JPS58122459A - 酵素の会合を利用した測定方法 - Google Patents
酵素の会合を利用した測定方法Info
- Publication number
- JPS58122459A JPS58122459A JP57003314A JP331482A JPS58122459A JP S58122459 A JPS58122459 A JP S58122459A JP 57003314 A JP57003314 A JP 57003314A JP 331482 A JP331482 A JP 331482A JP S58122459 A JPS58122459 A JP S58122459A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- antibody
- antigen
- labeled
- afp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/972—Modified antibody, e.g. hybrid, bifunctional
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/819—Multifunctional antigen or antibody
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生体液中の物質を定量的に測定する丸めの均一
系分析方法に関する。詳しくは酵素を標識した抗原参る
いは抗体を用い、抗原抗体反応を行なわせ、会合０＊＊
生ずる酵素活性の変化を主として光学的に測定し、それ
よ）ｌ的の抗原あるいは抗体を定量する均一系の分析方
法に関する。なお、本発明における会合とは物質が酵素
Ｏ周辺に局在的に酵素活性に変化をおよぼすＳ＊に集ま
ることをいう、例えば生物学的反応である免疫学的凝集
反応参るいは凝集素による凝集反応や化学的架橋反応に
よる凝集反応をいう。
系分析方法に関する。詳しくは酵素を標識した抗原参る
いは抗体を用い、抗原抗体反応を行なわせ、会合０＊＊
生ずる酵素活性の変化を主として光学的に測定し、それ
よ）ｌ的の抗原あるいは抗体を定量する均一系の分析方
法に関する。なお、本発明における会合とは物質が酵素
Ｏ周辺に局在的に酵素活性に変化をおよぼすＳ＊に集ま
ることをいう、例えば生物学的反応である免疫学的凝集
反応参るいは凝集素による凝集反応や化学的架橋反応に
よる凝集反応をいう。
従来から免疫学的手法により抗原抗体反応を利用し生体
液中の物質を禰定する方法は檀々考見られて１九。例え
ば古（は毛細管沈降法、免債゛比濁法、ネフエロメトリ
ックイムノ、アッセイ、ラテックスＩＪＩ法、シングル
ラジアルイムノディに３−−ジ璽ン螢直接沈降めるいは
凝集を測定する方法や近くはラジオイムノアッセイ、あ
るいは■以エンザイムイムノアツセイのように抗原ある
いは抗体に標識を施し微量の成分を正確に測定すること
が開発され盛に利用されている。しかしこれらの方法は
いずれも一長一短があ〕感度に問題があったシまたは操
作が煩雑で６つ九り放射性物質の処理に問題があるなど
通常の臨床検査の場においては不便なものである。
液中の物質を禰定する方法は檀々考見られて１九。例え
ば古（は毛細管沈降法、免債゛比濁法、ネフエロメトリ
ックイムノ、アッセイ、ラテックスＩＪＩ法、シングル
ラジアルイムノディに３−−ジ璽ン螢直接沈降めるいは
凝集を測定する方法や近くはラジオイムノアッセイ、あ
るいは■以エンザイムイムノアツセイのように抗原ある
いは抗体に標識を施し微量の成分を正確に測定すること
が開発され盛に利用されている。しかしこれらの方法は
いずれも一長一短があ〕感度に問題があったシまたは操
作が煩雑で６つ九り放射性物質の処理に問題があるなど
通常の臨床検査の場においては不便なものである。
本発明者等は上述の観点から種々研究を重ねた結果抗原
あるいは抗体に標識され九酵素が単独の場合と抗原抗体
反応で会合が起った場合とで酵素活性に違いが現われ会
合の進むに伴って酵素活性が増加するととを発見し本発
明を完成した。本発明に従って標的物質とその物質に特
異的結合性を有する受容体のいずれか一方に酵素を結合
させえものを用い、標的物質と受容体との会合反応を行
なわせ、その結果生ずる酵素ｍｓの変化から標的物質を
分析定量する方法が提供される。
あるいは抗体に標識され九酵素が単独の場合と抗原抗体
反応で会合が起った場合とで酵素活性に違いが現われ会
合の進むに伴って酵素活性が増加するととを発見し本発
明を完成した。本発明に従って標的物質とその物質に特
異的結合性を有する受容体のいずれか一方に酵素を結合
させえものを用い、標的物質と受容体との会合反応を行
なわせ、その結果生ずる酵素ｍｓの変化から標的物質を
分析定量する方法が提供される。
本発明は上述の通シ免疫学的余合による酵素活性が会合
の度合によ如定量的に増加することに基づき会合が全く
ない状態ではその酵素活性が阻害され発現しないような
基質濃度を選ぶことによ如均−系分析方法を可能にした
。
の度合によ如定量的に増加することに基づき会合が全く
ない状態ではその酵素活性が阻害され発現しないような
基質濃度を選ぶことによ如均−系分析方法を可能にした
。
