JP4004230B2 - 架橋アビジン含有新規複合体、架橋アビジンを用いる分析方法、並びに分析用試薬及びキット - Google Patents
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Description
これらの方法で用いられる酵素標識化抗原又は酵素標識化抗体は、種々の方法で調製されてきた。例えば、初期には、抗原又は抗体と酵素との混合液に、二価性の反応性を有するグルタルアルデヒドを加え、抗原又は抗体と酵素とのポリマーをランダムに調製する方法が開発された。その後、ペルオキシダーゼの表面アミノ基が少ないこと、そして、化学反応試薬に対しての耐性が強いことを利用した改良も試みられた。すなわち、まず、ペルオキシダーゼにグルタルアルデヒドを反応させた後に、過剰のアルデヒド基を除去し、得られたアルデヒド導入ペルオキシダーゼと、抗体とを混合することにより、必要な酵素標識化抗体のみを合成する方法が開発された。また、ペルオキシダーゼが糖鎖を持つことを利用して、過ヨウ素酸で糖鎖を酸化してアルデヒドを生じさせ、抗体のアミノ基と結合させることにより、高収率に酵素標識化抗体を得る方法も開発された。
一方、前記方法(2)で使用する前記ビオチン導入酵素は、酵素として、例えば、ルシフェラーゼを使用する場合に、遺伝子操作法により得ることができる。例えば、ルシフェラーゼの遺伝子とビオチンアクセプターの遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、ルシフェラーゼ−ビオチンアクセプター融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビオチンが結合され、ビオチン導入酵素(ビオチンが導入されたルシフェラーゼ−ビオチンアクセプター融合タンパク質)を得ることができる。
反応ステップを減らすために、ビオチン導入抗体、アビジン、及びビオチン導入酵素の三者を予め混合して、酵素標識化抗体(ビオチン導入抗体−アビジン−ビオチン導入酵素複合体)として用いる試みもなされたが、反応性が著しく低下したり、安定性が非常に悪くなったりして、そのままでは試薬として使用することはできなかった。
従って、本発明の課題は、前記の従来技術の欠点を解消し、アビジン−ビオチン反応の長所を有しながら、操作ステップが少なく、迅速且つ簡易であって、しかも、正確な分析方法を提供することにある。
[1]同種又は異種のビオチン導入物少なくとも2個と、前記ビオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン1個とを含む、ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[2]少なくとも1個のビオチン導入物が、ビオチン導入結合成分であり、少なくとも1個のビオチン導入物が、ビオチン導入標識物質である、[1]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[3]結合成分が、抗体、抗体フラグメント、抗原、DNA、RNA、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖である、[2]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[4]抗体フラグメントがFab’である、[3]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[5]ビオチン導入標識物質が、ビオチン導入酵素、ビオチン導入蛍光物質若しくはビオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビオチン導入発光物質若しくはビオチン導入発光物質結合タンパク質、又はビオチン導入放射性同位元素である、[1]〜[4]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[6]前記ビオチン導入酵素が、ビオチンが導入された酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質である、[5]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[7]前記ビオチン導入酵素が、ビオチン導入ルシフェラーゼである、[5]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[8]架橋アビジンが、架橋卵白アビジン、架橋ストレプトアビジン、又は架橋リコンビナントアビジンである、[1]〜[7]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[9]ビオチン導入結合成分が、1分子中に含まれるビオチン数が1であるビオチン導入結合成分である、[2]〜[8]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体、
[10](1)アビジンを架橋剤で処理することにより、架橋アビジンを調製する工程、
(2)同種又は異種のビオチン導入対象物をビオチン化することにより、同種又は異種のビオチン導入物を調製する工程、及び
