JPH05506094A - 放射伝達蛍光検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は標識として蛍光材料を使用する蛍光検定に関するものである。この発 明は抗体および抗原の親和性に基づく免疫検定法に特に適用性を有するが、互い に特定的かつ選択的に結合する他の対の反応原系を使用する他の型の検定にも適 用性を有する。

発明の背景 典型的蛍光サンドイッチ免疫検定法において、未知量の興味ある抗原を含む試料 は固相支持体上に固定化された対応する抗体（モノクローナル、またはポリクロ ーナル）と接触されるとともに、抗原に蛍光的に標識を付けられた抗体を供給さ れる。試料中のいかなる抗原も固定化された抗体および標識を付けられた抗体に 結合し、その結果蛍光的に標識を付けられた固定化された「サンドイッチ」を形 成するであろう。いかなる未結合の試薬が洗い流された後でも、必要ならば適当 な刺激に反応して蛍光標識材料によって放射される光を監視することによって抗 原の存在、または量が示されることができる。

従来の検定において、１分子の蛍光標識材料は典型的に抗体の各分子と結合し、 それによって少量の光しか結合された抗原の各分子について放射されず、それが この技術の感度を著しく制限する。

典型的凝集検定において、未知量の興味ある抗原を含む試料は０．１−１．０ｕ ｍの範囲の大きさの単分散ラテックス球で標識付けされた対応する抗体の溶液に 導入される。

試料中のいかなる抗原も標識付けされた抗体に結合され、多数の結合によってラ テックス球はともに結合するであろう。

溶液の光学特性、特定的には入射光線から散乱された光の角度分布を監視するこ とによっていかなる結合も検出されることができる。この検査は均一であるが、 すなわち別々の洗浄段階を必要としないが、散乱光の検出可能な変化を起すため には数千、または数百刃の結合事象を必要とするため相対的に感度が低い。

この発明は均一検定、すなわち検出に先立ち洗浄段階を必要としない検定を提供 することを目的とする。この発明はまた、少なくとも好ましい実施例において従 来の凝集および蛍光検定より高い感度を有する検定を提供することを目的とする 。

発明の概要 この発明に従って、被検体、または被検体が特定的、かつ選択的に結合する結合 相手の試料における存在を決定するための蛍光検定が提供され、この検定は第１ の蛍光材料Ａで標識付けされた多量の結合相手、または被検体、および第２の蛍 光材料Ｂで標識付けされた多量の結合相手、または被検体に試料を接触させるス テップを含み、Ａで標識付けされた１単位の物質およびＢで標識付けされた１単 位の物質はいずれも一粒子の被検体、または結合相手に同時に結合することが可 能であるか、互いに結合することが可能であり、ＡおよびＢは、適当に刺激され るときＡから放射される光による放射伝達蛍光によってＢが刺激されることが可 能であり、かつＢがＡを刺激するように作用する光によって著しく刺激されない ように選択され、もし必要ならば多量の被検体、または結合相手を試料に加える ステップを含み、Ａの適当な刺激に反応してＢから放射される光を監視するステ ップをさらに含む。

この発明の好ましい局面において、被検体、または被検体が特定的、かつ選択的 に結合する結合相手の試料における存在を決定するための蛍光検定が提供され、 この検定は第１の蛍光材料Ａで標識付けされた多量の結合相手、および第２の蛍 光材料Ｂで標識付けされた多量の結合相手に試料を接触させるステップを含み、 Ａで標識付けされた１単位の結合相手およびＢで標識付けされた１単位の結合相 手はいずれも一粒子の被検体に同時に結合することが可能であり、ＡおよびＢは 適当に刺激されるときＡから放射される光による放射伝達蛍光によってＢが刺激 されることが可能であり、かつＢがＡを刺激するように作用する光によって著し く刺激されないように選択され、Ａの適当な刺激に反応してＢから放射される光 を監視するステップをさらに含む。

放射伝達蛍光の現象は第１の蛍光材料（Ａ）から第２の蛍光材料（Ｂ）へ通過す る光子を含み、逆二乗の法則が、第１の蛍光材料に十分に近接するときだけ第２ の蛍光材料から著しい量の光が放射されるように適用される。この発明の検定を 実行するとき、このことは、Ａで標識付けされた１単位の物質およびＢで標識付 けされた１単位の物質が、たとえばいずれもが−粒子の被検体に結合されること によって近接して結合され、それによってＢからの光の放射が被検体の存在を示 すときにのみ起こるであろう。放射された光の強度を監視することによって、試 料中に存在する被検体の量を示すことができる。

