JPS5822980B2 - ブルセラ・カニス抗体検出用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 プルセラ・カニメ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）に
よって起される犬の病気である、犬プルセラ症が犬を冒
すことは公知である。

ピーグル種の犬は主として上記病気によって冒される犬
である。

犬のプルセラ症の特徴は全身的リンパ原炭および牌炎、
早期非検出の胎児致死もしくは流産、妊娠約５０１目の
明白な流産、流産に続く長期の腟分泌物にある。

感染した雄の犬には副華丸炎、陰のうの皮ふ炎および薗
丸委縮、しばしば一側性の薗丸委縮が現われる。

雄の犬には生殖能がなくなる犬もいる。

多くの感染した犬は生殖不全および強勢喪失を被るため
に、臨床的徴候を失なう。

菌血症は頑固であるのが普通であり、微生物は一年以上
の間各種の組織中に生き残る。

感染した犬は一般に体現は高くなく、目下のところ、感
染は陽性凝集反応試験、可能ならばプルセラ・カニメの
単離によって認められるにすぎない。

プルセラ・カニメ、犬プルセラ症およびその検出用の管
凝集反応試験（ｔｕｂｅ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ
ｔｃｓｔ） については、就中、Ｃａｒｍｉ ｃｈａ
ｅ ｌ 。

Ｐｒｏｃ、Ｕ−８、Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｓａｎ 、Ａ
−。

第７１巻第５１７〜５２７頁（１９６９年）；Ｃａｒｍ
ｉ ｃｈａｅ ］等Ｊ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ａ、、第１５２巻
第６０５〜６１６頁（１９６８年）；およびＪ、Ａ、Ｖ
、Ｍ、Ａ、、第１５６巻第１７２６〜１７３４頁（１９
７０年） ： Ｈａ ｌ ｌ 、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅｕｓｅｓ、第１２４
巻第６１５〜６１８頁（１９７１年）、およびＤｉａｚ
等、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、第９５巻第６１８〜６２４頁（１９６８年）に記載
されている。

上記文献の開示は上記文献をここに記載することによっ
て本明細書に加入されているものとする。

プルセラ・カニメの通常の血清診断に現在利用されてい
る管凝集反応試験には欠点がある。

この管凝集反応試験は菌血症と相互関係があることが実
証されているが、技術上の不利益のために、広範囲の臨
床上の使用が制限されている。

プルセラ・カニメは長く培養した後はねばねばする糸を
引く様になる傾向がある故に、適当な同型の診断用抗原
の生産には相当の注意が必要である。

その微生物の類粘液質の性質が感染した犬から得たある
種の血清で観察される完全凝集反応の欠落の原因になる
ことがあることも報告されている。

凝集反応を高めるために、試１験を５２°Ｃで４８時間
、恒温に維持して行なうことが推奨されているが、この
推奨案は臨界的であり、普遍的に許与され得る試験操作
としては利用することができない。

観念論的には有用な試験があれば感染の検出が簡単に行
なわれ、容易に判断され、そして正確になる。

さらに、プルセラ・カニメを凝集する抗体が通常の動物
中に発見された。

プルセラ・カニメと反応する凝集素がたとえばホルテテ
ラ・ブロンキゼブテイクス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂ
ｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃｓ）を接種した犬の血清中で
発見された。

これらの反応を区別するには経験が必要である。

プルセラ・カニメは主として犬に感染する病気ではある
が、少なくとも数例のプルセラ・カニメによる人間の感
染が報告されている。

本発明者の研究により、プルセラ・オヴイス（Ｂｒｕｃ
ｅｌｌａ ｏｖｉｓ）の抗原がプルセラ・カニメに対す
る抗体を検出するのに使用することができることが一見
用された。

さらに本発明者の研究により、プルセラ・オヴイスの死
菌の、好ましくは着色された全体細胞培養物がプルセラ
・カニメ抗体の検出用の迅速且つ正確な平板凝集反応試
験（Ｐｌａｔｅ ａｇｇｌｕｔｉｎａ−ｔｉｏｎ ｔ
ｅｓｔ）として利用することができることが見出され７
た。

その平板凝集反応試験は抗原とプルセラ・オヴイスの全
体細胞培養物（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
）とプルセラ・カニメ感受性被験対象血清との混合物を
、透明または生ずる凝集反応生成物と対照的であり且つ
生ずる凝集の程度が観察される対照的な不透明な色のス
ライド上に拡げてフィルムまたはプールを形成させるこ
とを特徴とするものである。

本発明の平板凝集反応試験はいずれのプルセラ・カニス
菌血症被験対象でも、たとえば大斜、特に犬、または人
間のととき動物でもそのプルセラ・カニメ感染を検出す
るのに有用である。

