JPS60233555A - 螢光エネルギ−移動を使用する抗遺伝子型検定 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、可溶性の物質または分析物（ａｎａ
ｌｙｔｅ）、例えば、抗原を検出するために有用な免疫
検定方法に関し、さらに詳しくは、本発明は抗体の１つ
の免疫学的反応に基づく２つの異る型の抗体間の距離ま
たは配向の変化を検出することに頼る均一系検定（ｈｏ
ｍｏｇｅｎｏｕｓ　ａｓｓａｙ）に関する。

体液、例えば、血液、痰、尿などの中の特定した抗原類
（動物中へのその導入が、それと特異的に反応すること
ができる抗体の生産を刺激する物質として定義される）
、ハブテン類（動物中へのその導入がそれに対して特異
性の抗体の生産を刺激する前に、追加の補助物質を必要
とする物質）などの物質（以後、一括して分析物と呼ぶ
）は、最近、研究および臨床的環境の両者において最も
重要になってきた０分析物、とくに抗原および抗体の検
出は、しばしば種々の病気の状態に関連することがあり
、結局、診断において、ならびに病気の発生に関する基
本的理解を獲得しならびにその治療効果を監視するとき
極めて有用である。

結局、水性試料中の分析物を検出するための改良された
方法は絶えず探究されている。とくに、検定は典型的に
はその速度および用いる設備ならびにその感度により特
徴づけられる。好ましい検定はより短い時間で実施する
ために要する努力が少なくかつより大きい感度により特
徴づけられるものである。

不均一系検定として知られる検定の１つのクラスにおい
て、検定すべき物質を含有する試料を反応成分と混合し
、免疫学的反応を起こさせた後、得られる成分を可溶性
相および不溶性相に分離し、モして一方または他方を検
出可能な標識の存在について分析する。このような不均
一系検定は、不利なことには、分離および洗浄の工程な
らびにこれらの工程を達成するための補助の物質および
装置を必要とする。

本発明の目的は、標識の検出前に分離工程を必要としな
い均一系免疫検定を提供することにより、これらの欠点
を回避することである。

免疫検定は一般にタンパク質１例えば、抗体、抗体断片
またはさらには人工的に発生させたペプチド（以後、一
括して結合パートナ−と呼ぶ＞ｔ３よびそれらに対して
特異性の物質の間の免疫学的反応に基づく、これらの物
質を以後−・殻に分析物と呼ぶ、免疫学的反応は、一般
に、それらの特異性により特徴づけられ、したがって、
この特徴の利点を得るために多数の方法が開発されてき
ている。典型的には、このような方法は精製された抗原
を、測定される抗原および標識付けされかつ固定化され
た抗体と拮抗（ｃｏｍｐｅｔｅ）させること、あるいは
相互に反応性の多数の固定化されかつ標識付けされた抗
体および抗原を必要とする。精製された抗原を抗体上の
結合部位について試料の抗原と拮抗させることを必要と
する技術は、特異性のパートナ−と結合させるために十
分に無傷の形で精製された抗原を生成させるためには、
困難なかつ経費を要する製造方法を不利なこ々、には必
要とする。これは、抗原が細胞表面の受容体である場合
、とくに困難である。

本発明の目的は、精製された抗原または分析物との拮抗
に頼らず、こうして精製された無傷の抗原の生産に関連
する前述の困難なかつ経費を要する製造方法を必要とし
ない、拮抗検定を提供することである。

Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ　ｅｔ　６１．は、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２１５：１６３７−１６３９（１９８２）中で、
試料の抗原と精製された研究者が供給する抗原との拮抗
に頼らない、拮抗固相放射線検定法を記載している。そ
の代わり、Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇは抗遺伝子型（ａｎ
ｔｉ−ｉｄｉｏ　ｔ　ｙ　ｐ　ｅ）抗体の使用を記載し
ている。遺伝子翠は、特定の型の抗体に関連する（ａｓ
ｓｏｅｉａｔｅ　ｗｉｔｈ）が、−一般的な抗体の部類
の他の構成員に関連せず、かつ遺伝子型に特異的に反応
しうる抗体がそれについて生じうる、個々に特異性の抗
原決定因子として定義することができる。例えば、遺伝
子型は一般に抗体の可変領域と関連すると考えられ、そ
してまた抗原の結合部位の全部または一部からなること
ができる。これに対照的に、アロタイプ（ａｌｌｏｔｙ
ｐｅ）の決定因子は前記部類のすべての構成員に共通し
て関連する決定因子であり、そして、例えば、抗体のＦ
ｃ部分または非可変領域を含むであろう。

本発明の目的は、抗遺伝子型抗体のアプローチを利用し
、このような抗体が提供しうる利益を得ることである。

従来、抗遺伝子型抗体は、免疫機能およびこのような系
が自己免疫病を破壊する方法の研究において一般に使用
されてきている。これらの面に関する参考文献は１次の
通りである：Ｂｒｉ　ｅｎｔｅ　ｔ　ａ　１　：　＋　
“ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏ
ｎｓ　ｏｆ　Ｉｄｉ。

ｔｙｐｉ’ｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、１３２：９５１−９６２（１９７０）：Ｇｅ
ｈａ　ｅｔ　ａｌ、、”Ａｎｔｉ−Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ
　Ａｎｔｉｓｅｒａ　ｉｎ　Ｍａｎ”　、ｊ　、Ｉｍｍ
ｕｎｏ　ｌ　ｏｇｙ　、Ｖｏ　ｌ　、１２１．４：１５
１８−１５２３（１９７８）；およびＲａｕｃｈ　ｅｔ
　ａｌ、、“Ａ　ＨｉｇｈＦｒｅｑｕｎｅｎＣ７Ｉｄｉ
ｏｔｙｐｉｃＭ＆ｒｋｅｒ　ｏｆ　Ａｎｔｉ−ＤＮＡ　
Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ＭＲＬ−Ｉｐｒ
／Ｉｐｒ　Ｍｉｃｅ”、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、、
Ｖｏｌ、、１２９，１：２３．６−２４１　（１９８１
）。

本発明の他の目的は、免疫検定において抗遺伝子型抗体
または結合パートナ−を使用し、これによりそれらの能
力を大きく拡張する方法を提供することである。

すべての免疫検定は、１つの共通する特性として、免疫
学的反応が検出可能であるという要件を有する。典型的
には、これは１）抗体がそれに対して特異性である抗原
または分析物、そして２）水相または固相のいずれかの
中で容易に検出できる抗体自体を標識と関連させること
により達成される。このような標識は、例えば、蛍光団
、リン、光分子、放射性同位元素、酵素、反射粒子など
を包含することができる。これらの標識のすべておよび
それらの検出に関連する技術は最近にわたって高度に開
発されるようになったが、それ、らは典型的には、免疫
学的反応に関与しなかった標識材は構成成分の除去を必
要とする。

