JPS62220865A - 均一系酵素免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は生化学分析において用いられる、化学発光によ
る均一系酵素免疫学的測定方法に関する。

詳しくは、酵素で標識した抗原または抗体をもちい、抗
原抗体反応を行わせ、会合の結果生ずる酵素活性の変化
を、化学発光により測定し、それにより目的の抗原ある
いは抗体を定量する均一系分析方法に関する。

「従来の技術」 生化学分野において生体成分の特異的かつ高感度測定法
として抗原抗体反応を用いる免疫学的測定方法が種々考
案され実用化されている。それらの中で、均一系酵素免
疫学的測定方法は測定操作がｗ琳で、自動分析機への適
用も容易であることから汎用されている。

他方、従来の均一系酵素免疫学的測定方法よりも感度の
高い測定方法としては、ラジオアイソトープや螢光物質
あるいは発光物質を用いる方法がある。しかし、多くの
場合、抗原抗体反応物と未反応の抗原あるいは抗体全分
離する操作を必要とするために測定操作が煩雑であった
り、ラジオアイソドーグを用いる時にはその処理に問題
があった。

そこで、ラジオアイソドーグ、螢光物質あるいは発光物
質を用いる測定法に匹敵する感度を持つ。

測定操作の簡単な均一系酵素免疫学的測定方法の開発が
望まれていた。

本発明者らはすでに、特願昭５７−３３１４Ｄ工びデソ
ヤーナルオプパイオケミスト１７−、Ｊ・Ｂｉｏｃｈ＠
ｍａ　（ホシノら、　Ｈｏ５ｈｉｎｏ　Ｎ、　ｓｔ、　
ａｌ　９７巻。

１１３頁−１１８頁、１９８５年）に２いて、高感度な
均一系酵素免疫学的測定方法を開示している。

すなわち、抗原あるいは抗体に標識された酵素が単独の
場合と、酵素に結合され之抗原ま之は抗体とその抗体１
几は抗原との間の抗原抗体反応に工り酵素同志の会合が
起きた場合とで、酵素活性に違いが現れ、会合が進むに
伴って酵素活性が増加する性質を利用したものであシ、
その現象についてザジャーナルオブバイオケミストリー
、Ｊ。

Ｂｉｏｅｈｓｍｏ（９７巻、１１３頁、＋　１１８頁、
１９８５年）において詳細に考察されている。なお、こ
こにおいて会合とは抗原と抗体の反応により複数個の酵
素が集合してくる現象である。本測定方法は従来の均一
系酵素免疫学的測定方法にくらべ、蛋白質などの高分子
量の物質の測定が可能であシ、操作が容易でしかも感度
の高い方法である。しかし、さらに微量成分の分析の必
要がある場合がある。

本発明者らがすでに特願昭５７−３３１４において開示
している均一系酵素免疫学的測定方法において、標識す
る酵素は特に限定されるものではないが、好適には西洋
ワサビパーオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）がもちい
られる。このＨＲＰの活性は基質として過剰の過酸化物
、水素供与体としてフェノール類、このフェノール類に
対する酸化縮合剤を用いて測定され、フェノール類と酸
化縮合剤の縮合物を吸光光度法あるいは螢光光度法によ
り測定されていた。そして、従来の知見では、標識酵素
としてＨＲＰ　ｔ−用いるとき、抗原抗体反応会合物の
）ＩＲＰと未反応抗体あるいは抗原に標識されたＨＲＰ
の活性の違いは、フェノールあるいはフェノール誘導体
が存在するときに顕著であると考えられていた（デジャ
ーナルオプパイオケミストリ、　Ｊ−Ｂｌｏｃｈｅｍ、
、９７巻、１１３頁−１１８頁。

１９８５年）０ 「発明が解決しょうとする問題点」 本発明者らは、上記測定方法の高感度化を目標に、更に
検討を加え１発光光度法に応用することを試みた。すな
わち、ルミノール類のみを水素供与体として用い、過剰
の過酸化物の存在下、ＨＲＰを作用させてルミノールの
化学発光を測定することを試み次ところ、抗原抗体反応
会合物のＨＲＰと未反応抗体あるいは抗原に標識され念
ＨＲＰには大きな活性の違いがあることを見出し、鋭敏
なルミノール類酸化発光を抗原、抗体の微愈定蓋分析に
利用すべく本発明を完成した。このことは、ルミノール
類にはフェノール基を有さないことから、これにより従
来の知見から容易に推測出来るものではない。

