JPH0235359A

JPH0235359A - 免疫的検出用試薬

Info

Publication number: JPH0235359A
Application number: JP18495188A
Authority: JP
Inventors: Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎; Noboru Motoyama; 昇本山; Tadayasu Mitsumata; 光亦　忠泰
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1988-07-25
Filing date: 1988-07-25
Publication date: 1990-02-05
Anticipated expiration: 2012-03-19
Also published as: JP2591089B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、主として臨床検査における病原体、あるいは
疾患マーカー等の検出、さらには広〈産業上の極微量検
出分野に用いられる免疫的検出用試薬に関する。

従来の技術天然に存在する、あるいは人工的に作製した抗体を用い
た検出方法は、高特異性及び高感度の点に特徴ををし、
極小量の存在割合の目的物質を検出する目的で現在用い
られている。このような目的には、例えば、血液中から
病原体、あるいは腫瘍、心筋梗塞、脳血、栓等の疾出峙
に特異的に分泌されるいわゆる疾患マーカーなとの臨床
検査業務や、体内および大気中から生理活性のある極微
量の物質を検出する目的なとがある。近年このような目
的で、例えば石川栄冶、河合忠、宮井潔著「酵素免疫１
１１１１定法第３版」　（医学書院１９８７年、３１〜
５４頁）に記載されているように多くの種類の免疫測定
法が開発されている。この方法は、検出物質が高分子（
タンパク質）が低分子（ハプテン）かによって２分され
る。本発明では主としてハプテン系ながても精神疾患用
１医薬品てありがつ覚醒剤として習慣（性の高いメタン
フェタミン及びその類似物を対象としている。以下、ハ
プテン系の免疫的測定方法の代表例である、抗原同相酵
素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡ法と称する）の実験手順
を段階を追って説明する。

（Ａ）抗原のコーティングキャリアー蛋白、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
に、検出物質あるいはこれに官能基を導入した誘導体を
結合したフンシュゲートをバッファーに溶解して抗原溶
液とする。

マイクロプレート（塩化ビニルあるいはポリスチレン製
９６ウエルプレー１−　）に抗原溶液を１００μＬ／ウ
エル注入し、２０°Ｃで１夜保存する。

（Ｂ）ブロッキングＢＳＡのバッファー溶液を２５０μＬ／ウエル注入し、
０．５−２時間室温で放置する。その後、バッファーま
たは純水で３−５回洗浄する。

（Ｃ）抗体の反応検出物質溶液を注入し、振とうしながら抗体溶液をさら
に加える。常温で３−５時間１保存した後、アスピレー
タで抗体溶液を除去し、バッファーまたは純水で３−５
回・洗浄する。

（Ｄ）第２抗体の反応酵素、例えばペルオキシダーゼで標識した抗体に対する
抗体（第２抗体〕の溶液を注入し、常温で０．５−２時
間放置する。その後、バッファーまたは純水で３−５回
洗浄する。

（Ｅ）基質の反応と停止発色剤、例工ば０−フェニレンシアミン（セレン検出用
）をバッフｒ−に溶解し、使用直前に３０に過酸化水素
水を加えた溶液（基質溶液）を注入し、室温で発色反応
を行う。５−２０分後、硫酸て反応を停止する。

（Ｆ）測定マイクロプレート用吸光光度系を用いて４９２ｎｍの吸
光度を測定する。最終的に検出物質が多いほど吸光度が
弱いこ七から、物質の検出を行う。

発明が解決しようとする課題上述のように、従来の免疫的検出方法は多くの手順を必
要とし、また反応が固今相と液相の共存する不均一系で
進行、最終的な検出に酵素反応を用いているため、本質
的に長時間を要していた。本発明は、免疫的１検出に要
する時間を短縮することを目的とする。

