CN101398432B - 玉米赤霉烯酮的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

玉米赤霉烯酮(ZEN)的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，属光激化学发光免疫分析技术领域。包被ZEN-BSA发光微粒加入微孔板，顺序加入ZEN标准或样品、ZEN单克隆抗体和生物素化羊抗鼠抗体反应，避光加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。包被在发光微粒上ZEN-BSA与标准或样品中ZEN竞争连接到ZEN抗体，与生物素化羊抗鼠抗体及包被链霉亲和素的感光微粒形成复合体，在光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测，光信号强度与样品中ZEN浓度成反比，对照标准曲线确定被测样品中ZEN含量。本发明用于饲料，谷物及其制品中ZEN含量检测。提供的检测试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。

Description

玉米赤霉烯酮的光激化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法

技术领域

一种检测玉米赤霉烯酮(ZEN)的试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析(LICLIA)技术领域，用于对谷物中ZEN含量的检测。

背景技术

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种雌激素真菌毒素，由禾谷镰刀菌(F.graminearum)、三线镰刀菌(F.tricinetum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、黄色镰刀菌(F.culmorum)、串珠镰刀菌(F.oeniliforme)、木贼镰刀菌(F.eguiseti)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、雪腐镰刀菌(F.nivale)等多种菌种代谢产生。ZEN其主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高粱、大米中也有一定程度的分布，其主要污染小麦、大麦、燕麦、小米、芝麻、干草和青贮饲料等。ZEN具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素中毒症，主要症状有阴道和乳腺肿胀、子宫肿大、外翻、导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来经济损失；ZEN可直接通过污染的谷类等作物进入人和动物体内，亦可通过被污染的肉、奶等动物性食品进入人体，它引起人中毒的症状主要出现无力、头痛、头晕、呕吐、腹泻和中枢神经系统的紊乱。因此为了保障人们的健康，开展食品中ZEN的卫生检测研究是很有必要的。

欧盟委员会规则856/2005号规定了谷物食品和谷物中ZEN的最大限量为20-100μg/kg，于2006年7月1日生效。目前也有许多国家制定了ZEN的限量标准，奥地利规定小麦、裸麦、硬质小麦中不得超过60μg/kg，巴西、法国、罗马尼亚、俄罗斯、乌拉圭等国也制定了限量标准。修订的《粮食卫生标准》规定小麦、玉米中ZEN的限量为60μg/kg。

我国ZEN污染较重地区主要集中在东北冷湿储粮生态区和华东热湿储粮生态区。谷物在耕作、收获、储藏期间，若湿度较高，温度适宜25-28℃，镰刀菌可不断增殖，而且在较低温度下12℃左右或温度高低变化的情况下，ZEN毒素都可产生。

目前ZEN的检测方法主要有：色谱技术和免疫分析技术。色谱技术(HPLC、GC-MS、LC-MS)由于费时，花费多，在实际应用中受到一定限制，通常作为确定性的定量检验方法；免疫分析技术(ELISA)是常用的现场抽样快速筛选检验方法。国外的酶免试剂盒有德国R-Biopharm(检测范围50-4050ppt)、美国Neogen(检测范围25-600ppb)、Beacon(检测范围20-1000ppb)等公司生产的ZEN-ELISA检测试剂盒。但由于进口试剂盒价格昂贵，在一定程度上限制了它的使用范围。国内有研制的ZEN-ELISA试剂盒，其最低检出浓度为1μg/L(ppb)，标准曲线的线性范围为1-200μg/L。检测的灵敏度和试剂的稳定性不够，所以需要建立高灵敏的ZEN的检测。

光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。LICLIA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒的表面包被着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。

LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测ZEN的试剂盒及其检测方法，用于对谷物中ZEN含量的检测。

本发明的技术方案：一种检测玉米赤霉烯酮(ZEN)的光激化学发光免疫分析试剂盒，由白色不透明微孔板(1)，ZEN标准(2)，连接ZEN-BSA的发光微粒(3)，ZEN的单克隆抗体冻干品(4)，生物素化羊抗鼠冻干品(5)，包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。

连接ZEN-BSA的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1％的Tween-20，0.05mg ZEN-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL 0.3M pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接ZEN-BSA的发光微粒，稀释后备用。

