JPS58122459A - 酵素の会合を利用した測定方法 - Google Patents
酵素の会合を利用した測定方法Info
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- JPS58122459A JPS58122459A JP57003314A JP331482A JPS58122459A JP S58122459 A JPS58122459 A JP S58122459A JP 57003314 A JP57003314 A JP 57003314A JP 331482 A JP331482 A JP 331482A JP S58122459 A JPS58122459 A JP S58122459A
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- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生体液中の物質を定量的に測定する丸めの均一
系分析方法に関する。詳しくは酵素を標識した抗原参る
いは抗体を用い、抗原抗体反応を行なわせ、会合０＊＊
生ずる酵素活性の変化を主として光学的に測定し、それ
よ）ｌ的の抗原あるいは抗体を定量する均一系の分析方
法に関する。なお、本発明における会合とは物質が酵素
Ｏ周辺に局在的に酵素活性に変化をおよぼすＳ＊に集ま
ることをいう、例えば生物学的反応である免疫学的凝集
反応参るいは凝集素による凝集反応や化学的架橋反応に
よる凝集反応をいう。
系分析方法に関する。詳しくは酵素を標識した抗原参る
いは抗体を用い、抗原抗体反応を行なわせ、会合０＊＊
生ずる酵素活性の変化を主として光学的に測定し、それ
よ）ｌ的の抗原あるいは抗体を定量する均一系の分析方
法に関する。なお、本発明における会合とは物質が酵素
Ｏ周辺に局在的に酵素活性に変化をおよぼすＳ＊に集ま
ることをいう、例えば生物学的反応である免疫学的凝集
反応参るいは凝集素による凝集反応や化学的架橋反応に
よる凝集反応をいう。
従来から免疫学的手法により抗原抗体反応を利用し生体
液中の物質を禰定する方法は檀々考見られて１九。例え
ば古（は毛細管沈降法、免債゛比濁法、ネフエロメトリ
ックイムノ、アッセイ、ラテックスＩＪＩ法、シングル
ラジアルイムノディに３−−ジ璽ン螢直接沈降めるいは
凝集を測定する方法や近くはラジオイムノアッセイ、あ
るいは■以エンザイムイムノアツセイのように抗原ある
いは抗体に標識を施し微量の成分を正確に測定すること
が開発され盛に利用されている。しかしこれらの方法は
いずれも一長一短があ〕感度に問題があったシまたは操
作が煩雑で６つ九り放射性物質の処理に問題があるなど
通常の臨床検査の場においては不便なものである。
液中の物質を禰定する方法は檀々考見られて１九。例え
ば古（は毛細管沈降法、免債゛比濁法、ネフエロメトリ
ックイムノ、アッセイ、ラテックスＩＪＩ法、シングル
ラジアルイムノディに３−−ジ璽ン螢直接沈降めるいは
凝集を測定する方法や近くはラジオイムノアッセイ、あ
るいは■以エンザイムイムノアツセイのように抗原ある
いは抗体に標識を施し微量の成分を正確に測定すること
が開発され盛に利用されている。しかしこれらの方法は
いずれも一長一短があ〕感度に問題があったシまたは操
作が煩雑で６つ九り放射性物質の処理に問題があるなど
通常の臨床検査の場においては不便なものである。
本発明者等は上述の観点から種々研究を重ねた結果抗原
あるいは抗体に標識され九酵素が単独の場合と抗原抗体
反応で会合が起った場合とで酵素活性に違いが現われ会
合の進むに伴って酵素活性が増加するととを発見し本発
明を完成した。本発明に従って標的物質とその物質に特
異的結合性を有する受容体のいずれか一方に酵素を結合
させえものを用い、標的物質と受容体との会合反応を行
なわせ、その結果生ずる酵素ｍｓの変化から標的物質を
分析定量する方法が提供される。
あるいは抗体に標識され九酵素が単独の場合と抗原抗体
反応で会合が起った場合とで酵素活性に違いが現われ会
合の進むに伴って酵素活性が増加するととを発見し本発
明を完成した。本発明に従って標的物質とその物質に特
異的結合性を有する受容体のいずれか一方に酵素を結合
させえものを用い、標的物質と受容体との会合反応を行
なわせ、その結果生ずる酵素ｍｓの変化から標的物質を
分析定量する方法が提供される。
本発明は上述の通シ免疫学的余合による酵素活性が会合
の度合によ如定量的に増加することに基づき会合が全く
ない状態ではその酵素活性が阻害され発現しないような
基質濃度を選ぶことによ如均−系分析方法を可能にした
。
の度合によ如定量的に増加することに基づき会合が全く
ない状態ではその酵素活性が阻害され発現しないような
基質濃度を選ぶことによ如均−系分析方法を可能にした
