括根据前述方面的方法,和进一步的将对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体和任选的对细胞角蛋白19具有特异性的第二标记抗体的量与细胞角蛋白8、18和/或19可溶性片段的量定量相关联的步骤。
在另一方面,本发明涉及实施根据上述任一方面方法的组配试剂盒,所述组配试剂盒包括其上固定了对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体,和/或对细胞角蛋白18具有特异性的第二抗体和/或对细胞角蛋白19具有特异性的第三抗体的固相;和对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体,和任选的,对细胞角蛋白19具有特异性的第二标记抗体,优选的是在缓冲溶液中。
本发明进一步的实施方式在以下的详细说明和从属权利要求中进行了限定。
附图的简要说明
图1是如何实施根据本发明的方法的示意图。
图2是显示了实施例2.1获得的结果的图。
图3是显示了实施例2.2获得的结果的图。
发明优选实施方式的详细说明
本发明人已经确认了对于制备新的或发现存在的抗体来优化检测以避免现有技术的缺陷,并保持与存在的检测方法,MonoTotal IRMA的良好的临床相关性的需求。在以下详细说明中,术语“具有亲和力”用于对其相应目标物具有特异性的抗体,这易于由本领域技术人员掌握的知识确认。
因此本发明人已经开发出灵敏地指征用于上皮源性癌,特别是非小细胞肺癌患者管理中的肿瘤细胞活性的新检测方法。这里选择了酶联免疫吸附检测(ELISA)方式,但本领域技术人员可以确定其它利用根据本发明的方法的原理的方式也落入本发明的范围。
本发明的一个实施方式,其中检测三种细胞角蛋白8、18和19,相较于存在的免疫放射分析,要求使用的单克隆抗体保持对细胞角蛋白19的特异性,并且还与存在的方法有良好的临床相关性。该检测方法也必须稳定并具有可接受的信号强度。
该实施方式在检测细胞角蛋白19时已表现出NSCLC中的临床优越性。为提高灵敏度并考虑到细胞角蛋白形成杂二聚体以及某些抗体表位仅在二聚体形式才可获得,构建了细胞角蛋白8、18和19的检测方法。
令人惊奇的是,在该实施方式中通过结合对细胞角蛋白8和18的二聚体具有亲和力的第一标记抗体和对细胞角蛋白19具有亲和力的第二标记抗体获得了与现有技术的检测方法非常好的临床相关性。第一标记抗体显示出基本上不与细胞角蛋白8或18的单体或均二聚体的亲和性。
因此,本发明的方法的该实施方式利用结合到固相,如标准微孔板上的第一、第二和第三抗体。固定到固相上的第一、第二和第三抗体可通过例如WO92/05197公开的方法制备,其分别利用细胞角蛋白8、18和19的纯化片段。通过Silén等,Scand J Clin Invest,1995,55,153-161和Sfigbrand等,Tumor Biol 1998,19,132-152描述的方法制备了对细胞角蛋白8具有特异性的以6D7表示的抗体,对细胞角蛋白18具有特异性的以3F3表示的抗体。如等,Diseases of the esophagus,2005,18,298-303所讨论的,抗体IDLC4对细胞角蛋白19在氨基酸残基340-370区域的表位具有特异性。
对细胞角蛋白8和18的二聚体具有亲和力的第一标记抗体可用根据Rydlander等,Eur J Biochem,1996,241,309-315的方法制备,并筛选了对细胞角蛋白8和18的二聚体的亲和力,且缺乏对细胞角蛋白8和18的单体形式的亲和力。在以下实施例2中进一步对此进行解释,其中制备了命名为M21的合适抗体。可替换的是,第一标记抗体可以为商业上可获得的抗体如A45-B/B3(Biologicals Ltd.,U.K.)或DE-K18(Fisher Scientific)。
