JPH0614046B2 - 生物学的流体の螢光イムノアツセイ用基材 - Google Patents
生物学的流体の螢光イムノアツセイ用基材Info
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- JPH0614046B2 JPH0614046B2 JP59009929A JP992984A JPH0614046B2 JP H0614046 B2 JPH0614046 B2 JP H0614046B2 JP 59009929 A JP59009929 A JP 59009929A JP 992984 A JP992984 A JP 992984A JP H0614046 B2 JPH0614046 B2 JP H0614046B2
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 本発明は生物学的流体の螢光イムノアッセイに関する。
より詳しくは、本発明は特異的蛋白質およびその他の生
物学的物体（例、ＤＮＡ）と結合することのできる螢光
イムノアッセイ用基材に関する。この基材は螢光イムノ
アッセイ（ＦＩＡ）の特異性および感度を高め、従っ
て、特異的抗原および抗体に随伴する病気の診断におい
て有用である。本発明は、愛玩動物、実験室用動物およ
び家畜を冒す病気に対する獣医学的アッセイ並びにヒト
における病気および病態のアッセイにおいて有用であ
る。
より詳しくは、本発明は特異的蛋白質およびその他の生
物学的物体（例、ＤＮＡ）と結合することのできる螢光
イムノアッセイ用基材に関する。この基材は螢光イムノ
アッセイ（ＦＩＡ）の特異性および感度を高め、従っ
て、特異的抗原および抗体に随伴する病気の診断におい
て有用である。本発明は、愛玩動物、実験室用動物およ
び家畜を冒す病気に対する獣医学的アッセイ並びにヒト
における病気および病態のアッセイにおいて有用であ
る。
螢光アッセイは複雑な混合物における少量の物質を検出
するための強力な技術である。特に、それを認識する少
量の抗原および抗体を検出しなければならない血液のよ
うな体液の螢光イムノアッセイ（ＦＩＡ）において有用
である。
するための強力な技術である。特に、それを認識する少
量の抗原および抗体を検出しなければならない血液のよ
うな体液の螢光イムノアッセイ（ＦＩＡ）において有用
である。
ＦＩＡはその病気の特徴的な特別の抗原又は抗体に対し
て特異的である病気の診断に有用である。しかしなが
ら、信頼性のある診断のためには、検出すべき物質がし
ばしば分析される流体中に極めて少量存在するために、
特異的であるのみならず、又感度が高くなければならな
い。
て特異的である病気の診断に有用である。しかしなが
ら、信頼性のある診断のためには、検出すべき物質がし
ばしば分析される流体中に極めて少量存在するために、
特異的であるのみならず、又感度が高くなければならな
い。
ＦＩＡの感度を高める従来の試みの中には選択的に蛋白
質と結合する基材の開発或いは使用が含まれる。これら
の基材は抗原抗体間の免疫反応がより容易に観察される
ように固体表面に固定することができる。
質と結合する基材の開発或いは使用が含まれる。これら
の基材は抗原抗体間の免疫反応がより容易に観察される
ように固体表面に固定することができる。
しかしながら、これらの基材は、一般に、強く蛋白質と
結合しないポリスチレン或いはポリプロピレンのような
重合体よりなり、従って、複雑な生物学的流体から微量
の蛋白質免疫原を選択する際には、使用上限度がある。
有用な診断アッセイには特別の抗体或いは抗原を効率的
に吸収する基材が必要とされる。
結合しないポリスチレン或いはポリプロピレンのような
重合体よりなり、従って、複雑な生物学的流体から微量
の蛋白質免疫原を選択する際には、使用上限度がある。
有用な診断アッセイには特別の抗体或いは抗原を効率的
に吸収する基材が必要とされる。
ＦＩＡは特別の発螢光団より発光される光の検出を含む
ものであるから、感度は又そのように発光された光の強
度、およびその背景或いは散乱光に対する関係にも依存
する。発螢光団の励起周波数に適合する入射波長の選択
は、感度を増大する際の一つの重要な要因である。米国
特許第4,３４0,５６４号明細書には、重合体ビーズを光
散乱中心および散乱光を高めるバインダーで被覆するこ
とよりなる固相免疫基材が開示されている。基材を改良
し、透過光の量を増大するその他の方法も活発に探索さ
れている（例えば、米国特許第4,２５8,００２号明細書
参照）。
ものであるから、感度は又そのように発光された光の強
度、およびその背景或いは散乱光に対する関係にも依存
する。発螢光団の励起周波数に適合する入射波長の選択
は、感度を増大する際の一つの重要な要因である。米国
特許第4,３４0,５６４号明細書には、重合体ビーズを光
散乱中心および散乱光を高めるバインダーで被覆するこ
とよりなる固相免疫基材が開示されている。基材を改良
し、透過光の量を増大するその他の方法も活発に探索さ
れている（例えば、米国特許第4,２５8,００２号明細書
参照）。
概要 本発明は、三次元のコロイド状枠組みを形成する膨潤性
蛋白質結合性重合体ゲル状物質およびその中にランダム
に分布された光散乱中心よりなる螢光イムノアッセイ用
基材を提供するものである。より具体的には、本発明は
三次元マトリックスを形成する膨潤性蛋白質結合性重合
体物質、前記重合体マトリックス中に分布された可視光
線を散乱することのできる粒状の非特異的光散乱中心、
および前記重合体マトリックス中に分散された特定の狭
帯域螢光励起光線を反射し、非特異的光線を吸収するこ
とのできる粒状の特異的光散乱中心、よりなることを特
徴とする螢光イムノアッセイ用基材を提供するものであ
る。
蛋白質結合性重合体ゲル状物質およびその中にランダム
に分布された光散乱中心よりなる螢光イムノアッセイ用
基材を提供するものである。より具体的には、本発明は
三次元マトリックスを形成する膨潤性蛋白質結合性重合
体物質、前記重合体マトリックス中に分布された可視光
線を散乱することのできる粒状の非特異的光散乱中心、
および前記重合体マトリックス中に分散された特定の狭
帯域螢光励起光線を反射し、非特異的光線を吸収するこ
とのできる粒状の特異的光散乱中心、よりなることを特
徴とする螢光イムノアッセイ用基材を提供するものであ
る。
殆んどの固体基材と異なり、本発明の基材は同様な大き
さの面積を有する、例えばポリスチレンの５〜20倍の蛋
白質と結合することのできる三次元マトリックスの膨潤
性コロイド状ゲル様特性を有する再水和可能なフィルム
である。このフィルムの特性は水性物質に曝された際に
液体を迅速に吸収する能力であり、再水和の過程中に膨
潤し、これにより蛋白質のフィルム内の移動を可能にす
るものであり、その結果、例えば、特異的抗体がそれら
の相補的抗原に到達し、結合することができ、或いは又
その逆も可能であり、酵素はそれらの特異的基質に到達
することができる。
さの面積を有する、例えばポリスチレンの５〜20倍の蛋
白質と結合することのできる三次元マトリックスの膨潤
性コロイド状ゲル様特性を有する再水和可能なフィルム
である。このフィルムの特性は水性物質に曝された際に
液体を迅速に吸収する能力であり、再水和の過程中に膨
潤し、これにより蛋白質のフィルム内の移動を可能にす