。
本発明による酵素活性の変化は極めて鋭敏で、非常に僅
かの会合物質の量的変化に比例して起るので生体成分中
の微量物質の定量が可能である。本発明の方法は抗原抗
体反応を酵素を用いて均−系で測定する面から見れば従
来のホモジニアスエンザイムイムノアツセイと類似の方
法と考えられるが、従来のものは抗原抗体反応によシ基
質が酵素の活性部位に結合できなくなるという立体障害
を利用して均−系の測定を可能にしたものでろるのに対
し、本発明の方法は会合による酵素活性の発現に対する
変化に基づいている点で反応機構を全く異にする新規な
方法である。よって従来不可能でめり九高分子抗原を低
分子の基質を用いて測定することも可能となった。酵素
活性の変化は酵素標識抗体に標的物質である抗原が１分
子量合した時点よシ始を如、凝果反厄あるいは会合の進
行に対して酵素活性の変化も大きくなる丸めポリエチレ
ングリコール等の反応促進剤を加えることは測定時間の
短縮に有効でるる。
かの会合物質の量的変化に比例して起るので生体成分中
の微量物質の定量が可能である。本発明の方法は抗原抗
体反応を酵素を用いて均−系で測定する面から見れば従
来のホモジニアスエンザイムイムノアツセイと類似の方
法と考えられるが、従来のものは抗原抗体反応によシ基
質が酵素の活性部位に結合できなくなるという立体障害
を利用して均−系の測定を可能にしたものでろるのに対
し、本発明の方法は会合による酵素活性の発現に対する
変化に基づいている点で反応機構を全く異にする新規な
方法である。よって従来不可能でめり九高分子抗原を低
分子の基質を用いて測定することも可能となった。酵素
活性の変化は酵素標識抗体に標的物質である抗原が１分
子量合した時点よシ始を如、凝果反厄あるいは会合の進
行に対して酵素活性の変化も大きくなる丸めポリエチレ
ングリコール等の反応促進剤を加えることは測定時間の
短縮に有効でるる。
本発明に用いられるｉｌ素には種々の酵素が考えられ、
それらよｎａｍｅ酵素を選ぶことは研究者としてさはど
国難ではない。九とえはパーオキシダーイは好適な酵素
の一つである。
それらよｎａｍｅ酵素を選ぶことは研究者としてさはど
国難ではない。九とえはパーオキシダーイは好適な酵素
の一つである。
を九、本Ａｋ！ＡＯ＃素活性の画定方法は公知の方法が
使用できるが、ペルオキシダーゼについては基質として
至適濃度よシ過刹かつ遊離の＃木を完全に阻害する濃度
の過酸化物、九とえば過酸化水素ま九は過酸化尿素を用
い、水素供与体としてフェノール類九とえはフェノール
、パックルーフェノールなどを、またそのフェノールに
対応する酸化縮合剤とじて九とえば４−ア建ノアンチビ
リンを用い発色の吸光度を測定して行なうことができる
。この方法は本発明に適用できる蛾も有効な方法である
。
使用できるが、ペルオキシダーゼについては基質として
至適濃度よシ過刹かつ遊離の＃木を完全に阻害する濃度
の過酸化物、九とえば過酸化水素ま九は過酸化尿素を用
い、水素供与体としてフェノール類九とえはフェノール
、パックルーフェノールなどを、またそのフェノールに
対応する酸化縮合剤とじて九とえば４−ア建ノアンチビ
リンを用い発色の吸光度を測定して行なうことができる
。この方法は本発明に適用できる蛾も有効な方法である
。
酵素標識抗原６るいは抗体の調製には公知の試薬が使用
できる。たとえば、グルタルアルデヒド、カルボジイミ
ド、ビスマレイド、２個の異なる官能基を有する試薬等
があり、また、ペルオキシダーゼの糖鎖を過沃素酸で酸
化してアルデヒド基にする方法も有効である。これらの
試薬を用い抗原あるいは抗体の反応性を保った状態で酵
素を標識する。
できる。たとえば、グルタルアルデヒド、カルボジイミ
ド、ビスマレイド、２個の異なる官能基を有する試薬等
があり、また、ペルオキシダーゼの糖鎖を過沃素酸で酸
化してアルデヒド基にする方法も有効である。これらの
試薬を用い抗原あるいは抗体の反応性を保った状態で酵
素を標識する。
本発明の測定の対象となる標的物質はその分子量に制限
はないが、標的物質の種類に応じて多数の測定の方法が
ある。以下例としてそのいくつかを示すが、本発明はこ
れに制限されるものではない。
はないが、標的物質の種類に応じて多数の測定の方法が
ある。以下例としてそのいくつかを示すが、本発明はこ
れに制限されるものではない。
Ｌ競合反応の利用
（１）低分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する場合
： 抗原分子上に１繊し得る１コの抗原決 定基をもつ抗原九とえばステロイドホルモン、各ＳＳ剤
等は酵素１分子に抗原２分子以上を結合した酵素標識抗
原を調製する。
： 抗原分子上に１繊し得る１コの抗原決 定基をもつ抗原九とえばステロイドホルモン、各ＳＳ剤
等は酵素１分子に抗原２分子以上を結合した酵素標識抗