产生6D7的细胞系已经于2013年3月19日在欧洲细胞株保藏中心(ECACC,PortonDown,英国)进行保藏,保藏号为13031902。产生3F3 6D7的细胞系已经于2013年3月19日在ECACC进行保藏,保藏号为13031901。产生IDLC4的细胞系已经于2013年3月19日在ECACC进行保藏,保藏号为13031903。产生M21的细胞系已经于2013年3月21日在ECACC进行保藏,保藏号为13032101。
用于根据本发明的方法的该实施方式的对细胞角蛋白19具有亲和力的第二标记抗体可为对细胞角蛋白19具有亲和力的任何抗体,例如商业上可获取的抗体,如A53-B/A2(Ventana,Tuscon Arizona,U.S.A.)。
根据本发明的方法的另一个实施方式,对样品中细胞角蛋白8和18,和/或其可溶性片段进行检测。更具体地,该方法的该实施方式包括以下步骤:
-使所述样品接触其上已经固定了对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体,和对细胞角蛋白18具有特异性的第二抗体的固相;
-使所述样品中的细胞角蛋白和/或其可溶性片段结合到所述第一、第二抗体从而形成复合物;
-使所述复合物与对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体接触;
-使所述标记抗体结合到所述复合物;
-检测结合到所述复合物的所述标记抗体。
第一实施方式的关于例如抗体、其制备等的前述详细描述也适用于该实施方式。
以上描述的两个实施方式,和根据本发明方法的其它实施方式,以一步酶联夹心免疫分析(ELISAs)有利地实施。在与固定于固相上的单克隆捕获抗体和辣根过氧化物酶(HRP)-结合检测抗体同时孵育过程中进行标准、控制和样品反应。清洗后,加入显影底物,例如3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),在孵育时间后停止反应并检测在450nm处的吸收。显影的颜色正比于分析物的浓度。
在一个实施方式中,对血清样品实施根据本发明的检测方法。每次分析需要收集对2*100μl血清(双份)足够量的血液。如果在24h内进行分析,则需要对血清进行冷藏保存(2-8℃)。如果延迟分析,则优选对血清进行冰冻存储<-18℃。应避免重复的解冻和冷冻。不应当使用高溶血、严重脂血或污染的血清样品。
分析过程图示于图1中。
1.向每个限定的孔中加入100μl标准、对照或样品。留两个空孔(空白)进行背景吸收检测(任选的)。
2.除空白孔外向每个孔中加入100μl第一和第二标记抗体。
3.在450rpm的振荡器上孵育2h±10min。
4.用0.3ml清洗液抽吸并清洗孔3次。
5.向每个孔中加入200μl TMB底物,包括空白孔。
6.黑暗中孵育15±1min。
7.向每个孔中加入100μl终止液。在振荡器上混合1min。
8.在加入终止液后的30min内读取450nm处的吸收值。
计算样品的细胞角蛋白8/18/19浓度。在重复分析前,应当用稀释剂将样品稀释到适当的、本领域技术人员易于测定的浓度。
用标准化微孔板读数器(波长450nm)读取450nm处的吸收值。用计算机软件对原始数据进行处理。推荐使用样条平滑作为曲线拟合算法。为产生有效数据,需要保证包括的对照在范围之内。
结果的人工处理:通过减去空白OD来校正每个OD-值(优化的密度)。计算每次重复的平均OD-值。通过用每个标准(y-轴)的平均OD-值相对于相应的浓度(x-轴)做图来构建标准曲线。根据标准曲线来确定样品的浓度。
在可替换的实施方式中,对尿液样品实施根据本发明的方法以检测膀胱癌。基于在该应用的信息及普通技术知识,本领域技术人员能够以适当方式制备用于根据本发明检测方法的样品。
本发明进一步涉及用于进行以上所描述方法的组配试剂盒。
这样的试剂盒有利地包括:
-具有固定于其上的对细胞角蛋白8具有亲和性的第一抗体,和/或对细胞角蛋白18具有亲和性的第二抗体,和/或对细胞角蛋白19具有亲和性的第三抗体的固相;和
-对细胞角蛋白8和18的二聚体具有亲和性的第一标记抗体和/或对细胞角蛋白19具有亲和性的第二标记抗体。
优选在一种或更多缓冲溶液中提供标记的抗体。在一个实施方式中标记的抗体通过结合辣根过氧化物酶来标记。