本発明による酵素活性の変化は極めて鋭敏で、非常に僅
かの会合物質の量的変化に比例して起るので生体成分中
の微量物質の定量が可能である。本発明の方法は抗原抗
体反応を酵素を用いて均−系で測定する面から見れば従
来のホモジニアスエンザイムイムノアツセイと類似の方
法と考えられるが、従来のものは抗原抗体反応によシ基
質が酵素の活性部位に結合できなくなるという立体障害
を利用して均−系の測定を可能にしたものでろるのに対
し、本発明の方法は会合による酵素活性の発現に対する
変化に基づいている点で反応機構を全く異にする新規な
方法である。よって従来不可能でめり九高分子抗原を低
分子の基質を用いて測定することも可能となった。酵素
活性の変化は酵素標識抗体に標的物質である抗原が１分
子量合した時点よシ始を如、凝果反厄あるいは会合の進
行に対して酵素活性の変化も大きくなる丸めポリエチレ
ングリコール等の反応促進剤を加えることは測定時間の
短縮に有効でるる。
かの会合物質の量的変化に比例して起るので生体成分中
の微量物質の定量が可能である。本発明の方法は抗原抗
体反応を酵素を用いて均−系で測定する面から見れば従
来のホモジニアスエンザイムイムノアツセイと類似の方
法と考えられるが、従来のものは抗原抗体反応によシ基
質が酵素の活性部位に結合できなくなるという立体障害
を利用して均−系の測定を可能にしたものでろるのに対
し、本発明の方法は会合による酵素活性の発現に対する
変化に基づいている点で反応機構を全く異にする新規な
方法である。よって従来不可能でめり九高分子抗原を低
分子の基質を用いて測定することも可能となった。酵素
活性の変化は酵素標識抗体に標的物質である抗原が１分
子量合した時点よシ始を如、凝果反厄あるいは会合の進
行に対して酵素活性の変化も大きくなる丸めポリエチレ
ングリコール等の反応促進剤を加えることは測定時間の
短縮に有効でるる。
本発明に用いられるｉｌ素には種々の酵素が考えられ、
それらよｎａｍｅ酵素を選ぶことは研究者としてさはど
国難ではない。九とえはパーオキシダーイは好適な酵素
の一つである。
それらよｎａｍｅ酵素を選ぶことは研究者としてさはど
国難ではない。九とえはパーオキシダーイは好適な酵素
の一つである。
を九、本Ａｋ！ＡＯ＃素活性の画定方法は公知の方法が
使用できるが、ペルオキシダーゼについては基質として
至適濃度よシ過刹かつ遊離の＃木を完全に阻害する濃度
の過酸化物、九とえば過酸化水素ま九は過酸化尿素を用
い、水素供与体としてフェノール類九とえはフェノール
、パックルーフェノールなどを、またそのフェノールに
対応する酸化縮合剤とじて九とえば４−ア建ノアンチビ
リンを用い発色の吸光度を測定して行なうことができる
。この方法は本発明に適用できる蛾も有効な方法である
。
使用できるが、ペルオキシダーゼについては基質として
至適濃度よシ過刹かつ遊離の＃木を完全に阻害する濃度
の過酸化物、九とえば過酸化水素ま九は過酸化尿素を用
い、水素供与体としてフェノール類九とえはフェノール
、パックルーフェノールなどを、またそのフェノールに
対応する酸化縮合剤とじて九とえば４−ア建ノアンチビ
リンを用い発色の吸光度を測定して行なうことができる
。この方法は本発明に適用できる蛾も有効な方法である
。
酵素標識抗原６るいは抗体の調製には公知の試薬が使用
できる。たとえば、グルタルアルデヒド、カルボジイミ
ド、ビスマレイド、２個の異なる官能基を有する試薬等
があり、また、ペルオキシダーゼの糖鎖を過沃素酸で酸
化してアルデヒド基にする方法も有効である。これらの
試薬を用い抗原あるいは抗体の反応性を保った状態で酵
素を標識する。
できる。たとえば、グルタルアルデヒド、カルボジイミ
ド、ビスマレイド、２個の異なる官能基を有する試薬等
があり、また、ペルオキシダーゼの糖鎖を過沃素酸で酸
化してアルデヒド基にする方法も有効である。これらの
試薬を用い抗原あるいは抗体の反応性を保った状態で酵
素を標識する。
本発明の測定の対象となる標的物質はその分子量に制限
はないが、標的物質の種類に応じて多数の測定の方法が
ある。以下例としてそのいくつかを示すが、本発明はこ
れに制限されるものではない。
はないが、標的物質の種類に応じて多数の測定の方法が
ある。以下例としてそのいくつかを示すが、本発明はこ
れに制限されるものではない。
Ｌ競合反応の利用
（１）低分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する場合
： 抗原分子上に１繊し得る１コの抗原決 定基をもつ抗原九とえばステロイドホルモン、各ＳＳ剤
等は酵素１分子に抗原２分子以上を結合した酵素標識抗
原を調製する。
： 抗原分子上に１繊し得る１コの抗原決 定基をもつ抗原九とえばステロイドホルモン、各ＳＳ剤
等は酵素１分子に抗原２分子以上を結合した酵素標識抗
原を調製する。
標的物質すなわち標的抗原とその抗体
にさらに酵素標識抗原を加え競合的に凝集反応を起させ
ると、標的抗原の量の函数として＃素活性が測定される
ので標準＊＊を用い標的抗原の量を定量することができ
る。この場合酵素標識抗原は多価抗原と同様の働きをす
る。
ると、標的抗原の量の函数として＃素活性が測定される
ので標準＊＊を用い標的抗原の量を定量することができ
る。この場合酵素標識抗原は多価抗原と同様の働きをす