原を調製する。
標的物質すなわち標的抗原とその抗体
にさらに酵素標識抗原を加え競合的に凝集反応を起させ
ると、標的抗原の量の函数として＃素活性が測定される
ので標準＊＊を用い標的抗原の量を定量することができ
る。この場合酵素標識抗原は多価抗原と同様の働きをす
る。
ると、標的抗原の量の函数として＃素活性が測定される
ので標準＊＊を用い標的抗原の量を定量することができ
る。この場合酵素標識抗原は多価抗原と同様の働きをす
る。
（鍼）＾分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する場合
： 蛋白質のように高分子の抗原の場合は 同−抗原上に認識し得る抗原決定基が複数個あるので酵
素に結合する抗原は１分子以上であればよい。この場合
も１−（１）と同様の操作で制置反応を起重ぜると標的
抗原を測定することができる。
： 蛋白質のように高分子の抗原の場合は 同−抗原上に認識し得る抗原決定基が複数個あるので酵
素に結合する抗原は１分子以上であればよい。この場合
も１−（１）と同様の操作で制置反応を起重ぜると標的
抗原を測定することができる。
２非競合反応の利用
（１）高分子抗原を酵素標識抗体を用いて測定する場合
： 認識し得る２つ以上の抗原決定基をも つものはこれらを標的抗原として測定するときはこの抗
原に対する抗体に酵素を標識する。標的抗原と酵素標識
抗体との間に凝集反応を起させると抗原抗体間に立体的
な結合が進行して凝集の度合が大きくなり酵素活性が大
きく変化する。従ってこの＃素活性の変動から標的抗原
を測定することができる。この場合には均−系であるに
も拘わらず、競合反応による測定ではない。
： 認識し得る２つ以上の抗原決定基をも つものはこれらを標的抗原として測定するときはこの抗
原に対する抗体に酵素を標識する。標的抗原と酵素標識
抗体との間に凝集反応を起させると抗原抗体間に立体的
な結合が進行して凝集の度合が大きくなり酵素活性が大
きく変化する。従ってこの＃素活性の変動から標的抗原
を測定することができる。この場合には均−系であるに
も拘わらず、競合反応による測定ではない。
（ｉｔ）高分子抗原をハイブリッド抗体と酵素を用いて
測定する場合− 標的抗原として高分子たとえば蛋白質 を測定する場合、標的抗原に対する抗体と使用する＃素
に対する抗体からノ・イブリッド抗体をｖ４製し、標的
抗原と酵素とハイブリッド抗体の３つを非競合的に反応
させ、その結果生ずる酵素活性の変化から標的抗原を測
定することができる。
測定する場合− 標的抗原として高分子たとえば蛋白質 を測定する場合、標的抗原に対する抗体と使用する＃素
に対する抗体からノ・イブリッド抗体をｖ４製し、標的
抗原と酵素とハイブリッド抗体の３つを非競合的に反応
させ、その結果生ずる酵素活性の変化から標的抗原を測
定することができる。
この場合酵素は標識等の操作をせずにそのま＼使用する
ことができる。
ことができる。
ＧｉＯ抗体を測定する場合：
低分子抗原に対する抗体は１−（１）、高分子抗原に対
する抗体は１−（１）の酵素標識抗原を用いて未知量抗
体との間に凝集反応を起させ、その結果生ずるｉｌＩ素
活性の変化から抗体量を測定することができる。
する抗体は１−（１）の酵素標識抗原を用いて未知量抗
体との間に凝集反応を起させ、その結果生ずるｉｌＩ素
活性の変化から抗体量を測定することができる。
抗原抗体の凝集反応はその一方の量を
変化させると両者の比が最適比を得るために他方の量は
必然的に変化する。この性質を利用して酵素標識抗体に
標識をしていない抗体を加えることにより標的抗原の測
定範囲を変えることができる。すなわちあらかじめ酵素
標識抗体に適当な既知量の抗体を加えておき、その混合
液を標的抗原に加え抗原抗体反応を行なわせ酵素活性を
測定すると添加した未４１識抗体が多い根側定範囲が標
的抗原の高濃度側に移動する。これによって検体を希釈
することなく通常０＠度範囲の測定系に倉せて測定する
ことができる。
必然的に変化する。この性質を利用して酵素標識抗体に
標識をしていない抗体を加えることにより標的抗原の測
定範囲を変えることができる。すなわちあらかじめ酵素
標識抗体に適当な既知量の抗体を加えておき、その混合
液を標的抗原に加え抗原抗体反応を行なわせ酵素活性を
測定すると添加した未４１識抗体が多い根側定範囲が標
的抗原の高濃度側に移動する。これによって検体を希釈
することなく通常０＠度範囲の測定系に倉せて測定する
ことができる。
既知量の酵素標識抗体を用い非競合的
に抗原と反応させる場合、抗原過剰域では凝集反応が起
こ）に〈＜、酵素活性の変化が小さくなる。こＯことは
測定する物質の存在する範囲が広い場合、たとえばｇ−
７エトプロテインの血中１１ｍ１：＃Ｊ定のような場合
には、測定可能な範囲に検体を希釈しなくてはならない