るものであり、その結果、例えば、特異的抗体がそれら
の相補的抗原に到達し、結合することができ、或いは又
その逆も可能であり、酵素はそれらの特異的基質に到達
することができる。
基材の粒状の非特異性光散乱中心は、入射可視光線およ
び発光螢光光線の両者を散乱することにより本発明の基
材を用いた螢光イムノアッセイの感度を高める。
び発光螢光光線の両者を散乱することにより本発明の基
材を用いた螢光イムノアッセイの感度を高める。
フィルム内に運び込まれた第２の反応体として導入され
ている抗原或いは抗体が同定標識としての螢光染料分子
と結合する螢光イムノアッセイの光学的体系において、
該染料分子は染料の光吸収スペクトルに適合する波長の
光で励起される。この染料分子がその特異的励起スペク
トル内の光の光子を吸収すると電子がより高いエネルギ
ー状態に高められ、次いで三重項状態変換により、より
低いエネルギー（より長い波長）の光子が再発光され
る。螢光を伴う特別の光散乱物はそのような光の検出器
への移動を高めることであろう。しかしながら、そのよ
うな粒子は、又、元の励起光を吸収し、従って削減さ
せ、それにより染料の励起を妨げることとなるであろ
う。従って、本発明の非特異的光散乱体は、励起光は吸
収しないが、染料からの発光螢光は散乱することができ
るように選ばれたものである。
ている抗原或いは抗体が同定標識としての螢光染料分子
と結合する螢光イムノアッセイの光学的体系において、
該染料分子は染料の光吸収スペクトルに適合する波長の
光で励起される。この染料分子がその特異的励起スペク
トル内の光の光子を吸収すると電子がより高いエネルギ
ー状態に高められ、次いで三重項状態変換により、より
低いエネルギー（より長い波長）の光子が再発光され
る。螢光を伴う特別の光散乱物はそのような光の検出器
への移動を高めることであろう。しかしながら、そのよ
うな粒子は、又、元の励起光を吸収し、従って削減さ
せ、それにより染料の励起を妨げることとなるであろ
う。従って、本発明の非特異的光散乱体は、励起光は吸
収しないが、染料からの発光螢光は散乱することができ
るように選ばれたものである。
本発明の基材の特異的光散乱中心は染料の螢光励起波長
に対応する狭い帯域の光のみを散乱するものである。こ
れらの特別の光散乱体はその光散乱スペクトルが螢光染
料のスペクトルを吸収する光に適合する顔料である。螢
光標識を励起することのスペクトル範囲の波長を有する
入射光の移動は、このようにして高められる。場合によ
り、異った波長の干渉背景光が吸収され、かようにこれ
らの特別の光散乱体により削減される。螢光光線の移動
が高められる一方、背景光はこれらの特別の光散乱体に
より減少するので、本発明の基材を用いたＦＩＡの感度
が改良される。
に対応する狭い帯域の光のみを散乱するものである。こ
れらの特別の光散乱体はその光散乱スペクトルが螢光染
料のスペクトルを吸収する光に適合する顔料である。螢
光標識を励起することのスペクトル範囲の波長を有する
入射光の移動は、このようにして高められる。場合によ
り、異った波長の干渉背景光が吸収され、かようにこれ
らの特別の光散乱体により削減される。螢光光線の移動
が高められる一方、背景光はこれらの特別の光散乱体に
より減少するので、本発明の基材を用いたＦＩＡの感度
が改良される。
従って、本発明の基材は効率的に蛋白質と結合し、且つ
透過螢光を増強し、かようにして螢光測定を含むアッセ
イの感度を増大する。
透過螢光を増強し、かようにして螢光測定を含むアッセ
イの感度を増大する。
具体的説明 好ましくは、本発明の蛋白質結合性重合体物質はゲル
状、コロイド状特性を有する水膨潤性および再水和可能
なフィルム、例えばアクリル系共重合体、好ましくはア
クリル共重合体樹脂の水をベースとするエマルジョン、
である三次元重合体マトリックスである。このコロイド
フィルム中には二つのタイプ、即ち、1)非特異的、およ
び2)特異的光散乱体の光散乱中心が埋め込まれている。
各光散乱体はミクロン未満の径であり、水性媒体は不溶
である。非特異的粒状光散乱中心としては、個別或は結
合した酸化亜鉛または二酸化チタン（ルチル形）の粒子
が最も好ましい。非特異的光分波器散乱粒子は、アナタ
ース形或はルチル形二酸化チタン、酸化亜鉛、炭酸カル
シウムのような無機物質、或はカオリン(china clay)、
ペントナイトまたはフラー土などの粘土起源のものであ
ってもよく、或はデンプンなどの有機物起源のものであ
ってもよい。これらの光散乱体は、粒状であり、均一に
分散されており、全ての光を効率的に散乱し、たとえそ
の元々の光路においてではなくとも、反射後の励起光光
子が発螢光団に到達する可能性を増大するものである。
状、コロイド状特性を有する水膨潤性および再水和可能
なフィルム、例えばアクリル系共重合体、好ましくはア
クリル共重合体樹脂の水をベースとするエマルジョン、
である三次元重合体マトリックスである。このコロイド
フィルム中には二つのタイプ、即ち、1)非特異的、およ
び2)特異的光散乱体の光散乱中心が埋め込まれている。
各光散乱体はミクロン未満の径であり、水性媒体は不溶
である。非特異的粒状光散乱中心としては、個別或は結
合した酸化亜鉛または二酸化チタン（ルチル形）の粒子
が最も好ましい。非特異的光分波器散乱粒子は、アナタ
ース形或はルチル形二酸化チタン、酸化亜鉛、炭酸カル
シウムのような無機物質、或はカオリン(china clay)、
ペントナイトまたはフラー土などの粘土起源のものであ
ってもよく、或はデンプンなどの有機物起源のものであ
ってもよい。これらの光散乱体は、粒状であり、均一に
分散されており、全ての光を効率的に散乱し、たとえそ
の元々の光路においてではなくとも、反射後の励起光光
子が発螢光団に到達する可能性を増大するものである。
本発明の特異的光散乱中心も又粒状であり、蛋白質結合
重合体ラテックス中にランダムに分布されており、最も
好ましくは、特別の所望の分光反射率を有する着色化合
物である。最も好ましいのは、金属フタロシアニン塩、
例えば、銅フタロシアニンである。フタロシアニン化合
物（以下、場合により、「顔料」と称する）は、そのス
ペクトル散乱分布が使用される螢光染料の励起スペクト
ルに適合し、従って自動螢光或は背景散乱の如何を問わ
ず任意の望ましくない波長の光を減少させる特別の光吸
収体である。即ち、そのスペクトル吸光度が470nmにお
けるスペクトルの「青色」部分にピークがある染料とし
てイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を使用
する場合には、その分光反射率或いは散乱が470nmにお
いて最適であると示された銅フタロシアニンの粒子を使
用することになる。使用される染料が、スペクトルの
「緑色」領域において吸収し、スペクトルの「橙色」領
域において螢光を発するローダミン誘導体である場合に
は、約530nmの波長において散乱が最大になる最適の顔
料を使用すべきであろう。酵素標識化技術において使用
される光度測定変化における如く、非螢光光学的効果が
決定され、励起および発光の両者が同一である場合に
は、コロイドフィルムを形成するエマルジョンに何等の
特異的スペクトル散乱粒子を添加する必要はない。
重合体ラテックス中にランダムに分布されており、最も
好ましくは、特別の所望の分光反射率を有する着色化合