未結合のＢは一般に光を放射しないので、たとえば洗浄することによって未結合 の試薬を除去する必要はない。したがってこの方法は、均一な１ステツプの検定 を提供する。

この方法は定性的、または定量的に使用されてもよく、後者の場合既知の基準に 対する結果とその結果とを比較することによって行なわれてもよい。

ある実施例において、対照目的のために１つは試料を含み、１つは試料を含まな い２つの類似システムから結果を得ることが適当であろう。

等しい数の単位のＡで標識付けされた結合相手およびＢで標識付けされた結合相 手を使用することが好ましい。この場合、以下に説明するようにいかなる二重結 合機構が欠如しても、結合事象の半分では結果的に八で標識付けされた１単位の 結合相手およびＢで標識付けされた１単位の結合相手が１分子の被検体に結合さ れ、ＡＡ、またはＢＢ対よりむしろＡＢ対を形成するであろう。もしＡの各々が １つより多いＢを励起し得るならば、多数の結合事象は存在すれば、感度を高め るであろう。

この発明の方法は典型的に、たとえばサンプル内の興味ある抗体を検出するため に標識付けされた抗原を使用し、そこで２つの標識付けされた抗原が興味ある抗 体の各分子の抗原結合部に結合される免疫検定法に適用を見出す。代替的に興味 ある抗原は２つの型の異なった標識付けされた抗体を使用することによって検出 されてもよく、各抗体の型は抗原の異なる決定因子に結合する。このような配置 の結果、理論的に１００％のＡＢ対が結合において生成されるであろう。結合に おけるＡＢ対の比率を増加するために二重特異性抗体を使用することも可能であ る。この方法は、競合測定法においても使用され得ることが企図され、たとえば 標識を付けられた抗原が加えられた抗体に結合するために競合することによって 試料中の抗原を検出するために使用される。さらなる可能性として、ＡおよびＢ 材料は標識抗体および抗原へそれぞれ使用されてもよい。いかなる標的抗原（ま たは抗体）が欠如しても、ＡおよびＢ単位はすべて一緒に結合するであろう。し かし、いかなる標的抗原も結合部の標識付けされた抗原と競合し、したがって、 信号レベルを低減するであろう。

この発明の方法は当業者に明らかなように、酵素、またはＤＮＡ種の検出のため 、および他の材料の検出のためにも使用され得る。た七えばＤＮＡ検査について 、ＡおよびＢ標識が効率的な放射蛍光伝達のために十分に近接している、すなわ ち標識Ｂが標識への数粒径内であるべきであるように、標的ＤＮＡ上の特定の部 位に結合するであろう２つの異なるＤＮＡプローブにＡおよびＢ標識が結合され てもよい。この技術は標的基質に結合する酵素で標識をコーティングすることに よってコレステロールのような分子を検出するためにも使用され得る。原理にお いてその反対、すなわち基質でコーティングされた標識による酵素の検出も可能 である。

発せられた光の量を増加し、および従ってこの方法の感度を改良するために、結 合相手の各単位は好ましくは１個より多い分子の蛍光材料Ａ、またはＢで標識付 けされる。

これは１個の適当な担体材料の粒子にＡまたはＢの多数の分子を被包し、その粒 子に結合相手を付着させることによって都合よく達成される。この粒子は便宜土 工ないし１００ミクロンの範囲の直径を有する微球体、または微粒子の形式にあ る。このように結合相手の各単位はおそらく１０６ないし１０１２の範囲の多数 の蛍光体を含み、実質的な増幅効果を与えてもよい。

蛍光材料が有機色素溶液である場合、水と混和しない溶媒中の乳剤、蛋白質のマ イクロカプセル、および（カーボンを使わないコピー紙に使用されるように）ア ラビアゴムのような炭水化物を形成することによって、ポリアクリルアミド、ポ リスチレンまたはナイロンのようなポリマーのその場的な重合によって、色素の 液滴のまわりのポリマーの沈殿によって、または他の方法によって多数の分子が 、架橋結合されたゼラチン、または他の蛋白殻に被包されてもよい。さらなる詳 細については、１９７９年のマーセル・デツカ−株式会社（Ｍａ＋ｃｅｌ　Ｄｅ ｋｋｅ＋　Ｉｎｃ、）のＡ−コンデ−（Ａ、Ｋａｎｄｅｒ　）およびＪ−Ｗ−フ オンファルケンバーグ（Ｊ、　Ｌ　ｗｏｎ　Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇ）の「マイク ロカプセル処理および技術（Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ 　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ７）　Ｊを参照されたい。

