CN101113984A - 小檗碱及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说是小檗碱及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。本发明还提供了应用小檗碱进行蛋白荧光凝胶检测的方法，包括步骤：将蛋白质样品电泳后的凝胶在固定液中固定，去离子水冲洗；染色，去离子水冲洗；检测。本发明具有敏感度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景好、线性关系好、可逆性好、兼容性好、使用安全、成本低等优点。

Description

小檗碱及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及蛋白质的一种新的荧光染料。

背景技术

在生命科学研究领域中，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术。尤其是近几年，随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的分离检测技术有了更高的要求。

蛋白质的检测方法有很多，包括浊度法、凯氏定氮法、吸光光度法、荧光光度法，以及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法。荧光光度法是目前研究最多、应用最广、操作较为简便、灵敏度高的检测方法。

小檗碱是一种异喹啉生物碱，分子式[C₂₀H₁₈NO₄]⁺，又称黄连素。其存在于小檗科的许多植物中。小檗碱从乙醚中可析出黄色针状晶体，熔点145℃。溶于水，难溶于苯、乙醚和氯仿。小檗碱对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌和弗氏、志贺氏痢疾杆菌均有抗菌作用，并有增强白血球吞噬作用。到目前为止，还没有将其用于在电泳后的蛋白质凝胶上荧光染色的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供小檗碱及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。

本发明所述的小檗碱衍生物是指以小檗碱阳离子为母核的盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐等。

小檗碱的母核为：

本研究利用独特的离子对技术对胶体上的蛋白质进行荧光染色，根植于多年的研究成果，采用相对安全、价廉的天然产物小檗碱作为荧光染料，开发高度适用于蛋白质组学研究，同时具有敏感度高、快速、安全价廉和质谱仪兼容性等优点的新型蛋白质检测技术。本发明的发明点主要为使用了小檗碱相关化合物做为染料进行蛋白质染色检测，同时利用了离子对技术进行染色，小檗碱的配对离子为SDS(十二烷基硫酸钠)。

下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定1-30min，弃固定液，然后用去离子水冲洗0.01-10min；优选的固定时间为5min，去离子水冲洗时间为3min，固定液可以是含有40％乙醇和10％乙酸的水溶液；

2)加入荧光染色液染色1-30min，用去离子水冲洗1-10min，其中所述染色液为含按重量体积比0.0001～0.01％的巴马汀或其衍生物及按体积比1-20％醋酸的水溶液；优选的染色的时间为10min，去离子水冲洗时间为0.5min，优选的巴马汀或其衍生物的浓度是0.0005％，醋酸浓度为2％；

3)检测，检测波长为250-370nm，优选为312nm。

本发明方法具有如下优点：

1)高敏感度：荧光染料比普通染料的灵敏度要高很多倍

2)操作简单迅速：操作步骤少，可在半个小时内完成；

3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

4)染色背景好：采用独特的离子对技术，即小檗碱和溶液中的SDS结合成配合物，减少对胶体背景的染色并产生比单纯使用小檗碱更强烈的荧光，确保染料对蛋白质的高度选择性和灵敏性；

5)线性关系好：能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；

6)可逆性好：容易脱色；

7)兼容性好：可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；

8)使用安全：采用毒性很低的天然荧光染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；

9)成本低。

附图说明

图1.不同染色方法灵敏度的比较，其中(A)为Sypro ruby染色法；(B)为Nile red染色法；(C)小檗碱蛋白质荧光染色法。其中，样品为SDS-6H标准蛋白(Sigma)；上样量为：(1)160；(2)80；(3)40；(4)20；(5)10；(6)5；(7)2.5；(8)1.2；(9)0.6；(10)0.3ng/mm²；

图2.小檗碱蛋白质荧光染色法在双向电泳胶上的应用，其中样品为E-coliBL21总蛋白；13厘米长，pH 4-7 IPG胶条；200ug/胶.

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1  不同染料的染色效果比较

本例中的蛋白质样品为SDS-6H标准蛋白(Sigma)。

小檗碱蛋白质荧光染色法：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定5min，弃固定液，所述固定液为体积百分含量40％乙醇和10％乙酸水溶液，然后用去离子水冲洗3min；

2)加入荧光染色液染色5min，用去离子水冲洗3min，染色液为含0.0005％(w/v)小檗碱染料及2％醋酸的水溶液，然后用去离子水冲洗0.5min；

3)检测。将染色后的凝胶置于透射仪上，312nm处透射，记录影像。

按照上述方法分别用小檗碱的盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能够得到类似于小檗碱的检测结果。

SDS-PAGE参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行。

Sypro Rube荧光染色法^[1]：

1)将蛋白质样品电泳后的凝胶置于250ml 20％乙醇，7％乙酸固定液中固定1小时，弃固定液；

2)加入250ml荧光染色工作液(按照试剂盒的说明)液染色3小时，用去离子水冲洗2次，每次10min；

3)检测。将染色后的凝胶置于透射仪上，312nm处透射，记录影像。

Nile Red荧光染色法^[2]：

1)将蛋白质样品用含有0.05％SDS(十二烷基硫酸钠)的电泳液(通常用0.1SDS)电泳后的凝胶置于250ml 0.0002％的Nile red染色液中染色5秒；

2)加入250ml去离子水冲洗10秒；

3)检测。将染色后的凝胶置于透射仪上，312nm处透射，记录影像，影像记录要快，荧光衰减很快，3分钟后就衰减到一半强度。

由图1可以看出本染色法较Nile red染色法有较高的灵敏度，与Sypro ruby染色法接近，能检测蛋白质约到4ng/mm²。

实施例2 E.coli BL21总蛋白双向电泳染色

取E.coli BL21菌液，12000rpm离心收集菌体，加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心30分钟，收集上清，即得E.coli总蛋白，将上述总蛋白经双向凝胶电泳后，按照实施例1的方式用小檗碱进行染色，结果如图2所示。由图2可以看出本染色法与SYPRO Red染色法的可视化的蛋白质斑点基本一致，且此方法更快速灵敏。

参考文献：

1.Thierry Rabilloud，Jean-Marc Strub，Sylvie Luche，Alain van Dorsselaer，JoelLunardi，A comparison between Sypro Ruby and ruthenium || tris(bathophenanthroline disulfonate)as fluorescent stains for protein detection in gels.Proteomics，2001，1，699-704

2.F.Javier Alba，Antonio Bermudez，Salvador Bartolome，Joan-Ramon Daban，Detection of five nanograms of protein by two minute Nile Red staining of unfixedSDS gels.BioTechniques，21，625-626.

Claims (9)

1.小檗碱及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的小檗碱衍生物为小檗碱的盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐。

3.一种蛋白质的荧光检测方法，其其包括步骤：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定1-30min，弃固定液，然后用去离子水冲洗0.01-10min；

2)加入荧光染色液染色1-30min，用去离子水冲洗1-10min，其中所述染色液为含按重量体积比0.0001～0.01％的小檗碱或其衍生物及按体积比1-20％醋酸的水溶液；

3)检测。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中蛋白质固定的时间为5min，然后用去离子水冲洗3min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中染色的时间为10min，然后用去离子水冲洗0.5min。

6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)染色液中小檗碱的浓度按重量体积比为0.0005％。

7.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中醋酸的浓度为2％。

8.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)检测波长为250-370nm。

9.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)检测波长为320nm。