物である。最も好ましいのは、金属フタロシアニン塩、
例えば、銅フタロシアニンである。フタロシアニン化合
物（以下、場合により、「顔料」と称する）は、そのス
ペクトル散乱分布が使用される螢光染料の励起スペクト
ルに適合し、従って自動螢光或は背景散乱の如何を問わ
ず任意の望ましくない波長の光を減少させる特別の光吸
収体である。即ち、そのスペクトル吸光度が470nmにお
けるスペクトルの「青色」部分にピークがある染料とし
てイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を使用
する場合には、その分光反射率或いは散乱が470nmにお
いて最適であると示された銅フタロシアニンの粒子を使
用することになる。使用される染料が、スペクトルの
「緑色」領域において吸収し、スペクトルの「橙色」領
域において螢光を発するローダミン誘導体である場合に
は、約530nmの波長において散乱が最大になる最適の顔
料を使用すべきであろう。酵素標識化技術において使用
される光度測定変化における如く、非螢光光学的効果が
決定され、励起および発光の両者が同一である場合に
は、コロイドフィルムを形成するエマルジョンに何等の
特異的スペクトル散乱粒子を添加する必要はない。
非特異的光散乱中心は特異的光散乱中心に対して約30対
１の重量比で使用するのが好ましい。
１の重量比で使用するのが好ましい。
本発明の好ましい実施態様において、免疫吸着性基材は
固体支持体と組合わされる。最も好ましくは、固体支持
体は、例えば、試験スライドのそれのような本質的に平
坦な表面を有してなるものである。しかしながら、最も
好ましくは、免疫吸着性基材は固体支持体中の試験ウエ
ルの本質的に平たい底上に比較的厚い層（40〜50ミクロ
ンの深さ）として設けられる。これらの試験ウエルは例
えば同時係属中の米国特許出願第399,855号明細書(1982
年７月19日出願、この出願内容は本発明において準用す
る）に開示されているような急勾配の壁を有する円形寸
法のものである。
固体支持体と組合わされる。最も好ましくは、固体支持
体は、例えば、試験スライドのそれのような本質的に平
坦な表面を有してなるものである。しかしながら、最も
好ましくは、免疫吸着性基材は固体支持体中の試験ウエ
ルの本質的に平たい底上に比較的厚い層（40〜50ミクロ
ンの深さ）として設けられる。これらの試験ウエルは例
えば同時係属中の米国特許出願第399,855号明細書(1982
年７月19日出願、この出願内容は本発明において準用す
る）に開示されているような急勾配の壁を有する円形寸
法のものである。
本発明の免疫吸着性基材は、更に免疫原性試薬−抗原或
いは抗体のいずれかを含むものであってもよい。これら
の実施態様における基材は、病気、特にウィルス、細菌
或いは寄生虫の感染によって引き起こされる病気の特徴
を示す免疫原性試薬用の血液その他の体液の分析に特に
有用である。
いは抗体のいずれかを含むものであってもよい。これら
の実施態様における基材は、病気、特にウィルス、細菌
或いは寄生虫の感染によって引き起こされる病気の特徴
を示す免疫原性試薬用の血液その他の体液の分析に特に
有用である。
本発明の基材は、小さな愛玩動物、家畜および実験室用
動物の生物学的流体の普通のウィルス、寄生虫および細
菌に拠る病気の免疫原的アッセイによる診断に有用であ
り、その診断はネコ白血病ウィルス、ネコ感染性腹膜
炎、トキソプラスマ症、ネコ感染性貧血、心臓虫イヌブ
ルセラ症、イヌパルボウィルス、抗核抗体、リューマチ
様因子およびイヌジステンパーに対する生物学的流体の
免疫原性アッセイにより行われ、又ウマ類動物について
は、ウマ感染性貧血、ウマ妊娠、ウマ腺疫、ウマ肺炎、
ウマ子宮炎およびウマインフルエンザに対する診断に、
実験室用のマウスおよびラットについてはウィルスパネ
ルの診断に、ウシブルセラ症の診断に、ニューカッスル
病ウィルス、オウム病および白血病を含むトリの障害、
旋毛虫症、胃腸炎、擬性狂犬病およびアフリカブタ熱の
ようなブタの病気の診断に有用である。
動物の生物学的流体の普通のウィルス、寄生虫および細
菌に拠る病気の免疫原的アッセイによる診断に有用であ
り、その診断はネコ白血病ウィルス、ネコ感染性腹膜
炎、トキソプラスマ症、ネコ感染性貧血、心臓虫イヌブ
ルセラ症、イヌパルボウィルス、抗核抗体、リューマチ
様因子およびイヌジステンパーに対する生物学的流体の
免疫原性アッセイにより行われ、又ウマ類動物について
は、ウマ感染性貧血、ウマ妊娠、ウマ腺疫、ウマ肺炎、
ウマ子宮炎およびウマインフルエンザに対する診断に、
実験室用のマウスおよびラットについてはウィルスパネ
ルの診断に、ウシブルセラ症の診断に、ニューカッスル
病ウィルス、オウム病および白血病を含むトリの障害、
旋毛虫症、胃腸炎、擬性狂犬病およびアフリカブタ熱の
ようなブタの病気の診断に有用である。
本発明の基材を用いて使用するに適したトキソプラスマ
症のアッセイは次の文献に記載されている： A.B.サビン、H.A.フェルドマン、「原生動物寄生虫（ト
キソプラスマ）に影響を及ぼす新らしい免疫現象のミク
ロ化学指示薬としての染料」〔Sabin,A.B.,Feldman,H.
A.,Dyes as Microchemical Indicators of a New Immun
ity Phenomenon Affecting Protzoan Parasite (Toxopl
asma),science,108 660-663 1948〕。
症のアッセイは次の文献に記載されている： A.B.サビン、H.A.フェルドマン、「原生動物寄生虫（ト
キソプラスマ）に影響を及ぼす新らしい免疫現象のミク
ロ化学指示薬としての染料」〔Sabin,A.B.,Feldman,H.
A.,Dyes as Microchemical Indicators of a New Immun
ity Phenomenon Affecting Protzoan Parasite (Toxopl
asma),science,108 660-663 1948〕。
L.ヤコブス、M.N.ルンデ、「トキソプラスマ症の血球凝
集試験」〔Jacobs,L.,Lunde,M.N.,A hemagglutination
Test for Toxoplasmosis,J.Parasitol,43 308-314 195
7〕。
集試験」〔Jacobs,L.,Lunde,M.N.,A hemagglutination
Test for Toxoplasmosis,J.Parasitol,43 308-314 195
7〕。
A.J.サルツァー、E.C.ホール、「寄生虫病に対する間接
螢光抗体試験IV、トキソプラスマ症に対する間接螢光抗
体（ＩＦＡ）における変化の統計的研究」〔Sulzer,A.
J.,Hall,E.C.,Indirect Fluorescent Antibody Tests f
or Parasitic Diseases IV,Statistical Study of Vari
ation in the Indirect Fluorescent Antibody（ＩＦ
Ａ）for Toxoplasmosis,Am.J.Epidemio,86 401-407 196
7〕。
螢光抗体試験IV、トキソプラスマ症に対する間接螢光抗
体（ＩＦＡ）における変化の統計的研究」〔Sulzer,A.