プルセラ属検出の一平板凝集反応試１験法はＡｌｔｏｎ
およびＪｏｎｃｓ 、 ｒプルセラ症の実験室的技術
（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｂｒｕｃｅ−１１ｏｓｉｓ） ｌ （１９６７年）「
スイス国ジュネーフ市、ワールド・ヘルス・オーガニゼ
ション）に記載されている。

この方法は透明な試験板−ヒに一定量の抗原をのせてプ
ールを形成させそしてこの抗原に疑わしい被１験対象の
一定量の血清を加え、充分な時間、凝集させた後に、適
当な背景照明と対照的な観察背景とを用いて凝集の程度
を観察することからなる方法である。

使用することができ且つカードの形で保存できる他の平
板凝集反応試１験法は凝集生成物を不透明な背景と対照
させること以外は同じ一般的操作からなる方法である。

使用する抗原は好ましくは死菌の、たとえば加熱殺菌し
た、プルセラ・オヴイス微生物（たとえば、ＮＣＴｃ１
０５１２ ；ＡＴＣＣ２５８４０）の懸濁液である；た
とえば、プルセラ・カニメ含有血清を凝集させる死菌の
全体細胞培養物が得られるだけの温度と時間の間、殺菌
したプルセラ・オヴイスを含有する全体細胞培養物であ
る。

全体細胞のプルセラ・オヴイス含有培養物は次いで、た
とえば前以って重さを測り且つ遠心分離した管中で沈降
させ、上澄液を除去しそして細胞を塩溶液中に所望の濃
度に懸濁して、濃縮するのが好ましい。

積用濃度は］、ｌ当り約１２５７の細胞である。

プルセラ・カニメ感染を検出するために平板凝集反応試
験で使用するには、プルセラ・オヴイス抗原含有懸濁液
を着色するのが好ましい。

実験上、実質的に凝集反応を干渉せずに、すなわち実質
的な凝集阻止効果を有せずに凝集の可視化を高めるかま
たは実質的な偽凝集反応を起す何らかの着色物質を使用
してもよい。

任意の特定着色物質の許容性は公知の抗原、陽性および
陰性被験対象血清の存在下に試験することによって容易
に決定することができる。

典型的な着色溶液はブＩＪ ＩＪアント・グリーン（Ｂ
ｒｉｌｌｉａｎｔ Ｇｒｅｅｎ）２部とクリスタル・
バイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ ）１
部とを緊密に混合し、水３００部に加えそして使用前６
ケ月の間冷凍下に熟成さぜたものである。

他の有用な着色物質はローズ・ベンガール（ＲｏｓｅＢ
ｅｎｇａｌ）である。

この染料はその色の強度の故に不透明表面で使用するの
に特に適合するので、不透明表面が使用される場合に特
に有用である。

凝集物着色物質の量は有効な着色を生ずる量である。

細胞懸濁液の総計細胞濃度は一ト記アルドンおよびジョ
ンズが記載しているごとく充填細胞量法（Ｐａｃｋｅｄ
ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ｍｅｉｈｏｄ）によって測
定するのが好ましい。

最終の全体細胞懸濁液は好ましくは約４％〜約７係の間
の濃度をもつべきである。

目下の所、好ましい濃度は約６％である。

全体細胞懸濁液のｐＨは約６〜約８の間に調節するのが
好ましい。

使用することができる１つの適当な緩衛剤はｐＦ（を約
７．４に調節する０、１５モル燐酸塩緩衛剤である。

着色物質を使用する場合、凝集反応を干渉することなく
最高の着色を達成するために、ｐＨの選択は染料または
着色物質によって支配されることがある。

Ｉローズ・ベンガールを用いた場合、約０．４モル以上
、好ましくは約０．６〜約１モルのトリス（ヒドロキシ
メチル）アミツメクン−マレイン酸緩衛剤を使用するこ
とによって約６９〜７，１、好ましくは７．０のｐＨで
、非特異的凝集反応が最少になることが見出された。

さらに、ローズ・ベンガールを用いた場合、６係の充填
細胞濃度のプルセラ・オヴイス抗原懸濁液Ｌｏｏｍ／当
りローズ・ベンガール０．８１またはそれ以下を使用し
てその非特異的凝集反応が最少になることが見出された
。