る。
（鍼）＾分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する場合
： 蛋白質のように高分子の抗原の場合は 同−抗原上に認識し得る抗原決定基が複数個あるので酵
素に結合する抗原は１分子以上であればよい。この場合
も１−（１）と同様の操作で制置反応を起重ぜると標的
抗原を測定することができる。
： 蛋白質のように高分子の抗原の場合は 同−抗原上に認識し得る抗原決定基が複数個あるので酵
素に結合する抗原は１分子以上であればよい。この場合
も１−（１）と同様の操作で制置反応を起重ぜると標的
抗原を測定することができる。
２非競合反応の利用
（１）高分子抗原を酵素標識抗体を用いて測定する場合
： 認識し得る２つ以上の抗原決定基をも つものはこれらを標的抗原として測定するときはこの抗
原に対する抗体に酵素を標識する。標的抗原と酵素標識
抗体との間に凝集反応を起させると抗原抗体間に立体的
な結合が進行して凝集の度合が大きくなり酵素活性が大
きく変化する。従ってこの＃素活性の変動から標的抗原
を測定することができる。この場合には均−系であるに
も拘わらず、競合反応による測定ではない。
： 認識し得る２つ以上の抗原決定基をも つものはこれらを標的抗原として測定するときはこの抗
原に対する抗体に酵素を標識する。標的抗原と酵素標識
抗体との間に凝集反応を起させると抗原抗体間に立体的
な結合が進行して凝集の度合が大きくなり酵素活性が大
きく変化する。従ってこの＃素活性の変動から標的抗原
を測定することができる。この場合には均−系であるに
も拘わらず、競合反応による測定ではない。
（ｉｔ）高分子抗原をハイブリッド抗体と酵素を用いて
測定する場合− 標的抗原として高分子たとえば蛋白質 を測定する場合、標的抗原に対する抗体と使用する＃素
に対する抗体からノ・イブリッド抗体をｖ４製し、標的
抗原と酵素とハイブリッド抗体の３つを非競合的に反応
させ、その結果生ずる酵素活性の変化から標的抗原を測
定することができる。
測定する場合− 標的抗原として高分子たとえば蛋白質 を測定する場合、標的抗原に対する抗体と使用する＃素
に対する抗体からノ・イブリッド抗体をｖ４製し、標的
抗原と酵素とハイブリッド抗体の３つを非競合的に反応
させ、その結果生ずる酵素活性の変化から標的抗原を測
定することができる。
この場合酵素は標識等の操作をせずにそのま＼使用する
ことができる。
ことができる。
ＧｉＯ抗体を測定する場合：
低分子抗原に対する抗体は１−（１）、高分子抗原に対
する抗体は１−（１）の酵素標識抗原を用いて未知量抗
体との間に凝集反応を起させ、その結果生ずるｉｌＩ素
活性の変化から抗体量を測定することができる。
する抗体は１−（１）の酵素標識抗原を用いて未知量抗
体との間に凝集反応を起させ、その結果生ずるｉｌＩ素
活性の変化から抗体量を測定することができる。
抗原抗体の凝集反応はその一方の量を
変化させると両者の比が最適比を得るために他方の量は
必然的に変化する。この性質を利用して酵素標識抗体に
標識をしていない抗体を加えることにより標的抗原の測
定範囲を変えることができる。すなわちあらかじめ酵素
標識抗体に適当な既知量の抗体を加えておき、その混合
液を標的抗原に加え抗原抗体反応を行なわせ酵素活性を
測定すると添加した未４１識抗体が多い根側定範囲が標
的抗原の高濃度側に移動する。これによって検体を希釈
することなく通常０＠度範囲の測定系に倉せて測定する
ことができる。
必然的に変化する。この性質を利用して酵素標識抗体に
標識をしていない抗体を加えることにより標的抗原の測
定範囲を変えることができる。すなわちあらかじめ酵素
標識抗体に適当な既知量の抗体を加えておき、その混合
液を標的抗原に加え抗原抗体反応を行なわせ酵素活性を
測定すると添加した未４１識抗体が多い根側定範囲が標
的抗原の高濃度側に移動する。これによって検体を希釈
することなく通常０＠度範囲の測定系に倉せて測定する
ことができる。
既知量の酵素標識抗体を用い非競合的
に抗原と反応させる場合、抗原過剰域では凝集反応が起
こ）に〈＜、酵素活性の変化が小さくなる。こＯことは
測定する物質の存在する範囲が広い場合、たとえばｇ−
７エトプロテインの血中１１ｍ１：＃Ｊ定のような場合
には、測定可能な範囲に検体を希釈しなくてはならない
不便さを生じる。このような場合には、既知量の酵素標
識抗体と未知量抗原を反応させ、反応終了後に既知量ｏ
ａｔｓ識抗体を加え、更に反応を行なうと広い範囲にわ
九る醐定か可能になる。次に実施例によシさらに詳しく
本発明を説明する。
こ）に〈＜、酵素活性の変化が小さくなる。こＯことは
測定する物質の存在する範囲が広い場合、たとえばｇ−
７エトプロテインの血中１１ｍ１：＃Ｊ定のような場合
には、測定可能な範囲に検体を希釈しなくてはならない
不便さを生じる。このような場合には、既知量の酵素標
識抗体と未知量抗原を反応させ、反応終了後に既知量ｏ
ａｔｓ識抗体を加え、更に反応を行なうと広い範囲にわ
九る醐定か可能になる。次に実施例によシさらに詳しく
本発明を説明する。
実施例Ｌ 牛血清アルブン／（以下１８ムという）の競
合的均−系槻定 ａ） 西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ｎ１ｉｐと