「問題点を解決するための手段」 すなわち、本発明は抗原または抗体の定量測定において
、過酸化物によるルミノール類酸化発光を触媒する酵素
に抗原または抗体を結合させ、この結合された抗原また
は抗体と試料中の抗体または抗原との抗原抗体反応によ
り酵素同志を会合させることにより生じる該酵素の酵素
活性の向上によるルミノール類酸化発光の増加を検知す
ることにより抗原または抗体を定量することを特徴とす
る均−系簿素免疫学的測定方法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いられる酵素は過酸化物によるルミノール類
の酸化発光反応を触媒する酵素であれば特に限定されな
い。また、この酵素は結合された抗原または抗体の抗体
または抗原との抗原抗体反応によシ当該酵素同志が会合
することにより上記反応を触媒する酵素活性が向上する
。その結果ルミノール発光を著るしぐ増加させるに至る
。このような酵素としては例えば、西洋ワサビパーオキ
シダーゼ、ミクロ／４’−オキシダーゼ等が例示される
。

本発明に用いられるルミノール類は酸化発光反応が酵素
により触媒され促進されるものであり、特に制限を受杆
るものではな−か、例えばルミノール、イソルミノール
の他にそれらの誘導体であるＮ−（４−アミノブチル）
−Ｎ−エチルイソルミノールへミサクシミド、Ｎ−（６
−アミノヘキシル）−Ｎ＝エチルイソルミノール、Ｎ−
エチルイソルミノール等であり、好適にはルミノールあ
るいけイソルミノールがもちいられる。

本発明に用いられる過酸化物は上記ルミノールを発光さ
せるものであり特に限定されないが、過酸化水素、過酸
化尿素などをもち込ることができる。過酸化水素、過酸
化尿素を用いる場合は、ルミノール類を発光させると同
時に、反応系中の至適濃度より過剰かつ遊離のパーオキ
シダーゼを完全に阻害する濃度の過酸水素、過酸化尿素
を用いることにより水素供与体としてルミノール類たと
えばルミナール、イソルミノールなどを用い発光量を測
定して行うことができる。

本発明の測定の対象になる抗原また抗体としての標的物
質は抗原・抗体反応により酵素を会合させる時、酵素の
ルミノール類酸化発光反応触媒活性の向上を′阻害しな
いものであれば特に制限を受けるものではな−。例えば
、抗ふとして蛋白質やペプチド（各種癌由来蛋白質、酵
素、ホルモン等）や低分子化合物（各種ステロイドホル
モン、各種薬物等）があり、ま念、抗体としては肝炎ウ
ィルス抗体やヒト成人白血病ウィルス抗体等がある。

本発明に用いる抗原または抗体で標識されたパーオキシ
ダーゼ、例えばＨＲＰ標識抗原あるいは抗体の調裂け、
公知の試薬が使用出来る。たとえば、ゲルタールアルデ
ヒド、カル−ジイミド、ビスマレイミｙ、ｚ個の異なる
官能基を有する試薬などがあり、また、ＨＲＰの糖鎖を
過沃素酸で酸化してアルデヒドにする方法も有効である
。

これらの試薬を用い抗原あるいは抗体の反応性を保持し
た状態でＨＲＰを標識する。

この標識の方法は、例えばグルタルアルテヒｒ法はＨＲ
Ｐと抗原ま之は抗体との混液にゲルタールアルデヒドを
加えて攪拌するだけで簡易に調製することができるが、
調製後精製を必要とする欠点がある。その点記用らの方
法のようにＨＲＰと標識したい抗体または抗原を別々に
反応基を導入しそれらを反応させることにより効率よ＜
　ＨＲＰ標識抗原あるいけ抗体を調製することができる
。

本発明においては標的物質の種類だ応じて適当な測定方
法を選択することが出来る。たとえば、標識抗体を用す
る競合反応あるいけ、標識抗体を用いる非競合反応を利
用する抗原あるいは抗体の測定に応用できる。すなわち
、上記の測定原理にもとすき抗原抗体反応をさせ、これ
にルミノール類および過剰の過酸化物を加えて生じる化
学発光を測定し、既知料の標的物質をもちいた検量線よ
り未知量の標的物質量を求めることができる。