本発明の目的は、なお他の部類の標識の代わりに、蛍光
エネルギー移動特性を示すものに頼ることである。

蛍光エネルギー移動は、一方が共与体と見なされかつ他
方が受容体と呼ばれる２つの分子の間で起こる。典型的
には、共与体分子は１つの波長（実際には、ピークまた
は最適な波長−を有するベル９　（ｂｅ　ｌ　１−ｓｈ
ａｐｅｄ）スペクトルの波長）のエネルギーにより励起
され、そして典型的な蛍光団のそれに非常に類似する蛍
光エネルギー放射曲線を示す、受容体分子は励起波長を
有するもの、好ましくは共与体分子の放射波長スペクト
ルの範囲内に入るその励起スペクトルの有意な部分を有
するものを選択する。最適な条件下で、共与体のピーク
放射波長は受容体のピーク励起波長にほぼ等しいであろ
う、共与体分子からのエネルギーを受容体分子が受け取
ると、共与体分子の蛍光は減少する０次いで、受容体分
子は発色団、すなわち、固有の蛍光を示さない分子であ
ることができるが、好ましくはその特性蛍光放射スペク
トルを有する蛍光分子であろう。

真の蛍光エネルギー移動対におけるエネルギー移動は、
双極子−双極子エネルギー移動過程により起こり、その
効率は共与体分子と受容体分子との間の距離の６乗の逆
数で変化する。こうして。

蛍光エネルギー放射の変化を使用して受容体分子および
共与体分子またはそれらが結合する分子の間の近接関係
を決定することができる。さらに、双極子−双極子エネ
ルギー移動過程は、Ｆｏｒｓｔｅｒの理論に従うと、移
動効率に影響を及ぼす配向成分（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ
ｎ　ｃｏｍｐ。

ｎｅｎｔ）をも有する。これらおよび他の蛍光エネルギ
ー移動の考察は、次の文献に詳述されている：Ｌｕｂｅ
ｒｔ　５ｔｒｙｅｒ　著、”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｓ　ａ　５ｐｅ
ｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃＲｕｌｅｒ”、Ａｎｎｕａｌｓ　
ＲｅｖｉｅｗＢｉ　ｏｃｈｅｍ、、４７：８１９−８４
８　（１９７８）。

大発明の他の目的は、拮抗、均一・系免疫検定において
共与体および受容体の間の近接および配向感度を利用す
ること〒ある。

蛍光エネルギー移動標識材は技術の使用は、Ｕｌｌｍａ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許第４，１９９．５５９号、
同第３，９９６，３４５号、同第４．１７４，３４８号
および同第４，２６１，５５９号に記載されている。こ
れらの米国特許は、蛍光体分子が特定した波長の光りお
よびより長い波長の・蛍光により励起される分子の蛍光
体−クエンチャ−（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の対の使用を教
示している。しかしながら、蛍光体に密に近接してクエ
ンチャ−分子が存在すると、この蛍光のクエン、チング
（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）が起こり、これにより測定可能
な蛍光は減少する。したがって、前記米国特許の検定は
、検出すべき配位子との特異的な同時の免疫学的反応の
ために、蛍光体またはクエンチャ−分子のいずれかで標
識付けされた２種の異る抗体を使用する。こうして、配
位子は性質が多価であって、多数の抗体の結合のための
必要な多数の結合部位を提供しなくではならない、配位
子の濃度が増加すると、抗体の結合のための機会は多く
なり、より多くの蛍光がクエンチングされ、より低いレ
ベルの蛍光が示される。

あるいは、１価の配位子の場合において、Ｕｌｌ　ｍ　
ａ　ｎは配位子の類似体の使用を教示しており、その実
質的な比率は配位子と同一の空間的なかつ極性の配向を
有して、受容体または抗体の結合部位について配位子と
拮抗することができる１または２以上の決定因子または
エピトープの部位を定める。配位子の類似体は、結合部
位に原子または官能基が存在しないか、あるいは配位子
中に本来存在した１または２以上の原子の代わりに導入
された結合基を有することにおいて配位子と異る。それ
ゆえ、典型的には、この配位子類似体は蛍光体またはク
エンチャ−のいずれかで標識付けされ、そして蛍光体−
クエンチャ一対の他方の分子で標識された抗体上の結合
部位について試料の配位子と拮抗する。この方法におい
て、配位子の濃度を増加すると、結合部位の拮抗がより
効果的になり、これにより標識付は配位子類似体が置換
され、そしてそうでなければそれらが寄与するであろう
蛍光のクエンチングの量が減少する。Ｕｌｌｍａｎの検
定は、不利なことには、多価の配位子または検出すべき
分析物を必要とし、あるいは、配位子と拮抗させるため
に精製された無傷の配位子類似体を必要とする。すでに
述べたように、このような物質の生産は一般に不利な、
困難な、時間を消費する、経費を要する提案である。

本発明の目的は、１価または多価の分析物につσλて等
しく有用でありがつ、いずれの場合においても、Ｕｌｌ
ｍａｎの方法におけるような精製された無傷の分析物様
物質の経費がかかる困難な生産を必要としない、感度の
高い免疫検定を提供することである。

本発明のなお他の目的は、少なくとも２つの蛍光団を用
い、それらの一方は励起すると第２蛍光団を励起するこ
とができる放射スペクトルを示し、前記ｗＩ１２蛍光団
は第１放射スペクトルから区別可能な測定できる放射ス
ペクトルを示す。

さらに１本発明に他の目的は、単一の抗原の結合部位に
ついて２つの免疫学的に類似する抗体間の拮抗に頼るこ
とを回避することである。

関連する目的は、検出すべき分析物の構造および抗体の
対応する結合部位の構造に関する情報を明らかにするこ
とができる免疫検定を提供することである。

本発明に原理および目的に従うと、最も好ましい形態に
おいて、遺伝子型抗体および抗遺伝子型抗体を使用し、
それらの各々は蛍光エネルギー移動対の共与体分子また
は受容体分子の一方または他方で標識付けされる。抗遺
伝子型抗体は、有利には、抗体上の分析物の結合部位を
遮断する（ｂｌｏｃｋ）するかあるいは部分的に遮断し
、これにより分析物と抗体との間の免疫学的反応を防止
または阻１トするように選択される。抗体と抗遺伝子抗
体とかの免疫学的に反応すると、受容体分子および共与
体分子は一緒に密に近接され、これによりエネルギー移
動はＦｏｒｓｔｅｒの双極子−双極子相互作用に従い起
こることができる。免疫検定混合物を励起し、特定的に
は共与体分子をその励起波長で励起し、そして受容体の
放射波長を測定することにより、試料中の分析物の存在
を定性的にあるいは定量的に決定することができる。

