CN102288470A

CN102288470A - 一种考马斯亮蓝g250染色方法及其专用染色液和应用

Info

Publication number: CN102288470A
Application number: CN2011102038777A
Authority: CN
Inventors: 王旭初; 郭安平; 王海燕; 王东阳
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了一种考马斯亮蓝G250染色液，含有以下组分：质量体积浓度为0.1-0.2％的CBB G-250，质量体积浓度为5-15％的硫酸铵，体积百分含量为3-8％的磷酸，体积百分含量为20-40％的乙醇，体积百分含量为5-20％的甲醇。该染色液集固定液，敏化液和染色液为一体，染出胶的背景比较轻，染色灵敏度高；还公开了利用上述考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，该方法除具有较好的重复性、很低的染色背景外，该检测方法快速灵敏，检测到的蛋白点数目比较多；有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；应用范围比较广泛。同时公开了上述方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。

Description

一种考马斯亮蓝G250染色方法及其专用染色液和应用

技术领域

本发明涉及一种考马斯亮蓝的染色方法及其染色液和应用，具体涉及一种考马斯亮蓝G250染色方法及其专用染色液和应用。

背景技术

双向电泳和质谱(MS)是蛋白质组学研究的最重要的两项技术，经过SDS-PAGE之后，灵敏高效的蛋白染色成为后续蛋白质组学研究的先决条件(Choi et al.1996；Wang et al.2007a；Yasumitsuet al.2010b)。在蛋白分析和检测上，考染、银染和荧光染色是广泛使用在蛋白分析和检测上的三种染色方法(Patton，2000)。在这些方法中，银染是目前公认的除了放射性标记以外的最为灵敏的蛋白检测方法，可以在纳克级水平上检测蛋白(Yan et al.2000；Candiano et al.2004；Yasumitsu et al.2010b)。但是，银染通常会有相对低的重复性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛会对蛋白进行修饰，导致银染的质谱兼容性能普遍不佳(Candiano et al.2004；Lin et al.2008)。最近发展以来的荧光染料技术有很高的灵敏性和质谱兼容性(Patton，2000；Steinberg et al.2000；Candianoet al.2004)，但由于荧光染料价格昂贵，且极易淬灭，还需要高端的仪器设备和特殊的分析软件(Patton 2000；Steinberg et al.2000；Wang et al.2007a；Yasumitsu et al.2010a)，限制了该项技术在蛋白质组学领域的广泛应用。

因此，在蛋白质组学研究中，考马斯亮蓝染色法(CBB)仍然目前仍然最受欢迎。该法具有良好的重复性、很低的染色背景、良好的灵敏度以及优良的质谱兼容性(Candiano et al.2004；Wang etal.2007a)。传统的CBB染料包括G-250和R-250，通常只能检测到微克或几百纳克水平的蛋白(Choiet al.1996；Yasumitsu et al.2010b)。为了提高染色效率，人们最近报道了许多更加灵敏的CBB改进染色方法(Choi et al.1996；Patton 2000；Pink et al.2010；Yang et al.2010；Yasumitsu et al.2010a；Yasumitsu et al.2010b)。几年前，本申请发明人通过改进固定液和敏化液的配方，以及增加R-250浓度，也发明了一种改进的CBB R-250染色方法，能检测到10纳克的BSA条带，有较高的分辨率和很好的MS兼容性(Wang et al.2007a；Wang et al.2009；Wang et al.2010；Wang et al.2011)。但是，这种染色方法步骤繁琐，耗时较长，限制了其应用范围。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种考马斯亮蓝G250染色液，该染色液集固定液，敏化液和染色液为一体，其使用CBB G-250做染料，这种染料能彻底的在染色液里溶解，并且染出胶的背景比较轻；其采用磷酸代替了醋酸，提高了染色的灵敏度。

本发明的第二个目的在于提供一种利用上述考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，该方法除具有较好的重复性、很低的染色背景外，该检测方法快速灵敏，检测到的蛋白点数目比较多；有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；应用范围比较广泛，能广泛的用在哺乳动物和植物组织中。