不便さを生じる。このような場合には、既知量の酵素標
識抗体と未知量抗原を反応させ、反応終了後に既知量ｏ
ａｔｓ識抗体を加え、更に反応を行なうと広い範囲にわ
九る醐定か可能になる。次に実施例によシさらに詳しく
本発明を説明する。
こ）に〈＜、酵素活性の変化が小さくなる。こＯことは
測定する物質の存在する範囲が広い場合、たとえばｇ−
７エトプロテインの血中１１ｍ１：＃Ｊ定のような場合
には、測定可能な範囲に検体を希釈しなくてはならない
不便さを生じる。このような場合には、既知量の酵素標
識抗体と未知量抗原を反応させ、反応終了後に既知量ｏ
ａｔｓ識抗体を加え、更に反応を行なうと広い範囲にわ
九る醐定か可能になる。次に実施例によシさらに詳しく
本発明を説明する。
実施例Ｌ 牛血清アルブン／（以下１８ムという）の競
合的均−系槻定 ａ） 西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ｎ１ｉｐと
いう）標識Ｂ８ムの調製： ＨＢＦ４”ｆをナカネ等の方法（テｈ＠Ｊ。
合的均−系槻定 ａ） 西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ｎ１ｉｐと
いう）標識Ｂ８ムの調製： ＨＢＦ４”ｆをナカネ等の方法（テｈ＠Ｊ。
ｏｆ Ｈ１ｓｔｏ＊に＠ＩＬＪｋ Ｃｙｔ・＠ｈ・ｗａ
、 、 ２２−１２ 。
、 、 ２２−１２ 。
１０８４〜１０９１ 、１９７４ ） によ如そＯ糖
鎖をアルデヒド化しその３ｑ°と結晶化１８ム（シグオ
社製晶）１ｗをｐｉｔｓ炭酸緩衝液中で２器℃において
２時間反応後、セファデックスＧ−Ｚｏｏカラムを用い
て分画し酵素標識抗原を得九。
鎖をアルデヒド化しその３ｑ°と結晶化１８ム（シグオ
社製晶）１ｗをｐｉｔｓ炭酸緩衝液中で２器℃において
２時間反応後、セファデックスＧ−Ｚｏｏカラムを用い
て分画し酵素標識抗原を得九。
ｂ）Ｂ８ムの一定：
＆４−のポリエチレングリコール６０００（以下ＰＥＧ
という）を含む食塩加リン酸緩衝液（ＰＪ１７．Ｏ１以
下ＰＢ１１という）で調製し九１１廊ムの希釈系列よ）
ａ、０器−をそれぞれ試験管にとｊ＋、１−ａ） で
調製した酵素ＩＩＩ織抗原α０２ｍｇをそれぞれに加え
、次いで１８ム抗体（ダコ社員品） ａｏ ２ｓｄを加
えて３７℃において１５分間反応後、０、５ ｍＭ ４
−ア建ノア／チビリン、５０ｍＭフェノール、３５欝Ｍ
過酸化水素からなる基質呈色液ｚ５−を加え、３７℃に
おいてＳ分間反応後、波長Ｓ ＯＯｎｍにより吸光度を
一定する。結果をｊＩＩ１図に示す。この結果よ３１ｍ
８ム濃度が嵩くなるほど競合的に凝集反応が低下し、酵
素活性が減少することが明らかで、抗原濃度による標準
曲線が得られ九。
という）を含む食塩加リン酸緩衝液（ＰＪ１７．Ｏ１以
下ＰＢ１１という）で調製し九１１廊ムの希釈系列よ）
ａ、０器−をそれぞれ試験管にとｊ＋、１−ａ） で
調製した酵素ＩＩＩ織抗原α０２ｍｇをそれぞれに加え
、次いで１８ム抗体（ダコ社員品） ａｏ ２ｓｄを加
えて３７℃において１５分間反応後、０、５ ｍＭ ４
−ア建ノア／チビリン、５０ｍＭフェノール、３５欝Ｍ
過酸化水素からなる基質呈色液ｚ５−を加え、３７℃に
おいてＳ分間反応後、波長Ｓ ＯＯｎｍにより吸光度を
一定する。結果をｊＩＩ１図に示す。この結果よ３１ｍ
８ム濃度が嵩くなるほど競合的に凝集反応が低下し、酵
素活性が減少することが明らかで、抗原濃度による標準
曲線が得られ九。
実施例ｚ ｇ−フェトプロティン（以下ＡＦＰという＞
ｏ＊ｔｉａ合的均−系画定 ａ）抗ムＦＰ抗体Ｆ（ａｂ’）１画分の＃４製：西等の
方法（Ｃａｎｅ＠ｒ ＩＬ＠１＋、 、 ３０ 、２５
０７〜２ＩＳ１３ 、 ’１ｓｙｏ ）によ゛如腑帯血
清より抽出し精製しえムＦＰをフロイントの完全アジュ
バントと畳量混合し、つ１ナギに免疫して抗ムＦＰウナ
ギ血清を得九。この抗血清よ）エベレイ等の方法（Ｊ、
８ｏ１１ｄ −ｐｋａｓ・１１ｏｏｋｕａ、 、 ２
、４５〜７８ 、１９７７）によって抗体を精製した
。α１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ！本５）に対して透析し大抗
体に２−重量のペプシン（ベーリンガー社製品）を加え
３７℃において４８時間消化し先後、セファデックスＧ
−２００カツ五を用いて抗ＡＩ’Ｐ抗体Ｆ（ａｋ’）、
画分を得え。
ｏ＊ｔｉａ合的均−系画定 ａ）抗ムＦＰ抗体Ｆ（ａｂ’）１画分の＃４製：西等の
方法（Ｃａｎｅ＠ｒ ＩＬ＠１＋、 、 ３０ 、２５
０７〜２ＩＳ１３ 、 ’１ｓｙｏ ）によ゛如腑帯血
清より抽出し精製しえムＦＰをフロイントの完全アジュ
バントと畳量混合し、つ１ナギに免疫して抗ムＦＰウナ
ギ血清を得九。この抗血清よ）エベレイ等の方法（Ｊ、
８ｏ１１ｄ −ｐｋａｓ・１１ｏｏｋｕａ、 、 ２
、４５〜７８ 、１９７７）によって抗体を精製した