本発明を添付図面を参照しながらさらに説明する。

本発明の好ましい実施態様の一般化された線図盲、第１
図に示されている。３つの別々の成分は、試薬を構成し
、そして試料の分析物、線図に抗分析物抗体と表示する
試料の分析物について特異性の結合パートナ−（ｂｉｎ
ｄｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ）および抗分析物結合パート
ナ−と反応性である抗（抗分析物）抗体と表示する抗遺
伝子型結合パートナ−を含む、当業者には明らかなよう
に、線図は単に技巧的な表示であり、そして数個以上の
アミノ酸の実際の結合部位は構造および配向がより複雑
であるが、これらの複雑さは本発明の理解において必要
ではなくあるいは絶対に必要であるというわ（すではな
い、第１図を参照すると、抗分析物抗体は共与体分子で
標識付けされ、そして抗遺伝子型抗体は受容体分子でＩ
ＩＩ！Ｉｉ付けされ、両者の分子は一緒になって蛍光エ
ネルギー移動対を構成する。再び、容易に理解されるよ
うに、結合パードナー−標識の関連は検定を有意に変更
しないで容易に逆転することができる。

試料の分析物の存在しない瞬間を仮定すると、抗遺伝子
型抗体および抗分析物抗体は免疫学的に結合し、これｋ
より受容体分子および共与体分子を密に物理的に近接さ
せる。エネルギー移動はその距離の６乗の逆数（６ｔｈ
　ｉｎｖｅｒｓｅｐｏｗｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔ
ａｎｃｅ）に従って変るので、この距離は好ましくは抗
体の適当な標識付は技術の利用により調節されるので、
受容体分子−共与体分子はｉ　ｏ　ｏ、オングストロー
ムより近接しており、好ましくは５０オングストローム
より短い距離で離れているであろう。

励起波長ラムダ（ｌａｍｂｄａ）−ＥＸ（第１ＦＩ！Ｊ
参照）で共与体を励起することにより、共与体分子は、
光子エネルギーを受け取ることにより、より高いエネル
ギー水準を満たさせられる。このエネルギーは２つの機
構を経て開放される。あるエネルギーは光子の放射によ
り開放され、そして残部は、エネルギー移動機構、例え
ば、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｐ
ａｒｔ■：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５
ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ｐ。

４．４８ｆｆ、、Ｃ，Ｒ，ＣａｎｔｏｒおよびＰ。

Ｒ０Ｓｈｉｍｍｅｌ著（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　、＆
　Ｃｏ、、１９８０．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）中に記載され
ている量子機構のモデルにより、受容体分子への距離お
よび受容体分子の相対的配向に依存する。このようにし
て励起された受容体分子自体は、第１図に入ＥＭ−Ａと
表示するように、蛍光の放射を経てその正常のエネルギ
ー水準に戻る。受容体分子の蛍艷の放射または共与体分
子の蛍光の放射を監視することができる。

第１図において試料の分析物を添加すると、抗遺伝子型
抗体の拮抗置換が起こり、そしてこれは平衡定数Ｋによ
り支配される。置換の量は抗分析物抗体上の結合部位に
ついての抗遺伝子型抗体と試料の分析物との間の相対的
親和性ならびにそれらの相対的濃度に従って変わるであ
ろう、当業者にとって明らかなように、これらの親和性
および濃度を容易に操作して検定の感度を最適化するこ
とができる。さらに、反応順序は、かならずしも第１図
に示すものである必要はない、第１図の順序は、明瞭で
あるように便宜上選択した。その代わり、反応成分を同
時に混合するか、あるいは試料の分析物を抗分析物ｉ体
と免疫学的に反応させた後、抗遺伝子型抗体を添加する
ことが好ましいことがある。いずれの場合においても、
受容体の放射の減少または共与体の放射の増加を試料の
分析物の存在に関係づけることができる。定性的検定が
考えられるが、好ましい検定は結果を既知の標準と比較
することを包含し、これにより試料中の分析物の存在に
関して定量的決定を行うことができる。これらの技術は
、当業者にとって明らかであろう。

明瞭さを高めるために、第１図に示す免疫検定は抗体−
Ｈの結合部位について分析物と純粋な拮抗を行うことが
できる抗遺伝子型抗体の使用を包含した。前述のように
、本発明はそれに限定されず、抗遺伝子型抗体の基本的
遮断機能に類似する方詰で作用する結合パートナ−変更
物を包含する。詳しくは、抗骨格結合パートナ−（ａｎ
ｔｉ−ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｒｔ
ｎｅｒ）および抗体、抗体断片および人工的に生産され
たペプチド類似体も考えられる。

抗骨格抗体は、抗体上の結合部位の一部のみと反応する
ことができ、あるいは、事実、結合部位のいずれの部分
とも反応せず、その代わり結合部位に関連するかその次
のいわゆる骨格または隣接構造と反応することができる
ものである。こうして、抗骨格抗体は、分析物の結合部
位と反応しないが、立体障害または他のタンパク質の形
状変化のために、分析物の結合を防止する。関連する分
析物の構造、または抗体の結合部位それら自体の空間的
配置および構造のいずれかの研究を可能とするのは、こ
のような抗遺伝子型、抗骨格、抗体断片などの結合パー
トナ−単独および／またはエネルギー移動配向成分との
組み合わせを提供することができることにある。

抗原、ハプテンまたは分析物に対して免疫学的に反応性
の抗体の実際の生産は、とくにポリクロナル源の抗体に
関して、よく知られている。Ｋ。

ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（ＮａｔｕｒｅＶｏｌ
、２５８．ｐ、４９５．１９７５）が記載するハイブリ
ドーマの生成の原理および方法に突い、モノクロナル抗
体、その選択および特性づけはこの分野において標準に
実施されるようになった。抗原物質として生成した抗体
を使用することにより、抗遺伝子型、抗骨格などの抗体
をまた容易に生産することができる０例えば、抗遺伝子
型抗ヒ酸塩抗体の生産は、次の文献に記載されている：
Ｋｕｅｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｑｕａｎｔｉｔａｔ
ｉｖｅ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｔｏｎ　ｏｆ　Ｉｄｆｏ
ｔｙｐｅ　Ａｎｔｉｂ。