典型的には、６％の充填細胞濃度のプルセラ・オヴイス
抗原懸濁液１００ｍ１当り約０．０３Ｐ〜約０６１の間
のローズ・ベンガールを使用する。

前記したように、抗原製剤の混合物、たとえば全体細胞
懸濁液のプールまたはフィルムは抗原および被験対象血
清を平板上で混合することによって形成させる。

被験対象の血清を平板上にのせそして抗原を被験対象の
血清に加えるのが好ましい。

この技術は偽凝集反応が回避されて度合を高めることが
見出された。

さらに、偽凝集反応の回避は累進的に加えそして被験対
象血清を混合することによって避けられる。

典型的な平板試験では、２つの別々の試験を異なった濃
度で同時に行なう。

０．０４ｍ１および０．０２ｍ１の被験対象血清を含有
するプールを基体（すなわち、ガラス板）上にのせそし
て０．０５ｍ１のプルセラ・オヴイス抗原含有全体細胞
懸濁液（６％の充填細胞）をそれぞれに加え、生じる凝
集を観察する。

さらに信頼できる結果をうるには、被験対象の血清を、
菌血症の初めから少なくとも約３週間後、好ましくは４
週間後に得べきである、というのはこの時以前では少な
くとも感染したある被１験対象では陰性または少なくと
も疑わしい凝集反応が証明されることがあるからである
ということが見出された。

凝集の程度を測定する前に経過しなければならない時間
は平板試験を行な・うにはそれほど臨界的ではない。

一般に、５分間の恒温維持時間（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ
ｐｅｒｉｏｄ）が認められる。

一般に完全な凝集反応は２分以内に起ることが観察され
る。

一般に５分以内に、形成されることがある性質の何らか
の凝集生成物が観察されるであろう。

さらに、本発明を次の実施例と関連して記載する。

実施例は本発明を制限するものでなく例として説明する
ものと考えるべきである。

実施例中および明細書を通して全ての部およびパーセン
１へは特記しない限り重量単位である。

実施例 １ 本実施例はプルセラ・カニス測定用の公知技術の凝集試
験を説明するものである。

管凝集試験で使用するための抗原はＣａｒｍｉ−ｃｈａ
ｅｌ、 ｒ犬の閑血症（Ｃａｎｉｎｅ Ｂｒｕｃｃｌｌ
ｏ −３ＩＳ）：単離（Ｉｓｏｌａｔ １ｏｎ） ＋診
断（Ｉ）ｉａｇｎｏｓ ｉ ｓ））伝搬（Ｔｒａｎｓｍ
ｉｓｓｉｏｎ） Ｊ 、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ７
１Ａｎｎ、Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｕ、Ｓ、Ｌｉｖｓｔｏｃｋ
Ｓａｎ、Ａ、 、第１９６７巻、第５１７〜５２７頁
（１９６８年）に記載の通り、菌株ＲＭ６−６６を用い
て、製造した。

接種物用の種として使用した微生物はアルビミ寒天（Ａ
ｌｂｉｍｉ Ａｇａｒ）斜面培地上で３７°Ｃで４８時
間、好気的に増殖させた。

細菌を燐酸塩緩衝剤塩液５、Ｏｍｌを添加して採取し、
０．１５Ｍ。

ｐＨ’７．２ （ＰＢＳ）および約２．５ｍ＃）培養
種懸濁液を前以ってアルビミ寒天１．００ｍ１で層を形
成させた１０個のルーフラスコ（Ｒｏｕｘ ｆｌａｓｋ
）の各各中に接種した。

接種物は無菌ガラスビードを用いて培地表面にいっばい
に広げ、フラスコを３７°Ｃで４８時間、好気的に培養
した。

培養後、ＰＢＳｌｏｍｌを各ルーフラスコに加え、プル
セラ・カニス増殖コロニーはアルビミ寒天培地表面上を
無菌ガラスピードをころがして除去した。

形成した懸濁液を６層の無菌ガーゼを通して注ぎ、各フ
ラスコをさらに１０ｍ、ｌを無菌ＰＢＳで洗浄した。

ルーフラスコから採取物をため、そして１０，０ＯＯＧ
で２０分間遠心分離した。

遠心分離後、上澄液を傾斜し、そして沈殿物のベレット
をＰＢＳで２回洗浄した。

次いでペレットをＰＢ８５０ｍｌに懸濁し、細菌を５０
°Ｃで１時間、加熱して殺菌した。

次いでメーテオレート（ｍｅ ｒ ｔ ｈ ｉ ｏ ｌ
ａ ｔ ｅ ）を０．１％濃度に添加し抗原を貯蔵懸
濁液として４°Ｃで貯蔵した。

管試験は次の様に行なった。

濃縮貯蔵抗原の部分試料を取出しそしてＰＢＳで希釈し
て４２０μの波長で０．１２５の光学密度にした。

管試験は最終希釈度１／２５〜１／２０００（０，０４
゜０．０２ 、０．０１ｍ１等）に相当する疑イつしい
血清量を含有する管に希釈抗原懸濁液２．０ ｍ１部分
を添加して行なった。