蛍光材料がネオジムイオン（Ｎｄ３°）のような固体蛍光体、または他のレーザ 媒体を含む場合、これらはガラス、または類似の宿主に便宜上ドープされ、微球 体の形式に生成されるか、小さい粒子に粉砕されてもよい。

抗体を含む蛋白質は広範囲の既知の技術によって粒子に結合されてもよい。１つ の技術は１９８８年のコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（！Ｉ！＋＋１１１＋ｔａｂ、）のＥ　・バーｏ　−（Ｅ、 　Ｈａｒｌｏｔ　）およびＤ−レイン（Ｄ、　Ｌａｎｅ　）による［抗体：研究 マニュアル（Ａｎｊｉｂｏｄｉｅ＋：　ａ　Ｉｘｂｏ＋ａｆｏｒｙ　ｆｆ１ａｎ ＬＩａｌ）　Ｊ第１４章に説明されるような非共有吸収である。共有結合の範囲 がたとえばグルタルアルデヒド、ｐ、ｐ’　ジフルオロ−ｍ、ｍ’　−ジニトロ フェニールスルホン（ＦＮＰＳ）または類似の二価性試薬を介する吸収蛋白質に 使用されてもよい。１９８６年り、　Ａ。

ハーゼンバーブ、ブラックウェル（Ｌ、　Ａ、　Ｈｅｔｘｅｎｂｅｔｇ。

８１ａｃｋｖｅｌｌ　）のＤ−Ｍ−ツイヤ−（Ｄ、　Ｍ、Ｗｅｉｔ）　ｇｉ集の 「実験免疫学のハンドブック：１、免疫化学（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　。

Ｉ　ｅｒｐｅｒｍｅｎｌａｌ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ７：　１．　ｉｎｎｕｎｏｃ ｈｅｍｉｓｆｒ７）　Ｊ　ｐ　３５．２６．を参照されたい。蛋白質は臭化シア ン、塩化トシルなどの処理の後に「活性」プラスチックに直接結合されるか（バ ーローおよびレインのｐｐ５２８−９を参照された（す、または（たとえば米国 、インディアナ州カーメル（Ｃａｒｍｅｌ、Ｉｎｄｉａｎｘ、Ｕ、Ｓ、＾）のパ ンゲス・ラボラトリ−・イン−１−ボレーテッド（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂ　Ｉｎｃ 、）によって製造されるような）トシル、塩化物などのような界面活性基を有す るビーズに直接結合されてもよい。

ＤＮＡプローブは、ＤＮＡにビオチンで標識付け、これをアビジンに結合するこ とによって、前述のようにそれ自体ビーズに結合されて（たとえば１９８９年版 の「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａ「ｃｈ）　ＪのＴ・ハルツマン（Ｔ、　Ｈｕｌｔ＋ｎａｎ）　、Ｓ　・スタ ール（Ｓ、　５ｌａｈｌ）　、Ｅ−ホーン（Ｅ、　Ｈｏ＋ｎｅｓ　）　、Ｍ　・ ユーラー（Ｍ、　Ｕｈｌｅ＋）の「固相支持体として磁気ビーズを使用するゲノ ムおよびプラスミドＤＮＡの直接固相シーフェンシング（ｆ）ｉｒｅｃｌ　５ｏ ｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　＋ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎｄ　 ｐｌａｏｎｉｄ　ＤＮＡｕｓｉｎｇ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ａｎｄ　 ＋ｏｌｉｄ　＋ｕｐｐｏ＋ｌ　）　Ｊを参照されたい）か、共有にＵＶ光を使用 する架橋結合によって（Ｅ−Ｗ−に−ランジャン（Ｅ、　Ｊ　に、Ｌａｎｄｉｉ ａｎ　）の「バイオテクノロジー５　（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　）　 （１９８７）の１６５−１６７頁の「ニトロセルロースおよびナイロン膜に吸着 され、かつ固定されたＤＮＡの最適化されたハイブリダイゼーション（Ｏｐｔｉ ｍｉｓｅ＋Ｉ　ｈ７ｂ＋１ｄｉｓｘｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｌ。