ｎｄｉｅｓ　Ｖｌ、Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　ａｓ　ａＰｏ
ｔｅｎｔｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｒｋｅｒ　ｆｏ
ｒ　ｔｈｅ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｒ’ｅｇｉｏｎｓ　ｏ
ｆ　Ｍｏｕｓｅ　Ｉｍｍｕｎ。

ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈａｔ
　ｎｓ”、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１３５：５７９（１９
７２）、そこに記載されている手順を使用して、後述す
る抗遺伝子型抗体を生産した。

容易に明らかなように、そこに記載されている手順を適
当に修正して事実上いかなる抗遺伝子または同様な抗体
を生産することができる。同様に、抗体はタンパク質全
体の代わりに臨界的なペプチド配列のみを使用すること
により生じさせる（ｒａｆｓｅ）ことができる、なぜな
ら、これらの配列は、ある場合において、制御された条
件下でより容易に生産することができる。

すべての蛍光免疫検定と用いるとき、非特異性のバック
グラウンドの存在は信号対ノイズ比を低下させ、こうし
て感度を減少させる作用をするだけである。好ましくは
、バックグラウンドの蛍光は緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）お
よび試薬を賢明に選択しかつそれらを注意して取扱うこ
とにより減少させるか、あるいは完全に排除することが
できるであろう、さらに、蛍光エネルギー移動対の選択
は検出された蛍光信号中の非特異的ノイズ成分の大きさ
に有意に影響を及ぼす０例えば、バックグラウンドの蛍
光は波長の増加とともに有意に減少することがよく知ら
れている。したがって、スペクトルの遠い赤または近い
赤外の領域において放射する蛍容体分子を使用すること
により、信号対ノイズ比を適当に最適化し、これにより
感度を高めることができる。

本発明のこれらおよび他の原理について、実施例１によ
りさらに理解できるであろう、実施例１は抗遺伝子型蛍
光エネルギー移動免疫検定を説明し、その結果は第２図
にグラフで示されている。

抗体、あるいはさらに広くは決定すべき分析物と免疫学
的に特異的に反応性の結合パートナ−に関するなお他の
変更は、本発明の範囲内に包含される。すでに述べたよ
うに、結合パートナ−はポリクロナル源またはモノクロ
ナル源の抗体であることができ、後者は一般に非特異的
反応性が少なくかつより容易に選択される結合親和性を
有する。抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ
）２’部分を使用して感度を最適化することが望ましい
ことがあるであろう、詳しくは、Ｆａｂ’抗体断片の選
択は多数の結合の問題を排除し、これにより完全抗体上
に多数の結合部位が存在するため、分析物の特異性抗体
は分析物ならびに抗遺伝子型抗体へ同時に結合すること
ができる。これらの後者の免疫学的複合体（ｃｏｍｐｌ
ｅｘ）は、分析物または抗遺伝子型抗体の両者ではなく
それらのいずれかと結合ｆることができる分析物特性抗
体断片のような試薬を用いる免疫検定に比較したとき、
感度を減少することを期待することができる０機能的に
同等なペプチド配列として前述のものから機能的に有意
に相違しない抗体断片の他の型が同等に考えられる。

−里差１」− ウシ血清アルブミンーアゾベンゼンヒ酸塩についての遺
伝子型−抗遺伝子型蛍光エネルギー移動免疫検定 本発明の原理に従い、この検定は抗つシ血清アルブミン
ーアゾベンゼンヒ酸塩抗体、抗Ａｒｓへ向かう抗原、ウ
シ血清アルブミンーアゾベンゼンヒ酸塩、ＢＳＡ−Ａｒ
ｓ、および抗遺伝子型抗体、抗（抗Ａｒ５）の拮抗結合
に基づく、蛍光エネルギー移動のために使用する色素対
は、共与体−受容体対のフルオレスカミン（ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃａｍｉ　ｎｅ）（ＦＣＡ）−ジクロロトリアジニ
ルフルオレセイン（ＤＴＡＦ）である、ＦＣＡは３９０
ｎｍにおいて励起されることができ、そして４７７ｎｍ
において放射ピーク最大を示し、これは４９５　ａｍ付
近を中心とするＤＴＦＡの励起ピークと重なる。ＦＣＡ
およびＤＴＡＦがエネルギー移動距離の範囲内、好まし
くは５０オングストローム以下にあるとき、ＦＣＡの観
測される放射はＤＴＡＦへのエネルギー移動のため実質
的に減少する。こうして、ＦＣＡからの４７７ｎｍの放
射の減少が存在し、これにＤＴＡＦからの５１５ｎｍに
おける放射の増加が伴なうであろう。

抗（抗Ａｒ５）をＤＴＦＡで標識付けし、そして抗Ａｒ
　ｓｌ／ＣＡへ結合するとき、免疫学的結合の量は、成
分の混合の前および後に、４７７ｎｍまたは５１５　ｎ
ｍにおける放射の変化により監視することができる。混
合物中のＢＳＡ−ＡｒＳ濃度を増加しくこれにより受容
体分子と置換し）、そして４７７ｎｍにおける共与体の
放射の増加または５１５ｎｍにおける受容体の放射の減
少を監視することにより、抗原濃度の増加（および抗原
−抗体の免疫学的反応の増加）に比例する標準曲線を確
立し、水性試料中のＢＳＡ−Ａｒｓの存在を定量的に評
価することができる。容易に理解されるように、定性的
決定は、試料を反応成分に添加したとき、蛍光放射の変
化を単に検出することによって行うこともできる。蛍光
の放射は事実上いかなる型の標準蛍光分光光度計により
測定することもできる。

（ＩＩ）材料 すべてに試薬は特記しないかぎり精製しないで使用した
。ＦＣＡおよびＤＴＡＦはｓ　ｔ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、から入手した。ＢＳＡ−Ａｒｓ、抗Ａｒｓ
および抗（抗Ａｒ５）は、前述のようなよく知られた技
術に従い調製した。

（ｍ）試薬の調製 ！、（抗Ａｒ５）−ＦＣＡ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
）は、１ｍｌの試薬緩衝液中に懸濁させた１　ｍｇｃ７
）抗Ａｒｓを１００ＩＬｌのアセトン溶液中の５ｍｇの
ＦＣＡと一緒に室温において１５分間インキュベーショ
ンすることによって調製した。この混合物をＤＥＡＥ−
セフ７セル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）イオン交換カラムに通
して塩化ナトリウム勾配で分別した。４７７ｎｍにおけ
る蛍光の変化および２８０ｎｍにおけるタンパク質のＵ
Ｖ吸収をすべての分画について記録し、そして前記タン
パク質−色素複合体に相当するものをプールし、０．１
％のナトリウムアジドの緩衝液とともに４℃において貯
蔵した。