試験物を５２℃で４８時間、恒温に維持した後、最終の
読みを読み取った。

凝集反応を、抗原の凝集無しく０）から上澄液の澄明さ
を有する完全な凝集（＋４）までの範囲のＯ〜＋４で記
録した。

実施例 ２ 本実施例はプルセラ・オヴイス抗原を利用してプルセラ
・カニメの検出用平板試２験を説明するものである。

抗原はアルドン（Ａｌｔｏｎ）等、プルセラ症の実験技
術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｉ−ｑｕｅｓ
ｉｎ Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ） （スイス国ジュネー
フ市、ワールド・ヘルス・オーガニゼーション）（１９
６７年）に記載されている方法を変更して使用し製造し
た。

プルセラ・オヴイス（菌株ＲＥＯ１１８２継代培養６回
）を、ＣＯ２１，０％の雰囲気を使用すること以外は実
施例１−でプルセラ・カニメについて記載した様にして
培養した。

実施例１でプルセラ・カニメについて記載した方法と同
じ方法でプルセラ・オヴイスを採取した後、微生物を１
１！当り１２５７の湿潤細胞濃度にＰＢＳに懸濁さぜた
。

懸濁液を５２°Ｃで１時間、加熱して殺菌し、次いで懸
濁液１１当り着色溶液６ｍｌを添加して着色した。

着色溶液（２’ｙ’月間熱成させた）はブリリアント・
グ１１−ン２７およびクリスタル・バイオレット１？か
ら成る微粉末混合物からつくった。

トリチュレ−１へした粉末を蒸留水３００ｍ１に溶解し
、溶液をウアットマン（Ｗｈ ａ ｔ ｍ ａ ｎ）
Ａ Ｉ Ｐ紙を通して濾過しそして暗所に４°Ｃで貯蔵
した。

着色後、各プルセラ・オヴイス製剤の充填細胞量を２本
の７５Ｘ０．９〜１．１朋の毛細管に満たし、粘度でそ
の毛細管に栓をしそしてミクロへマドクリット（ｍｉｃ
ｒｏｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）遠心分離機で５分間遠心分
離にかけて測定した。

懸濁液を６％の充填細胞量に希稀し、ゆるく充填したガ
ラスウールのＩＣｍＸ１ｍのカラムを通して沢過した。

最後に、マーチオレート０．０１％の最終濃度になるよ
うに添加した。

平板試験をガラス板上で疑わしい血清を０．０４゜０．
０２ 、０．０１および０．００５ｍ１量で沈殿させて
行なった。

微量力価滴下器を使用して着色抗原懸濁液の１滴（０，
０５ｍ１）を各測定容量の血清に分配した。

次いで点滴を木製塗布棒を用いて４ＣＴＬの円形区域い
っばいに拡げ、ガラス板を５分間、軽くゆすった。

反応は蛍光を斜めから照らすことによって最もよく観察
された。

凝集反応を実施例１で記載の通り０〜＋４の増分で記録
した。

実施例 ３ 獣医学ウィルス研究協会（ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＶｉｒ
ｕｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）におけ
るコーネル大学（Ｃｏｒｎｃｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ）の病原体のいない特定施設で、飼育された１１匹の
ピーグル犬を隔離して住ませた。

犬をプルセラ・カニメで接種した時に採血した。

各動物から１０ｍ１２の血液を扱き取り、そして１係の
クエン酸すトリウムを添力［山たアルビミ・プルセラ・
ブロス５ｍｌ！ヲ含有する管中にその血液５ｍｌを接種
した。

３７℃で４日間培養した後に、−日全耳の培養物を取出
し、そしてアルビミ寒天平板培地にすしをつけた。

該平板培地をさらに３日間、培養した後に最終的に増殖
の観察を行なった。

残っている５ｍｇの血液が採取した血清を凝集反応試験
を行なうまで一２０℃に冷凍して貯蔵した。

次いで、犬を約１０°コロニー形成単位のプルセラ・カ
ニメ（４２０μにおける光学密度０、１．２５ ）を経
口的に感染させた。

血液培養物と血清試料を一週間の間隔で得た。

管凝集力価を−１，Ｊ−ンプリング後１週間以内に測定
したが、平板凝集反応試験は全ての血清が集められるま
で行なわなかった。

実施例２にしたがって、血清を試験した時には、試料を
ランダムを順序でならべ、各々にコード番号を定めた。

菌血症にかかり始め前に得た１５の試料、菌血症の始め
から１〜３週間後に得た２９の試料および菌血症の始め
から３〜２５週間後に得た９６の試料を含めて、総計１
４０の試料を試験した。

管状１験および平板試験をまた、２匹の市販の飼育犬か
ら集めた７４の血清試料およびプルセラ・カニメ血清学
を求める獣医によって提出された７３の試料を使用して
比較した。