本发明的最后一个目的在于提供上述利用考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术手段来实现的：一种考马斯亮蓝G250染色液，含有以下组分：质量体积浓度为0.1-0.2％的CBB G-250，质量体积浓度为5-15％的硫酸铵，体积百分含量为3-8％的磷酸，体积百分含量为20-40％的乙醇，体积百分含量为5-20％的甲醇。

优选的，本发明所述的CBB G-250的质量体积浓度为0.12-0.13％，所述的硫酸铵的质量体积浓度为8-12％，所述的磷酸的体积百分含量为4-6％，所述的乙醇的体积百分含量为20-30％，所述的甲醇的体积百分含量为10-15％。

最佳的，本发明所述的CBB G-250的质量体积浓度为0.125％，所述的硫酸铵的质量体积浓度为10％，所述的磷酸的体积百分含量为5％，所述的乙醇的体积百分含量为30％，所述的甲醇的体积百分含量为10％。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种利用上述考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，含有以下步骤：将SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝G250染色液中，进行染色，再将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，振荡脱色直到背景干净为止。

在上述染色方法中：

本发明所述的SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝染色液G250中前先置于ddH₂O(双蒸水)中振荡2-10min。

本发明利用上述考马斯亮蓝染色液G250进行染色的时间优选为3-24h。

本发明所述的脱色液优选为含有体积百分含量为20-40％的乙醇和体积百分含量为1-10％的乙酸。

本发明振荡脱色的时间为2-3h。

本发明所述的SDS-PAGE胶优选为单向胶，其含有质量百分含量优选为10-15％的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量优选为1-5％的聚丙烯酰胺浓缩胶；或所述的SDS-PAGE胶优选为双向胶，其含有质量百分含量优选为10-15％的聚丙烯酰胺分离胶。

本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：利用考马斯亮蓝染色液G250进行染色的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明染色液使用CBB G-250做染料，它能彻底的溶解，并且染出胶的背景比较轻；

(2)本发明染色液用磷酸代替了醋酸，提高了染色的灵敏度；

(3)使用本发明染色方法可以减少整个染色过程的时间，它把固定，敏化和染色放在一起进行，简化了染色步骤；

(4)使用本发明染色方法，检测到的蛋白点数目比较多：

(5)使用本发明染色方法有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；

(6)本发明染色方法应用范围比较广泛，能广泛的用在哺乳动物和植物组织中；

(7)本发明方法在蛋白质组学的研究中发挥着重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1a是实施例1中通过牛血清蛋白BSA检测几种常规CBB染色法和本发明染色法的灵敏度；

图1b是实施例1中通过牛血清蛋白BSA检测几种常规CBB染色法和本发明染色法的灵敏度；

图2是实施例2中不同的CBB染色后胶乳和木薯块根的2-DE图谱比较图，其中：从胶乳C-乳清里获得1200微克蛋白，上样到24cm胶上，每个至少做了3个重复，得到的凝胶通过CBR(A)，GAP(B)，GPP(C)，RAP(D)和RAM(E)染色或RAM脱色，通过GAP重新染(F)。从木薯中获得的1200微克蛋白，上样到24cm胶上，每个至少做了3个重复，得到的凝胶通过GRP(G)，GPP(I)或RAM(K)观察，然后脱干净，紧接着通过GAP重新染6个小时(H，J，K，箭头标的是做MS鉴定的点)；

图3是实施例2中通过MALDITOF/TOF MS鉴定出来的特殊蛋白点，其中蛋白点1被切除，用胰蛋白酶酶解通过MALDI-TOF/TOF分析，肽指纹图谱(PMF)光谱峰代表不同肽段的强度，序列下面划线的部分和非划线的部分分别代表匹配的和非匹配的肽段数，匹配的肽段数下面进一步做MALDI TOF-TOF MS/MS，并且注释了母离子光谱，使用Mascot software搜索NCBInr数据库鉴定出来的目标蛋白是来自于橡胶树的小橡胶粒子(SRPP)；

图4a是实施例2中人类癌细胞蛋白凝胶GAP染色后的2-DE图谱，其中使用BPP法提取人类癌细胞的蛋白，1200微克蛋白在24cm，pH 4-7的胶条上分离，并通过GAP染色3小时；在癌细胞(A)蛋白的双向电泳胶上检测到2680±112(n＝3)个蛋白点；