２、　ＤＴＡＦを抗（抗Ａｒ５）抗体へ結合するために
、０．５ｍｇの抗（抗Ａｒ５）を含有する彎衝溶液を１
．５ｍｇのＤＴＡＦと一緒に室温において１時間インキ
ュベーションした。複合体の単離を（抗Ａｒ５）−ＦＣ
Ａの単離と同一手順により実施した。

３、　０．１ＭのＮａＣｌ、０．００５Ｍ（７）ホウ酸
塩緩衝液、ＰＨ８，０，１％のアジ化ナトリウムおよび
１％のポリエチレングリコールを含有する検定緩衝液を
配合し４、　た。

標識性は調製工程ｌおよび２において使用した試薬緩衝
液は、０　、１５Ｍｃ７）ＮａＣ１およびＯ，０１５ｍ
Ｍのホウ酸塩を使用して調製し、ｐＨ８に調節したホウ
酸塩食塩溶液であった。

（ｆｆ）検定束１件 ２つのプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を使用して、
ＢＳＡ−Ａｒｓの検定のための標準曲線を確立した。こ
れらのプロトコールは反応成分および試料を反応させる
順序が異った。

プロトコール（１）：１工程の検定 ０．３ｍｌの（抗Ａｒ５）−ＦＣＡおよび０　、３ｍ１
ｃ７）抗（抗Ａｒ５）−ＤＴＡＦを、ｌ系列の０．５ｇ
ｇから２００ｊＬｇの濃度範囲を有する０、１ｍｌのＢ
ＳＡ−Ａｒｓ試料と混合した。得られる混合物を３７℃
において１時間インキュページ璽ンした。インキュベー
ションした混合物を３９０ｎｍにおいて励起させ、そし
て４７７ｎｍおよび５１５ｎｍにおける蛍光放射を測定
した。ＢＳＡ−Ａｒｓおよび緩衝液をまた引き続く標準
のバックグラウンドの蛍光補正のために記録した。

プロトコール（２）：順次の検定 ０．３ｍｌの（抗Ａｒ５）−ＦＣＡ８よびｌ系列の０．
５１Ｌｇから２００１Ｌｇの範囲の濃度を有する０、１
ｍｌのＢＳＡ−Ａｒｓ試料を３７℃において１時間イン
キュベーションした。

次いで、０．３ｍｌの抗（抗Ａｒ５）−ＤＴＡＦを添加
し、この混合物を室温においてさらに３０分間インキュ
ベーションした。インキュベーションした混合物を３９
０ｎｍにおいて励起させ、そして４７７ｎｍにおける蛍
光を測定した。

（Ｖ）結果およびデータ 両者の検定において、ＢＳＡ−Ａｒｓおよび緩衝液の蛍
光の寄与を、標準技術に従い、観測された蛍光から減じ
て補正された蛍光を得た。得られたデータを第１図に表
わす。

（ＶＩ）考察 ＢＳＡ−Ａｒｓの濃度を増加したときの４７７ｎｍにお
ける共与体の蛍光の増加および５１５ｎｍにおける受容
体の蛍光の減少は、抗遺伝子型抗体についての抗体結合
部位の存在の減少によるエネルギー移動の期待される減
少と一致する。

−１差１ヱー モノクロナル抗体を使用するウシ血清アルブミンーアゾ
ベンゼンヒ酸塩についての遺伝子型−抗遺伝子型蛍光エ
ネルギー移動免疫検定前述の手順およびこの分野におい
てよく知られた手順を用いて、モノクロナル抗体を発生
（ｒａｉｓｅ）させて、実施例１において使用したポリ
クロナル抗体を置換した（すなわち、モノクロナル抗Ａ
ｒｓ抗体およびモノクロナル抗（抗Ａｒ５）抗体、後者
は抗遺伝子型抗体）、プロトコール２．実施例１に記載
する順次の検定をこれらの試薬を使用して反復し、そし
て受容体および共与体の放射スペクトルを種々の範囲の
分析物濃度にわたって測定した。得られたデータを第３
図に表わす。期待されるように、感度の増加はポリクロ
ナル抗体をモノクロナル抗体で置換しかつ非特異的゛反
応を同時に排除したために観測された。