実施例 ４ 次の実施例は平板凝集反応試験の特異性および平板凝集
反応試験の効率を説明するものである。

約４係の充填細胞量の死菌プルセラ・オヴイス懸濁液を
プルセラ・カニメで感染させた犬から得た０、０４ｍ１
量の血清に添加すると、抗原の粒状凝集反応が１分以内
に観察された。

抗原を特異的病原体をもたない犬から得た血清に添加し
た場合は凝集反応は観察されなかったが、プルセラ・カ
ニス声反応する低力価の非特異的凝集素が存在する血清
に抗原を添加した場合はより低い希釈度でいくらかの凝
集反応が観察された。

抗原濃度の増加がこれら非特異的反応を隠蔽するかどう
かを測定するために、４．６．８．１０％の充填細胞容
量に相当する濃度に標準化した抗原を使用してプルセラ
・カニメで菌面症にかかつている４匹の犬から得た血清
およびプルセラ・カニメに感染していないが１／１．０
０以下の管内側の抗体を有する４匹の犬から得た血清の
力価を測定した。

４％以上の抗原濃度を使用した場合、管状験において非
特異的に反応する通常の犬からのある血清においては凝
集反応は減少するかまたは除外された。

しかしながら、６％以トの濃度の充填細胞で調整した抗
原は菌穐症の動物から得た試料では一様により低い力価
を与えた。

この理由から、６％の充填細胞容量を含有する抗原を慣
用するのが好ましい。

診断−ヒ意義のある力価を決定するために、才板凝集反
応試１験を１１匹の感染した犬から得た一連の血清試料
について行なった。

犬が７週間の間、菌血症であった後に集めた全ての血清
は０．０４および０．０２ｍ１血清容量の平板試験抗原
を完全に凝集した。

さらに、３〜７ ｊ”’ｌｆ’４１の間、菌血症であっ
た犬から得た４４の血清のうち３４の甫１清は両方の初
期血清容量中の平板試験抗原を完全に凝集した。

残った試料の全てはそれぞれ０．０４および０．０２ｍ
１中の抗原の１００係および７５係を凝集した。

０．０４および００２ｍ１の血清容量中強力な反応に加
えて、３週間以上の間、菌血症の犬から得た試料は０．
０！および０．００５ｍ１の両方中のある抗原を常に凝
集したが、その量は、２つの低血清量のそれぞれに対し
２５〜１００％の間で変わることが観察された。

第１表・・・プルセラ・カニメの菌血症にある犬から得
た血清および通常の犬から得 たがプルセラ・カニメ抗原の凝集反 応を起させる血清で観察された典型 的な平板状１験反応 同様に、平板試験抗原は通常、００１および０．００５
ｍ１の血清容量において専管力価（１：２００より大き
い）を有する試料によって仏前力価（］：２００より小
さい）を有する試料よりも、より広範囲に凝集させられ
たが、しかしながら、容管の希釈値における凝集反応と
各平板試１験血清容量における凝集反応との間には確実
な相−ｑ関係が観察されなかった。

すなわち、試験した１４０の試料のうち、１４の試料が
］ ： ２００の管内側を有し０．０１ｍ１の血清容量
で５０％以上の平板試１験抗原を凝集させなかった。

逆に、１０の試料は１：１２５〜１：１００の間の管内
側を有し２つの終末希釈度の−方または両方において５
０％以上の平板試験抗原を凝集させた。

この矛盾の故に、他の平板試験抗原で処理した通り、個
々ノ管および平板試験抽清希釈度を平等祝することは不
可能であった。

最初の０．０４ｍ１の血清容量中の平板試験抗原の完全
な凝集反応（±４の反応）および０．０２ｍ１の血清容
量中に７５％またはそれ以上の凝集反応を起させる任意
の血清を陽性とした。

３週間またはそれ以下の間両血症を示す犬から得られた
試料（５５％）の１６〜２９は両方によって陽性に分類
されることがわかった。

しかしながら、閑血症の初めから４週間〜２５週間後の
間で得られた９５〜９６の試料（９９％）は平板状５験
を用いて正しく分類され、９４の試料（９８Ｌ：ｆＯは
管試験を用いて正しく分類された。

平板試験によって止しく分類されていない一試料は０．
０４．０．０２および０．０１ｍ、Ａ！の血清量中の抗
原の７５％を凝集し、一方管方法によって適当に分類さ
れていない、感染した犬から得た血清は１１５０の力価
の抗原と反応した。

陽性の血清の４における平板試験抗原を用いてプロシン
が観察されたが、凝集反応の下降により０．０４ｍ１の
血清容量に限定される様に思イっれた。

４つの試料の全てにおいて、血清は最初の０．０４ｍ１
の血清容量における７５％の抗原を凝集せしめそして残
っている３つの血清容量における１００係の抗原を凝集
せしめた。