ｆｌｅｄ　ａｎｄ　Ｉｉｗｅｄ　ｔｏ　ｎｉｔ「ｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ 　ｎｙｌｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）」を参照されたい）か、反応性官能基をＤ ＮＡに導入することによって（たとえば「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ↓ 河Ｊ　（１９８７）２８９１−２９０９頁のＪ−Ｎ・クレムスキー（Ｏ，Ｎ、　 Ｋｒｅｍｇｋｒ　）　、Ｊ−Ｌ　・ウータース（＋、Ｌ、Ｗｏｏｌｅｎｓ　）　 、Ｊ−Ｐ　・　ドーハーテ４　（Ｊ、Ｐ、Ｄｏｕｇｈｅ＋ｔＴ）　、Ｒ，Ｅ、　 フイヤース（Ｒ，Ｅ、Ｍｅｙｅｒｓ）　、Ｍ　・コリンズ（Ｍ、　Ｃｏｆｆ１ｎ ｓ）　、Ｅ　−Ｌ−ブラウン（Ｅ、Ｌ、Ｂ「ｏｗｎ　）の「５′末端においてア ルデヒド、またはカルボン酸基を含むオリゴヌクレオチドを介するＤＮＡの固定 化（ＩｍｍｏｂｉＩｉｓａｆｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡｖｉａ　ｏｌｉｇｏ＋＋ｕｃ ｌｅｏｌｉｄｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａｎ　ａｌｄｅｈ７ｄｅ　ｏｒ　ｃ ａ＋ｂｏＢｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｇｒｏｕｐ　ａｔ　ｔｈｅ　５’　ｔｅｒｍｉｎ ｕｓ　）」、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ１５Ｊ　（１９８７）の３１ ３１−３１３９頁のＢ−コナリー（Ｂ、Ｃｏ＋＋ｎｏｌｌＹ）の「５′末端にお いて一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成（Ｔｈｅ　５ｙｎｌｈｅｉｓ 　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ＋１ｄｅｓ　ｃｏｎｌａｉｎｉｎｇ　ａ　ｐ＋ ｉｍａ＋７　ａｍｉｎｏｇｒｏｕｐ　ａｌ　ｔｈｅ　５’　ｔｅ「ｍ１ｎｕｓ） 　Ｊ、・ポケット（Ｓ、Ｐａｃｋｅｔ　）　、Ｂ　・アーケインジオリ（Ｂ、　 Ａ＋ｃａｎｇｉｏｌｉ　）　、Ｔ、　ハイディン（Ｔ、　Ｈｕｙｎｈ−Ｄｉｎｈ 　）の「固相支持された結さつプライマー（Ｓｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｒｔｅｄ　 ｌｉｇａｆｉＨｐｒｉｍｅ「）　Ｊを参照されたい）、このようなビーズに結合 されてもよい。ＤＮＡは、酵素または化学的手段を使用して（リンカ−ＤＮＡに よって予め誘導体化されている）支持体に結合されてもよい（ポケットらの同書 を参照されたい）。

ガラス微粒子を検討するとき、抗体を含む蛋白質は前述のように、本質的にはプ ラスチックに関してガラスに結合されてもよい。特定的に蛋白質は清潔なガラス 面に吸収されるか、活性ガラスに共有に架橋結合されてもよい。ＤＮＡは再度本 質的には前述のように非共有に吸収されるか、活性ガラスに架橋結合されてもよ い、たとえば［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ１３Ｊ　（１９８７）の５３ ５３−５３７２頁のＳ−８・ゴーシュ（Ｓ、Ｓ、　Ｇｂａｃｈ　）およびＦ−Ｇ −ムッソ（Ｆ、　Ｇ、　Ｍｕｃｓｏ　）の［固相支持体ヘノオリゴヌクレオチド の共有付着（Ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａＨａｃｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｆｉｄｅ　ｔｏ　＋ｏｌｉｄ　＋ｕｐｐｏｒｔｓ）　Ｊを参照されたい。

適当な対の蛍光材料ＡおよびＢが、Ａが第１の波長（または第１の波長領域内） Ｌ＋の光によって刺激され、第２のより長い波長（または波長領域）Ｌ２の光を 放射し、これが順にＢを刺激して第３のより長い波長（または波長領域）Ｌ３の 光を放射するように選択され得る。Ｌ、およびＬ２が重ならずに互いに区別され ることも必要であり、それによって波長Ｌ１の光への照射上のＢの所望されない 刺激が生じない。