J.,Hall,E.C.,Indirect Fluorescent Antibody Tests f
or Parasitic Diseases IV,Statistical Study of Vari
ation in the Indirect Fluorescent Antibody（ＩＦ
Ａ）for Toxoplasmosis,Am.J.Epidemio,86 401-407 196
7〕。
A.D.ボラー、G.ビッドウェル、E.ハルト、A.エングバ
ル、「トキソプラスマ抗体に対する酵素結合イムノアッ
セイのマイクロプレート方法」 〔Voller,A.D.,Bidwell,G.Huldt,E.Engvall A.,Micropl
ate Method of Enzyme Linked Immunoassay for Toxopl
asma Antibody,J.Clin.Pathnl.29 150-153 1974〕。
ル、「トキソプラスマ抗体に対する酵素結合イムノアッ
セイのマイクロプレート方法」 〔Voller,A.D.,Bidwell,G.Huldt,E.Engvall A.,Micropl
ate Method of Enzyme Linked Immunoassay for Toxopl
asma Antibody,J.Clin.Pathnl.29 150-153 1974〕。
本発明の基材を用いた使用に適するネコ感染性腹膜炎に
対するアッセイは次の文献に記載されている： ペダーソン等、「ネコ感染性腹膜炎ウィルスのその他の
種のコロナウィルスに対する、原的関係」〔Pederson e
t al.,“Antigenic Relationship of the Feline Infec
tious Peritonitis Virus to Coronaviruses of Other
Species”,Archives of Virology 58,45-43(1978)〕。
対するアッセイは次の文献に記載されている： ペダーソン等、「ネコ感染性腹膜炎ウィルスのその他の
種のコロナウィルスに対する、原的関係」〔Pederson e
t al.,“Antigenic Relationship of the Feline Infec
tious Peritonitis Virus to Coronaviruses of Other
Species”,Archives of Virology 58,45-43(1978)〕。
ペダーソン、「自然発生的ネコ感染症腹膜炎の血清学的
研究」〔Pederson,“Serologic Studies of Naturally
Occurring Feline Infectious Peritonitis”,Am.Journ
al of Vet.Res.,37 No.12,1449-1453(197)〕。
研究」〔Pederson,“Serologic Studies of Naturally
Occurring Feline Infectious Peritonitis”,Am.Journ
al of Vet.Res.,37 No.12,1449-1453(197)〕。
ホルチネック等、「ネコ感染性腹膜炎のウィルス学およ
び病原論」〔Horzinek,et al.,“Virology and Pathoge
nesis of Feline Infectious Peritonitis”,Archives
of Virology59 1-15(1979)〕。
び病原論」〔Horzinek,et al.,“Virology and Pathoge
nesis of Feline Infectious Peritonitis”,Archives
of Virology59 1-15(1979)〕。
本発明の基材を用いて使用するに適したネコ白血病につ
いてのアッセイは次の文献に記載されている： ジャレット等、「ネコ白血病ウィルス診断の三つの方法
の比較」〔Jarrett,et al.,“A Comparison of Three M
ethods of Feline Leukemia Virus Diagnosis”,The Ve
terinary Record,325-328(1982)〕。
いてのアッセイは次の文献に記載されている： ジャレット等、「ネコ白血病ウィルス診断の三つの方法
の比較」〔Jarrett,et al.,“A Comparison of Three M
ethods of Feline Leukemia Virus Diagnosis”,The Ve
terinary Record,325-328(1982)〕。
ヒルシュ等、「ネコの血液におけるねこ白血病ウィルス
抗原の検出のためのＥＬＩＳＡおよび免疫螢光アッセイ
の比較」〔Hirsch,et al.,“Comparison of ELISA and
Immunefluorescence Assays for Detection of Feline
Leukemia Virus Antigens in Blood of Cats”,Journal
of the Amer.Animal Hospital Assoc.18 933-938(198
2)〕。
抗原の検出のためのＥＬＩＳＡおよび免疫螢光アッセイ
の比較」〔Hirsch,et al.,“Comparison of ELISA and
Immunefluorescence Assays for Detection of Feline
Leukemia Virus Antigens in Blood of Cats”,Journal
of the Amer.Animal Hospital Assoc.18 933-938(198
2)〕。
この様に、例えば、ネコ白血病ウィルスのＰ−27抗原が
基材に結合されている本発明の好ましい実施態様を使用
して、ネコの血液のネコ白血病ウィルスの存在を診断す
ることができる。同様に、ＴＧＥビリオン（virion、ウ
ィルス粒子）が基材内に結合されている実施態様を使用
して、ネコ感染性腹膜炎を診断することができ、トキソ
プラスマ・ゴンディー(toxoplasma gondii)抗原が結合
されている好ましい実施態様を使用して、ネコの血液の
トキソプラスマ症抗体の分析を行うことができる。
基材に結合されている本発明の好ましい実施態様を使用
して、ネコの血液のネコ白血病ウィルスの存在を診断す
ることができる。同様に、ＴＧＥビリオン（virion、ウ
ィルス粒子）が基材内に結合されている実施態様を使用
して、ネコ感染性腹膜炎を診断することができ、トキソ
プラスマ・ゴンディー(toxoplasma gondii)抗原が結合
されている好ましい実施態様を使用して、ネコの血液の
トキソプラスマ症抗体の分析を行うことができる。
蛋白質結合性免疫基材は、50％の樹脂および50％のpH約
８〜９の水よりなるアクリル系共重合体（成分Ａ）を、
（二酸化チタンおよび酸化亜鉛の懸濁液と混合したアク
リル系樹脂と水とのエマルジョン（成分Ｂ）、および二
酸化チタンおよび銅フタロシアニンの懸濁液と混合した
アクリル系樹脂と水とのエマルジョン（成分Ｃ）と混合
することにより製造することができる。成分Ｂは更に流
動性改良剤、例えば、トールエステル樹脂を含むことも
できる。好ましくは、成分Ｂは約３〜５％のトールエス
テル樹脂を含有する。これらの成分は好ましくはＡ：
Ｂ：Ｃ＝2.5：2.5：１の比で組合わせるのがよく、使用
前に５部の蒸留水で希釈する。
８〜９の水よりなるアクリル系共重合体（成分Ａ）を、
（二酸化チタンおよび酸化亜鉛の懸濁液と混合したアク
リル系樹脂と水とのエマルジョン（成分Ｂ）、および二
酸化チタンおよび銅フタロシアニンの懸濁液と混合した
アクリル系樹脂と水とのエマルジョン（成分Ｃ）と混合
することにより製造することができる。成分Ｂは更に流
動性改良剤、例えば、トールエステル樹脂を含むことも
できる。好ましくは、成分Ｂは約３〜５％のトールエス
テル樹脂を含有する。これらの成分は好ましくはＡ：
Ｂ：Ｃ＝2.5：2.5：１の比で組合わせるのがよく、使用
前に５部の蒸留水で希釈する。
アクリル系共重合体は、アクリル系エマルジョン源、例
えば、メタクリル酸又はポリメチルメタクリレート或い
はこれらの組合せの共重合体より得ることができる。
えば、メタクリル酸又はポリメチルメタクリレート或い
はこれらの組合せの共重合体より得ることができる。
基材は又、酢酸ビニル類およびその誘導体、或いはブタ
ジェン−スチレンおよびこれらとその他の重合体との共
重合体から得ることができる。それは又エポキシ重合体
物質、塩化ビニル物質および上記の任意および全ての共
重合体であり得る。
ジェン−スチレンおよびこれらとその他の重合体との共
重合体から得ることができる。それは又エポキシ重合体
物質、塩化ビニル物質および上記の任意および全ての共
重合体であり得る。
成分Ａ、ＢおよびＣ中の樹脂は、好ましくはビーズ状形
態がよく、ビーズの直径は約0.1〜1.0ミクロンであり、
最も好ましくは約0.2ミクロンである。成分ＢおよびＣ
中の酸化物は資料に向けられる光線の波長の約半分の径
であるように選ばれた粒子である。本発明の螢光アッセ
イのためには、例えば、粒子は好ましくは、約0.2ミク
ロンである。重合体マトリックス中にランダムに分布す
るフタロシアニン化合物は0.1ミクロン未満であり、好
ましくは0.05〜0.1ミクロンである。
態がよく、ビーズの直径は約0.1〜1.0ミクロンであり、
最も好ましくは約0.2ミクロンである。成分ＢおよびＣ
中の酸化物は資料に向けられる光線の波長の約半分の径
であるように選ばれた粒子である。本発明の螢光アッセ
イのためには、例えば、粒子は好ましくは、約0.2ミク
ロンである。重合体マトリックス中にランダムに分布す
るフタロシアニン化合物は0.1ミクロン未満であり、好
ましくは0.05〜0.1ミクロンである。
好ましい実施態様は染料標識としてＦＩＴＣを含み、散
乱性顔料粒子として銅フタロシアニンを含有する。粒子
の最適寸法は、mie散乱理論に基づいており、これは粒
子直径が光の波長のほぼ半分である場合に最適の散乱が
起こることを示す。ＦＩＴＣを染料分子として用いた場
合は波長420〜480nm「青色」光線がフィルムに向けられ
るので0.2〜0.3ミクロン直径の粒子を有することが理想
的である。
乱性顔料粒子として銅フタロシアニンを含有する。粒子
の最適寸法は、mie散乱理論に基づいており、これは粒
子直径が光の波長のほぼ半分である場合に最適の散乱が
起こることを示す。ＦＩＴＣを染料分子として用いた場
合は波長420〜480nm「青色」光線がフィルムに向けられ
るので0.2〜0.3ミクロン直径の粒子を有することが理想
的である。
アクリル系重合体ビーズおよび二酸化チタンは最大約0.
