CN102004099A - 一种电化学发光检测孔雀石绿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种高灵敏电化学发光检测领域，具体涉及一种电化学发光检测孔雀石绿的方法。将一定量的联吡啶钌配合物和孔雀石绿溶于磷酸或硼酸缓冲溶液中，用电化学方法在0-1.8V电位范围内对其进行扫描；分别用单核三联吡啶钌和双核三联吡啶钌检测孔雀石绿，单核钌所能达到的检测范围在1×10^-8～1×10^-5mol/L，最低检测限在1×10^-8mol/L，而双核钌所能达到的检测范围在1×10^-12～1×10^-8mol/L，最低检测限在1×10^-12mol/L。本发明能够更加有效的检测孔雀石绿，检测限更低，检测线性范围更宽，灵敏度高，重现性好，测试可在瞬间完成。

Description

一种电化学发光检测孔雀石绿的方法

技术领域

本发明属于一种高灵敏电化学发光检测领域，具体涉及一种电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法。

技术背景

孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂。孔雀石绿可致癌，很多国家已经禁用。孔雀石绿价格低廉，治疗鱼病效果好，尤其是对治疗水霉病和小瓜虫病有特效，而在其病防领域没有合适的替代药物出现，因此，仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用，也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间等，加上使用者对孔雀石绿的危害认识不足，所以导致孔雀石绿禁而不止。研究表明，孔雀石绿的代谢物无色孔雀石绿在鱼体内存留的时间更长。因此，开发一种简单、高效的孔雀石绿(无色孔雀石绿)的检测方法具有十分重要的意义。

目前孔雀石绿(无色孔雀石绿)的检测方法主要以理化检测法和免疫学检测法为主(刘海新，张农，钱卓真，福建水产，2007(1)，42～45)。理化检测法包括以下几种：高效液相色谱法(HPLC)可以检测生物体内及其他复杂基质中的孔雀石绿和无色孔雀石绿(如饲料原料、化工原料等)，此方法的特点是灵敏度较高。高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS-MS)是近年来发展起来的新的检测技术，该方法兼具定性功能、灵敏度高，但仪器价格昂贵。还有薄层色谱法(侯云龙，中国刑警学院，1997(4)，19～20)，普通分光光度法(Safarik I.，Kova M.，Water Research，2000，36，196～200)等。薄层色谱法虽然具有简便快速的特点，但是不能同时检测孔雀石绿的代谢物无色孔雀石绿。分光光度法：普通分光光度法检测限较高，灵敏度较低，准确性较差，也不能用于代谢物无色孔雀石绿的检测，而且仅仅局限于水样的检测，尚未见该方法在复杂样品基质中的应用，仅可用于孔雀石绿原料药等的测定。免疫学检测法是指酶联免疫法(ELISA)，可分为：间接竞争抑制法、抗体/抗原包被直接竞争法和夹心法。采用酶联免疫试剂盒检测水产品中孔雀石绿的特点是：检测速度快，2～3小时就可检测一批样品；灵敏度高，该方法特别适合大批量样品的筛选。虽然ELISA法的抗原和抗体结合有较强的选择性，但水产品的种类繁多，基质复杂，检测结果的假阳性几率高。因此，用该方法检出的阳性样还需用高压液相色谱法或液相色谱质谱联用法进行定量和确证。

三联吡啶钌Ru(bpy)₃ ²⁺电化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)具有原位响应、检测灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，在药物分析、氨基酸分析、DNA探针分析、酶生物传感器领域得到了广泛应用。但目前还没有任何将电化学发光用于孔雀石绿(无色孔雀石绿)检测的相关报道。我们采用的电化学发光法检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)能达到更低的检测限和更宽的检测范围，操作比较简单，检测速度快。

发明内容

本发明的目的是针对现有的孔雀石绿检测方法，提出一种全新的检测限更低、检测线性范围更宽、灵敏度更高的电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法。

本发明的原理是：本发明使用联吡啶钌类化合物作为发光物质，孔雀石绿(无色孔雀石绿)作为共反应物之一，同时也是被检测物。将它们分别溶于磷酸或硼酸缓冲溶液中，用电化学方法在0-1.8V电位范围内对其进行扫描；同时利用光检测器采集产生的光信号，经数据处理得到检测结果。由于联吡啶钌类化合物具有很高的发光效率，即使被测物孔雀石绿(无色孔雀石绿)的浓度很低，该方法仍可检测到明显电化学发光响应，并且孔雀石绿(无色孔雀石绿)加入前后体系电化学发光强度的变化与体系中孔雀石绿(无色孔雀石绿)浓度的对数值呈现良好的线性关系，通过计算可以确定体系中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的含量。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法，步骤如下：