(3)前記架橋アビジンと、同種又は異種の前記ビオチン導入物とを結合させることにより、[1]〜[9]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を形成させる工程
を含むことを特徴とする、前記ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体の製造方法、
[11]前記の[1]〜[9]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を使用することを特徴とする、分析方法、
[12]前記の[1]〜[9]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用試薬、
[13]前記の[1]〜[9]のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用キット
に関する。
アビジンは、同一のサブユニット4個からなるタンパク質である。各サブユニットにはビオチン結合部位が1箇所ずつ存在するため、1分子のアビジンには4分子のビオチンが結合することができる。各サブユニットは共有結合で結合していないため、アビジンに高い熱が加わると、各サブユニットに開裂してしまうことが知られている。
このようなビオチン導入酵素は、例えば、化学的修飾法又は遺伝子操作法を用いることにより調製することができる。
前記化学的修飾法は、酵素アミノ酸残基に対して化学的にビオチンを結合させる方法である。
酵素(例えば、ルシフェラーゼ)の遺伝子とビオチンアクセプターの遺伝子とを連結させた遺伝子を宿主細胞内で発現させると、酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質が宿主細胞内で合成され、続いて、この融合タンパク質に、宿主細胞の働きによりビオチンが結合され、ビオチン導入酵素(ビオチンが導入された酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質)を得ることができる。
本発明において使用することのできるビオチン導入結合成分における前記結合成分は、ビオチンを導入することができ、しかも、分析対象物と特異的に結合可能な結合成分である限り、特に限定されるものではなく、例えば、(a)タンパク質である抗体(モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む)、抗体フラグメント[例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、又はFv]、タンパク質抗原、受容体、タンパク質ホルモン、サイトカイン、レクチン、酵素、又は酵素アナログ、(b)核酸であるDNA又はRNA、あるいは、(c)タンパク質又は核酸以外の化合物である非タンパク質抗原、非タンパク質ホルモン、酵素に対するリガンド(例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、転写因子、若しくは阻害剤)、酵素アナログの元となる酵素の基質、又は糖を挙げることができる。
前記ニックトランスレーション法又はプライマー伸長法に用いるビオチン化dUTP又はビオチン化UTPとして、例えば、dUTP又はUTPのピリミジン環の5位の炭素原子にリンカーを介してビオチンを結合させたものが市販されており、それを使用することができる。
更に、本発明において使用するビオチン導入結合成分としては、1分子中に含まれるビオチン数が1であるビオチン導入結合成分(すなわち、結合成分1分子に対してビオチン1分子を導入したビオチン導入結合成分)が好ましく、本発明の好適態様においては、ビオチン導入結合成分として、ビオチン導入抗体フラグメントFab’を用いることができる。前記ビオチン導入抗体フラグメントFab’は、分析対象化合物に特異的に結合する抗体(モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を含む)から得られる抗体フラグメントFab’に、ビオチン1分子を共有結合により導入したものである。
このようにして得られたSH基1つを有する抗体フラグメントFab’と、マレイミド基を有するビオチン誘導体とを反応させると、抗体フラグメントFab’1分子当たり、ビオチン1分子が導入されたビオチン導入抗体フラグメントFab’を得ることができる。
例えば、これまで説明した方法により得られた(1)ビオチン導入抗体フラグメントFab’と、(2)架橋アビジンと、(3)ビオチン導入酵素とを、適当な比率で混合することにより、酵素活性及び抗体活性を共に維持した状態で酵素標識化抗体を得ることができる。これらの酵素標識化抗体を、本発明の分析方法で使用することができる。
また、(1)ビオチン導入抗体フラグメントFab’と、(2)架橋アビジンと、(3)ビオチン導入酵素とは、それぞれ別々に使用することもできる。例えば、抗体固定化担体と分析対象化合物(抗原)とを反応させた後に、
(a)前記の3種類の試薬をこの順に添加し、三段階で反応させることもできるし、
(b)ビオチン導入抗体フラグメントFab’と架橋アビジンとを予め混合しておいたものを反応させた後に、ビオチン導入酵素を反応させ、二段階で反応させることもできるし、あるいは、