これらの必要条件を満たす１つの好ましい対の材料は次のとおりである。

Ａは、たとえばラムダ・フィシツク（Ｌａｍｂｄａ　Ｐｈ７ｓｉｋ　）および他 の製造業者から商業的に入手可能な色素スチリル９　（Ｓｌｙｒｙｌ　９）であ る。スチリル９色素の吸収および蛍光特性を示すグラフは、１９８５年７月の「 オプティックス−コミュニケーションズ（Ｏｐｔｉｃｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔ ｉｏｎｓ　）　Ｊ、第５４巻、第５号の２９５−２９８頁のＪ−Ｊ−Ｌ・マルダ ーズ（＋、１．　Ｌ、　Ｍｏ１ｄｅ「ｓ）　、およびＬ−Ｗ−Ｇ−スティンハイ セン（Ｌ、　Ｗ、　Ｇ、５ｔｅｅｎｈｕｙｓｅｎ）による「単一モードのＣＷリ ングレーザ動作のためのローダミン６Ｇ／ローダミン５６０の、およびスチリル ８／スチリル９の色素および色素混合物の性能（Ｔｈｅ　Ｐｅｔｆｏｔｍｘｎｃ ｅ　ｏｆ　ＤＨｓ　ａｎｄ　ＤＹｅＭｉｘｔｕｒｅｓ　Ｏｆ　Ｒｈｏｄａｍｉｎ ｃ　６Ｇ　／　Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　５６０　ａｎｄ　ｏｆ　５Ｉ７ｒ７＋　８ 　／　５ｔ７ｒ７１９　ｌｏ「Ｓｉｎｇｌｅ　ｈｄｅ　ＣＷ　Ｒｉｎｇ　Ｌｘｓ ｅ＋　Ｏｐｅ＋ａｔｉｏｎ　）に与えられる。簡潔に言えば、Ｌ、は約６５０ｍ ｍであり、Ｌ２は７００−８００ｍｍである。

Ｂは、たとえば６６ｗｔ％５ｉ０２．５ｗｔ％Ｎｄ２Ｏ３，１６ｗｔ％Ｎａ２Ｏ ，５ｗｔ％ＢａＯ１２ｗｔ％Ａｌ２Ｏ３および１　ｗ　ｔ％５ｂ２０３の組成を 有するＮｄガラスの形式の固体蛍光体Ｎｄ３”である。このような材料は６５０ ｎｍぐらいの非吸収領域を有しくスチリル９について励起波長Ｌ＋　）　、７４ ０ｎｍおよび８１０ｎｍで励起ピークＬ２　（すなわちそれらの波長の中心に置 かれる２Ｏｎｍ幅の吸収ピーク）、１１０６０ｎの蛍光波長Ｌ３および約０，４ の量子効率を有する。さらに、これは０．１および１ｍｓの間の長い蛍光寿命を 有し、後述のように色素Ａの蛍光に対する時間ゲートを許容する。これによって 同じく後述のように粒径が直接励起による最小のバックグラウンドについて最適 化されることが可能になる。

蛍光伝達の伝達効率は極めて低く、したがって条件を最適化して、できるだけ全 体の利得を向上させることが重要である。特にできるだけバックグラウンド信号 を低減することが重要である。

バックグラウンド信号は３つの主な源から発生し得る。

１、Ｌ１光子の検出 ２、Ｌ２光子の検出 ３、Ｌ、光子によるＢの直接励起 時間ゲートはこれらの源の始めの２つから生じるバックグラウンド信号の可能性 を除去するために使用されてもよい。これは材料Ａより長い蛍光減衰時間を有す る蛍光材料Ｂを使用することと、Ａの蛍光の終了後（すなわちＡのわずかな蛍光 寿命後）Ｌ３光子を検出することとを含む。Ｎｄガラスの蛍光減衰が０．１およ び１ｍｓの間であるのに対しスチリル９は約１Ｏ−１５ｎｓの蛍光減衰を有する ので、前述の好ましい対の材料はこの条件を満たす。

源１および２が除去されたので、相対的な球の大きさ、１　個数密度などのよう な条件は、源３からのバッグラウンドｒ　信号を最小にするように調整され、源 １および２におけるこのような調整の対立する効果を心配しないでよい。単純な 理論的モデルに基づく計算は、Ａで標識付けされた粒子の半径（ｒＡ）がＢで標 識付けされた粒子の半径（ｒｅ　）の１０倍で良い結果を得られ得る。適当な粒 径は、ｒＡ＝１００ｕｍ、ｒ［Ｉ＝１０ｕｍであってもよい。

結合における蛍光の増加およびしたがって感度はＡ蛍光を吸収するがそれ自体蛍 光を発しない材料Ｃを加えることによって増加され得る。これは結合状態の信号 に影響を与えずに蛍光を発する溶液中の未結合のＢによるバックグラウンド信号 の低減効果を有する。