2ミクロンの直径分布を有するのが好ましい。銅フタロ
シアニンは幾分より小さな粒子からなるが、なお効率の
よい散乱断面を示すものが好ましい。
2ミクロンの直径分布を有するのが好ましい。銅フタロ
シアニンは幾分より小さな粒子からなるが、なお効率の
よい散乱断面を示すものが好ましい。
本発明の好ましい実施態様において、基材は固体支持体
上に固定されている。固体支持体は、その上に少なくと
も一つの分離された領域に基材が置かれる本質的に平坦
な表面を有することが好ましい。最も好ましくは、固体
支持体は、更に、実質的に平坦な底面および放散する側
壁を有する１以上の試験ウェルを含むものである。基材
は、好ましくは、ウェルの平坦な底面上に固定される。
基材を置いたウェルは、このように、流体を収容する領
域を与え、そこで流体のアッセイが進行する。制御され
た温度および湿度条件（例68゜F（約20℃）および70％湿
度）で固定されると、コロイド状フィルムは40〜50ミク
ロンの厚さで形成され、水透過性である。
上に固定されている。固体支持体は、その上に少なくと
も一つの分離された領域に基材が置かれる本質的に平坦
な表面を有することが好ましい。最も好ましくは、固体
支持体は、更に、実質的に平坦な底面および放散する側
壁を有する１以上の試験ウェルを含むものである。基材
は、好ましくは、ウェルの平坦な底面上に固定される。
基材を置いたウェルは、このように、流体を収容する領
域を与え、そこで流体のアッセイが進行する。制御され
た温度および湿度条件（例68゜F（約20℃）および70％湿
度）で固定されると、コロイド状フィルムは40〜50ミク
ロンの厚さで形成され、水透過性である。
制御された割合での乾燥（温度および湿度は変動せず、
或いは極端にならず、又風への曝露が許容されない）に
おいて、且つ配合組成に示された適当な稀釈率での蒸留
水での稀釈において、約75ミクロンの高さのエマルジョ
ンの液状堆積物は合一し、電子顕微鏡写真に示されるよ
うに約40〜45ミクロンの厚いフィルムを形成する。
或いは極端にならず、又風への曝露が許容されない）に
おいて、且つ配合組成に示された適当な稀釈率での蒸留
水での稀釈において、約75ミクロンの高さのエマルジョ
ンの液状堆積物は合一し、電子顕微鏡写真に示されるよ
うに約40〜45ミクロンの厚いフィルムを形成する。
乾燥時には、典型的には、フィルム重量は60〜65ミリグ
ラムである。水性溶液に10分間曝した後（例えば水或い
は体液の滞り液中の予備浸漬後）、 フィルムの重量は、115ミリグラム、即ち水分による75
％増加までに増加する。引続いて室温において１1/2時
間乾燥した後においても、６〜７％水分の残存過剰量が
存在し、これは漸次消滅する。
ラムである。水性溶液に10分間曝した後（例えば水或い
は体液の滞り液中の予備浸漬後）、 フィルムの重量は、115ミリグラム、即ち水分による75
％増加までに増加する。引続いて室温において１1/2時
間乾燥した後においても、６〜７％水分の残存過剰量が
存在し、これは漸次消滅する。
本発明の固定化基材は、基材およびその上およびその中
に吸収されている反応物質が透過する特別の波長の光の
量を測定する試験装置と共にイムノアッセイに使用する
ことができる。参考迄に本願明細書に記載する同時係属
中の米国特許出願第362,696号明細書(1982年３月29日出
願）には、そのような試験機械の一つが開示されてい
る。ダリルラボラトリーズ社(Daryl Laboratories)から
TRACK XIの商標名で市販されているこの試験装置および
系を用いると、発螢光団の励起モードを実質的に同様な
波長を有する光線が基材に向けられる。入射光は基材上
および基材中に存在する反応物質の量に比例する量で反
射、透過或いは吸収される。入射光が螢光標識の励起ス
ペクトルにある波長のものである場合には、基材中の粒
状物質、好ましくはフタロシアニン顔料、例えば銅フタ
ロシアニンは、この特別の入射光を反射し、任意の非螢
光活性化光線を吸収する。望ましくない反射光線の背景
水準が減少し、反射螢光光線の信号対背景比が高くなる
ので、分析の感度はこのように極めて増大する。
に吸収されている反応物質が透過する特別の波長の光の
量を測定する試験装置と共にイムノアッセイに使用する
ことができる。参考迄に本願明細書に記載する同時係属
中の米国特許出願第362,696号明細書(1982年３月29日出
願）には、そのような試験機械の一つが開示されてい
る。ダリルラボラトリーズ社(Daryl Laboratories)から
TRACK XIの商標名で市販されているこの試験装置および
系を用いると、発螢光団の励起モードを実質的に同様な
波長を有する光線が基材に向けられる。入射光は基材上
および基材中に存在する反応物質の量に比例する量で反
射、透過或いは吸収される。入射光が螢光標識の励起ス
ペクトルにある波長のものである場合には、基材中の粒
状物質、好ましくはフタロシアニン顔料、例えば銅フタ
ロシアニンは、この特別の入射光を反射し、任意の非螢
光活性化光線を吸収する。望ましくない反射光線の背景
水準が減少し、反射螢光光線の信号対背景比が高くなる
ので、分析の感度はこのように極めて増大する。
固定化基材は又、その他の発色団を含む分析、例えば酵
素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、の感度も高める。ＥＩＡ
においては、入射光は液体媒体中を移動して免疫反応が
起こる固定化基材に至り、そこから色変化を行う酵素反
応体である液体媒体を通じて戻される。
素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、の感度も高める。ＥＩＡ
においては、入射光は液体媒体中を移動して免疫反応が
起こる固定化基材に至り、そこから色変化を行う酵素反
応体である液体媒体を通じて戻される。
本発明の好ましい実施態様においては基材は更に１以上
のその他の物質と反応して螢光生成物を形成することの
できる第一の物質を含有することができる。例えば、基
材は適当な発螢光団の標識を付されたそれぞれの配位子
と反応することのできる抗原又は抗体を結合して有する
ことができる。この実施態様においては、基材は特定の
ウィルス、寄生虫或いは細菌感染症に特徴的な抗原又は
抗体を含有する生物学的流体の分析に有用であり、従っ
て有用な診断道具となる。高感度の分析をスピードおよ
び再現性をもって行うことができるので、感染の疑われ
た動物からの多量の資料の日常のスクリーニングに有用
である。本発明の基材に結合することのできる物質のそ
の他の例としては、ペプチド類、ホルモン類、薬品類或
いは酵素基質などがある。これらの物質は発螢光団で標
識された試薬による直接分析により、或いはサンドイッ
チ技術などの間接分析により、検出することができる。
のその他の物質と反応して螢光生成物を形成することの
できる第一の物質を含有することができる。例えば、基
材は適当な発螢光団の標識を付されたそれぞれの配位子
と反応することのできる抗原又は抗体を結合して有する
ことができる。この実施態様においては、基材は特定の
ウィルス、寄生虫或いは細菌感染症に特徴的な抗原又は
抗体を含有する生物学的流体の分析に有用であり、従っ
て有用な診断道具となる。高感度の分析をスピードおよ
び再現性をもって行うことができるので、感染の疑われ
た動物からの多量の資料の日常のスクリーニングに有用
である。本発明の基材に結合することのできる物質のそ
の他の例としては、ペプチド類、ホルモン類、薬品類或
いは酵素基質などがある。これらの物質は発螢光団で標
識された試薬による直接分析により、或いはサンドイッ
チ技術などの間接分析により、検出することができる。
以下の具体例は病気の診断における流体のイムノアッセ
イにおける本発明の用途を例示するものである。しかし
ながら、本発明はこれらの具体例によっては限定されな
いものと理解されるべきである。
イにおける本発明の用途を例示するものである。しかし
ながら、本発明はこれらの具体例によっては限定されな
いものと理解されるべきである。
例１ ネコ白血病アッセイ A.抗体低下アッセイ 基材を、ダクル・ラボラトリーズ社により標識コリミュ
ーン（ＣＯＬＬＩＭＭＵＮＥ）として提供され、本発明
において基材組成物および米国特許出願第３９9,９２０