。α１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ！本５）に対して透析し大抗
体に２−重量のペプシン（ベーリンガー社製品）を加え
３７℃において４８時間消化し先後、セファデックスＧ
−２００カツ五を用いて抗ＡＩ’Ｐ抗体Ｆ（ａｋ’）、
画分を得え。
ｂ） マレイ建ド基導入ＨＩＰの調Ｉｌｌ：実施例１−
ｓ） の方法に準じてＨ翼Ｐ９岬とナト２メチレンジ
アミン１５ｗＩを結合させ、アミノ基を導入し九ＨＲＦ
を得え。
ｓ） の方法に準じてＨ翼Ｐ９岬とナト２メチレンジ
アミン１５ｗＩを結合させ、アミノ基を導入し九ＨＲＦ
を得え。
このアミノ基導入Ｈ１ｌＰ２．３Ｗに北用らの方法（臨
床化学、６％、３号、 １７ｇ −１８６。
床化学、６％、３号、 １７ｇ −１８６。
１９７８ ） によ）メタ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−とドロ會シスクシンイオドエステル（ビアスケ２力
ル社製品）ｉｓｓｙを加え３０℃において３００分間反
応せ先後、セファデックスＧ−２ｓカツムを用いて分画
しルイ建ド基を導入したＩＩＲＰを得た。
Ｎ−とドロ會シスクシンイオドエステル（ビアスケ２力
ル社製品）ｉｓｓｙを加え３０℃において３００分間反
応せ先後、セファデックスＧ−２ｓカツムを用いて分画
しルイ建ド基を導入したＩＩＲＰを得た。
＠）酵素標識抗体の調１１：
２−１） で調製し大抗体ｙ（ａｂ’Ｌに蛾終浪直Ｉ
Ｚ５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを加え９０分間
反応後セファデックスＧ−２５力之ムを用いて分画して
１尋られた抗体Ｆａｌ＋’ ６岬に実施例２−ｂ）で調
製し九マレイミド基導入Ｈ１ｌＦ１．５ｑを加え３７℃
において３００分間反応後室温で一夜装置した。これを
セファデックスＧ−２００カラムを用いて分画し酵素４
１Ｉ繊抗体を得た。
Ｚ５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを加え９０分間
反応後セファデックスＧ−２５力之ムを用いて分画して
１尋られた抗体Ｆａｌ＋’ ６岬に実施例２−ｂ）で調
製し九マレイミド基導入Ｈ１ｌＦ１．５ｑを加え３７℃
において３００分間反応後室温で一夜装置した。これを
セファデックスＧ−２００カラムを用いて分画し酵素４
１Ｉ繊抗体を得た。
ｄ）ムＦＰの測定：
ｐｕｓで調製したムＦＰの希釈系列よりα０５−をそれ
ぞれ試験管にとり、、１０１０ｐＥＧを含むＰ藤８α０
２−と実施？植２−＠）でＩＩ製し九酵素標繊抗体α０
２ｍ１をそれぞれに加え３７℃において１５分間反応さ
せ丸後、実施例１−ｂ）と同じ基質呈色ｆＩＬλ５−を
加え、３７℃において５分間反応後、波長ｓ ｏ ｏ
Ｅｌｍによ如吸光度を一定した。
ぞれ試験管にとり、、１０１０ｐＥＧを含むＰ藤８α０
２−と実施？植２−＠）でＩＩ製し九酵素標繊抗体α０
２ｍ１をそれぞれに加え３７℃において１５分間反応さ
せ丸後、実施例１−ｂ）と同じ基質呈色ｆＩＬλ５−を
加え、３７℃において５分間反応後、波長ｓ ｏ ｏ
Ｅｌｍによ如吸光度を一定した。
一定績釆を第２１ｉに示す。この結果よりＡＦＰ濃度が
高くなるほど非競合的に凝集反応が進み、酵素活性が増
加することを示す標準曲線が得られ、均−系非競合反応
によって＾感度で特異的な分析方法が確立された。
高くなるほど非競合的に凝集反応が進み、酵素活性が増
加することを示す標準曲線が得られ、均−系非競合反応
によって＾感度で特異的な分析方法が確立された。
実施例１ 測定範囲の調整
ＰＨ１でＷ４１＆シたムＦＰの希釈系列よシα０５−を
それぞれ試験管にと！Ｄ、１０−のＰＥＧを含むＰＩ３
（ＬＯ２−をそれぞれに加える。実施例２−ｂ）で調製
し九酵素標識抗体と抗ＡＦＰウサギ血清のＰＢＩｉ希釈
液を等量混合した溶液α０４−を上記反応液それぞれに
加え１５分間反応後、実施例１−ｂ） と同様の方法
で酵素活性を測定し友。
それぞれ試験管にと！Ｄ、１０−のＰＥＧを含むＰＩ３
（ＬＯ２−をそれぞれに加える。実施例２−ｂ）で調製
し九酵素標識抗体と抗ＡＦＰウサギ血清のＰＢＩｉ希釈
液を等量混合した溶液α０４−を上記反応液それぞれに
加え１５分間反応後、実施例１−ｂ） と同様の方法
で酵素活性を測定し友。
加え九抗血清の量と測定範囲０関係を第３図に示す。酵
素標識抗体にろらかしめ未標識抗体を加えておくことに
ょシ測定範囲が変化することがあきらかとな如、生体成
分の通常濃度範囲に測定系を合わせることが可能となつ
九。
素標識抗体にろらかしめ未標識抗体を加えておくことに
ょシ測定範囲が変化することがあきらかとな如、生体成
分の通常濃度範囲に測定系を合わせることが可能となつ
九。
実施例也 測定範囲の拡大