材料Ｃは好ましくはＡを励起するために使用される波長の光の低い吸光度を有す るが、これは必須のものではない。

前述の好ましい材料ＡおよびＢについて１つの適当な材料ＣはＩＣＩ・カラーズ ・アンド・ファイン・ケミカル（ＩＣＩ　Ｃｏ１ｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｆｉｎｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　）から商業的に入手可能な５１０１７５６として既知の色素 である。この色素は無極性溶媒に可溶性があり、７７０ｎｍをピークとする高い モル吸光係数（約１２０．０００　）を有する。類似の特性を有するが、水溶性 があり、５１１６５１ｆｌとして既知の色素も、広帯域赤外線吸収色素３１０９ １８６、および５１０９５６４と同様利用可能である（ＩＣＩ・テクニカル・デ ータ・シートを参照されたい）。

ＩＲＩ４０　、ｌＲ１３２のようないくつかのレーザ色素を含む各種の代替的色 素があり、これらはその吸収特性を維持する一方でその蛍光が消され得ると仮定 すれば使用されることができる。

非特異結合によって、すなわち試料中の外来の生体材料による標的被検体の欠如 におけるＡおよびＢで標識付けされた物質量の結合によって問題が生じ得る。標 識付けされた被検体、または結合相手の注意深い選択以外によってこの効果を低 減することは不可能である。しかし、この効果の大きさは存在する被検体の量を 過大に見積らないために監視されるべきである。非特異結合を監視する１つの方 法は、抗原（ＡおよびＢで標識付けされたものとは異なる）に第３の材料で標識 付けすることである。この抗原はＡに対する非特異結合をＢと同程度有するよう に選択され、その標識はＬ２を吸収し、かつＢへ異なる波長、たとえばＬ４で蛍 光を発するか、または代替的にＬ２を吸収し、かつ蛍光を発しないように選択さ れるであろう。第１の場合において、第２の検出器およびフィルタはＬ４におけ る光の量を監視し、したがって非特異結合の量を決定し得る。第２の場合におい て、検出器はＬ２における光の量を監視し、これはもし非特異結合が発生すれば 減少するであろう。第２の場合において、標識が材料Ｃと同じ特性を有し、蛍光 利得を増加するために使用されることが必要とされ、したかって、適当な非特異 抗原でコーティングされた色素Ｃを含む微球体を使用することが可能であること が理解されるであろう。

照射源は便宜上せん光ランプか、発光ダイオード（ＬＥＤ）である。これらは次 の特性を有する。

せん光ランプ　ＬＥＤ 平均出力　Ｑ、　ｉｆ　Ｗ　ｌＯｍＷ （２０ｎｍ帯域内） 波長　白色光　６６０±１５　ｎ＋１１パルス速度　１００　Ｈｒまで　Ｉ　Ｍ Ｈｚまで指向性　４　ｐｉミステラジアン約１ステラジアンＬＥＤはやや力が弱 いが、より高いその指向性によって試料へのより効率的な結合が許容され、かつ ｋＨｚ周波数で変調されて、位相検波を許容し得る。これは廉価でもあり、バン ドパスフィルタを必要としなくてもよい。これら”の理由でＬＥＤは現在好まし い源である。

１１０６０ｎ波長における低減された応答性にもかかわらず、現在好ましい光検 出器はシリコン光ダイオードである。標準装置（ＢＰＸ６５）は約３Ｘ１０〜Ｉ 　４　Ｗ／、ｆＨ２のＮＥＰを有する。広範囲の光ダイオード（１０ｍ２）は約 １　ｐＷ／（Ｈｚ（ＤＮＥＰを有する。

この発明の検定は高感度で、おそらく適当に最適化された条件下で数千の粒子の 標的材料だけを検出することが可能であり、比較的廉価で小型の装置を使用して 実行されることができ、かつ抗体、酵素、ＤＮＡなどの検出に広範囲の適用性を 有すると考えられる。

この発明の好ましい実施例が添付の図面を参照して例示によってこれより説明さ れるであろう。

図１はこの発明の方法を実行するための装置を概略的に示す。

図２は図１の装置のタイミングサイクルを示す。

図面の簡単な説明 図１に示される装置は試薬を受けるための５００ｍｍ３の容量を有するキュベツ ト１０を含み、これは楕円反射器１２内に位置決めされる。ＬＥＤ１４および関 連のレンズ１６は反射器の外側の反射器の軸上に位置決めされ、反射器内の適当 な開口１８を介してキュベツト上に照射光を供給する。ＬＥＤ１４は次の特性を 有する。