いう）標識Ｂ８ムの調製： ＨＢＦ４”ｆをナカネ等の方法（テｈ＠Ｊ。
合的均−系槻定 ａ） 西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ｎ１ｉｐと
いう）標識Ｂ８ムの調製： ＨＢＦ４”ｆをナカネ等の方法（テｈ＠Ｊ。
ｏｆ Ｈ１ｓｔｏ＊に＠ＩＬＪｋ Ｃｙｔ・＠ｈ・ｗａ
、 、 ２２−１２ 。
、 、 ２２−１２ 。
１０８４〜１０９１ 、１９７４ ） によ如そＯ糖
鎖をアルデヒド化しその３ｑ°と結晶化１８ム（シグオ
社製晶）１ｗをｐｉｔｓ炭酸緩衝液中で２器℃において
２時間反応後、セファデックスＧ−Ｚｏｏカラムを用い
て分画し酵素標識抗原を得九。
鎖をアルデヒド化しその３ｑ°と結晶化１８ム（シグオ
社製晶）１ｗをｐｉｔｓ炭酸緩衝液中で２器℃において
２時間反応後、セファデックスＧ−Ｚｏｏカラムを用い
て分画し酵素標識抗原を得九。
ｂ）Ｂ８ムの一定：
＆４−のポリエチレングリコール６０００（以下ＰＥＧ
という）を含む食塩加リン酸緩衝液（ＰＪ１７．Ｏ１以
下ＰＢ１１という）で調製し九１１廊ムの希釈系列よ）
ａ、０器−をそれぞれ試験管にとｊ＋、１−ａ） で
調製した酵素ＩＩＩ織抗原α０２ｍｇをそれぞれに加え
、次いで１８ム抗体（ダコ社員品） ａｏ ２ｓｄを加
えて３７℃において１５分間反応後、０、５ ｍＭ ４
−ア建ノア／チビリン、５０ｍＭフェノール、３５欝Ｍ
過酸化水素からなる基質呈色液ｚ５−を加え、３７℃に
おいてＳ分間反応後、波長Ｓ ＯＯｎｍにより吸光度を
一定する。結果をｊＩＩ１図に示す。この結果よ３１ｍ
８ム濃度が嵩くなるほど競合的に凝集反応が低下し、酵
素活性が減少することが明らかで、抗原濃度による標準
曲線が得られ九。
という）を含む食塩加リン酸緩衝液（ＰＪ１７．Ｏ１以
下ＰＢ１１という）で調製し九１１廊ムの希釈系列よ）
ａ、０器−をそれぞれ試験管にとｊ＋、１−ａ） で
調製した酵素ＩＩＩ織抗原α０２ｍｇをそれぞれに加え
、次いで１８ム抗体（ダコ社員品） ａｏ ２ｓｄを加
えて３７℃において１５分間反応後、０、５ ｍＭ ４
−ア建ノア／チビリン、５０ｍＭフェノール、３５欝Ｍ
過酸化水素からなる基質呈色液ｚ５−を加え、３７℃に
おいてＳ分間反応後、波長Ｓ ＯＯｎｍにより吸光度を
一定する。結果をｊＩＩ１図に示す。この結果よ３１ｍ
８ム濃度が嵩くなるほど競合的に凝集反応が低下し、酵
素活性が減少することが明らかで、抗原濃度による標準
曲線が得られ九。
実施例ｚ ｇ−フェトプロティン（以下ＡＦＰという＞
ｏ＊ｔｉａ合的均−系画定 ａ）抗ムＦＰ抗体Ｆ（ａｂ’）１画分の＃４製：西等の
方法（Ｃａｎｅ＠ｒ ＩＬ＠１＋、 、 ３０ 、２５
０７〜２ＩＳ１３ 、 ’１ｓｙｏ ）によ゛如腑帯血
清より抽出し精製しえムＦＰをフロイントの完全アジュ
バントと畳量混合し、つ１ナギに免疫して抗ムＦＰウナ
ギ血清を得九。この抗血清よ）エベレイ等の方法（Ｊ、
８ｏ１１ｄ −ｐｋａｓ・１１ｏｏｋｕａ、 、 ２
、４５〜７８ 、１９７７）によって抗体を精製した
。α１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ！本５）に対して透析し大抗
体に２−重量のペプシン（ベーリンガー社製品）を加え
３７℃において４８時間消化し先後、セファデックスＧ
−２００カツ五を用いて抗ＡＩ’Ｐ抗体Ｆ（ａｋ’）、
画分を得え。
ｏ＊ｔｉａ合的均−系画定 ａ）抗ムＦＰ抗体Ｆ（ａｂ’）１画分の＃４製：西等の
方法（Ｃａｎｅ＠ｒ ＩＬ＠１＋、 、 ３０ 、２５
０７〜２ＩＳ１３ 、 ’１ｓｙｏ ）によ゛如腑帯血
清より抽出し精製しえムＦＰをフロイントの完全アジュ
バントと畳量混合し、つ１ナギに免疫して抗ムＦＰウナ
ギ血清を得九。この抗血清よ）エベレイ等の方法（Ｊ、
８ｏ１１ｄ −ｐｋａｓ・１１ｏｏｋｕａ、 、 ２
、４５〜７８ 、１９７７）によって抗体を精製した
。α１Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ！本５）に対して透析し大抗
体に２−重量のペプシン（ベーリンガー社製品）を加え
３７℃において４８時間消化し先後、セファデックスＧ
−２００カツ五を用いて抗ＡＩ’Ｐ抗体Ｆ（ａｋ’）、
画分を得え。
ｂ） マレイ建ド基導入ＨＩＰの調Ｉｌｌ：実施例１−
ｓ） の方法に準じてＨ翼Ｐ９岬とナト２メチレンジ
アミン１５ｗＩを結合させ、アミノ基を導入し九ＨＲＦ
を得え。
ｓ） の方法に準じてＨ翼Ｐ９岬とナト２メチレンジ
アミン１５ｗＩを結合させ、アミノ基を導入し九ＨＲＦ
を得え。
このアミノ基導入Ｈ１ｌＰ２．３Ｗに北用らの方法（臨
床化学、６％、３号、 １７ｇ −１８６。
床化学、６％、３号、 １７ｇ −１８６。
１９７８ ） によ）メタ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−とドロ會シスクシンイオドエステル（ビアスケ２力
ル社製品）ｉｓｓｙを加え３０℃において３００分間反
応せ先後、セファデックスＧ−２ｓカツムを用いて分画
しルイ建ド基を導入したＩＩＲＰを得た。
Ｎ−とドロ會シスクシンイオドエステル（ビアスケ２力
ル社製品）ｉｓｓｙを加え３０℃において３００分間反
応せ先後、セファデックスＧ−２ｓカツムを用いて分画
しルイ建ド基を導入したＩＩＲＰを得た。
