CN101393211B - 一种脱氧雪腐镰刀烯醇的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

一种脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析LICLIA技术领域。包被有DON-BSA的发光微粒加入微孔板，顺序加入DON标准或样品、兔抗DON抗体、生物素化羊抗兔抗体避光反应，再加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。发光微粒上的DON-BSA与DON竞争连接到DON抗体，再与生物素化羊抗兔抗体以及包被链霉亲和素的感光微粒形成复合体，在光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，光信号强度与样品中DON浓度成反比，对照标准曲线测得样品中DON含量。本发明用于饲料、玉米、谷物及其制品中DON含量的检测，试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。

Description

一种脱氧雪腐镰刀烯醇的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法

技术领域

一种脱氧雪腐镰刀烯醇的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析(LICLIA)技术领域，用于对饲料、玉米、谷物及其制品中DON含量的检测。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由某些镰刀菌产生。DON广泛存在小麦，大麦，玉米等农作物中。目前，世界范围内DON污染谷物居各种生物毒素之首，呈较严重的状况。我国2006-2007年饲料及原料霉菌毒素污染调查报告显示：在被检全部样品中呕吐毒素检出率为99.1％，超标率53.5％。居被检测的六种毒素之首。

霉菌毒素中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致畸和致突变等。1998年，国际癌症研究机构公布的评价报告中，DON被列为三类致癌物。DON被怀疑可能与食管癌疾病的发生有着紧密的联系。因此为了保障人们的健康，开展食品中DON的卫生检测研究是很有必要的。

DON污染谷物主要造成健康危害和经济损失。各国纷纷制定谷物及其制品中DON的限量标准，其中欧盟等地区国家对DON的限量较为严格。我国小麦、玉米中DON的限量为1000μg/kg。

DON检测技术主要分为两类：理化检测法和免疫检测法。理化检测法包括薄层色谱法(TLC)，气相相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)，以及GC或HPLC与质谱仪(MS)，电子捕获检测器(EDC)，紫外检测器(UV)等联合检测法。TLC最早用于DON检测。最低检出限为20～300ng/g。由于TLC检测法重复性差、缺乏严格的灵敏度，因此一般只用于定性或者半定量检测。GC法最低检出限可达5ng/g，检测前样品需要衍生化。DON含有三个羟基能够形成较强的氢键，在检测前需要对样品进行衍生化，使得衍生化产物具有挥发性，然后才可以进行GC检测法。另外GC法检测变异系数大。HPLC虽然解决了GC的衍生化问题，但它和GC法同样存在着需要贵重仪器，操作繁琐，对待检样品预处理要求高，使用多种毒性有机溶剂，检测成本高等缺点。免疫检测法主要为酶联免疫检测法(ELISA)，最低检出限可达0.3～1ng/g。尽管如此，ELISA存在标记酶分子较大，活性易受环境因素的影响从而降低检测的灵敏度和精密度。

光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。LICLIA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒的表面包被着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。

LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测DON的试剂盒及其检测方法，用于对饲料、玉米、谷物及其制品中DON含量的检测。

本发明的技术方案：一种脱氧雪腐镰刀烯醇(DON)的光激化学发光免疫分析试剂盒，由白色不透明微孔板(1)，DON标准(2)，连接DON-BSA人工抗原的发光微粒(3)，兔抗DON的抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)和包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。

连接DON-BSA人工抗原的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1％Tween-20，0.05mg DON-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时，加入10μL 0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接DON-BSA的发光微粒，稀释后备用。

DON标准(2)，从DON纯品中稀释得到，稀释液为0.01mmol/L、pH7.4的PBS，DON浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL。

一种用所述的试剂盒检测DON的方法，取包被有DON-BSA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入DON标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗DON抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入DON标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的DON含量。

所述的检测DON的方法，操作为：取20μL包被有DON-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的DON标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗DON抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的DON含量。