平均出力　１０ｍＷ 波長　６６０±１５ｎｍ パルス速度　ＩＭＨｚまで 指向性　約１ステラジアン この装置はさらに反射器軸上に位置決めされるシリコン光ダイオード光検出器２ ０を含む。軸外結像性能が比較的乏しいため、約１１）Ｗ／７Ｈ２のＮＥＰ　（ ノイズ等価電力）を有する約１０ｍ２の比較的広範囲の検出器２０を使用するこ とが適当である。代替的に検出器はキュベツトによって直接位置決めされ得る。

さらなる可能性として、やや費用がかかるか、二色フィルタが、キュベツトから のポンプ放射および蛍光放射を選択的に反射し、かつ透過するように使用されて もよい。

使用において、未知量の興味ある物質、たとえば特定の抗体を含む適当量の試料 がキュベツト内に置かれる。試料中の抗体の存在、または量を決定するために、 抗体に対応し、かつ２つの異なる蛍光材料ＡおよびＢで個別に標識付けされた多 量の抗原がキュベツトに加えられる。蛍光材料ＡおよびＢはいずれも前述のよう に被包された微球体の形式にあり、抗原は同じく前述のようにその表面に結合さ れる。

現在好ましい配合において、材料Ａは前述のように色素スチリル９であり、これ は前述の技術の１つによって、たとえば色素の液滴のまわりのポリアクリルアミ ドのようなポリマーの重合によって被包され、半径１１００ｕの微球体を形成す る。球の個数密度Ｎは１０ｍｍ−３ないし１０００ｍｍ−３の範囲である。材料 Ｂは前述のようにＮｄガラスであり、半径１０ｕｍの微球体に形成されるか、粉 砕される。いずれの型の球にも、抗原が前述の技術の１つによって、たとえば非 共有吸収によって表面に結合される。

はぼ等しい数のＡで標識付けされた球およびＢで標識付けされた球が使用される 。

多量の蛍光吸収色素５ＩＧＩ７５６　（材料Ｃ）もまた、溶液の形式か、または 半径１ｕｍの微球体として被包されてキュベツトに加えられる。

キュベツトはＬＥＤ　ｌ　４によって照射され、放射された光は図２に示される タイミングサイクルに従って検出器２０によって監視される。図示されるように 、ＬＥＤ１４は短い分離された間隔２２の開作動され、その時間検出器２０がオ フに切換えられる。キュベツト１０の内容物の照射によってＡは蛍光を発し、興 味ある抗体の同じ分子にいずれも結合される隣接する対のＡおよびＢで標識付け された微球体に対する放射伝達蛍光によってＢが結果的に蛍光を発する。Ｂから の蛍光の存在、したがって、図２に示されるタイミングは興味ある抗体の存在を 示す。

前述のタイミングゲートの効果を利用するために、検出器２０はＬＥＤ１４がオ フに切換えられている間分離された間隔２４において作動され、小さい時間間隔 ２６はＬＥＤ１４のオフへの切換えと検出器２０のオンへの切換えとの間そのま まにされ、（数マイクロ秒の間）Ａの蛍光が十分に減衰することを許容する。小 さい時間間隔２８は検出器２０のオフへの切換えと次のサイクルの開始時のＬＥ Ｄ１４のオンへの切換えとの間そのままにされて、照射光の所望されない検出の いかなる危険性も回避する。

「ブランクＪキュベツト、すなわち標識付けされた試薬を含むが検査試料を含ま ないキュベツトに対する検定を参照することが望ましいであろう。したがってこ の装置は図１に示されるように、検査試料ではないが標識付けされた試薬を受け るための第２のキュベツトおよび関連の構成要素を含んでもよい。いずれのキュ ベツトから発せられた光も周期的に測定され、標的被検体の量がその結果を比較 することによって決定される。

ある形式の混合／かくはんもまた、適当なタイムスケール、たとえば数分間で結 合が生じるために必要であろう。

二、三千個の興味ある標的粒子の存在を検出することが可能であろうと考えられ る。

要約 被検体、または被検体が特定的かつ選択的に結合する結合相手の試料における存 在を決定するための蛍光検定であって、第１の蛍光材料Ａで標識付けされた多量 の結合相手、または被検体と、かつ第２の蛍光材料Ｂで標識付けされた多量の結 合相手、または被検体と試料を接触させるステップを含み、Ａで標識付けされた １単位の物質およびＢで標識付けされた１単位の物質はいずれも一粒子の被検体 、または結合相手に同時に結合することが可能であるか、互いに結合することが 可能であり、ＡおよびＢは、適当に刺激されたときＡから発せられる光による放 射伝達蛍光によってＢが刺激されることが可能であり、かつＢがＡを刺激するよ うに作用する光によって著しく刺激されないように選択され、この検定は必要な ら多量の被検体、または結合相手を試料に加えるステップを含み、Ａの適当な刺 激に反応してＢから発せられた光を監視するステップをさらに含む。