１、競合反応の利用 中低分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する場合： 抗原分子上に認識し得る１コの抗原決定基をもつ抗原た
とえばステロイドホルモン、各種薬剤等は酵素１分子に
抗原２分子以上を結合した酵素標識抗原を調製する。

標的物質すなわち標的抗原とその抗体にさらに酵素標識
抗原を加え競合的に凝集反応を起させると、標的抗原の
量の函数として酵素活性が測定されるので標準曲線を用
い標的抗原の童を定量することができる。この場合酵素
標識抗原は多価抗原と同様の働きをする。

（ｉ）高分子抗原を酵素標識抗原を用いて測定する場合
： 蛋白質のように高分子の抗原の場合は同一抗原上に認識
し得る抗原決定基が複数個ある。ので酵素に結合する抗
原は１分子以上であればよい。

この場合も１−（ｉ）と同様の操作で競合反応を起させ
ると標的抗原を測定することができる。

２、非競合反応の利用 （ｉ）高分子抗原を酵素標識抗体を用いて測定する場合
： 認識し得る２つ以上の抗原決定基をもつものはこれらを
標的抗原として測定するときはこの抗原に対する抗体に
酵素を標識する。標的抗原と酵素標識抗体との間に凝集
反応を起させると抗原抗体間に立体的な結合が進行して
凝集の度合が大きくなシ酵素活性が大きく変化する。従
ってこの酵素活性の変動から標的抗原を測定することが
できる。この場合には均−系であるにも拘わらず、競合
反応による測定ではない。

（１１）高分子抗原をハイブリッド抗体と酵素を用いて
測定する場合： 標的抗原として高分子たとえば蛋白質を測定する場合、
標的抗原に対する抗体と使用する酵素に対する抗体から
ハイブリッド抗体を調製し、標的抗原と酵素とハイブリ
ッド抗体の３つを非競合的に反応させ、その結果生ずる
酵素活性の変化から標的抗原を測定することができる。

この場合酵素は標識等の操作をせずにそのまま使用する
ことができる。

（ｉｉｉｌ抗体を測定する場合： 低分子抗原に対する抗体は１−（ｉ）、高分子抗原に対
する抗体は１−（ｉｌＤの酵素標識抗原を用いて未知量
抗体との間に凝集反応を起させ、その結果生ずる酵素活
性の変化から抗体量を測定することができる。

「実施例」 以下、実施例によυ本発明をα−フェトプロティン（以
下ＡＦＰと略す）の非競合的均−測定系を例に取シ更に
詳細に説明する。

操作１　抗ＡＦＰ抗体（Ｆａｂ’）画分調製西らの方法
（キャンサーリサーチ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ＠ｓ、、３０
巻、２５０７頁−２５１３頁、１９７０）により屓帯血
清よシ抽出し精製したＡＦＰを７０インドの完全アジュ
バントと等量混合し、ウサギに免疫して抗ＡＦＰウサギ
血清を得た。

この抗血清よシエペレイ（デシャーナルオプソリッドー
フェーズバイオケミストリー、Ｊ。

５ｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、、２巻、４
５頁−７８頁、１９７７）らの方法によシ抗体を精製し
た。

この精製抗体を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）に透
析し、これに２％：１ｉｆｆｉ量の（プシン（ベーリン
ガー社製品）を加え、３７℃で４８時間消化した後、セ
ファデックスＧ−２００カラムを用いて精製し、抗ＡＦ
Ｐ抗体Ｆ　（ａｂ’）２画分を得た。

このようＫして得られた抗体（Ｆ　（ａｂ’）意）に終
濃度１２．５　ｍＭの２−メルカグトエチルアミンを加
え９０分間反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分
画し、抗体（Ｆａｂ’）を得た。

操作２　　ＨＲＰへのマレイミド基の導入ＨＲＰ　９〜
をナカネらの方法（デジャーナルオプヒストケミストリ
ーアンドサイトヶミストリー、Ｊ、　Ｈｌｓｔｅｈｓｍ
、　Ｃｙｔｏｃｈｓｍ、、２２巻、１０８４頁−１０９
１頁、１９８４）によジアルデヒド化し、これと過剰の
テトラメチレンジアミンを反応させてアミノ基導入ＨＲ
Ｐを得た。