＠）酵素標識抗体の調１１：
２−１） で調製し大抗体ｙ（ａｂ’Ｌに蛾終浪直Ｉ
Ｚ５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを加え９０分間
反応後セファデックスＧ−２５力之ムを用いて分画して
１尋られた抗体Ｆａｌ＋’ ６岬に実施例２−ｂ）で調
製し九マレイミド基導入Ｈ１ｌＦ１．５ｑを加え３７℃
において３００分間反応後室温で一夜装置した。これを
セファデックスＧ−２００カラムを用いて分画し酵素４
１Ｉ繊抗体を得た。
Ｚ５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを加え９０分間
反応後セファデックスＧ−２５力之ムを用いて分画して
１尋られた抗体Ｆａｌ＋’ ６岬に実施例２−ｂ）で調
製し九マレイミド基導入Ｈ１ｌＦ１．５ｑを加え３７℃
において３００分間反応後室温で一夜装置した。これを
セファデックスＧ−２００カラムを用いて分画し酵素４
１Ｉ繊抗体を得た。
ｄ）ムＦＰの測定：
ｐｕｓで調製したムＦＰの希釈系列よりα０５−をそれ
ぞれ試験管にとり、、１０１０ｐＥＧを含むＰ藤８α０
２−と実施？植２−＠）でＩＩ製し九酵素標繊抗体α０
２ｍ１をそれぞれに加え３７℃において１５分間反応さ
せ丸後、実施例１−ｂ）と同じ基質呈色ｆＩＬλ５−を
加え、３７℃において５分間反応後、波長ｓ ｏ ｏ
Ｅｌｍによ如吸光度を一定した。
ぞれ試験管にとり、、１０１０ｐＥＧを含むＰ藤８α０
２−と実施？植２−＠）でＩＩ製し九酵素標繊抗体α０
２ｍ１をそれぞれに加え３７℃において１５分間反応さ
せ丸後、実施例１−ｂ）と同じ基質呈色ｆＩＬλ５−を
加え、３７℃において５分間反応後、波長ｓ ｏ ｏ
Ｅｌｍによ如吸光度を一定した。
一定績釆を第２１ｉに示す。この結果よりＡＦＰ濃度が
高くなるほど非競合的に凝集反応が進み、酵素活性が増
加することを示す標準曲線が得られ、均−系非競合反応
によって＾感度で特異的な分析方法が確立された。
高くなるほど非競合的に凝集反応が進み、酵素活性が増
加することを示す標準曲線が得られ、均−系非競合反応
によって＾感度で特異的な分析方法が確立された。
実施例１ 測定範囲の調整
ＰＨ１でＷ４１＆シたムＦＰの希釈系列よシα０５−を
それぞれ試験管にと！Ｄ、１０−のＰＥＧを含むＰＩ３
（ＬＯ２−をそれぞれに加える。実施例２−ｂ）で調製
し九酵素標識抗体と抗ＡＦＰウサギ血清のＰＢＩｉ希釈
液を等量混合した溶液α０４−を上記反応液それぞれに
加え１５分間反応後、実施例１−ｂ） と同様の方法
で酵素活性を測定し友。
それぞれ試験管にと！Ｄ、１０−のＰＥＧを含むＰＩ３
（ＬＯ２−をそれぞれに加える。実施例２−ｂ）で調製
し九酵素標識抗体と抗ＡＦＰウサギ血清のＰＢＩｉ希釈
液を等量混合した溶液α０４−を上記反応液それぞれに
加え１５分間反応後、実施例１−ｂ） と同様の方法
で酵素活性を測定し友。
加え九抗血清の量と測定範囲０関係を第３図に示す。酵
素標識抗体にろらかしめ未標識抗体を加えておくことに
ょシ測定範囲が変化することがあきらかとな如、生体成
分の通常濃度範囲に測定系を合わせることが可能となつ
九。
素標識抗体にろらかしめ未標識抗体を加えておくことに
ょシ測定範囲が変化することがあきらかとな如、生体成
分の通常濃度範囲に測定系を合わせることが可能となつ
九。
実施例也 測定範囲の拡大
実施例３と同様のＰＩＧを含むＡＦＰの希釈系列それぞ
れに実施例２−ｂ） で調製した酵素標識抗体α０２
−を加え３７℃において１５分間反応させた。反応液そ
れぞれに抗ムＦＰ血清α０２−を加え、更に１５分間反
応後、実施例１−ｂ）と同様の方法で酵素活性を測定し
友。
れに実施例２−ｂ） で調製した酵素標識抗体α０２
−を加え３７℃において１５分間反応させた。反応液そ
れぞれに抗ムＦＰ血清α０２−を加え、更に１５分間反
応後、実施例１−ｂ）と同様の方法で酵素活性を測定し
友。
抗体を後から加えた場合と加えない場合の標準曲線を第
４図に示す。この結果より後から抗体を加えた場合側足
範囲が広くなることが明らかになった。
４図に示す。この結果より後から抗体を加えた場合側足
範囲が広くなることが明らかになった。
上述の通ｐ本発明は生体液中の値量成分を均−系で正確
に測定する新規な測定方法でめシ、その応用範囲は広く
極めて有用でるる。
に測定する新規な測定方法でめシ、その応用範囲は広く
極めて有用でるる。
さらに付言すれば本発明における＃水活性に変化をおよ
ばず会合反応は抗原抗体凝集反応に限定されるものでは
なく、たとえばビオチンとアビジ／、軸とレクチン、な
どのような物質と受容体との組合せの反応も含まれる。
ばず会合反応は抗原抗体凝集反応に限定されるものでは
なく、たとえばビオチンとアビジ／、軸とレクチン、な
どのような物質と受容体との組合せの反応も含まれる。
を走酵素活性の測定には比色ばがシでなく螢光による方
法も含まれる。
法も含まれる。
第１図はＢ８ムの競金的均−系測定にょる標準曲線を示
す。 第２図はＡＦＰの非競合的均−系測定による標準曲線を
示す。 第３図は酵素標識抗体に予め抗ＡＦＰ血清を加え、測定
に用いた場合の標準曲線を示す。 図中の数字は抗血清の希釈倍数を示す。 第４図は酵素標識抗体と抗原の反応後、抗ＡＦＰ血清を
加え、更に反応し九場合の標準曲線Ａｂ＋ と抗ＡＦＰ