所述试剂盒还包括稀释样品的工具,例如已经制备好的pH7.5的蛋白质稳定缓冲溶液,其进一步含有或不含有防腐剂,或当与水混合时以制备这种缓冲液的干式混合物。
所述试剂盒还进一步包括作为标准的工具,例如蛋白质稳定缓冲溶液中的标准材料或当与水混合时制备这种缓冲溶液的干式混合物。能以不同的浓度提供标准品。
所述试剂盒还进一步包括用于对照的工具,例如蛋白质稳定缓冲液中的对照材料或当与水混合时制备这种缓冲液的干式混合物。能以不同的浓度提供标准品,例如低和高。
所述试剂盒还进一步包括清洗固定相的工具(图1中的步骤4)。所述清洗工具可以为现成的清洗溶液或用于溶解在水中的清洗片。
根据本发明的该试剂盒还包括对肺癌检测,优选非小细胞肺癌,或对膀胱癌检测的书面说明书。
尽管对根据本发明的检测方法目前优选的形式是酶联免疫吸附检测(ELISA),但其它免疫分析原理也可用于实施本发明。这样的免疫分析原理包括放射免疫分析、荧光免疫分析、发光氧沟道分析(LOCI)、表面等离子共振(SPR)、椭圆光度法、发光免疫分析(荧光素酶/ATP)、化学发光免疫分析(二氧杂环丁烷、吖啶、吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)、电化学发光免疫分析(钌盐)、解离增强时间分辨荧光分析(DELFIA)、电检测(电导、碳纳米管、半导体纳米线、硅纳米线)、和流式荧光检测(激光荧光基团)。
本发明不限于以上描述的优选实施方式。可使用不同的替换、改进和等效方式。因此,以上的实施方式或以下示例性实施例并非作为对本发明范围的限制,发明的范围由所附的权利要求限定。
当实施本发明时,本领域技术人员可进一步利用药物化学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术领域的传统技术,如所公开的Sambrook等,“Molecular cloning:A laboratory manual”,3rd ed.2001;Ausubel等,“Short protocolsin molecular biology”,5th ed.1995;“Methods in enzymology”,Academic Press,Inc.;MacPherson,Hames and Taylor(eds.).“PCR 2::A practical approach”,1995;“Harlowand Lane(eds.)“Antibodies,a laboratory manual”1988;Freshney(ed.)“Culture ofanimal cells”,4thed.2000;“Methods in Molecular Biology”149卷(”The ELISAGuidebook”by John Crowther)Humana Press 2001,或这些书的后来的版本。
实施例部分
以下提供的实施例仅是说明性目的,不应当作为所附权利要求限定的发明的限制。本申请中以下和其它部分提供的参考内容通过引用包括于本申请中。
实施例1
为了发现适当的结合于ELISA形式中的单克隆检测抗体,对多种单克隆抗体进行评估。用来自AttanaAB(Stochkholm,Sweden)的石英晶体微天平生物传感器设备实时评估了结合于捕获抗体(3F3、6D7和IDLC4)上的细胞角蛋白8、18和19之间的相互作用,提供了关于结合强度、速率、结合水平和结合稳定性以及表位相似性的信息。
对细胞角蛋白19具有亲和力的六种抗体,对细胞角蛋白8具有亲和力的三种,对细胞角蛋白18具有亲和力的四种,以及对多种细胞角蛋白具有亲和力的一种抗体进行了评估,结果见表1。
表1
抗CK19 | 抗CK8 | 抗CK18 | Pan ab |
IDL C3 | IDL 33 | 3F3 | C11 |
IDL C4 | 6D7 | M3 | |
IDL C5 | 2D1 | M21 | |
A53-B/A2 | M34 | ||
BA 17 | |||
HCA077 |
基于生物传感器检测的结果,抗体A53-B/A2、IDL33、HCA077、M21和C11缀合于HRP,并在酶联免疫吸附检测中进行检测,并评估与现有技术检测方法的临床相关性。