菌血症があられれる前に得られた試料は両方の試１験に
よって首尾一貫して陰性であった。

管試験および平板試、験を、２軒の大小屋から得た７４
の血清試料とプルセラ・カニメの血清学について依頼し
ている臨床医から得た７５の試料とを試１験して比較し
た場合、２つの試験の結果の間に優れた相互関係があっ
た。

第２表・・・プルセラ・カニメの血清学について依頼し
ている臨床医から得た試料中 のプルセラ・カニメ凝集素を検出す る際の管試験および平板試験の比較 管試験 平板試験 陽性に 陰性に 陽性に陰性に 入手源 分類 分類 分類 分類犬小屋Ａ
０１５０１５ 大小屋ＢＯ３９０５９ 管試験 平板試験 入手源 陽性に 陰性に 陽性に陰性に分類
分類 分類 分類 臨床上の試料 １２ ６１ １２ ６１総計
１２１．３５ １２１３５ 犬小屋で飼育された動物から得られた７４の試料の全部
を、平板試験操作および管状１験操作の両操作によって
陰性に分類した。

７３の臨床トの試料を検査した場合、管試験および平板
状１験の結果の間には等しく良好な相互関係が観察され
た。

試１験した血清のうち、１２の試料が１ ： ］ ００
以上の資力価の抗体を有していた。

さらに、これらの血清もまた、一定の診断レベルで平板
酸、験抗原を凝集させた。

血清が陽性に分類される１２匹の犬のうち５匹のみから
血清培養物を得ることが可能であった。

プルセラ・カニメは５匹の動物全部の血液から単離され
た。

幾つかの血清（４つの試料）では管状、験において低力
価の反応を示し、１：５０または１ ： １００の希釈
度で部分的な凝集反応を起した。

反応時間の５分後に、血清は０．０４血清量において７
５係はどの多くの平板試験抗原を凝集させた。

しかしながら、どの場合においても、０．０４または０
．０２ｍ１の血清容量のいずれかにおいて抗原は完全に
は凝集しなかった。

管状、験によって陰性の血清はまた、平板試験によって
も陰性であった。

これらの交差反応が、関係するダラム陰性の微生物の抗
原によって起されうるかどうかを測定するために、プル
セラ・アボルトウス（Ｂ、ａｂｏ−ｒｔｕｓ）および他
のダラム陰性の微生物に対して調整した幾つかの抗血清
をプルセラ・オヴイス平板抗原およびプルセラ・カニス
管抗原を用いて試験した。

第３表・・・関係する微生物に対する抗血清を使用した
平板反応と前反応との比較抗血清 同類０菌株
にｊｎｙ−ｑ″９°力 平板凝集反応対する力価
ニスの資力価 ０．０４ ０．０２ ０．０１ ０．０
０５プルセラ・アボルトウス ８００
−プルセラ・ブ七ンキゼプテカ１ ｓｏｏ
’／１ｏｏＰ −−−−プルセラ・
ブロンキゼプテカ２ ５０ −
−プルセラ・オヴイス ５００
５００ ４ ４． ４ ３プルセ
ラ・カニメ ２５０ ２５０
４ ４ ４ ３Ｐはこのレベルでの部
分的凝集を示す あるプルセラ・ブロンキゼプテ力およびプルセラ・アボ
ル１へウス抗血清は管抗原の部分的凝集反応を起すこと
が観察されたが、平板抗原は凝集しなかった。

プルセラ・オヴイス抗血清は診断レベルで平板抗原およ
び管抗原の両方を凝集させた。

このような反応はプルセラ・カニメ抗血清によって起さ
れた反応と区別かつか／Ｓかった。

実施例 ６ 次の実施例は不透明な白色の背景を使用する平板試験を
使用するものである。

緩衝溶液を、トリス（ヒドロキシメチル）アミツメクン
（２４２グ／ｌ）およびマレイン酸（２３２？／ｌ ）
の第１の水溶液２００ｍ／ｌ！と第２の５Ｎ水酸化ナト
リウム溶液７８ｍ１とを混合して調整した。