血清を加えない場合の標準曲線Ａ、−を示す。 ［１園 ？ ＢＳＡ（Ｐｇ／ｍｌ） 第２１１ ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ） 第３１！１ 一ゝ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍｌ ）
す。 第２図はＡＦＰの非競合的均−系測定による標準曲線を
示す。 第３図は酵素標識抗体に予め抗ＡＦＰ血清を加え、測定
に用いた場合の標準曲線を示す。 図中の数字は抗血清の希釈倍数を示す。 第４図は酵素標識抗体と抗原の反応後、抗ＡＦＰ血清を
加え、更に反応し九場合の標準曲線Ａｂ＋ と抗ＡＦＰ
血清を加えない場合の標準曲線Ａ、−を示す。 ［１園 ？ ＢＳＡ（Ｐｇ／ｍｌ） 第２１１ ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ） 第３１！１ 一ゝ ＡＦＰ （ｎｇ／ｍｌ ）
Claims (3)
- （１）標的物質とその物質に４１異的結舎性を有する受
容体の−ずれか−オに酵素を紬会させたものを用い、標
的物質と受容体との金倉反応を行なわせ、そＯ締果生ず
る酵素活性の変化から標的物質を分析定量する方法。 - （２）標的物質とその物質に４Ｉ異的結金性を有する受
容体の−ずれか一方に酵素に特異的結合性を有する物質
を鐘会させ良ものを用い、標的物質と受容体上＊、ｍｅ
会舎反応を行なわせそＯ艙果生ずる酵素温性Ｏ変化から
標的物質を分析定量する方法。 - （３） 酵素としてペルオキシダーゼヲ眉−、ペルオ
キシダーゼの活性を基質として過剰の過酸化物、水嵩供
与体としてフェノール類、このフェノール類に対する酸
化纏金剛を用いて測定することからなる畳許請求Ｏ＠囲
ｔｓＩ項、第２項記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003314A JPS58122459A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 酵素の会合を利用した測定方法 |
| CA000418760A CA1208550A (en) | 1982-01-14 | 1982-12-30 | Method of quantitative determination utilizing enzyme aggregation |
| EP83100220A EP0084807B1 (en) | 1982-01-14 | 1983-01-12 | A method for the quantitative determination of a target substance |
| DE8383100220T DE3363976D1 (en) | 1982-01-14 | 1983-01-12 | A method for the quantitative determination of a target substance |
| US07/399,440 US5130234A (en) | 1982-01-14 | 1989-08-28 | Method of quantitative determination utilizing enzyme aggregation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57003314A JPS58122459A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 酵素の会合を利用した測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58122459A true JPS58122459A (ja) | 1983-07-21 |
| JPS6364746B2 JPS6364746B2 (ja) | 1988-12-13 |
Family
ID=11553890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57003314A Granted JPS58122459A (ja) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | 酵素の会合を利用した測定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130234A (ja) |
| EP (1) | EP0084807B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58122459A (ja) |
| CA (1) | CA1208550A (ja) |
| DE (1) | DE3363976D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59164960A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fujirebio Inc | 抗原決定基具有物質の測定法 |