对来自癌症患者的12种样品或混合样品用MonoTotal稀释剂以1∶2或1∶4进行稀释,并用于比较。缀合的抗体或抗体混合物被稀释到1μg/ml的最终浓度。使用六个步骤以1∶2稀释的5472U/I标准。
方案
100μl标准/样品/稀释样品
100μl结合的抗体
450rpm,震荡2小时
清洗2*3*300μl
200μl TMB
黑暗中15min孵育
100μl终止液
1min震荡
读取器:450nm
结果
对于多种分析变量的浓度产生于Gen5中,并对MonoTotal的IRMA数据进行做图,而后在MS Excel中进行线性拟合。结果概括于表2中。
表2
缀合物 | R2 |
C11 | 0.8023 |
M21 | 0.9231 |
A53-B/A2 | 0.9395 |
HCA 077 | 0.8435 |
C11+M21 | 0.9357 |
C11+A53-B/A2 | 0.9579 |
C11+HCA 077 | 0.9339 |
M21+A53-B/A2 | 0.9936 |
M21+HCA 077 | 0.8615 |
A53-B/A2+HCA 077 | 0.9479 |
令人惊奇的是,通过结合对细胞角蛋白18具有亲和性而已知对细胞角蛋白8不具有亲和性的单克隆抗体(M21)与对细胞角蛋白19具有亲和性的单克隆抗体(A53-B/A2),获得了与现有检测方法非常好的临床相关性(R2=0.9936)。
实施例2
该实施例显示了实施例1所使用的抗体M21结合到细胞角蛋白8和18的杂二聚体,但不结合到纯细胞角蛋白18。以前M21已经显示出结合到细胞角蛋白18,见Rydlander等,Eur.J.Biochem.1996,241,3009-314,但并没有显示出这种结合需要细胞角蛋白18结合到细胞角蛋白8。
实施例2.1:
在室温下用生物素偶联抗体M21、M34和3F3涂覆抗生物素蛋白质条带,并用3*300μl清洗液进行清洗。涂覆的条带用来自含有细胞骨架的细胞角蛋白片段,主要是细胞角蛋白8、18和19(浓度分别为0/120和1200U/I)的肿瘤细胞系的培养液上清液的标准溶液培养,或以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8对纯重组细胞角蛋白18稀释的参比溶液进行培养。用HRP-结合单克隆抗体M3或多克隆马抗-TPS抗体P03检测结合的细胞角蛋白18。
结果概括于表3中并显示在图2A-D。
表3
结果清楚说明抗体M21基本上缺乏对纯重组细胞角蛋白18的亲和力,但对细胞角蛋白8、18和19的混合物具有亲和力。
实施例2.2:制备抗体M21(0.65mg/ml)和M34(0.58mg/ml)的储备溶液。
用六种变量的M21抗体和M21与M34抗体的混合物涂覆用于ELISA的96-孔微孔板的孔:
参比:TPS标准样(多克隆马抗-TPS)
变量1:12μg/ml M21+0.5μg/ml牛血清白蛋白
变量2:16μg/ml M21+0.5μg/ml BSA
变量3:20μg/ml M21+0.5μg/ml BSA
变量4:12μg/ml M21+4μg/ml M34
变量5:16μg/ml M21+4μg/ml M34
变量6:20μg/ml M21+4μg/ml M34
向每种变量加入50μl的癌症样品(来自乳腺癌(BC)病人的汇集样品),正常样品(来自健康献血者(BD)),TPS(组织多肽特异性抗原)稀释剂(0U/I)或TPS标准品(1200U/I)(IDL Biothch,Bromma,Sweden),重组细胞角蛋白18,或重组细胞角蛋白8和18的混合物。加入50μl浓度为200ng/ml的HRP-缀合的mAb M3,孔在室温下以~450rpm于振荡器上孵育2h,然后用300μl清洗液清洗三次。加入200μl TMB底物并使孔在黑暗中孵育20min。加入50μl终止液而后振荡一分钟。通过检测450nm处的吸收对结合的细胞角蛋白进行检测。
结果显示于表4和图3中。
表4