号（１９８２年１月１９日出願）の試験方法に関して説
明されたのと同様にして調製された固体支持体内の試験
ウェルの底面上に固定した。ネコ白血病ウィルスの核抗
原の一つであるＰ−27抗原を成長細胞系統Ｆ１−74から
収穫し、第一試験ウェル上に置いた。
ーン（ＣＯＬＬＩＭＭＵＮＥ）として提供され、本発明
において基材組成物および米国特許出願第３９9,９２０
号（１９８２年１月１９日出願）の試験方法に関して説
明されたのと同様にして調製された固体支持体内の試験
ウェルの底面上に固定した。ネコ白血病ウィルスの核抗
原の一つであるＰ−27抗原を成長細胞系統Ｆ１−74から
収穫し、第一試験ウェル上に置いた。
補助試験ウェル中において、Ｐ−27抗原を含有する試料
をウサギ中で発育させた抗−Ｐ−27抗体と共にインキュ
ベートさせた。10分間のインキュベーション後、この混
合物の一部を第一の試験ウェル中に移し、試料抗原に未
だ結合していない遊離の抗体を基材中のＰ−27抗原と結
合させた。15分のインキュベーションおよび簡単な洗浄
後、インチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識
化されたヤギ抗−ウサギイムノグロブリンＧ(IgG)を基
材に添加した。10分間のインキュベーション後、基材を
洗浄し、本発明で説明したダリル・トラックXI装置中に
挿入し、透過螢光光線を測定した。白血病ウィルスの検
量試料は、公知濃度のＰ−27抗原を含有する正常なネコ
血清であった。
をウサギ中で発育させた抗−Ｐ−27抗体と共にインキュ
ベートさせた。10分間のインキュベーション後、この混
合物の一部を第一の試験ウェル中に移し、試料抗原に未
だ結合していない遊離の抗体を基材中のＰ−27抗原と結
合させた。15分のインキュベーションおよび簡単な洗浄
後、インチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識
化されたヤギ抗−ウサギイムノグロブリンＧ(IgG)を基
材に添加した。10分間のインキュベーション後、基材を
洗浄し、本発明で説明したダリル・トラックXI装置中に
挿入し、透過螢光光線を測定した。白血病ウィルスの検
量試料は、公知濃度のＰ−27抗原を含有する正常なネコ
血清であった。
104個の予め凍結したネコ血清試料についての臨床試験
は、比較してのＥＬＩＳＡの主観的サンドイッチアッセ
イ〔ヒットマン・ムーア社製のリューカッセイ(Leukass
ay)FTM（商標）〕に対して85％の特異性および95％の感
度を示した。
は、比較してのＥＬＩＳＡの主観的サンドイッチアッセ
イ〔ヒットマン・ムーア社製のリューカッセイ(Leukass
ay)FTM（商標）〕に対して85％の特異性および95％の感
度を示した。
例２ ネコ感染性腹膜炎(FIP)の螢光イムノアッセイ ＦＩＰ抗体に対するグリル・トラックXIシステムアッセ
イは標準的な「サンドイッチ型」アッセイであるが、各
試料は抗原被覆ウェルおよび対照被覆ウェルの両者につ
いて行われる。コリミューン基材は例１で使用されたも
のと同一であった。
イは標準的な「サンドイッチ型」アッセイであるが、各
試料は抗原被覆ウェルおよび対照被覆ウェルの両者につ
いて行われる。コリミューン基材は例１で使用されたも
のと同一であった。
交互のウェルに対照調剤および抗原調剤が適用された。
対照調剤は培養されたブタ腎臓（ＰＫ）細胞から得られ
た上澄液を0.1Ｍ重炭酸塩緩衝液(pH9)で１：３に希釈し
たものであった。抗原調剤はＴＧＥウィルス（ミラー
株）に感染した培養ＰＫ細胞からの上澄液から得られた
ＴＧＥビリオンであった。ネコ感染性腹膜炎抗原はＴＧ
Ｅウィルスと強く交差反応する。
対照調剤は培養されたブタ腎臓（ＰＫ）細胞から得られ
た上澄液を0.1Ｍ重炭酸塩緩衝液(pH9)で１：３に希釈し
たものであった。抗原調剤はＴＧＥウィルス（ミラー
株）に感染した培養ＰＫ細胞からの上澄液から得られた
ＴＧＥビリオンであった。ネコ感染性腹膜炎抗原はＴＧ
Ｅウィルスと強く交差反応する。
ネコ血液試料を対照および抗原ウェルの両者に適用し、
10分間インキュベートした。洗浄後、ＦＩＴＣ標識を有
するウサギ抗−ネコIgGをウェルに適用した。10分間の
インキュベーションおよび最終水洗後、ウェルの螢光を
トラックXI螢光読み取り器で観察した。結果を分析する
に当り、対照例の螢光を検量試料および未知試料の両者
の抗原ウェルから得られた螢光から差し引き、正味の螢
光の読みを得た。検量試料は他の技術により求められた
公知のＦＩＰ力価のプールされた血清である。予め凍結
したネコ血清試料の124の試料について行われた臨床試
験は、公知の動的酵素結合アッセイ（ＫＥＬＡ）と対比
して、80％の特異性を示した。トラックXIアッセイはＫ
ＥＬＡアッセイに対比して90％の感度を示した。
10分間インキュベートした。洗浄後、ＦＩＴＣ標識を有
するウサギ抗−ネコIgGをウェルに適用した。10分間の
インキュベーションおよび最終水洗後、ウェルの螢光を
トラックXI螢光読み取り器で観察した。結果を分析する
に当り、対照例の螢光を検量試料および未知試料の両者
の抗原ウェルから得られた螢光から差し引き、正味の螢
光の読みを得た。検量試料は他の技術により求められた
公知のＦＩＰ力価のプールされた血清である。予め凍結
したネコ血清試料の124の試料について行われた臨床試
験は、公知の動的酵素結合アッセイ（ＫＥＬＡ）と対比
して、80％の特異性を示した。トラックXIアッセイはＫ
ＥＬＡアッセイに対比して90％の感度を示した。
例３ トキソプラスマ・ゴンディーの螢光イムノアッセイ トキソプラスマ・ゴンディーは多くの異なった動物を冒
すが、ネコはその天然の貯蔵所として役立つ。家ネコか
ら妊娠した飼主への伝染は退治における悲劇的出産欠陥
に導く可能性があるので、それは非常に臨床的に重要で
ある。従って、妊娠した女性および彼女のネコを、妊娠
期間内に血清学により定期的に試験するべきである。
すが、ネコはその天然の貯蔵所として役立つ。家ネコか
ら妊娠した飼主への伝染は退治における悲劇的出産欠陥
に導く可能性があるので、それは非常に臨床的に重要で
ある。従って、妊娠した女性および彼女のネコを、妊娠
期間内に血清学により定期的に試験するべきである。
例１と同様な基材に粉砕したトキソプラズマ・ゴンディ
ー菌から抽出した可溶性抗原を添加した。
ー菌から抽出した可溶性抗原を添加した。
基材および抗原を試験ウェル内で固定した。１滴の全未
希釈血清或いは血液を各ウェル中に入れた。ウェルを室
温で10分間インキュベートさせてT.gondiiに対する抗体
と固定抗原間の反応を行わせた。ウェルを洗浄し、次い
でイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識
化した抗−ネコ抗体と接触させた。10分間のインキュベ
ーション後、ウェルを洗浄し、螢光を観察した。公知の
力価の対照試料を同時に実験して検量線を作成した。
希釈血清或いは血液を各ウェル中に入れた。ウェルを室
温で10分間インキュベートさせてT.gondiiに対する抗体
と固定抗原間の反応を行わせた。ウェルを洗浄し、次い
でイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識
化した抗−ネコ抗体と接触させた。10分間のインキュベ
ーション後、ウェルを洗浄し、螢光を観察した。公知の
力価の対照試料を同時に実験して検量線を作成した。
例４ 以下のアッセイは例１〜３の一般的方法、基材および装
置を用いて行った。ネコIgGは例３と同様にして行った
が、抗体或いは抗原はコロイド基材に予備適用しなかっ
た。血清はウェル内に10分間入れられた。全血清蛋白質
は吸収された。洗浄後、ＦＩＴＣ標識を付された抗−ネ
コIgG抗体を適用した。それは結合IgGのみと反応した。
10分間のインキュベーション後、過剰の抗−ネコIgGを
洗浄して除去し、螢光をトラックXI装置内において読ん
だ。検量計は血液100ml当りのIgG/mgで計量を与えた。
置を用いて行った。ネコIgGは例３と同様にして行った
が、抗体或いは抗原はコロイド基材に予備適用しなかっ
た。血清はウェル内に10分間入れられた。全血清蛋白質
は吸収された。洗浄後、ＦＩＴＣ標識を付された抗−ネ