実施例３と同様のＰＩＧを含むＡＦＰの希釈系列それぞ
れに実施例２−ｂ） で調製した酵素標識抗体α０２
−を加え３７℃において１５分間反応させた。反応液そ
れぞれに抗ムＦＰ血清α０２−を加え、更に１５分間反
応後、実施例１−ｂ）と同様の方法で酵素活性を測定し
友。
れに実施例２−ｂ） で調製した酵素標識抗体α０２
−を加え３７℃において１５分間反応させた。反応液そ
れぞれに抗ムＦＰ血清α０２−を加え、更に１５分間反
応後、実施例１−ｂ）と同様の方法で酵素活性を測定し
友。
抗体を後から加えた場合と加えない場合の標準曲線を第
４図に示す。この結果より後から抗体を加えた場合側足
範囲が広くなることが明らかになった。
４図に示す。この結果より後から抗体を加えた場合側足
範囲が広くなることが明らかになった。
上述の通ｐ本発明は生体液中の値量成分を均−系で正確
に測定する新規な測定方法でめシ、その応用範囲は広く
極めて有用でるる。
に測定する新規な測定方法でめシ、その応用範囲は広く
極めて有用でるる。
さらに付言すれば本発明における＃水活性に変化をおよ
ばず会合反応は抗原抗体凝集反応に限定されるものでは
なく、たとえばビオチンとアビジ／、軸とレクチン、な
どのような物質と受容体との組合せの反応も含まれる。
ばず会合反応は抗原抗体凝集反応に限定されるものでは
なく、たとえばビオチンとアビジ／、軸とレクチン、な
どのような物質と受容体との組合せの反応も含まれる。
を走酵素活性の測定には比色ばがシでなく螢光による方
法も含まれる。
法も含まれる。
第１図はＢ８ムの競金的均−系測定にょる標準曲線を示
す。 第２図はＡＦＰの非競合的均−系測定による標準曲線を
示す。 第３図は酵素標識抗体に予め抗ＡＦＰ血清を加え、測定
に用いた場合の標準曲線を示す。 図中の数字は抗血清の希釈倍数を示す。 第４図は酵素標識抗体と抗原の反応後、抗ＡＦＰ血清を
加え、更に反応し九場合の標準曲線Ａｂ＋ と抗ＡＦＰ
血清を加えない場合の標準曲線Ａ、−を示す。 ［１園 ？ ＢＳＡ（Ｐｇ／ｍｌ） 第２１１ ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ） 第３１！１ 一ゝ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍｌ ）
す。 第２図はＡＦＰの非競合的均−系測定による標準曲線を
示す。 第３図は酵素標識抗体に予め抗ＡＦＰ血清を加え、測定
に用いた場合の標準曲線を示す。 図中の数字は抗血清の希釈倍数を示す。 第４図は酵素標識抗体と抗原の反応後、抗ＡＦＰ血清を
加え、更に反応し九場合の標準曲線Ａｂ＋ と抗ＡＦＰ
血清を加えない場合の標準曲線Ａ、−を示す。 ［１園 ？ ＢＳＡ（Ｐｇ／ｍｌ） 第２１１ ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ） 第３１！１ 一ゝ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍｌ ）
Claims (3)
- （１）標的物質とその物質に４１異的結舎性を有する受
容体の−ずれか−オに酵素を紬会させたものを用い、標
的物質と受容体との金倉反応を行なわせ、そＯ締果生ず
る酵素活性の変化から標的物質を分析定量する方法。 - （２）標的物質とその物質に４Ｉ異的結金性を有する受
容体の−ずれか一方に酵素に特異的結合性を有する物質
を鐘会させ良ものを用い、標的物質と受容体上＊、ｍｅ
会舎反応を行なわせそＯ艙果生ずる酵素温性Ｏ変化から
標的物質を分析定量する方法。 - （３） 酵素としてペルオキシダーゼヲ眉−、ペルオ
キシダーゼの活性を基質として過剰の過酸化物、水嵩供
与体としてフェノール類、このフェノール類に対する酸
化纏金剛を用いて測定することからなる畳許請求Ｏ＠囲
ｔｓＩ項、第２項記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003314A JPS58122459A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 酵素の会合を利用した測定方法 |
| CA000418760A CA1208550A (en) | 1982-01-14 | 1982-12-30 | Method of quantitative determination utilizing enzyme aggregation |
| DE8383100220T DE3363976D1 (en) | 1982-01-14 | 1983-01-12 | A method for the quantitative determination of a target substance |