好ましい組合わせは色素スチリル９（Ａ）と、Ｎｄガラス粒子の形式のＮｄ３” 　（Ｂ）とである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．被検体、または被検体が特定的、かつ選択的に結合する結合相手の試料にお ける存在を決定するための蛍光検定であって、第１の蛍光材料Ａで標識付けされ た多量の結合相手、または被検体と、かつ第２の蛍光材料Ｂで標識付けされた多 量の結合相手、または被検体と試料を接触させるステップを含み、Ａで標識付け された１単位の物質およびＢで標識付けされた１単位の物質はいずれも一粒子の 被検体、または結合相手に同時に結合することが可能であるか、または互いに結 合することが可能であり、ＡおよびＢは、適当に刺激されたときＡから発せられ た光による放射伝達蛍光体によってＢが刺激されることが可能であり、かつＢが Ａを刺激するように作用する光によって著しく刺激されないように選択され、こ の検定はもし必要ならば多量の被検体、または結合相手を試料に加えるステップ を含み、Ａの適当な刺激に反応してＢから発せられた光を監視するステップをさ らに含む、蛍光検定。
2. ２．被検体、または被検体が特定的、かつ選択的に結合する結合相手の試料にお ける存在を決定するための蛍光検定であって、第１の蛍光材料Ａで標識付けされ た多量の結合相手と、かつ第２の蛍光材料Ｂで標識付けされた多量の結合相手と 試料を接触させるステップを含み、Ａで標識付けされた１単位の結合相手および Ｂで標識付けされた１単位の結合相手はいずれも一粒子の被検体に同時に結合す ることが可能であり、ＡおよびＢは、適当に刺激されるときＡから発せられた光 による放射伝達蛍光体によってＢが刺激されることが可能であり、かつＢがＡを 刺激するように作用する光によって著しく刺激されないように選択され、Ａの適 当な刺激に反応してＢから発せられた光を監視するステップをさらに含む、蛍光 検定。
3. ３．結合相手の各単位は１つより多い分子の蛍光材料Ａ、またはＢで標識付けさ れる、請求項１、または２に記載の検定。
4. ４．ＡまたはＢの多数の分子は適当な担体材料の一粒子内に被包され、かつ被検 体、または結合相手はその粒子に付着される、請求項３に記載の検定。
5. ５．粒子は１ないし１００ミクロンの範囲の直径を有する微球体、または微粒子 の形式にある、請求項４に記載の検定。
6. ６．蛍光材料Ａは色素スチリル９であり、蛍光材料ＢはＮｄガラスの形式の固体 蛍光体Ｎｄ３＋である、前述の請求項のいずれか１つに記載の検定。
7. ７．蛍光材料Ｂは材料Ａより長い蛍光減衰時間を有し、材料Ｂから発せられた光 はＡの蛍光の終了後検出される、前述の請求項のいずれか１つに記載の検定。
8. ８．Ａで標識付けされた粒子の半径（ｒＡ）はＢで標識付けされた粒子の半径（ ｒａ）の１０倍である、前述の請求項のいずれか１つに記載の検定。
9. ９．Ａから発せられた光を吸収するが、それ自体蛍光を発さない材料Ｃを試料に 加えるステップをさらに含む、前述の請求項のいずれか１つに記載の検定。
10. １０．蛍光材料Ａは色素スチリル９であり、蛍光材料ＢはＮｄガラスの形式の固 体蛍光体Ｎｄ３＋であり、材料ＣはＳ１０１７５６、Ｓ１１６５１０、Ｓ１０９ １８６、Ｓ１０９５６４、ＩＲ１４０、およびＩＲ１３２として既知の色素から 選択される、請求項９に記載の検定。
11. １１．非特異結合は、さらなる抗原に第３の材料で標識付けすることによって監 視され、さらなる抗原はＢと同程度のＡへの非特異結合を有し、標識はＡから発 せられた光を吸収し、かつＢへ異なる波長で蛍光を発するか、または蛍光を発さ ない、前述の請求項のいずれか１つに記載の検定。