图4b是实施例2中小鼠肾脏蛋白凝胶GAP染色后的2-DE图谱，其中使用BPP法提取生长9天的小鼠肾脏的蛋白，1200微克蛋白在24cm，pH 4-7的胶条上分离，并通过GAP染色3小时；在小鼠肾脏(B)蛋白的双向电泳胶上检测到1950±65(n＝3)个蛋白点。

具体实施方式

实施例1

本实施提供的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0.125％的CBB G-250，质量体积浓度为10％的硫酸铵，体积百分含量为5％的磷酸，体积百分含量30％的乙醇和体积百分含量10％的甲醇，各溶液采用ddH₂O配制，其具体配制过程如下：

(1)将300mL乙醇，100mL甲醇和100mL ddH₂O混合在一起；

(2)称取1.25g CBB G-250，并且把它加入到(1)混合后的溶液中；

(3)将(2)中得到的溶液放在摇床上，设转速为150rpm，温度为37℃摇一个小时以上，保证CBBG-250完全溶解，然后放在室温备用，称此溶液为CBB-A液；

(4)称取100g硫酸铵，加入300mLddH₂O，待硫酸铵完全溶解；

(5)向(4)中得到的溶液中加入58.8mL体积百分含量为85％的磷酸，用ddH₂O定容到500mL，称此溶液为CBB-B液；

(6)使用前把500mL的CBB-A液和500mL的CBB-B液混合即可。

本实施提供的利用上述考马斯亮蓝染色液进行染色的方法，具体包括以下步骤：

(1)将SDS-PAGE胶置于ddH₂O中摇5分钟；

(2)将SDS-PAGE胶转移至上述染色液中，染色三个小时以上或者过夜；

(3)将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，震荡脱色2-3个小时，直到背景干净为止；其中脱色液包括体积百分含量为30％的乙醇和体积百分含量为5％的乙酸水溶液。

上述(3)中的SDS-PAGE胶指分离胶为质量百分含量为12.5％聚丙烯酰胺和浓缩胶为质量百分含量为4％聚丙烯酰胺(Laemmli 1970)。

以下通过牛血清蛋白(BSA)对GAP的灵敏度进行检测的，牛血清蛋白(BSA)被上样到8.3cm宽，7.3cm长和0.75mm厚的胶上，上样量分别为100ng，80ng，50ng，40ng，30ng，20ng，10ng，5ng，4ng，2ng，1ng，0.5ng和0.1ng。用CBR染色后如图1所示，66.2kD的目标蛋白条带的强度随着100到0.1ng逐渐减弱(图1a，A-D)，用CBR(图1a，B)和GPP(图1a，A)染色后，发现它们的灵敏度一样，都能检测到10-5ng的牛血清蛋白(BSA)。