| EP83100220A EP0084807B1 (en) | 1982-01-14 | 1983-01-12 | A method for the quantitative determination of a target substance |
| US07/399,440 US5130234A (en) | 1982-01-14 | 1989-08-28 | Method of quantitative determination utilizing enzyme aggregation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003314A JPS58122459A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 酵素の会合を利用した測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58122459A true JPS58122459A (ja) | 1983-07-21 |
| JPS6364746B2 JPS6364746B2 (ja) | 1988-12-13 |
Family
ID=11553890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57003314A Granted JPS58122459A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 酵素の会合を利用した測定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130234A (ja) |
| EP (1) | EP0084807B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58122459A (ja) |
| CA (1) | CA1208550A (ja) |
| DE (1) | DE3363976D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59164960A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fujirebio Inc | 抗原決定基具有物質の測定法 |
| JPS62220865A (ja) * | 1986-03-24 | 1987-09-29 | Yatoron:Kk | 均一系酵素免疫学的測定方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0144176B1 (en) * | 1983-11-18 | 1991-12-11 | FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. | Method of measuring a biological ligand |
| US4757001A (en) * | 1984-02-16 | 1988-07-12 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| DE3525911A1 (de) * | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Konjugat fuer die enzymimmunobestimmung |
| IT1235349B (it) * | 1988-12-23 | 1992-06-30 | Biodata Spa | Saggio immunologico per determinazioni in fase omogenea |
| US5437981A (en) * | 1990-02-26 | 1995-08-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the immunological determination of ligands |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5327763A (en) * | 1976-08-10 | 1978-03-15 | Nissan Diesel Motor Co Ltd | Pin-type synchronizer of auxiliary transmission |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2334107A1 (fr) * | 1975-12-05 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Procede de couplage de substances biologiques par des liaisons covalentes |