(c)ビオチン導入抗体フラグメントFab’を反応させた後に、架橋アビジンとビオチン導入酵素とを予め混合しておいたものを反応させ、二段階で反応させることもできる。
これらの3種類の試薬を、予め全て混合して使用するか、あるいは、別々に使用するかは、それぞれの測定系に応じて適宜決定することができる。
例えば、サンドイッチ法を利用し、(1)ビオチン導入抗体フラグメントFab’と、(2)架橋アビジンと、(3)ビオチン導入酵素とを、適当な比率で混合して得られた酵素標識化抗体を用いる本発明の分析方法では、具体的には、ビオチン導入抗体フラグメントFab’とは異なるエピトープで分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する(第1抗体)。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤[例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)やゼラチン等]で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間(例えば、5分〜3時間)及び一定温度(例えば、4℃〜40℃、好ましくは室温付近)で接触させ、反応させる(1次反応)。続いて、3種類の試薬の混合物である前記酵素標識化抗体を加えて一定時間(例えば、5分〜3時間)及び一定温度(例えば、4℃〜40℃、好ましくは室温付近)で接触させ反応させる(2次反応)。これを適当な洗浄液(例えば、界面活性剤を含む生理食塩水)で洗浄してから、不溶性担体上に存在する酵素標識化抗体の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。
本発明の分析用キットは、それ単独で、あるいは、所望により他の試薬と組み合わせて、本発明の分析方法に使用することができる。
例えば、(1)ビオチン導入抗原と、(2)架橋アビジンと、(3)ビオチン導入酵素とを、適当な比率で混合して得られた酵素標識化抗原を用いる本発明の分析方法では、例えば、競合法により抗原を免疫学的に分析することができる。具体的には、分析対象化合物と反応する抗体又は抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する(第1抗体)。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤[例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)やゼラチン等]で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、3種類の試薬の混合物である前記酵素標識化抗原と、被検試料とを加えて一定時間(例えば、5分〜3時間)及び一定温度(例えば、4℃〜40℃、好ましくは室温付近)で接触させ、反応させる。これを適当な洗浄液(例えば、界面活性剤を含む生理食塩水)で洗浄してから、不溶性担体上に存在する酵素標識化抗原の量を定量する。その値から、被検試料中の分析対象化合物の量を算出することができる。
更には、ビオチン導入抗体フラグメントFab’又はビオチン導入抗原に代えて、その他のビオチン導入結合成分、例えば、ビオチン導入抗体、ビオチン導入抗体フラグメント、ビオチン導入DNA、ビオチン導入RNA、ビオチン導入受容体、ビオチン導入酵素、ビオチン導入リガンド(受容体に対するリガンド及び酵素に対するリガンドを含む)、ビオチン導入酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質にビオチンを導入したもの、ビオチン導入レクチン、又はビオチン導入糖を用いても、同様に本発明を実施することができる。
また、ビオチン導入酵素に代えて、その他のビオチン導入標識物質、例えば、ビオチン導入蛍光物質若しくはビオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビオチン導入発光物質若しくはビオチン導入発光物質結合タンパク質、又はビオチン導入放射性同位元素を用いても、同様に本発明を実施することができる。
(1)ビオチン導入抗体フラグメントFab’の調製
ヒトα−フェトプロテイン(AFP)をウサギに対し免疫して得られた抗血清から、AFP固定化セファロース4Bを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーで特異抗体IgG分画を得た。
この特異抗体IgG分画[0.1mol/l酢酸緩衝液(pH4.5)]に2%重量のペプシンを加え、37℃の孵卵器で一夜消化を行い、ゲルクロマトグラフィーで分子量10万の抗体フラグメントF(ab’)2分画を得た。
50mmol/l酢酸緩衝液(pH5.0)に対して透析したF(ab’)2分画5mg(1ml)に、0.25mol/l−2−メルカプトエチルアミン[50mmol/l酢酸緩衝液(pH5.0)]50μlを加え、37℃で90分間還元した。得られた反応液を、1mmol/lエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む50mmol/lリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したセファデックスG−25カラム(1.5×13cm)に通し、ボイドボリュームに溶出される抗体フラグメントFab’分画をプールした。