其中GAP：本发明所述的考马斯亮蓝G-250染色法；

其中RAP：把GAP染色液中的CBB G-250换成了CBB R-250，其它成分不变；

改进的CBB染色法包括CBR，GPP和RAP染色方法，具体如下：

其中CBR来自(Wang et al.2007a)的染色方法，CBR的染色步骤为：

(1)将SDS-PAGE凝胶于固定液(10％乙酸、10％甲醇、40％无水乙醇)中固定40min；

(2)将凝胶转入敏化液(1％乙酸、10％硫酸铵)中敏化50min；

(3)敏化结束后，将SDS-PAGE凝胶用纯水或蒸馏水漂洗一下，转入染色液(0.125％CBB-R250、5％乙酸、45％无水乙醇)中染色过夜(至少6h以上)；

(4)染色完后，SDS-PAGE凝胶用纯水或蒸馏水漂洗一下，转入脱色液I(5％乙酸、40％无水乙醇)中脱色约30min；

(5)再转入脱色液II(30％乙酸、30％无水乙醇)中脱色约40min；

(6)将凝胶转入保存液(5％～7％乙酸)中长时间浸泡。

其中GPP来自(Pink et al.2010)的染色方法，该方法的染色步骤：

(1)将SDS-PAGE凝胶转入固定液(体积百分含量为30％乙醇和体积百分含量为2％磷酸)中固定40min；

(2)用纯水漂洗一下2-DE凝胶，转入染色液(5％硫酸铝，10％无水乙醇，0.02％CBB-G250和8％磷酸)中染色过夜；

(3)纯水漂洗(1)中凝胶后，转入脱色液(2％磷酸和10％无水乙醇)中脱色1h；

(4)转入保存液(5％～7％乙酸)中长时间浸泡，以脱净杂色。

RAM来自(Yasumitsu et al.2010a)的染色方法，该方法染色步骤为：

(1)凝胶在ddH₂O中漂洗三次，每次约5min；

(2)凝胶置于RAMA染液(0.05％CBB R250，10％乙酸，15％甲醇和3％硫酸铵)中染色约2-3h；

(3)用ddH₂O脱色三次，每次约30min。

其中上述硫酸铵，硫酸铝，考马斯亮蓝G-250和R250优选来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。

用GAP和RAP染色后，发现RAP和GAP的灵敏度明显要比CBR和GPP要高(图1a：C，D和图1b)，这与报道的CBR灵敏度能检测到10ng水平的BSA条带(Wang et al.2007a)一致。RAP能检测到5ng水平的BSA(图1a，C)，GAP的灵敏度稍微高一点，检测范围是4ng/BSA条带水平，达到0.2ng/mm²。值得注意的是，GAP在低丰度蛋白区域能染出很强的的条带，但是在高丰度区域，要比RAP(图1a：C和图1b)的灵敏度和对比度弱，可能是由于CBBG-250比R-250更适合于低丰度蛋白，这个结果表明，GAP比改进的CBB染色法(GPP，CBR和RAP)在纳克水平上检测蛋白的灵敏度更高。

另外，为了确定GAP染色过程中在体外造成的翻译后修饰，BSA(图1a，D)B1箭头标的位置被用来通过MALDI TOF MS和TOF/TOF MS/MS质谱(表1，B1)鉴定。CBB染色后发生翻译后修饰包括甲基化，磷酸化和糖基化，还有蛋白在谷氨酸或天冬氨酸上的甲基化(Sumpton and Bienvenut2009)。有报道介绍，在体外主要引起甲基化是由于在CBB染色过程中使用强酸，如三氯乙酸和磷酸(Yasumitsu et al.2010a；Yasumitsu et al.2010b)。本发明人的MS结果表明，GAP染色牛血清蛋白(BSA)条带能产生高质量的肽指纹(PMF)图和达到241鉴定得分(表1，B1)。有三个主要的母离子的光谱图927.3，1283.4和2044.5m/z被进一步通过TOF/TOF和肽碎片指纹图谱(PFF)分析，搜索分数依次是48，56和67(表1，B1)。在它们之中，BSA中的R.HPEYAVSVLLR.L序列1283.4m/z，众所周知是最频繁的甲基化序列(Sumpton and Bienvenut 2009；Yasumitsu et al.2010b)。比较主要的峰和有潜在甲基化的峰，结果显示，有潜在甲基化的峰是1297.7，低于检测极限。即使甲基化发生，它的峰不超过非甲基化峰的1％。因此，总结出来，GAP染色能诱导极少的蛋白样品在体外甲基化修饰，这可能是由于在染色液中用到了低浓度(体积百分含量为5％)的磷酸和磷酸代替了乙酸抑制了蛋白修饰的过程(Yasumitsu et al.2010b)。上述提到的这些结果表明，GAP染色法不仅有好的质谱兼容性，而且体外有很少的蛋白修饰，因而更适合于将来的比较蛋白质组学研究。