課題を解決するための手段免疫的な検出を行う際の被検出物質と、抗体の有する蛍
光を消光する機能ををした蛍光消光物質が化学的に結合
した免疫的検出用試薬を構成する。

作用上記構成によれば、反応がすべて均一系（液相）で進行
し、さらに酵素反応も用いないため検出時間の著しい短
縮を行うことが可能となる。

実施例本発明は、例えばニトロベンゼン、ジニ）・ロベンゼン
、トリニトロベンゼンまたはそれらの誘導体と被検出物
質を化学的に結合したプローブ物質、即ち免疫的検出用
試薬を提供する。このプローブ物質を用いた免疫的検出
方法においては、あらかじめ抗体とプローブ物質を混合
するこ七によって抗体とプローブ物質を結合させ、抗体
が本来有している蛍光を消光しておく。目的１検出物質
を導入することによって、抗体とプローブ物質を解離さ
せ、蛍光が再び増大する現象を用いて免疫的検出を行な
う。

一般的に抗体は２８０ｎｍの励起で３＋４．Ｏｎ　ｍ、
付近に蛍光を発する。この蛍光は、種々の消光物質によ
り消光されるが、特によく知られた消光物質としてはニ
トロベンゼン、ジニトロベンゼン、１−ＩＪ二ｌ−ロベ
ンゼン等があり、蛋白あるいはハプテンと結合するため
にスルフォン酸基、ハロケン、アミン基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基なとの官能基が導入されていて
も同様の効果がある。なかでモ２．４−ジニトロフルオ
ロベンセンはサンカー法ニよるアミノ酸配列決定の試薬
として容易に入手でき、ハプテン、蛋白を問わすアミン
基に容易に結合するので望ましいと思われる。

特に、メタンフェタミンおよＯ・アンフェタミン、エフ
ェドリン等の覚醒剤検出については、下記の構造式の免
疫的検出試薬が良好である。

実施例１ます、プローブ物質の合成方法を簡単に説明する。装置
、幅用、炭田、直積、　１田本法医学髄誌（Ｊｐｎ、　
Ｊ、、　Ｌｅｇａｌ　Ｍｅｄ、、　３７（４）、　４１
１’７．１９８３）に記載された方法で、以下の構造式
を何するＮ−（４アミノブチル）メタンフェタミン、　
（ＭＡＮＨ２）を合成した。

たたし、ｎはＯもしくは１以上の正数、ＲＩは水素原子
もしくは水酸基、Ｒ２は水素原子もしくはアルキル基、
Ｘは水素原子もしくはメＩ・キシ基を表わすものとする
。

以下、本発明の原・理確認のため実験的に行った実施例
について説明する。

アセトン中でＭＡＮＨ２と２，４−ジニトロフルオロベ
ンセンを等モル混合し１時間１１ｔはんをおこなったの
ち分取用薄層クロマトグラフィーで精製した。この結果
、以下の構造式を有するプローブ物質、ＭＡＮＨ２ＤＮ
Ｐを得た。

本実施例で用いた抗体は、発明者らによって作製された
抗メタンフエタミンモノクローナル抗体（αＭＡＭＡＢ
Ｉ）である。この抗体はメタンフェタミン（ＭＡ）に対
し、約１０７のアフィニティーを有していた。

以下、実験的な検出の方法について手順を述べる。

■バッファー（１）　Ｈ７のリン酸基ソファーを０゜４
５μのフィルターに通したもの）てαＭＡＭＡＢ１を溶
解してＩ　Ｘ　１０−７Ｍの濃度とした。この溶液３６
０μＬを蛍光測定用ミクロセル波長２８０ｎｍ　（バン
ドパス５ｎｍ）の励起光、蛍光波長３．４１Ｑｎｍ　（
バンドパス１０ｎｍ）て強度約４６（ＰＬＯ）の蛍光を
発した（第１図、ａ部分）。