| JPS62220865A (ja) * | 1986-03-24 | 1987-09-29 | Yatoron:Kk | 均一系酵素免疫学的測定方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0144176B1 (en) * | 1983-11-18 | 1991-12-11 | FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. | Method of measuring a biological ligand |
| US4757001A (en) * | 1984-02-16 | 1988-07-12 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| DE3525911A1 (de) * | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Konjugat fuer die enzymimmunobestimmung |
| IT1235349B (it) * | 1988-12-23 | 1992-06-30 | Biodata Spa | Saggio immunologico per determinazioni in fase omogenea |
| US5437981A (en) * | 1990-02-26 | 1995-08-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the immunological determination of ligands |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5327763A (en) * | 1976-08-10 | 1978-03-15 | Nissan Diesel Motor Co Ltd | Pin-type synchronizer of auxiliary transmission |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2334107A1 (fr) * | 1975-12-05 | 1977-07-01 | Pasteur Institut | Procede de couplage de substances biologiques par des liaisons covalentes |
| US4134792A (en) * | 1976-12-06 | 1979-01-16 | Miles Laboratories, Inc. | Specific binding assay with an enzyme modulator as a labeling substance |
| IL51668A (en) * | 1977-03-16 | 1981-12-31 | Israel State | Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor |
| IT1105734B (it) * | 1977-07-14 | 1985-11-04 | Syva Co | Prova di legame di competizione di antienzima omogeneo |
| US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
| US4275149A (en) * | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| US4401764A (en) * | 1980-02-07 | 1983-08-30 | Technicon Instruments Corporation | Immunoassays employing labeled reagent and a conjugate having two binding sites |
| US4359457A (en) * | 1980-09-30 | 1982-11-16 | Neville Jr David M | Anti Thy 1.2 monoclonal antibody-ricin hybrid utilized as a tumor suppressant |
| US4423143A (en) * | 1980-12-30 | 1983-12-27 | Syva Company | β-D-Galactosidase conjugate for enzyme immunoassays |
| US4444878A (en) * | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
-
1982
- 1982-01-14 JP JP57003314A patent/JPS58122459A/ja active Granted
- 1982-12-30 CA CA000418760A patent/CA1208550A/en not_active Expired
-
1983
- 1983-01-12 DE DE8383100220T patent/DE3363976D1/de not_active Expired