表1胶乳中C-乳清和BSA蛋白的MALDI TOF/TOF MS/MS鉴定结果

其中：

^a代表在图1a和图2中标出的蛋白条带或点。

^bNCBInr数据库中的登录号。

^c通过MALDI TOF MS鉴定的蛋白名称和通过TOF/TOF MS/MS鉴定的肽序列。

^d鉴定出蛋白的理论和实验分子量(kDa)及等电点(pI)。

^ePMF或PFF中匹配的肽段数(MP)和总的肽段数(TP).SC鉴定出蛋白的氨基酸序列覆盖率；-指没有鉴定出来的。

^fPMF和PFF NCBInr的搜索分数。

实施例2

(1)将300mL乙醇，100mL甲醇和100mL ddH₂O混合在一起；

(2)称取1.25g CBB G-250，并且把它加入到(1)混合后的溶液中；

(4)称取100g硫酸铵，加入300mLddH₂O，待硫酸铵完全溶解；

(6)使用前把500mL的CBB-A液和500mL的CBB-B液混合即可。

(1)将SDS-PAGE胶置于ddH₂O中摇5分钟；

以上(3)中采用的SDS-PAGE胶指的是质量百分含量为12.5％的聚丙烯酰胺((Laemmli 1970)双向胶。

以下通过2-DE胶系统的比较CBB染色方法，从中可以看出，本发明GAP方法可以具有更好的染色效果。

用BPP法(Wang et al.2007b)提取木薯块根，人癌细胞和小鼠肾脏中的蛋白，用改进的BPP方法提取橡胶树胶乳C-乳清中的蛋白(Wang et al.2010)。

其中，从木薯块根中提取蛋白过程如下：采用BPP法，每1g的木薯块根中加入3mL BPP蛋白提取液(100mM EDTA，100mM Tris(pH 8.0)，50mM硼砂，50mM维生素C，1％PVPP(w/v)，1％Triton X-100(v/v)，然后室温将漩涡混匀5分钟后，加入等体积的Tris-饱和酚(pH 8.0)，继续涡混振荡10min，4℃，12000rpm，离心15min之后将上层酚相转入另一离心管，向其中加入等体积蛋白提取液，涡混振荡5min，4℃，12000rpm离心15min，将上层酚相转入另一离心管中。向其中加入5倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h或过夜。沉淀后在4℃，15min，条件下离心，倒去上清，沉淀用-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤一次，再在4℃，12000rpm条件下离心15min，倒去上清，沉淀再用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤两次，每次洗涤后在4℃，12000rpm离心15min，将蛋白沉淀在室温风干，最后用裂解液在室温融解蛋白2小时以上。提取好的蛋白可以不用加热，直接上样。其它人癌细胞，小鼠肾脏和胶乳中的C-乳清提取蛋白的过程相似。

从木薯块根和C-乳清中提取出来的1200微克蛋白，用24cm长pH值4-7的线性IPG胶条(GEHealthcar)，在水化盘中水化18小时，接着使用聚焦仪(Hoefer IEF100)完成等电聚焦过程，完成后的的胶条第一次在平衡液(50mMTris-HCl，pH8.8，6M尿素，体积百分含量30％甘油，质量百分含量2％十二烷基磺酸钠(SDS)，质量百分含量为0.02％溴酚兰)中加入质量百分含量为1％的二硫苏糖醇(DTT)浸泡胶条15分钟，第二次向平衡液中加入质量百分含量为4％的碘乙酰胺浸泡胶条15分钟后，平衡结束后使用超纯水将胶条上残留的平衡缓冲液冲洗干净。将平衡后的胶条转移到第二向垂直凝胶(使用质量百分含量为12.5％的聚丙烯酰胺凝胶)的上端，用质量百分含量1％的琼脂糖将胶条密封，使用电泳仪(Hoefer)进行SDS-PAGE凝胶电泳，起始恒功率6W/胶电泳1h，之后调节恒功率8W/胶电泳6h至溴酚蓝指示剂到达凝胶底端。电泳完成后，进行后续的凝胶染色过程。

用CBR，RAM，RAP和GPP染C-乳清的2-DE胶后，发现CBR(图2，A)可以检测到1310个蛋白点。RAP和RAM与CBR比较，它们在2-DE上能检测到更多的蛋白点(RAP是1390个，RAM是1500个)，但是染色背景会增强(图2，D和E)。一般来说，CBB G-250染色能产生1600个高分辨率的蛋白点(图2，B和C)，比R250的蛋白点要更多(图2：A，D和E)。蛋白点(1780±90)最多的是用GAP重染C-乳清蛋白的2-DE胶((图2，F)，它首先通过RAM染色，然后用30％乙醇和5％乙酸彻底脱色后，进行GAP重染的。从木薯块根中分离的蛋白点，通过GPP染色的胶上最少有(1180±70)个，并且有很深的背景(图2，I)。GPP染色的胶彻底脱色后用GAP重染，有1650多个蛋白点被观察到(图2，J)。在木薯块根蛋白的2-DE中，GAP能多染出500多个蛋白点，有更好的优越性。GRP和RAM在木薯块根2-DE胶上能产生1350个蛋白点，但是这些胶被GAP重染后，额外的蛋白点产生了，分别产生1500和1600个蛋白点，说明GAP染色能染出更多的蛋白点。