ZEN标准(2)，共6瓶，ZEN浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，从ZEN纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶PBS体积比1∶9。

用所述的试剂盒检测ZEN的方法，取包被有ZEN-BSA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入ZEN标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入ZEN单克隆抗体、生物素化羊抗鼠抗体进行标记免疫反应；接着加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应后检测光信号，以加入ZEN标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的ZEN含量。

操作为：取20μL包被有ZEN-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的ZEN标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL ZEN单克隆抗体；继续加入20μL生物素化羊抗鼠抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育暗处15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，以加入ZEN标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的ZEN含量。

所述的样品处理，谷物样品处理：将样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL，提取液为甲醇∶PBS体积比7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用7mL PBS进行稀释，备用。

本发明的有益效果：该检测试剂盒结构简单，操作简便、廉价、检测时间短、灵敏度高。

附图说明

图1：检测ZEN的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、ZEN标准，3、连接ZEN-BSA的发光微粒，4、ZEN的抗体冻干品，5、生物素化羊抗鼠抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。

图2：ZEN-LICLIA反应示意图。

图3：ZEN-LICLIA标准曲线图。

具体实施方案

实施例1：制备试剂盒和检测玉米样品

发光微粒、包被有链霉亲和素的感光微粒购于博阳生物科技(上海)有限公司。

包被发光微粒ZEN-BSA人工抗原的制备：

在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL 1％Tween-20，0.05mg ZEN-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时。加入10μL 0.3M pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接ZEN-BSA的发光微粒，稀释后备用。

试剂的配制：

ZEN标准，共6瓶，浓度分别为：(0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL)，从ZEN纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶PBS体积比1∶9。

实验室应自备的试剂：

甲醇；蒸馏水或去离子水。

试剂盒的组成：

(1)、白色不透明微孔板(12条×8孔，可以拆分为单孔)。

(2)、1×包被有ZEN-BSA人工抗原的发光微粒：2mL。

(3)、6×ZEN标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，0.1，1，10，50，100ng/mL。

(4)、1×ZEN抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(5)、1×生物素化羊抗鼠抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。

(6)、1×包被有链霉亲和素的感光微粒：20mL。

测定时注意事项

1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、在所有恒温孵育过程中避免光线照射。

具体检测步骤如下：

样品处理：玉米样品处理：将玉米样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL，提取液为甲醇∶PBS＝7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用7mL PBS进行稀释，备用。

取20μL包被有ZEN-BSA发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL的ZEN标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μL ZEN单克隆抗体；继续加入20μL生物素化羊抗鼠抗体，37℃孵育15分钟；暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒37℃孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的ZEN含量。结果见表1，由标准曲线求得该例样品所含ZEN浓度为3.15ng/mL。

表1

Claims (2)

1.一种检测玉米赤霉烯酮(ZEN)的光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，ZEN标准(2)，连接ZEN-BSA的发光微粒(3)，ZEN的单克隆抗体冻干品(4)，生物素化羊抗鼠冻干品(5)，包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成；

连接ZEN-BSA的发光微粒(3)的制备：在离心管中加入1mg发光微粒，加入12.5μL质量浓度1％的Tween-20，0.05mg ZEN-BSA人工抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL 0.3M pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐CMO溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接ZEN-BSA的发光微粒，稀释后备用；

ZEN标准(2)，共6瓶，ZEN浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，从ZEN纯品中稀释得到，稀释液为甲醇：PBS体积比1∶9。

2.一种用权利要求1所述的试剂盒检测ZEN的方法，其特征是取20μL包被有ZEN-BSA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μL ZEN标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入20μL ZEN单克隆抗体、20μL生物素化羊抗鼠抗体，37℃孵育15分钟进行标记免疫反应；接着暗处加175μL包被有链霉亲和素的感光微粒，37℃孵育暗处15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，以加入ZEN标准的检测数据绘制标准曲线，以加入被测样品的检测数据从标准曲线计算样品中的ZEN含量；

所述样品处理，谷物样品处理：将样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液25mL，提取液为甲醇∶PBS体积比7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1mL滤液用7mL PBS进行稀释，备用。

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