■ＭＡＮＨ２＋）ＮＰ３ＸＩＯ−７Ｍのバッファー溶液
２０μＬを加えると、消光が起こり蛍光強、度か２８（
ＦＬＩ）に減少した。この消光反応は約１５秒で平衡状
態に達した。　（第１図、ｂ部分）■−１−記の溶液に
ＭＡの３ＸＩＯ−２Ｍバッファー溶液２０μＬ（最終濃
度Ｉ　Ｘ　ＩＯ＝Ｍ）を加えるさ、抗体とＭＡが結合し
、ＭＡＮＨ２ＤＮＰか脱離したため消光が阻害され、そ
の結果型光強、度が約４０（ＦＬｘ）に増大した。この
反応は約３０秒で平衡に達した。　（第１図、Ｃ部分）以」二記載のように、■の段階の溶液にＭＡを導入し、
蛍光強度の増大からＭＡを検出することができた。この
実験条件での検出感度を確かめるため、■で各濃度のＭ
Ａを用いたときの蛍光強度の変化を第２図に示す。なお
、第２図でＭＡａ度は最終濃度で示した。縦、軸はで示した。

第２図の結果から約１０−８Ｍの濃度のＭＡが本発明の
方法により検出できたことが証明された。

実施例２実施例１のメタンフェタミンの代わりにアンフェタミン
を用いて同・様の合成を行った結果、以下に示す構造式
の化合物（Ａ　Ｐ　Ｎ　Ｈ２１）　Ｎ　Ｐ　）か得られ
た。ＡＰＮＨ２ＤＮＰをプローブ物質として用いて実施
例１と同様の操作を行った結果、検出感度はＩＱ−８，
５に落ちたものの、同様の効果が得られた。

実施例３実施例１におけるＭ　Ａ　Ｎ　Ｈ２の代わりにアンフェ
タミンを用いて同様の合成方法をとった結果、以下に示
す構造式の化合物（ＡＰＤＮＰ）を得た。

ＡＰＤＮＰをプローブ物質として用いて実施例１と同様
の操作を行った結果、検出感度は実施例２と同じく１０
−６５に落ちたものの、同様の効果が得られた。

以」―、主としてＭＡの検出を例にとって本発明の説明
を行ったが、もちろんその他の化学物質すべてに応用可
能な一般的方法である。また、実施の手軽さから蛍光消
光物質として、ジニトロベンゼンの誘導体を用いたが、
トリニトロベンゼン、ニトロベンゼンであっても同様の
効果が得られることは容易に考えられる。

発明の効果本発明によれば、従来５時間以−１−要していた免疫的
検出を１分以下に短縮することか可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の一実施例における免疫的検出用試薬
を用いた測定の際の蛍光強度の時間変化を示すグラフ、
第２図は各Ｍ　Ａ　？）Ａ度における蛍光消光阻害の変
化を示したグラフである。代理人の氏名　弁理士　粟野重孝　はか１名＋１（％）謙１「某擢某裏憾憾

Claims

【特許請求の範囲】

（１）免疫的な検出を行う際の被検出物質と、抗体の有
する蛍光を消光する機能を有した蛍光消光物質が化学的
に結合したことを特徴とする免疫的検出用試薬。
（２）蛍光を消光する機能を有した蛍光消光物質が、ニ
トロベンゼン、ジニトロベンゼン、トリニトロベンゼン
またはそれらの誘導体である特許請求の範囲第１項記載
の免疫的検出用試薬。
（３）被検出物質が、メタンフェタミン、アンフェタミ
ンあるいはエフェドリンである特許請求の範囲第１項記
載の免疫的検出用試薬。
（４）抗体と結合する類似物質が以下の構造式を有して
いる特許請求の範囲第１項記載の免疫的検出用試薬。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ただし、ｎは０もしくは１以上の正数、Ｒ１は水素原子
もしくは水酸基、Ｒ２は水素原子もしくはアルキル基、
Ｘは水素原子もしくはメトキシ基を表わすものとする。