コIgG抗体を適用した。それは結合IgGのみと反応した。
10分間のインキュベーション後、過剰の抗−ネコIgGを
洗浄して除去し、螢光をトラックXI装置内において読ん
だ。検量計は血液100ml当りのIgG/mgで計量を与えた。
ウマIgGアッセイはネコIgGアッセイにおけるのと同様に
行われたが、ウマの新生児が免疫不全−メスウマから初
乳を採っていない−かどうかを決定するために低水準に
対して検量が行われた。
行われたが、ウマの新生児が免疫不全−メスウマから初
乳を採っていない−かどうかを決定するために低水準に
対して検量が行われた。
イヌジステンパー抗体、イヌパルボウィルス抗体および
ブルセラに対するイヌ抗体は全て例３と同様にして行わ
れたサンドイッチ技術であり適当な抗原に向けられたも
のである。全て、二回の10分間のインキュベーションお
よび二回の簡単な洗浄を使用した。いずれも例２のＦＩ
Ｐ試験で必要としたような対照ウェルの使用を必要とし
なかった。イヌにおけるリューマチ様因子試験について
は、抗原は、あるイヌの場合においては、IgM抗体が向
けられた「変化させられた」ウサギIgGであった。抗−
イヌIgMＦＩＴＣ標識化抗体が例１〜３と同様にして使
用された。イヌ抗核抗体試験については、二本鎖および
一本鎖ＤＮＡプラスリボ核蛋白質が抗原として組合わさ
れた。試験は例１〜３と同様にして行われた。
ブルセラに対するイヌ抗体は全て例３と同様にして行わ
れたサンドイッチ技術であり適当な抗原に向けられたも
のである。全て、二回の10分間のインキュベーションお
よび二回の簡単な洗浄を使用した。いずれも例２のＦＩ
Ｐ試験で必要としたような対照ウェルの使用を必要とし
なかった。イヌにおけるリューマチ様因子試験について
は、抗原は、あるイヌの場合においては、IgM抗体が向
けられた「変化させられた」ウサギIgGであった。抗−
イヌIgMＦＩＴＣ標識化抗体が例１〜３と同様にして使
用された。イヌ抗核抗体試験については、二本鎖および
一本鎖ＤＮＡプラスリボ核蛋白質が抗原として組合わさ
れた。試験は例１〜３と同様にして行われた。
本発明に従って行うことのできるウェルス、細菌、およ
び寄生虫の抗原又は抗体の検出を含む免疫学的試験に
は、特に次のものが含まれる： 小愛玩動物： ネコ白血病ウィルス ネコ感染性腹膜炎 ネコトキソプラスマ症 ネコ感染性貧血症 イヌ心臓虫 イヌブルセラ症 イヌパルボウィルス イヌ抗−核抗体 イヌリューマチ様因子 イヌジステンパー ウマ： ウマ感染性貧血症 ウマ妊娠 ウマ腺疫 ウマ肺炎 ウマ子宮炎 ウマインフルエンザ 実験室： マウスおよびラットに対するウィルスパネル 食物および繊維： ウシブルセラ症 旋毛虫 ブタの胃腸炎 青舌ウィルス病 トリ類： ニューカッスル病ウィルス オウム病 白血病 更に、IgG、IgA、IgMおよびIgE、相補系の血清蛋白成分お
よびＣ反応性蛋白質などのその他の血清蛋白質の定量も
可能である。
び寄生虫の抗原又は抗体の検出を含む免疫学的試験に
は、特に次のものが含まれる： 小愛玩動物： ネコ白血病ウィルス ネコ感染性腹膜炎 ネコトキソプラスマ症 ネコ感染性貧血症 イヌ心臓虫 イヌブルセラ症 イヌパルボウィルス イヌ抗−核抗体 イヌリューマチ様因子 イヌジステンパー ウマ： ウマ感染性貧血症 ウマ妊娠 ウマ腺疫 ウマ肺炎 ウマ子宮炎 ウマインフルエンザ 実験室： マウスおよびラットに対するウィルスパネル 食物および繊維： ウシブルセラ症 旋毛虫 ブタの胃腸炎 青舌ウィルス病 トリ類： ニューカッスル病ウィルス オウム病 白血病 更に、IgG、IgA、IgMおよびIgE、相補系の血清蛋白成分お
よびＣ反応性蛋白質などのその他の血清蛋白質の定量も
可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナンシー，ケー，カウフマン アメリカ合衆国カリフォルニア州，ベルモ ント，カサ，ボナ，2320
Claims (16)
- 【請求項１】(1)三次元マトリックスを形成する膨潤性
再水和可能な蛋白質結合性重合体物質、 (2)前記重合体マトリックス中にランダムに分布され
た、可視光線を散乱することのできる粒状の非特異的光
散乱中心、および (3)前記重合体マトリックス中にランダムに分布され
た、特異的螢光励起光線を反射し、特異的螢光励起光線
以外の光線を吸収することのできる粒状の特異的光散乱
中心、 を含むことを特徴とする螢光イムノアッセイ用基材。 - 【請求項２】該蛋白質結合性重合体物質がアクリル系共
重合体である、特許請求の範囲第１項記載の基材。 - 【請求項３】該アクリル系共重合体がメタクリル酸およ
びポリメチルメタクリレートを含む、特許請求の範囲第
２項記載の基材。 - 【請求項４】該非特異的光散乱中心がチタンおよび亜鉛
の酸化物の各々或いは組合せである、特許請求の範囲第
１項記載の基材。 - 【請求項５】該非特異的光散乱中心がフタロシアニン化
合物である、特許請求の範囲第１項記載の基材。 - 【請求項６】固体支持体に固定されている、特許請求の
範囲第１項記載の基材。 - 【請求項７】該固体支持体が本質的に平坦な平面よりな
る、特許請求の範囲第６項記載の固定化基材。 - 【請求項８】固体支持体が、実質的に平坦な底面および
放散する側壁を有する１個以上の試験ウエルを含み、前
記基材がその底に固定化されているものである、特許請
求の範囲第７項記載の基材。 - 【請求項９】１以上の他の物質と反応して螢光生成物を
形成することのできる第１の物質を結合して有する、特
許請求の範囲第１項記載の基材。 - 【請求項１０】該第１の物質が抗原または抗体である、
特許請求の範囲第９項記載の基材。 - 【請求項１１】該全抗原或いはその分画がＴＧＥビリオ
ン(virion、ウイルス粒子）、ネコ白血病ウイルスのＰ−
２７抗原、トキソプラスマ・ゴンディー(Toxoplasma go
ndii)、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイル
ス、イヌブルセラ菌(canine Brucella organismus)、ブ
ルセラ流産菌、心臓虫、或いは旋毛虫属(Trichinella)
である特許請求の範囲第１０項記載の基材。 - 【請求項１２】(1)免疫原を含むと思われる流体を螢光
イムノアッセイ用に有用な、抗体を含む基材と接触さ
せ、但しこの基材は、 (a)三次元重合体マトリックスを形成する膨潤性再水和
可能な蛋白質結合性重合体物質、 (b)前記重合体マトリックス中にランダムに分布され
た、すべての可視光線を散乱する第一の粒状の光散乱中
心、および (c)前記重合体マトリックス中にランダムに分布され
た、特定の波長または周期の螢光励起光線のみを散乱
し、他のすべての光線を吸収する第二の粒状の光散乱中
心、 を含んでおり、 (2)前記基材に免疫原が結合しやすい条件のもとに前記
流体と基材を培養し、 (3)特に免疫原に結合することが知られ、螢光染料分子
がそれに結合している物質の試料を加え、 (4)免疫原に前記物質が結合しやすい条件のもとに、前
記試料の結合した免疫原とともに前記基材を培養し、 (5)非結合物質を除き、そして (6)螢光染料分子からの光の散乱またはその欠如、免疫
原の存在を示す前記散乱の存在および免疫原の不存在を
示す前記散乱の欠如を観察する、 ことからなる免疫原の存在または不存在を決定または検
出するためのイムノアッセイ法。 - 【請求項１３】螢光イムノアッセイよりなる、特許請求
の範囲第１２項記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１４】酵素結合イムノアッセイよりなる、特許
請求の範囲第１２項記載のイムノアッセイ法。 - 【請求項１５】(1)細菌、ウイルス、寄生虫または真菌
の仲介によって感染された哺乳動物を診断するために前
記哺乳動物からの体液を、 (a)三次元重合体マトリックスを形成する膨潤性再水和
可能な蛋白質結合性重合体物質、 (b)前記重合体マトリックス中にランダムに分布され
た、可視光線を散乱することのできる粒状の非特異的光
散乱中心、および (c)前記重合体マトリックス中にランダムに分布され
た、特異的螢光励起光線を反射し、特異的螢光励起光線
以外の光線を吸収することのできる粒状の特異的光散乱
中心、 を含み、かつ免疫原または抗体を含む螢光イムノアッセ