所述的检测DON的方法，其中的样品处理，玉米、谷物样品及其制品的处理：将玉米、谷物样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL，提取液为蒸馏水，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用检测；啤酒样品处理：直接取样检测或者用蒸馏水按比例稀释备用检测。

本发明的有益效果：本发明用于饲料、玉米、谷物及其制品中DON含量的检测，试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。

附图说明

图1：检测DON的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、DON标准，3、连接DON-BSA人工抗原的发光微粒，4、兔抗DON的抗体冻干品，5、生物素化羊抗兔抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。

图2：DON-LICLIA反应示意图。

图3：DON-LICLIA标准曲线图。

具体实施方案

实施例1  制备试剂盒和检测玉米样品

发光微粒、包被有链霉亲和素的感光微粒购于博阳生物科技(上海)有限公司。

包被有DON-BSA人工抗原的发光微粒制备：

在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL 1％Tween-20，0.05mg DON-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时。加入10μL0.3M pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接DON-BSA的发光微粒，稀释后备用。

标准DON试剂的配制：(0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL)，从DON纯品中稀释得到，稀释液为PBS(0.01mmol/L，pH7.4)。

试剂盒的组成：

(1)、白色不透明微孔板(12条×8孔，可以拆分为单孔)。

(2)、1×包被有DON-BSA人工抗原的发光微粒：2mL。

(3)、6×DON标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，0.1，1，10，100，500ng/mL。

(4)、1×兔抗DON抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(5)、1×生物素化羊抗兔抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(6)、1×包被有链霉亲和素的感光微粒：20mL。

测定时注意事项

1.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。

2.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。

具体检测步骤如下：

样品处理：将玉米样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL蒸馏水。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。

取20μL包被有DON-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL、DON标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗DON抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的DON含量。结果见表1，由标准曲线求得该例样品的溶液所含DON浓度为11.2ng/mL。

表1

实施例2  小麦样品测定

试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测小麦样品。

具体检测步骤如下：

小麦样品处理：将小麦样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL蒸馏水。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。

取20μL包被有DON-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的DON标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗DON抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的DON含量。结果见表2，由标准曲线求得该例样品的溶液所含DON浓度为1.71ng/ml。

表2

实施例3  啤酒样品测定

试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测啤酒样品。

具体检测步骤如下：

啤酒样品处理：直接提取啤酒样品或者用蒸馏水5倍稀释。

取20μL包被有DON-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的DON标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗DON抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的DON含量。结果见表3，由标准曲线求得该例样品的溶液所含DON浓度为1.08ng/ml。

表3

Claims (6)

1.一种脱氧雪腐镰刀烯醇DON的光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，脱氧雪腐镰刀烯醇标准(2)，连接DON-BSA人工抗原的发光微粒(3)，兔抗DON的抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)和包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是连接DON-BSA人工抗原的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1％的Tween-20，0.05mg DON-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH 6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL 0.3M、pH 5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接DON-BSA的发光微粒，稀释后备用。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是脱氧雪腐镰刀烯醇标准(2)，从脱氧雪腐镰刀烯醇纯品中稀释得到，稀释液为0.01mmol/L、pH 7.4的PBS，脱氧雪腐镰刀烯醇浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL。

4.一种用权利要求1所述的试剂盒检测脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征是取包被有DON-BSA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入脱氧雪腐镰刀烯醇标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗DON抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入脱氧雪腐镰刀烯醇标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的脱氧雪腐镰刀烯醇含量。

5.根据权利要求4所述的检测脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征是操作为：取20μL包被有DON-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的脱氧雪腐镰刀烯醇标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL兔抗DON抗体；继续加入20μL生物素化羊抗兔抗体，37℃孵育15分钟；加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的脱氧雪腐镰刀烯醇含量。

6.根据权利要求4所述的检测脱氧雪腐镰刀烯醇的方法，其特征是样品处理，玉米样品及其制品的处理：将玉米样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL，提取液为蒸馏水，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用1mL蒸馏水或去离子水进行稀释，备用检测；啤酒样品处理：直接取样检测或者用蒸馏水按比例稀释备用检测。

Images