(1)根据孔雀石绿(无色孔雀石绿)样品浓度，将10^-7～10^-1mol/L的联吡啶钌以及待测的孔雀石绿(无色孔雀石绿)样品分别加入到pH值为3-11的0.1M的磷酸盐或硼酸盐缓冲溶液中；

(2)在任意一款电化学工作站上，对步骤(1)配置的溶液进行扫描；扫描电位范围0-1.8V；

(3)所述的联吡啶钌包括单核三联吡啶钌、以及通过不同长度碳链连接的双核三联吡啶钌，其代表性结构式如下：

三联吡啶钌

双核三联吡啶钌

该方法适用于检测所有含有孔雀石绿的物质，同样适用于检测孔雀石绿的代谢产物-无色孔雀石绿。检测可使用任意一款电化学工作站和/或发光检测器。单核三联吡啶钌所能达到的检测范围在1×10^-8～1×10^-5mol/L，最低检测限在1×10^-8mol/L，而双核三联吡啶钌所能达到的检测范围在1×10^-12～1×10^-8mol/L，最低检测限在1×10^-12mol/L。

本发明的有益效果是：能够更加有效的检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)，检测限更低，检测线性范围更宽，灵敏度高，重现性好，测试可在瞬间完成，适用于检测所有含有孔雀石绿(无色孔雀石绿)的物质，以及所有的电化学检测装置。

附图说明

图1是三联吡啶钌-孔雀石绿电化学发光体系测定孔雀石绿的检测限以及它的线性范围。

其中横坐标是孔雀石绿浓度的对数，纵坐标是加入孔雀石绿后的光强减掉没加孔雀石绿前的光强，即混合溶液的ECL减掉三联吡啶钌空白的ECL所得的差值。检测线性范围在1×10^-8～1×10^-5mol/L，最低检测限为1×10^-8mol/L，线性相关系数为0.99917。

图2是双核钌(n＝6)-孔雀石绿电化学发光体系测定孔雀石绿的检测限和它的线性范围。

其中横坐标是孔雀石绿浓度的对数，纵坐标是加入孔雀石绿后的光强减掉加入孔雀石绿前的光强，即混合溶液的ECL减掉双核钌(n＝6)空白的ECL所得的差值。检测范围在1×10^-12～1×10^-8mol/L，最低检测限为1×10^-12mol/L，线性相关系数为0.99739。

图3是三联吡啶钌-无色孔雀石绿电化学发光体系测定无色孔雀石绿的检测限以及它的线性范围。

其中横坐标是无色孔雀石绿浓度的对数，纵坐标是加入无色孔雀石绿后的光强减掉没加无色孔雀石绿前的光强，即混合溶液的ECL减掉三联吡啶钌空白的ECL所得的差值。

图4是双核钌(n＝6)-无色孔雀石绿电化学发光体系测定无色孔雀石绿的检测限和它的线性范围。

其中横坐标是无色孔雀石绿浓度的对数，纵坐标是加入无色孔雀石绿后的光强减掉加入无色孔雀石绿前的光强，即混合溶液的ECL减掉双核钌(n＝6)空白的ECL所得的差值。

图5是双核钌(n＝8)-孔雀石绿电化学发光体系测定孔雀石绿的检测限和它的线性范围。

其中横坐标是孔雀石绿的浓度的对数，纵坐标是加入孔雀石绿后的光强减掉加入孔雀石绿前的光强，即混合溶液的ECL减掉双核钌(n＝8)空白的ECL所得的差值。

图6是双核钌(n＝12)-孔雀石绿电化学发光体系测定孔雀石绿的检测限和它的线性范围。

其中横坐标是孔雀石绿的浓度的对数，纵坐标是加入孔雀石绿后的光强减掉加入孔雀石绿前的光强，即混合溶液的ECL减掉双核钌(n＝12)空白的ECL所得的差值。

具体实施方式

实施例1

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置三联吡啶钌的浓度为10^-3mol/L的溶液，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，光电倍增管采用二级放大。所用工作电极为Au电极，不加孔雀石绿检测溶液的发光信号，所测得的电化学发光强度为70333。分别加入不同浓度的孔雀石绿，使得混合后的孔雀石绿浓度分别为1×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、5×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L等，所测得的电化学发光强度分别为75867、80833、84633、86623、90167、92267。