次いでこの混合物を蒸留水で１１にした。

得られた溶液を以下において０．８モルの１へリス緩衡
剤と記載する。

ローズ・ベンガールの１％染料溶液を、蒸留水１００ｍ
１中にローズ・ベンＬ７゛−ル１２を）容量して調整し
た。

−ｈ記洗浄溶液５ｍｌを死菌のプルセラ・オヴイス懸濁
液１．００ ｙｎｌに添加し、混合物を一夜放置して抗
原製剤を形成させた。

次いで懸濁剤を遠心分離。＊シ、沈殿物を０．８モル１
〜リス緩衡剤で３回洗浄し、次いで６％の充填細胞容量
で０．８モルｌ−ＩＪス緩衡剤に懸濁さぜた。

懸濁液のｐＨは７゜Ｏであった。懸濁液はガラス繊維を
通して沖過した。

白色の不透明シート〔白色の被覆マツナイト繊維板（ｃ
ｏａｔｅｄ １Ｖａｓｏｎｉｔｅ ｆｉｂｅｒ ｂｏａ
ｒｄ ） ）上に疑わしい血清のプール（それぞれ、０
．０４．０．０２．０，０１．０．００５）をつくった
。

プルセラ・オヴイス抗原（上記の通りに調整）０．０５
ｍ１をそれぞれに添加した。

３分間待った後、結果を観察し評価した。

疑しい血清０．０４および０．０２では評価した凝集物
の７５係が陽性であると考えられた。

Ｓ、Ｐ、Ｂ、の陰性の犬として知られている１１匹の犬
を飼って６３の血清試験を得た。

その全てを実施例１（管）の通り管状１験で、そして実
施例２（ＣｏＶ、）の通り平板試１験で試験して陰性で
あることがわかった。

平板試験は上記（Ｒ，Ｒ，）した。プルセラ・カニメで
犬を経口的に感染させ、血液の培養物を、それぞれの週
で取り出し、血清を得、そして全て３ケ月の凝集反応に
ついて試験した（−上記のコ由り、管、Ｃ，Ｖ、および
Ｒ，Ｂ、）：１〜５週 ８０％プルセラ・カニメ陽性（Ｒ，Ｂ、 ）５３係プル
セラ・カニメ陽性（Ｃ，Ｖ、 ）７１％プルセラ・カニ
メ陽性（管） 同様にして７７匹のフィード由来（ｆｉｅｌｄｄｅｒｉ
ｕｅｄ）の犬の血清試料を上記の通り３ケ６〜４５週 ｉｏｏ％プルセラ・カニメ陽性（Ｒ，Ｂ、）９５％プル
セラ・カニメ陽性（Ｃ，Ｖ、）９８係プルセラ・カニメ
陽性（管） 、１て月までに試験した。

管 平板−Ｃ，Ｖ、
平板−Ｒ，Ｂ。

６５プルセラ・カニメ陰性 ６７ブルセラ・カニメ陰
性 ６５プルセラ・カニス陰性９プルセラ・カニメ陽
性 ９プルセラ・カニメ陽性 １０プルセラ・カ
ニメ陽性３ 不 定 １ 不
定 １ 不 定他の染料、緩衡剤
または補助剤を上記例示したものの代わりに添加するこ
とができる。

同様に、上記記載した技術を、技術の実施面の範囲内で
且つ均等の結果を得る範囲内で変えることができる。

特許法の規定にしたがって、本発明および現在最良の具
体例と考えられることを上記に記載した。

しかしながら、本発明の特許請求の範囲の範囲内ならば
、具体的に記載したことは違ったやり方で本発明を実施
することができることを理解すべき実施例 ６ ２４３匹のフィールド由来の犬の血清試料を、実施例１
の通り、管方法、並びに実施例２の平板試験法の両方法
によって試験した。

管方法 実施例２の方法 ２１プルセラ・カニメ陽性 ２０プルセラ・カニス陽性
２２１プルセラ・カニス陰性２２０プルセラ・カニス陰
性１不定 １不定 （７５％以下の凝集） である。

本発明の実施態様および関連事項を要約すれば次の通り
である。

１、プルセラ・カニス菌血症感受性被１験対象の血清を
、プルセラ・オヴイス抗原を利用する凝集反応操作に付
しそして生ずる凝集を測定することを特徴とするプルセ
ラ・カニス菌血症感受性被１験対象のプルセラ・カニメ
感染の診断法。

２、該被験対象の血清を、抗原としてプルセラオヴイス
抗原を含む死菌全体細胞懸濁液を使用する凝集平板試験
操作に付することからなる上記１のプルセラ・カニメ感
染の診断法。

３、懸濁液含有プルセラ・オヴイス抗原が凝集物を着色
し、実質的に凝集反応を干渉しない有効量の染料を含有
する一ヒ記２の方法。

４、該染料がクリスタル・バイオレットおよびローズ・
ベンガールの群から選ばれる染料からなる上記３の方法
。

５、プルセラ・カニス菌血症感受性被、験対象が大斜の
動物である上記２の方法。

６、プルセラ・カニス菌血症感受性被１験対象が犬であ
る上記２の方法。

７、 プルセラ・オヴイス抗原が凝集物を着色し、実質
的に凝集反応を干渉しない有効量の染料（ｅｆｆｅｃｔ
ｉｖｅ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ａｇｇｌｕｔ
ｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ
ｏｆ ａ ｄｙｅ）を含有する上記６の方法。