| US4134792A (en) * | 1976-12-06 | 1979-01-16 | Miles Laboratories, Inc. | Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance |
| IL51668A (en) * | 1977-03-16 | 1981-12-31 | Israel State | Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor |
| US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| IT1105734B (it) * | 1977-07-14 | 1985-11-04 | Syva Co | Prova di legame di competizione di antienzima omogeneo |
| US4275149A (en) * | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| US4401764A (en) * | 1980-02-07 | 1983-08-30 | Technicon Instruments Corporation | Immunoassays employing labeled reagent and a conjugate having two binding sites |
| US4359457A (en) * | 1980-09-30 | 1982-11-16 | Neville Jr David M | Anti Thy 1.2 monoclonal antibody-ricin hybrid utilized as a tumor suppressant |
| US4423143A (en) * | 1980-12-30 | 1983-12-27 | Syva Company | β-D-Galactosidase conjugate for enzyme immunoassays |
| US4444878A (en) * | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
-
1982
- 1982-01-14 JP JP57003314A patent/JPS58122459A/ja active Granted
- 1982-12-30 CA CA000418760A patent/CA1208550A/en not_active Expired
-
1983
- 1983-01-12 DE DE8383100220T patent/DE3363976D1/de not_active Expired
- 1983-01-12 EP EP83100220A patent/EP0084807B1/en not_active Expired
-
1989
- 1989-08-28 US US07/399,440 patent/US5130234A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5327763A (en) * | 1976-08-10 | 1978-03-15 | Nissan Diesel Motor Co Ltd | Pin-type synchronizer of auxiliary transmission |
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| JPS59164960A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fujirebio Inc | 抗原決定基具有物質の測定法 |
| JPS62220865A (ja) * | 1986-03-24 | 1987-09-29 | Yatoron:Kk | 均一系酵素免疫学的測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0084807B1 (en) | 1986-06-11 |
| JPS6364746B2 (ja) | 1988-12-13 |
| DE3363976D1 (en) | 1986-07-17 |
| EP0084807A1 (en) | 1983-08-03 |
| US5130234A (en) | 1992-07-14 |
| CA1208550A (en) | 1986-07-29 |
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