本発明の精神また仲範囲を逸脱しないで、検定に対する
種々の改良を容易に行ない感度を増加することができ、
例えば、モノクロナル抗体を使用しかつ選択して抗体の
非特異性の結合を減少させかつ抗体の親和性および親和
性を調節し、あるいは存在する結合および分析物の測定
を共与体放射の時間速度定数の変化を測定することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、分析物、抗分析物抗体、抗遺伝子型抗体およ
び受容体−共与体分子の相互作用に基づく免疫学的検定
を線図で描いたものである。 第２図は、実施例１に従って得られたデータ（ポリクロ
ナル抗体を使用するデータ、励起＝３９０ｎｍ）のグラ
フである。 第３図は、実施例２に従って得られたデータ（モノクロ
ナル抗体を使用するデータ、励起；３９０ｎｍ）のグラ
フである。 特許出願人　オーツ・ダイアグノスティック・システム
ズ・インコーボレーテツド 第１頁の続き ［相］発　明　者　スチーブン・エイチ・シー・アイビ
ー アメリカ合衆国マサチュセツツ州０２０４８マンスフイ
ールド・ヒーザーレイン　３ 手続補正書（オΩ 昭和６０年５月２８日 特許庁渠ｔ（志　菌　学　殿 １、事件の表示 昭和６０年覗許願記　１２　号 ２、発明の名称 蛍光エネルギー移動を１に用する抗遺伝子型検定事件と
の関係　特許出願人 （１）明細書筒１８頁１９行目〜第１９頁１行目の「Ｎ
ｕｓｓｅｆＬｚｗｅｉｇ　ａｔ　ａｔ、　Ｖ’ｒ、５ｃ
ｉｅｎｃｅ」を、「ヌセンツワイグら（ｆｉｈｂｓｓｅ
ｎｚｗｅｉｇ　ｅｔａｌ、）は、サイ：ｃ−：／ス（５
ｃｉｅｎｃｅ　）　ｊと訂正する。 （２）　同第２０頁６行目〜第２１頁２行目の「Ｂｒｉ
ｇｎｔ　ａｔ　ａｌ、、　”　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖ
ｅ−・・−・・−（中略）−・−・・−−／、　Ｉｒｒ
ａｎｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ　、　１２９＋１：２３
６−２４１　（１９８１）。」を、ｒブリエンドら（Ｂ
ｒ１ｅｎｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　、”クオンテイタテイ
プ　インペステイグイションズ　オプ　イデイオテイピ
ツク　アンテイボデイズ（ＱｕａｆＬｔｉｔａｔｉｖｅ
　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａ−ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｄｉｏｔ
ｙｐｉｃ　Ａｎｔｉｂｔｒｄｉｅｓ　）”　。 ジャーナル・オプ・イクスペリメンタル・メデイスンズ
（Ｊ、　Ｅｚｐ、　Ｍａｄ、　）。 １３２：９５１−９６２（１９７０）、グハら（Ｇｅｈ
ａ　ｅｔ　ａＬ、）　、”７ｙテイイデイオテイピツク
　アンティセラ　イン−ｑ　：／　（Ａｎｔｉ−１ｄｔ
ｏｔｙｐｉｃ　Ａｎｔｉｓｅｒａ　ｉｎＭａｎ　）”、
ジャーナル・オプ・イムノロシイ（Ｊ、　Ｉｗｎｕｎｏ
ｌｏｇｙ　）　、　Ｖｏｌ、１２１゜４：１５１．８−
１５２５（１９７Ｂ）ｉおよびラウテら（Ｒａｎｃｈ　
ｇｔ　ａｌ、　）　、　”アハイ　フレクエンシイ　イ
デイオテイビック　マーカー　オプ　アンティーＤＮＡ
オウトアンテイボデイズ　インＡｆＲＬ−Ｉｐτ／　Ｉ
ｐ　ｒ−ｒイス（Ａ　Ｈｉｇｈ　Ｆｒｔｒｑｕ−′ｒＬ
ｔｒｎｃｙ　Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　Ｍａｒｋｅｒ　ｏｊ
Ａｎｔｉ−ＤＮＡ　Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅ、ｓ　
ｉｎ　ＭＲＬ　−Ｉｐｒ／Ｉｐｒ　Ｍｉｃｅ　）”、ジ
ャーナル・オプ・イムノロシイ（／、　ＩｆｒｒｒＭＬ
ｆＬｏｌｏｇｙ　）　＋ＶＯ１，１２９，１：２３６−
２４１　（１９８１）ｊ と訂正する。 ｉ３１　同第２３員１５〜１９行−の［ＬｕｂｅｒｔＳ
　ｔｒｙｅｒ著、Ｆｌｓｏｒｅｓｃｍｎｃｅ　Ｅｎｅｒ
ｇｙ　Ｔｒａｎｓ−ｆｅｒ　ａｓ　ａ　５ｐｅｃｔｒｏ
ｓｃｏｐｉｃ　Ｒｕ１ｅｒ”、　ＡｎｎｕａｌｓＲｇｖ
ｉｔｗ　Ｂｉｏｃｈｔｒｍ、　Ｊを、「ルベルト　スト
リニル著、′フルオレッセンス　エナーソイ　トランス
ファ　アズア　スイクトロスコビツク　ルーラ− （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ　ａｓａ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ　Ｒｕ
１ｅｒ　）”、アニュアルズ　レビュー　バイオケミス
トリイ（Ａｎｔｎｂａｌｓ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　）　ｊと訂正する。 （４）同第３０頁１２〜１９行目の［Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ・・・・・・・・・・・・・
・・Ｃ中＃）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
・・Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　Ｊを、 「バイオロジカル　ケミストリイ、パートＴＴ　（Ｂｉ
ｏｐｈｙａｉｃａｌ　Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ、ｐａｒｔ
■）：テクニークス　フォア　ザ　スタディ　オツ　バ
イオロジカル　ストラフチャアンド　ファンクシ：ｌ　
：／　（Ｔｅｃｈ？！１ｑｕｅｓｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｔ
ｒｔｄｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｔｒｕ−ｃ
ｔｓｒｇ　ａ、ｎｄ　Ｆｕ？１．ｃｔｉｏ％）　、　ｐ
、　４４８　ｆｆ、＋シー・アール・カンタ−（Ｃ１ｌ
？、　Ｃａ、ｔ＋、ｔｏｒ）およびビー・アール・シメ
ル（ｐ、Ｒ。 ５ｈｉｔｒｗｎｅｌ　）著〔ダブル、エイチ、フリーマ
ン　アンド　コーポレーション（Ｆ、’／７゜Ｆｒｅｅ
ｍａｎ　＆　Ｃｏ、　）　、　＝ニー　Ｅ−り（、Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ　）、　、１１ と訂正する。 （５）同第６４頁９〜１８行目の「Ｋｕｅｔｔｎｅｒ　
ｅｔα１．　・・・・・・・・・・・・・・・・・・（
中略）・・・・・・・・・・・・・・・Ｊ、　Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、　１３５：５７９　（１９７２）。Ｊを、 「ケトナーら（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、
”クオンテイタテイグ　インベステイケ９イション　オ
プ　イディオタイプ　アンテイボデイズ　■、イデイオ
テイビック　アズ　アポテンシャル　ソエネテイツク　
マーカーフォア　ザ　バリアプル　リージョンズオツ　
マウス　イムノグロブリン　ポリベグタイトチェインズ
（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｉｄｉｏｔｙｐｅ　Ａｎｔｉｂｏｎ−ｄｉｅ
ｓ　ＶＴ、　Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　ａｓ　ａ、　ｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌＧｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　