为了进一步确定MS的兼容性，本申请发明人从胶乳C-乳清的2-DE上切取了GAP(图2，B)染色后的一些蛋白点，10个代表性的蛋白点通过MALDI TOF MS鉴定，并且进一步通过TOF/TOFMS/MS确定，结果见表1。来自全胶乳C-乳清的蛋白(点1)的质谱结果在(图3)中被显示出来，搜索结果揭示了这是小橡胶粒子蛋白(SRPP)(表1)。正如图3中看到的，这些与相匹配的肽段有很低的噪音背景，说明肽指纹图谱PMF和离子碎片谱图(PFF)的质量很高。

在鉴定的10个蛋白点中，每种蛋白都获得了较高的搜索分数，2个蛋白点(点2和3)被鉴定出来是hevein蛋白，2个蛋白点(点4和5)被鉴定出来是胶乳过敏原(表1)，另一些蛋白点被鉴定出来是小橡胶粒子(SRPP)。这些蛋白都是胶乳中C-乳清特有的蛋白，许多另一些胶乳中的蛋白也被明确的鉴定出来了(表1)。

为了确认GAP的应用范围，通过实例2中BPP法提取的人癌细胞和小鼠肾脏的蛋白，通过2-DE分离和GAP染色后，在胶上可以检测到有2650多个蛋白点，并且背景清晰(图4a，A)，因而检测到的蛋白点的数目与银染相接近了，这种方法检测到的蛋白点多。相应的，通过GPP染色，只能从人类癌细胞RT4的裂解产物中得到约2300个蛋白点(Pink et al.2010)。同样用GAP染从老鼠的肾脏中获得蛋白的2-DE胶，可以产生约2000个高分辨率的蛋白点，并且染色背景浅(图4b，B)。因此，GAP比另一些染色方法优越，能广泛用在哺乳动物和植物组织中，可以更好的用在将来的比较蛋白质组学研究。

总之，本发明申请人通过1-DE和2-DE，对不同CBB的染色方法的染色效果进行了详细比较，并在此基础上得到了本发明所述的GAP染色方法。本发明GAP的灵敏度很高，和其它一些CBB染色方法比较，能产生更背景清晰的蛋白，能广泛应用于哺乳动物和植物组织中。通过对GAP染色后的11个蛋白进行质谱鉴定，本申请发明人发现GAP不仅仅有很好的质谱兼容性，并且能减少体外的蛋白修饰，因而能作为一种更好的CBB染色方法用在将来的比较蛋白质组学研究中。

实施例3

本实施提供的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0.10％的CBB G-250，质量体积浓度为15％的硫酸铵，体积百分含量为3％的磷酸，体积百分含量40％的乙醇和体积百分含量5％的甲醇，各溶液采用ddH₂O配制，其具体配制过程如下：

(1)将400mL乙醇，50mL甲醇和100mL ddH₂O混合在一起；

(2)称取1.0g CBB G-250，并且把它加入到(1)混合后的溶液中；

(4)称取150g硫酸铵，加入300mLddH₂O，待硫酸铵完全溶解；

(5)向(4)中得到的溶液中加入35.3mL体积百分含量为85％的磷酸，用ddH₂O定容到500mL，称此溶液为CBB-B液；

(6)使用前把500mL的CBB-A液和500mL的CBB-B液混合即可。

(1)将SDS-PAGE胶置于ddH₂O中摇5分钟；

(2)将SDS-PAGE胶转移至上述染色液中，染色24过夜；

(3)将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，震荡脱色2-3个小时，直到背景干净为止；其中脱色液包括体积百分含量为20％的乙醇和体积百分含量为1％的乙酸水溶液。

其中SDS-PAGE胶可以为单向胶，其含有质量百分含量为10％的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量为5％的聚丙烯酰胺浓缩胶。