参考 | 变量1 | 变量2 | 变量3 | 变量4 | 变量5 | 变量6 | |
稀释剂 | 0.089 | 0.082 | 0.087 | 0.084 | 0.084 | 0.087 | 0.088 |
TPS标准 | 1.736 | 1.218 | 1.201 | 1.307 | 1.109 | 1.243 | 1.341 |
CK8/CK18 | 0.839 | 0.671 | 0.71 | 0.717 | 0.636 | 0.669 | 0.681 |
CK18 | 1.317 | 0.086 | 0.084 | 0.088 | 0.299 | 0.301 | 0.259 |
TPA参考 | 0.793 | 0.513 | 0.494 | 0.544 | 0.48 | 0.536 | 0.66 |
BD样品 | 0.22 | 0.14 | 0.141 | 0.152 | 0.141 | 0.15 | 0.147 |
BC样品 | 0.749 | 0.41 | 0.391 | 0.404 | 0.391 | 0.397 | 0.402 |
结果表明M21单独显示了对细胞角蛋白8和18的结合的亲和力,但对纯细胞角蛋白18则没有亲和力。
类似实验将表明M21对纯细胞角蛋白8,即不存在细胞角蛋白18的细胞角蛋白8,不显示亲和力。
实施例3
该实施例表明通过用两个单克隆抗体(特异于细胞角蛋白8(CK8)和细胞角蛋白18(CK18))取代现有技术(UBC/TPAcyk)中使用的来自马的多克隆抗体可以提供有利的检测形式。
首先在来自Attana A100 QCM Research System(http://www.attana.com/)的仪器上对抗体进行表位类似性和动力学检测。检测在以与ELISA检测相等的比例涂覆抗体6D7/3F3的聚苯乙烯芯片上进行。抗体令人满意地起作用地缀合并在ELISA中进一步检测。
下表中的缀合物浓度为1μg/ml。报道了最高标准的结合(ABS)。
不同缀合物的UBC ELISA
用等量的6D7(抗CK8)和3F3(抗CK18)涂覆板,标准物包括等量的重组CK8和CK18。通过内部对照和患者样品进行检测。
以上表明,C11表现较好,其结合了所有研究的抗体,且在CK8和CK18具有表位。
M21单独与现有技术的检测方法具有良好的相关性,但结合力非常低。
C11+M21的组合提供了约等于C11单独提供的结合。该组合提供了良好的结合和良好的相关性。该组合还允许较低的C11浓度,且可作为有利的经济性替换。
结论
该实施例表明C11和M21的组合可完全可操作性地替换现有技术的检测方法。
Claims (21)
1.一种检测样品中选自细胞角蛋白8、18和19组成的组的至少两种细胞角蛋白和/或其可溶性片段的方法,包括以下步骤:
-使所述样品接触固相,所述固相上固定有对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体和对细胞角蛋白18具有特异性的第二抗体,其中所述第一抗体为6D7,其由保藏号为ECACC13031902的细胞系分泌,所述第二抗体为3F3,其由保藏号为ECACC 13031901的细胞系分泌;
-使所述样品中的细胞角蛋白和/或其可溶性片段结合到所述第一和第二抗体从而形成复合物;
-使所述复合物接触对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体和任选的对细胞角蛋白19的第二表位具有特异性的第二标记抗体,其中所述第一标记抗体为M21,其由保藏号为ECACC 13032101的细胞系分泌,所述第二标记抗体为A53-B/A2;
-使所述标记抗体结合到所述复合物;和
-检测结合到所述复合物的所述标记抗体。
2.根据权利要求1的方法,其中所述固相上还固定有对细胞角蛋白19的第一表位具有特异性的第三抗体,所述第三抗体由保藏号为ECACC 13031903的细胞系分泌,且使所述形成的复合物还接触对细胞角蛋白19的第二表位具有特异性的第二标记抗体。