イ用基材と接触させ、 (2)前記基材に免疫原または抗体が結合しやすい条件の
もとに、前記体液と基材を培養し、 (3)特異的に免疫原または抗体に結合することが知ら
れ、螢光染料分子がそれに結合している物質の試料を加
え、 (4)免疫原または抗体に前記物質が結合しやすい条件の
もとに、前記試料の結合した免疫原または抗体とともに
前記基材を培養し、 (5)非結合物質を除き、そして (6)螢光染料分子からの光の散乱またはその欠如、免疫
原または抗体の存在を示す前記散乱の存在および免疫原
または抗体の不存在を示す前記散乱の欠如を観察する、 ことからなる免疫原または抗体の存在を検出するための
イムノアッセイ法。 - 【請求項１６】ネコ白血病ウイルス、ヒトその他の哺乳
動物におけるトキソプラスマ症、ネコＩｇＧ、イヌＩｇ
Ｇ、イヌジステンパー、イヌパルボウイルス或いはイヌ
ブルセラに対する、特許請求の範囲第１５項記載のイム
ノアッセイ法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/483,055 US4540660A (en) | 1983-04-07 | 1983-04-07 | Substrate for fluoroimmunoassay of biological fluids |
| US483055 | 1983-04-07 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59190664A JPS59190664A (ja) | 1984-10-29 |
| JPH0614046B2 true JPH0614046B2 (ja) | 1994-02-23 |
Family
ID=23918460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59009929A Expired - Lifetime JPH0614046B2 (ja) | 1983-04-07 | 1984-01-23 | 生物学的流体の螢光イムノアツセイ用基材 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4540660A (ja) |
| JP (1) | JPH0614046B2 (ja) |
| AU (1) | AU571476B2 (ja) |
| BR (1) | BR8400396A (ja) |
| CA (1) | CA1229301A (ja) |
| DE (1) | DE3412340C2 (ja) |
| DK (1) | DK159175C (ja) |
| FR (1) | FR2544081B1 (ja) |
| GB (1) | GB2138131B (ja) |
| IT (1) | IT1179356B (ja) |
| SE (1) | SE8307004L (ja) |
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| US4596723A (en) * | 1984-05-02 | 1986-06-24 | Daryl Laboratories, Inc. | Immunoassay substrate |
| US4853325A (en) * | 1986-03-26 | 1989-08-01 | Synbiotics Corporation | Saliva test for feline leukemia virus |
| US4962021A (en) * | 1986-06-20 | 1990-10-09 | Personal Diagnostics, Inc. | Analyte determination using gel including a reagent system reacts with analyte to change transmissive property of gel detectable by light beam transmitted through gel by total internal reflectance |
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| US5346670A (en) * | 1986-12-24 | 1994-09-13 | British Technology Group U.S.A. Inc. | Phthalocyanine and tetrabenztriazaporphyrin reagents |
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| DK269889A (da) * | 1988-06-06 | 1989-12-07 | Photest Diagnostics Inc | Heterogen immunoassay |
| DE4439348A1 (de) * | 1994-11-04 | 1996-05-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Weiße Trigger-Präparationen zur Verbesserung der Signaldetektion bei bio- und chemilumineszenten Reaktionen |
| FR2747387B1 (fr) * | 1996-04-12 | 1998-07-03 | Conseil General De L Orne | Moyens pour la detection de bacteries du genre taylorella et applications biologiques |
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| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
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| CN102209898B (zh) * | 2008-11-07 | 2014-08-27 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 光度反应膜的细粒填充剂 |
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 1983-12-19 SE SE8307004A patent/SE8307004L/xx not_active Application Discontinuation
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- 1983-12-23 AU AU22841/83A patent/AU571476B2/en not_active Ceased
-
1984
- 1984-01-12 GB GB08400807A patent/GB2138131B/en not_active Expired
- 1984-01-23 JP JP59009929A patent/JPH0614046B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-31 BR BR8400396A patent/BR8400396A/pt unknown
- 1984-02-27 DK DK105984A patent/DK159175C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-03-15 FR FR8403987A patent/FR2544081B1/fr not_active Expired
- 1984-03-26 IT IT47933/84A patent/IT1179356B/it active
- 1984-04-03 DE DE3412340A patent/DE3412340C2/de not_active Expired
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