ｔｈｅ　ＶａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｏ
５ｓｓ　Ｉｍｍｖ、ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＰｏｌｙｐｅ
ｐｔｉｄｅ　Ｃｈａｉｎｓ　）”、ジャーナル・オプ・
イクスペリメンタル・メデイスンズ（、Ｊ、　Ｅｒ、ｐ
、　Ｍｅｄ、　）　１３５　：　５７９（１９７２）。 」 と訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ、分析物と免疫学的に反応性の第１結合パートナー；
   　゛ 前記第１結合パートナ−と免疫学的に反応性の第２結合
   パートナー１前記第２結合パートナ−の前記第１結合パ
   ートナ−に対する空間的関係は前記分析物の前記第１結
   合パートナ−との免疫学的反応のとき変更される；およ
   び 前記第１結合パートナ−および前記第２結合パートナ−
   と関連し、前記変更された空間の関係に応答する検出可
   能な信号を提供する手段；からなることを特徴とする分
   析物を検出するための免疫検定。 ２、前記関連する手段は蛍光エネルギー移動対からなり
   、前記対は第１励起波長および第１放射波長を有する共
   与体分子と、前記第１放射波長により励起さ、れること
   ができかつ前記第１放射波長と区別して検出可能な第２
   放射波長を有する受容体分子とを有する特許請求の範囲
   第１項記載の免疫検定。 ３、前記共与体分子または受容体分子の一方が前記第１
   結合パートナ−と関連し、そして他方が前記第２結合パ
   ートナ−と関連する特許請求の範囲＃５ｚ項記載の免疫
   検定。 ４、前記第１結合バ’−）ナーおよび前記第２結合パー
   トナ−は、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、Ｆ（
   ａｂ）’抗体、Ｆ（ａｂ）２抗体および抗体断片から成
   る群より選択される特許請求の範囲第３項記載の免疫検
   定。 、５、前記第２結合パートナ−は抗遺伝子型抗体および
   抗骨格抗体から成る群より選択される特許請求の範囲第
   −４項記載の免疫検定。 ６、前記応答の検出可能な信号は、増加または減少した
   共与体蛍光放射増加または減少した受容住僧光放射増加
   または減少した共与体放射時間定数およびそれらの組み
   合わせから成る群より選択される特許請求の範囲第５項
   記載の免疫検定。 ７、遺伝子型を有する抗体への前記分析物の結合は、前
   記抗体、および前記遺伝子型を結合することができる抗
   遺伝子型抗体との間の空間的関係を変化させ、前記空間
   的関係または相対運動の変化は蛍光手段により検出可能
   であることを特徴とする免疫学的に反応性の分析物を検
   出する免疫検定。 ８、前記変化は蛍光放射の変化または蛍光放射時間定数
   の変化を測定することにより検出される特許請求の範囲
   第７項記載の免疫検定。 ９、蛍光手段は蛍光エネルギー移動対からなる特許請求
   の範囲第７項記載の免疫検定。 １０、蛍光エネルギー移動対は共与体分子と受容体分子
   とからなり、前記共与体分子は第１励起波長および第１
   放射波長を有し、そして前記受容体分子は前記第１放射
   波長により励起されることができかつ前記第１放射波長
   と区別して検出可能な第２放射波長を有する特許請求の
   範囲第９項記載の免疫検定。 １１、抗体の少なくとも一方は不完全抗体である特許請
   求の範囲第１０項記載の免疫検定。 １２、遺伝子型を有する抗体への免疫学的に反応性の分
   析物の結合が、前記抗体、および前記遺伝子型を結合す
   ることができる抗遺伝子型抗体との間の空間的関係を変
   化させ、前記空間的関係の変化が蛍光手段により検出可
   能であることを特徴とする免疫学的に反応性の分析物の
   構造を決定する免疫検定。 １３、前記変化は蛍光放射の変化または蛍光放射時間定
   数の変化を測定することにより検出され多特許請求の範
   囲第１２項記載の免疫検定。 １４、蛍光手段は蛍光エネルギー移動対からなる特許請
   求の範囲第１２項記載の免疫検定。 １５、蛍光エネルギー移動対は共与体分子と受容体分子
   とからなり、前記共与体分子は第１励起波長および第１
   放射波長を有し、そして前記受容体分子は前記ＰｉＳｌ
   放射波長により励起されることができかつ前記第１放射
   波長と区別して検出可能な第２放射波長を有する特許請
   求の範囲第１４項記載の免疫検定。 １６、抗体の少なくとも一方は不完全抗体である特許請
   求の範囲第１５項記載の免疫検定。 １７．１）免疫学的に反応性の抗原決定因子について特
   異性でありかつ遺伝子型で特徴づけられる抗体または２
   ）骨格抗体および抗遺伝子型抗体または抗骨格抗体の間
   の空間的関係の変化に対〔て応答することを特徴とする
   、免疫学的に反応性の抗原決定因子を有する分析物を検
   出するための均、・系免疫検定。 １８、前記変化は蛍光放射の変化を測定するかまたは前
   記抗体に関連する蛍光手段の蛍光放射時間定数の変化を
   測定することにより検出される特許請求の範囲第１７項
   記載の免疫検定。 １９、蛍光手段は蛍光エネルギー移動対からなる特許請
   求の範囲第１８項記載の免疫検定。 ２０、蛍光エネルギー移動対は共与体分子と受容体分子
   とからなり、前記共与体分子は第１励起波長および第１
   放射波長を有し、そして前記受容体分子は前記第１放射
   波長により励起されることができかつ前記第１放射波長
   と区別して検出可能な第２放射波長を有する特許請求の
   範囲第１９項記載の免疫検定。 ２１、抗体の少なくとも・方は抗体断片である特許請求
   の範囲第２０項記載の免疫検定。 ２２、蛍光エネルギー移動対からなる検出可能な標識系
   と一緒に使用するための試料中の分析物の存在について
   分析するための免疫検定であって、前記蛍光エネルギー
   移動対は共与体分子と受容体分子とからなり、前記共与
   体分子は第１励起波長および第１放射波長を有し、そし
   て前記受容体分子は前記第１放射波長により励起される
   ことができかつ前記第１放射波長と区別して検出可能な
   第２放射波長を有し、前記検定は、工程：分析すべき分
   析物を含有する試料を準備し：分析物について特異性で
   ありかつ受容体−共与体対の受容体分子または共与体分
   子のいずれかで標識付けされた第１結合パートナーをさ
   らに準備し； 前記第１結合パートナ−を、前記第１結合パートナ−に
   ついて特異性でありかつ前記受容体分子または前記共与
   体分子の他方で標識付けされた第２結合パートナーと接
   触させることによって第１混合物を形成し、前記接触の
   条件は免疫学的反応が可能であるような条件であり、前
   記第２結合パートナ−は前記第１結合パートナ−と空間
   的関係を有し、前記空間的関係は前記分析物と前記第１
   結合パートナ−との免疫学的反応時に変更されることが
   でき； 前記試料を前記第１混合物と接触させて第２混合物を形
   成し； 前記第２混合物を、前記分析物と前記第１結合ハードナ
   ーとの免疫学的結合が起こることができる条件下でイン
   キュベーションし； 前記第２混合物を光りで照射し、前記光りは前記共与体
   分子を励起することができる波長をもつが、前記受容体