实施例2

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置双核联吡啶钌(n＝6)的浓度为0.4×10^-3mol/L的溶液，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，光电倍增管采用一级放大。所用工作电极为Au电极，不加孔雀石绿检测溶液的发光信号，所测得的电化学发光强度为893000。分别加入不同浓度的孔雀石绿，使得混合后的孔雀石绿浓度分别为1×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、1×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L等，所测得的电化学发光强度分别为1.45×10⁶、1.59×10⁶、1.73×10⁶、1.85×10⁶、1.95×10⁶。

实施例3

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置三联吡啶钌的浓度为10^-3mol/L的溶液，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，光电倍增管采用二级放大。所用工作电极为Au电极，不加无色孔雀石绿检测溶液的发光信号，所测得的电化学发光强度为85580。分别加入不同浓度的无色孔雀石绿，使得混合后的无色孔雀石绿浓度分别为1×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、5×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L等，所测得的电化学发光强度分别为88700、92820、95000、97375、102050。

实施例4

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置双核联吡啶钌(n＝6)的浓度为0.4×10^-3mol/L的溶液，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，光电倍增管采用一级放大。所用工作电极为Au电极，不加无色孔雀石绿检测溶液的发光信号，所测得的电化学发光强度为2027250。分别加入不同浓度的无色孔雀石绿，使得混合后的无色孔雀石绿浓度分别为1×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、1×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L等，所测得的电化学发光强度分别为2.44×10⁶、2.55×10⁶、2.63×10⁶、2.74×10⁶、2.87×10⁶。

实施例5

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置双核联吡啶钌(n＝8)的浓度为0.4×10^-3mol/L的溶液，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，扫描速度100mV/s，光电倍增管采用二级放大。所用工作电极为Au电极，不加孔雀石绿检测溶液的发光信号，所测得的电化学发光强度为151600。

实施例6

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置双核联吡啶钌(n＝8)的浓度为0.4×10^-3mol/L的溶液，分别加入不同浓度的孔雀石绿，使得混合后的孔雀石绿浓度分别为1×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、1×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L等，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，扫描速度100mV/s，光电倍增管采用二级放大。所用工作电极为Au电极，所测得的电化学发光强度分别为162625、174300、185425、195825、206925。

实施例7

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置双核联吡啶钌(n＝12)的浓度为0.4×10^-3mol/L的溶液，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，扫描速度100mV/s，光电倍增管采用二级放大。所用工作电极为Au电极，不加孔雀石绿检测溶液的发光信号，所测得的电化学发光强度为259525。

实施例8

使用MPI-B型电化学发光分析仪，用pH＝10的0.1M硼酸盐缓冲液配置双核联吡啶钌(n＝12)的浓度为0.4×10^-3mol/L的溶液，分别加入不同浓度的孔雀石绿，使得混合后的孔雀石绿浓度分别为1×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、1×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L等，设定光电倍增管的高压为900V，扫描电压在0-1.8V，扫描速度100mV/s，光电倍增管采用二级放大。所用工作电极为Au电极，所测得的电化学发光强度分别为280500、302425、323500、343075、364150。

Claims (4)

1.一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，该方法步骤如下：

(1)根据孔雀石绿样品浓度，将10^-7～10^-1mol/L的联吡啶钌和待测的孔雀石绿样品分别加入到pH值为3-11的0.1M磷酸盐或硼酸盐缓冲溶液中；

(2)在电化学工作站上，对步骤(1)配置的溶液进行扫描；扫描电位范围0-1.8V；

(3)用光检测器采集电化学工作站扫描产生的光信号，经数据处理后得到样品中孔雀石绿的含量。

2.根据权利要求1所述的一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，该方法适用于检测所有含有孔雀石绿的物质，以及孔雀石绿的代谢产物。

3.根据权利要求1所述的一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，所述的电化学工作站为任意一款电化学工作站和/或发光检测器。

4.根据权利要求1所述的一种电化学发光检测孔雀石绿的方法，其特征在于，所述的联吡啶钌包括单核三联吡啶钌、以及通过不同长度碳链连接的双核三联吡啶钌，其代表性结构式如下：

三联吡啶钌

双核三联吡啶钌

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