实施例4

本实施提供的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0.20％的CBB G-250，质量体积浓度为5％的硫酸铵，体积百分含量为8％的磷酸，体积百分含量20％的乙醇和体积百分含量20％的甲醇，各溶液采用ddH₂O配制，其具体配制过程如下：

(1)将200mL乙醇，200mL甲醇和100mL ddH₂O混合在一起；

(2)称取2.0g CBBG-250，并且把它加入到(1)混合后的溶液中；

(4)称取50g硫酸铵，加入300mLddH₂O，待硫酸铵完全溶解；

(5)向(4)中得到的溶液中加入94.1mL体积百分含量为85％的磷酸，用ddH₂O定容到500mL，称此溶液为CBB-B液；

(6)使用前把500mL的CBB-A液和500mL的CBB-B液混合即可。

(1)将SDS-PAGE胶置于ddH₂O中摇10分钟；

(2)将SDS-PAGE胶转移至上述染色液中，染色3小时以上；

(3)将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，震荡脱色2-3个小时，直到背景干净为止；其中脱色液包括体积百分含量为40％的乙醇和体积百分含量为10％的乙酸水溶液。

其中SDS-PAGE胶可以为单向胶，其含有质量百分含量为15％的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量为1％的聚丙烯酰胺浓缩胶。

实施例5

本实施提供的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0.13％的CBB G-250，质量体积浓度为8％的硫酸铵，体积百分含量为6％的磷酸，体积百分含量25％的乙醇和体积百分含量12％的甲醇，各溶液采用ddH₂O配制，其具体配制过程如下：

(1)将250mL乙醇，120mL甲醇和100mLddH₂O混合在一起；

(2)称取1.3g CBB G-250，并且把它加入到(1)混合后的溶液中；

(4)称取80g硫酸铵，加入300mLddH₂O，待硫酸铵完全溶解；

(5)向(4)中得到的溶液中加入70.6mL体积百分含量为85％的磷酸，用ddH₂O定容到500mL，称此溶液为CBB-B液；

(6)使用前把500mL的CBB-A液和500mL的CBB-B液混合即可。

(1)将SDS-PAGE胶置于ddH₂O中摇10分钟；

(2)将SDS-PAGE胶转移至上述染色液中，染色3小时以上；

其中SDS-PAGE胶可以为为双向胶，其含有质量百分含量为10％的聚丙烯酰胺分离胶。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

Claims

1.一种考马斯亮蓝G250染色液，其特征是含有以下组分：质量体积浓度为0.1-0.2％的CBBG-250，质量体积浓度为5-15％的硫酸铵，体积百分含量为3-8％的磷酸，体积百分含量为20-40％的乙醇，体积百分含量为5-20％的甲醇。

2.根据权利要求1所述的考马斯亮蓝G250染色液，其特征是：所述的CBB G-250的质量体积浓度为0.12-0.13％，所述的硫酸铵的质量体积浓度为8-12％，所述的磷酸的体积百分含量为4-6％，所述的乙醇的体积百分含量为20-30％，所述的甲醇的体积百分含量为10-15％。

3.根据权利要求1所述的考马斯亮蓝G250染色液，其特征是：所述的CBB G-250的质量体积浓度为0.125％，所述的硫酸铵的质量体积浓度为10％，所述的磷酸的体积百分含量为5％，所述的乙醇的体积百分含量为30％，所述的甲醇的体积百分含量为10％。

4.利用权利要求1-3任一项所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是含有以下步骤：将SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝染色液G250中，进行染色，再将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，振荡脱色直到背景干净为止。

5.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是：所述的SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝染色液G250前先置于ddH₂O中振荡2-10min。

6.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是：染色时间为3-24h。

7.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是：所述的脱色液含有体积百分含量为20-40％的乙醇和体积百分含量为1-10％的乙酸。

8.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是：振荡脱色的时间为2-3h。

9.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是：所述的SDS-PAGE胶为单向胶，其含有质量百分含量为10-15％的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量为1-5％的聚丙烯酰胺浓缩胶；或所述的SDS-PAGE胶为双向胶，其含有质量百分含量为10-15％的聚丙烯酰胺分离胶。

10.权利要求4所述的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。