これに乳用らの方法（臨床化学、６巻、１７８頁−１８
６頁、１９７８）によシｍ−マレイミドペンソイルーＮ
−ヒドロキシスクシミドエステル（ピアスケミカル社製
品）をもちいてマレイミド基を導入した後、セファデッ
クスＧ−２５カラムを用いてマレイミド導入ＨＲＰ画分
を得た。

操作３　　ＨＲＰ標識抗体の調製 操作１において調製した抗体（Ｆａｂ’″）　６ｍｙと
操作２で調製したマレイミド基導入ＨＲＰ　１．５〜を
３７℃で３０分間反応後、室温で一夜装置した。これを
セファデックスＧ−２００カラムで分画し、ＨＲＰ標識
抗体を得た。

操作４　　ＡＦＰの測定 生理食塩濃度リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略す）で調製
したＡＦＰの希釈列のそれぞれ１μｔに６％ポリエチレ
ングリコールを含むＰＨ１１μｔｂよび操作３で得九Ｈ
ＲＰ標識抗体１μｔを加え、良く混和し、室温で３０分
間放置し、それらに１　ｍＭルミノールを含ｔｒ　０．
　Ｉ　Ｍ　）　リス−ＨＣ２緩衝液（ｐ）１８．５）０
．２−を加えて、良く混合した。これらを、ケミグロー
発光光度計（アミンコ社製）に設置し、２４ｍＭ過酸化
水素を含む上記トリス緩衝液ｏ、１ａをマイクロシリン
ジで加えて、発光反応を開始し、発光反応開始後３０秒
間の発光強度を測定した。

測定の結果を第１図にしめす。この結果よシＡＦＰ濃度
が高くなるに従って発光強度が増加する標準曲線が得ら
れた。

実施例にしめした例について、従来のフェノール類と酸
化縮合剤との酸化縮合による吸光度測定法の感度と比較
したところ約１０倍の感度（Ｓ／Ｎ＝２を示すＡＦＰ量
として比較）をしめした。トルグＴｈｏｒｐ＊、Ｇ、　
Ｈ，Ｇ、ら、（クリニカルケミストリー、Ｃｌ１ｎ、　
Ｃｈｅｍ、、　３１巻、１３３３頁−１３４１頁、１９
８５）は、過酸化水素とＨＲＰによるルミノール類の発
光強度がｐ−ヨウドフェノール等の増感剤を加えること
によｊ９１０００倍以上になることを報告している。そ
こで、本発明者らもそれらの増感剤の添加を試みたとこ
ろ、トリゾらと同様の結果を得た。このことは本発明に
よる均一系酵素免疫学的測定方法より１０　１１の蛋白
質測定が可能であることをしめす。本発明は蛋白質に限
定されるものではないが、この感度はラジオアイソトー
プを用いたときの感度に匹敵しておシ、さらに発光強度
測定装置の改良がなされれば感度の増加が期待できる。

「発明の効果」 以上の結果よシ明らかなように、本発明によれば、感度
の高い化学発光をもちいて、゛操作の簡便な均一系酵素
免疫学的微量定量分析が可能になった。本発明による均
一系酵素免疫学的測定法は、操作が一層簡単で自動測定
装置への応用が容易であり、ラジオアイソトープをもち
いる測定法を凌ぐ感度をもち、しかもラジオアイソトー
プを用いたときのような廃棄物処理の問題もなく測定方
法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は種々の濃度のＡＦＰ溶液を操作４に従い操作し
、各濃度のＡＦＰと得られた発光強度の関係を示したグ
ラフ図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原または抗体の定量測定において、過酸化物に
   よるルミノール類酸化発光を触媒する酵素に抗原または
   抗体を結合させ、この結合された抗原または抗体と試料
   中の抗体または抗原との抗原抗体反応により酵素同志を
   会合させることにより生じる該酵素の酵素活性の向上に
   よるルミノール類酸化発光の増加を検知することにより
   抗原または抗体を定量することを特徴とする均一系酵素
   免疫学的測定方法。
2. （２）過酸化物が過酸化水素である特許請求の範囲第１
   項記載の均一系酵素免疫学的測定方法。
3. （３）ルミノール類がルミノールである特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の均一系酵素免疫学的測定方法。
4. （４）ルミノール類がイソルミノールである特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の均一系酵素免疫学的測定方
   法。
5. （５）酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼである特許請
   求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の均
   一系酵素免疫学的測定方法。