3.根据权利要求1的方法,其中所述抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求1的方法,其中所述第一标记抗体对细胞角蛋白18的α-螺旋2B 2(aa414-429)具有特异性,所述第二标记抗体对细胞角蛋白19的α-螺旋2B 2(aa 311-335)具有特异性。
5.根据权利要求1或2的方法,其中所述第一抗体对α-螺旋2B(aa 340-365)具有特异性,所述第二抗体对α-螺旋2B(aa320-350)具有特异性,所述第三抗体对α-螺旋2B(aa340-370)具有特异性。
6.根据权利要求1的方法,其中对细胞角蛋白8具有特异性的所述第一抗体在总的固定抗体的组成中占20-40%,对细胞角蛋白18具有特异性的所述第二抗体在总的固定抗体的组成中占5-15%,对细胞角蛋白19具有特异性的所述第三抗体在总的固定抗体的组成中占50-70%。
7.根据权利要求6的方法,其中对细胞角蛋白8具有特异性的所述第一抗体在总的固定抗体的组成中占30%,对细胞角蛋白18具有特异性的所述第二抗体在总的固定抗体的组成中占10%,对细胞角蛋白19具有特异性的所述第三抗体在总的固定抗体的组成中占60%。
8.根据以上任一项权利要求的方法,其中检测样品中的细胞角蛋白8和18和/或其可溶性片段,包括以下步骤:
-使所述样品接触固相,所述固相上固定有对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体和对细胞角蛋白18具有特异性的第二抗体;
-使所述样品中的细胞角蛋白和/或其可溶性片段结合到所述第一和第二抗体从而形成复合物;
-使所述复合物接触对细胞角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体;
-使所述标记抗体结合到所述复合物;
-检测结合到所述复合物的所述标记抗体。
9.根据权利要求1的方法,其中所述标记抗体用辣根过氧化物酶标记,并且通过加入能够被所述辣根过氧化物酶转化成可检测物质的底物来进行检测。
10.根据权利要求9的方法,其中所述底物被所述辣根过氧化物酶转化为发色物质。
11.根据权利要求10的方法,其中所述底物为TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)。
12.一种定量测定样品中的至少两种细胞角蛋白的可溶性片段的方法,所述细胞角蛋白选自细胞角蛋白8、18和19组成的组,所述方法包括以上任一项权利要求的方法,进一步包括以下步骤:
-将结合的对角蛋白8和18的二聚体具有特异性的第一标记抗体和对细胞角蛋白19具有特异性的第二标记抗体的量与细胞角蛋白8、18和/或19的可溶性片段的量进行定量关联。
13.一种实施以上任一项权利要求所描述方法的组配试剂盒,包括:
-具有固定于其上的至少两种细胞角蛋白的固相基底,所述细胞角蛋白选自对细胞角蛋白8具有亲和性的第一抗体,对细胞角蛋白18具有亲和性的第二抗体,和对细胞角蛋白19具有亲和性的第三抗体;和
-对细胞角蛋白8和18的二聚体具有亲和性的第一标记抗体,和/或对细胞角蛋白19具有亲和性的第二标记抗体。
14.根据权利要求13的组配试剂盒,其中所述第一标记抗体和第二标记抗体处于缓冲溶液中。
15.根据权利要求13的组配试剂盒,进一步包括稀释工具、标准工具、对照工具、底物工具、终止工具、清洗工具和/或使用说明书。
16.根据权利要求13的组配试剂盒,适用于酶联免疫吸附分析。
17.根据权利要求13的组配试剂盒,其中对细胞角蛋白8具有特异性的第一抗体和对细胞角蛋白18具有特异性的第二抗体被固定在所述固体基底上。
18.根据权利要求17的组配试剂盒,其中所述第一标记抗体为M21,其由保藏号为ECACC13032101的细胞系分泌,和/或所述第二标记抗体为C11。
19.根据权利要求13的组配试剂盒,其包括用于肺癌的检测的书面说明书。
20.根据权利要求19的组配试剂盒,其中所述肺癌为非小细胞肺癌。
21.根据权利要求13的组配试剂盒,其包括用于膀胱癌的检测的书面说明书。
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