８、染料がクリスタル・バイオレットおよびローズ・ベ
ンガールの群から選ばれる上記７の方法。

９、 フィルムを形成させる基体上で （ａ） プルセラ・カニス菌血症感受性被１験対象と
（ｂ） 凝集物を着色し、実質的に凝集反応を干渉し
ない有効量の染料を含有するプル七′う・オヴイス抗原
を含む死菌細胞懸濁液。

とを混合する平板試験からなる上記１の方法。

１０、基体が透明である上記９の方法。

１１、染料がクリスタル・バイオレットからなる上記１
０の方法。

１２、基体が不透明でありそして凝集物の色と対照的な
色をしている上記９の方法。

１３、染料がローズ・ベンガールからなる−１−記１２
の方法。

１４、プルセラ・オヴイス抗原懸濁液が、充填細胞法で
測定して、約４係〜約７％の細胞濃度を有する上記９の
方法。

１５、プルセラ・オウ゛イス抗原懸濁液が、充填細胞法
で測定して約６％の細胞濃度を有する上記１４の方法。

１６、血清が、プルセラ・カニス菌血症であると疑われ
る初めから少なくとも３週間後に得られたものである上
記１４の方法。

１、７．（ａ） 少なくとも約３週間の間プルセラ・
カニメに感染しているプルセラ・カニメ感染被験対象の
血清のプールを基体上に形成し、そして （ｂ） これさ、凝集物を着色し実質的に凝集反応を
干渉しない量の染料を含有するプルセラ・オウ゛イス抗
原を含む死菌全体細胞懸濁液とを混合し、 （Ｃ） それによってプルセラ・カニメ感染を示す可
視凝集生成物を形成させる ことを特徴とするプルセラ・カニス感染被１験対象のプ
ルセラ・カニメ感染の診断平板試験法。

１８、プルセラ・カニス感染被１験対象が少なくとも約
４週間の間プルセラ・カニメに感染している上記１７の
方法。

１９、基体が透明でありそして染料がブリリアント・グ
リーンおよびクリスタル・バイオレットの混合物である
上記１７の方法。

２０ 基体が不透明でありそして染料がローズ・ベンガ
ールである−）ｉｉｃ１７の方法。

２１、抗原懸濁液が充填細胞法で測定して、約４係〜約
７％の細胞濃度を有しそして抗原懸濁液対被１験対象の
血清のおよその比が約０，５：０．４〜０．５ ： ０
．０５である上記１８の方法。

２２、抗原懸濁液のｐｉ（が約６〜約８の間にある１−
上記２１の方法。

２３、抗原懸濁液のｐｌ（が約７．３〜約７５の間にあ
り、そして染料がブリリアント・グリーンおよびクリス
タル・バイオレットの混合物からなる上記２１の方法。

２４、抗原懸濁液のｐＨが約６９〜約７１の間にありそ
して染料がローズ・ベンガールからなり、該ローズ・ベ
ンガールは６％の充填細胞濃度を有する抗原懸濁液１０
０ｍ１当り約０．３１〜約０．６？の間に相当する量で
存在している上記２１の方法。

２５．（ａ） プルセラ・Ａヴイス抗原を含み、腓つ
充填細胞法で測定して約４％〜約７％の細胞濃度を有す
る死菌全体細胞懸濁液、および（ｂ） プルセラ・カ
ニス凝集物着色量の実質的に凝集反応を干渉しナリ量の
染料 からなろ抗原含有組成物。

２６、染料がクリスタル・バイオレットおよびローズ・
ベンガールからなる群から選ばれる染料からなる一卜記
２５の組成物′。

２７、組成物が約７．３〜７．５の間のｐＨを有しそし
て染料がブリリアント・グリーンおよびクリスタル・バ
イオレットの混合物からなる上記２５の組成物。

２８、組成物が約６．９〜７．１の間のｐＨを有しそし
て染料がローズ・ベンガールからなり、該ローズ・ベン
ガールが６係の充填細胞濃度を有する抗原１００ｍ１当
り約０．３Ｐ〜約０．６′？の間に相当する量で存在す
る上記２５の組成物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ａ） プルセラ・オヴイス抗原を含み、且つ充填
   細胞法で測定して約４係〜約７係の細胞濃度を有する死
   菌全体細胞懸濁液、 および （ｂ） 抗プルセラ・カニメ抗体とプルセラ・オヴイ
   ス抗原の結合により生じる凝集物を着色し得る量で且つ
   該凝集反応を実質的に干渉しない量の染料 からなるプルセラ・カニメ抗体検出用の抗原含有組成物
   。