   分子を実質的に励起することができる波長をもたず；そ
   して 第１蛍光放射の減少または第２蛍光放射の増加を検出し
   、そして蛍光の前記減少または増加を基準にして前記分
   析物の存在を決定する；ことを特徴とする免疫検定。 ２３、前記決定工程は前記増加または減少を標準曲線と
   比較する工程をさらに含み、これにより前記試料中０前
   記分析物の量を決定することができる特許請求の範囲第
   ２２項記載の免疫検定。 ２４、前記検出工程は共与体の蛍光時間定数を藻定し、
   そして前記時間定数の変化を基準にして前記分析物の存
   在を決定することを含む特許請求の範囲第２２項記載の
   免疫検定。 ２５、前記結合パートナ−の一方または双方はモノクロ
   ナル抗体である特許請求の範囲第２２ＸＪ記載の免疫検
   定。 ２６、前記第１結合パートナ−および前記第２結合パー
   トナ−は、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、Ｆ（
   ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）２°抗体および抗体断片から成
   る群より選択される特許請求の範囲第２２項記載の免疫
   検定。 ２７、蛍光エネルギー移動対からなる検出可能な′ＩＩ
   ＩＪｌ：ＩＩＡ系と一緒に使用するための試料中の分析
   物の存在について分析するための免疫検定であって、前
   記蛍光エネルギー移動対は共与体分子と受容体分子とか
   らなり、前記共与体分子は第１励起波長および第１放射
   波長を有し、そして前記受容体分子は前記第１放射波長
   により励起されることができかつ前記第１放射波長と区
   別して検出可能な第２放射波長を有し、前記検定は、工
   程：測定すべき分析物を含有する試料を第１結合ハード
   ナーと接触させ、前記第１結合パートナ−は前記分析物
   について特異性でありかつ受のいずれかで標識付けされ
   ており、前記接触の条件は免疫学的反応を可能とする条
   件であり； 前記試料と前記第１結合パートナ−を第２結合パートナ
   ーとさらに接触させ、前記第２結合ハードナーは前記第
   １結合パートナ−について特異性でありかつ前記共与体
   分子または前記受容体分子の他方で標識付けされており
   、前記条件は前記第２結合パートナ−が前記分析物と前
   記第１結合パートナ−上の結合部位について拮抗するよ
   うな条件であり； 前記第２混合物を光りで照射し、前記光りは前記共与体
   分子を励起することができる波長をもつが、前記受容体
   分子を実質的に励起することができる波長をもたず：そ
   して 第１蛍光放射の減少または一２蛍光放射の増加を検出し
   、そして蛍光の前記減少または増加を基準にして前記分
   析物の存在を決定する；２８、前記決定工程は前記増加
   または減少を標準曲線と比較する工程をさらに含み、こ
   れにより前記試料中の前記分析物の量を決定することが
   できる特許請求の範囲第２７項記載の免疫検定。 ２９、前記検出工程は共与体の蛍光時間定数を決定し、
   そして前記時間定数の変化を基準にして前記分析物の存
   在を決定することを含む特許請求の範囲第２７項記載の
   免疫検定。 ３０、前記結合パートナ−の一方または双方はモノクロ
   ナル抗体である特許請求の範囲第２７項記載の免疫検定
   。 ３１、前記第１結合パートナ−および前記第２結合パー
   トナ−は、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、Ｆ（
   ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）２’抗体および抗体断片から成
   る群より選択される特許請求の範囲第２７項記載の免疫
   検定。 ３２、蛍光エネルギー移動対からなる検出可能な標識系
   と一緒に使用するための試料中の分析物の存在について
   分析するた、あの免疫検定であって、前記蛍光エネルギ
   ー移動対は共与体分子と受容体分子とからなり、前記共
   与体分子は第１励起波長および第１放射波長を有し、そ
   して前記受容体分子は前記第１放射波長により励起され
   ることができかつ前記第１放射波長と区別して検出可能
   な第２放射波長を有し前記検定は、工程：単一の工程に
   おいて： 測定すべき分析物を含有する試料、第１結合パートナー
   および第２結合パートナーを混合し、前記第１結合パー
   トナ−は前記分析物について特異性でありかつ受容体−
   共与体の蛍光エネルギー移動対の受容体分子または共与
   体分子のいずれかで標識付けされており、そして前記第
   ２結合パートナ−は前記第１結合パートナ−について特
   異性でありかつ前記共与体分子または受容体分子の他方
   で標識付けされており、前記混合の条件は免疫学的反応
   の惹起を可能とし、これにより前記分析物の前記第１結
   合パートナ−への結合が前記第１結合パートナ−と前記
   第２結合パートナ−との間の空間的関係を変更するよう
   な条件であり； 前記混合物を光りで照射し、前記光りは前記共与体分子
   を励起することができる波長をもつが、前記受容体分子
   を実質的に励起することができる波長をもたず；そして 第１蛍光放射の減少また１よ第２蛍光放射の増加を検出
   し、そして蛍光の前記減少または増加を基準にして前記
   分析物の存在を決定する；ことを特徴とする免疫検定。 ３３、前記決定工程は前記増加または減少を標準曲線と
   比較する工程をさらに含み、これにより前記試料中の前
   記分析物の量を決定することができる特許請求の範囲第
   ３２項記載の免疫検定。 ３４、前記検出工程は共与体の蛍光時間定数を決定し、
   そして前記時間定数の変化を基準にして前記分析物の存
   在を決定することを含む特許請求の範囲第３２項記載の
   免疫検定。 ３５、前記結合パートナ−の一方または双方はモノクロ
   ナル抗体である特許請求の範囲第３２項記載の免疫検定
   。 ３６、前記第１結合パートナ−および前記第２結合パー
   トナ−は、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、Ｆ（
   ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）２°抗体および抗体断片から成
   る群より選択される特許請求の範囲第３２項記載の免疫
   検定。 ３７、共与体分子と受容体分子との間の蛍光エネルギー
   移動を用いる分析物の拮抗均一系免疫検定系において使
   用する試薬キットであって、前記共与体分子は前記受容
   体分子を励起することができる放射を有し、前記受容体
   分子は共与体分子の放射と区別可能な放射の蛍光を有し
   、モして共与体分子を励起するために用いる励起波長は
   受容体分子の認められる励起を生じさせず、前記キット
   は： 検定すべき分析物について特異性でありかつ共与体−受
   容体の蛍光エネルギー移動対の共与体、分子または受容
   体分子のいずれかで標識付けされた＠１１結パードナー
   ：および 前記共与体−受容体の蛍光エネルギー移動対の前記共与
   体分子または前記受容体分子の他方で標識付けされた第
   ２結合パートナー１前記第２結合パートナ−は前記第１
   結合パートナ−と反応することができ、かつ前記第１結
   合パートナ−とのその空間的関係は前記決定すべき分析
   物と前記第１結合パートナ−との間の免疫学的反応時に
   変更される： からなることを特徴とする試薬キット。