- 1983-01-12 EP EP83100220A patent/EP0084807B1/en not_active Expired
-
1989
- 1989-08-28 US US07/399,440 patent/US5130234A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5327763A (en) * | 1976-08-10 | 1978-03-15 | Nissan Diesel Motor Co Ltd | Pin-type synchronizer of auxiliary transmission |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59164960A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-18 | Fujirebio Inc | 抗原決定基具有物質の測定法 |
| JPS62220865A (ja) * | 1986-03-24 | 1987-09-29 | Yatoron:Kk | 均一系酵素免疫学的測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0084807A1 (en) | 1983-08-03 |
| EP0084807B1 (en) | 1986-06-11 |
| DE3363976D1 (en) | 1986-07-17 |
| US5130234A (en) | 1992-07-14 |
| CA1208550A (en) | 1986-07-29 |
| JPS6364746B2 (ja) | 1988-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wisdom | Enzyme-immunoassay. | |
| JP3108103B2 (ja) | ヒト心筋ミオグロビンに対するモノクローナル抗体 | |
| US4302536A (en) | Colorimetric immunoassay process | |
| US4863875A (en) | Dye labelled antibodies as reagents for use in immunoassay systems | |
| JPS58117456A (ja) | 特定の結合活性を持つ蛋白質とこれに対応して結合する物質との反応の一つの成分を検出及び定量する試薬セツト | |
| US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| JPH1010126A (ja) | 検定分析装置 | |
| CN106918708A (zh) | 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒 | |
| US4722893A (en) | Reagents for enzyme immunoassay for apolipoprotein B | |
| US7300761B2 (en) | Methods and device for detecting prostate specific antigen (PSA) | |
| JPS60192263A (ja) | 免疫複合体測定用標準物質及びそれを用いた免疫複合体の測定法 | |
| NO790252L (no) | Spesifikke bindings-proevings teknikker | |
| JPS58122459A (ja) | 酵素の会合を利用した測定方法 | |
| CN109298178A (zh) | 基于免疫磁珠的心脏肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）时间分辨荧光免疫分析试剂盒 | |
| JPS60149972A (ja) | 酵素標識抗体の安定化法 | |
| JPS63292061A (ja) | 完全無傷なプラコラーゲンペプチド（３型）およびプロコラーゲン（３型）の選択的な免疫学的測定法 | |
| EP0166583A2 (en) | Compositions for enzyme immunoassay of prostaglandins | |
| JPH06167495A (ja) | 凝集イムノアッセイ法 | |
| JPS5960260A (ja) | 酵素免疫測定法 | |
| JPH01221665A (ja) | 単一エピトープ分折物検出のための競合固体相イムノアッセイ法、及びそのためのキット | |
| JPS58149700A (ja) | ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 | |
| JPS61243363A (ja) | Ｃｒｐの高感度定量法 | |
| JPH07103978A (ja) | 遊離ヘモグロビン測定 | |
| US4201221A (en) | Diagnostic test for allergic disorders and kit therefor | |
| JPH0566222A (ja) | 物質の分析方法 |