この抗体フラグメントFab’分画に、ジメチルホルムアミド0.1mlに溶解したN−ビオチノイル−N’−(6−マレイミドヘキサノイル)−ヒドラジド0.4mgを加え、室温で一夜静置反応させた後、生理食塩水で平衡化したセファデックスG−25カラム(1.5×13cm)に通し、ボイドボリュームに溶出されるビオチン導入抗体フラグメントFab’をプールした。
0.1mol/lリン酸緩衝液(pH7.0)1mlに溶解した精製ストレプトアビジン1mgに、1%グルタルアルデヒド溶液[0.1mol/lリン酸緩衝液(pH7.0)]20μlを加え、混合した後、4℃で16時間静置反応した。反応混液に、0.1mol/lリン酸緩衝液(pH7.0)で調製した4mg/ml水素化ホウ素ナトリウム液20μlを加え、室温で4時間静置反応することにより、アルデヒドを還元した。反応混液を0.3mol/l食塩水で平衡化したセファデックスG−25カラム(1.5×15cm)に通し、ボイドボリュームに溶出される架橋ストレプトアビジンをプールした。
50mmol/l炭酸緩衝液(pH9.5)で5μg/mlに調整した抗AFPモノクローナル抗体(オリエンタル酵母社)100μlを、白色96穴プレートの各ウェルに分注し、37℃で2時間振盪コーティングを行った後、洗浄液[0.1%トウィーン20を含む20mmol/lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)]で洗浄し、以下の工程に用いた。
前記実施例1(1)で得られたビオチン導入抗体フラグメントFab’(最終濃度=0.1μg/ml)と、前記実施例1(2)で得られた架橋ストレプトアビジン(最終濃度=1.2μg/ml)と、ビオチン導入ルシフェラーゼ−ビオチンアクセプター融合タンパク質(キッコーマン社)(最終濃度=0.07μg/ml)とを、5%グリセロール、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、及び1mmol/l−EDTAを含む50mmol/l−HEPES緩衝液(pH7.5)中で混合し、室温で2時間静置反応してから酵素標識化抗体として、以下の反応に用いた。
反応緩衝液(0.15mol/l食塩を含む前記洗浄液)で所定濃度(1pg/ml,10pg/ml,及び100pg/ml)に希釈した標準AFP溶液100μlを抗体コートウェルに分注し、37℃で1時間振盪反応を行った。洗浄液で4回洗浄した後、実施例1(4)で調製した酵素標識化抗体100μlを分注し、37℃で1時間振盪反応を行った。洗浄液で4回洗浄した後、発光検出器にセットし、0.2mg/mlルシフェリン、40mmol/l−ATP、及び150mmol/l硫酸マグネシウムを含む50mmol/l−HEPES緩衝液(pH7.5)100μlを基質として加え、10秒間の積算発光量を測定した。
結果を図1に示す。図1から明らかなように、非常に低濃度のAFPに対しても発光量のレスポンスが得られた。
このようにストレプトアビジンを架橋剤処理することにより、ビオチン導入抗体フラグメントFab’とビオチン導入酵素との間を、安定に結合することができることが示された。
比較例として、実施例1(2)で調製した架橋ストレプトアビジンの代わりに、架橋処理を行なっていないストレプトアビジンを使用すること以外は、前記実施例1(4)及び実施例1(5)の手順を繰り返した。結果を図2に示す。図2から明らかなように、AFP量に対する発光のレスポンスがほとんど見られず、架橋されていないストレプトアビジンでは、ビオチン導入抗体フラグメントFab’とビオチン導入酵素との間をうまく結合することができないことが確認された。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (13)
- 同種又は異種のビオチン導入物少なくとも2個と、前記ビオチン導入物の間に挟まれた架橋アビジン1個とを含む、ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- 少なくとも1個のビオチン導入物が、ビオチン導入結合成分であり、少なくとも1個のビオチン導入物が、ビオチン導入標識物質である、請求項1に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- 結合成分が、抗体、抗体フラグメント、抗原、DNA、RNA、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖である、請求項2に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- 抗体フラグメントがFab’である、請求項3に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- ビオチン導入標識物質が、ビオチン導入酵素、ビオチン導入蛍光物質若しくはビオチン導入蛍光物質結合タンパク質、ビオチン導入発光物質若しくはビオチン導入発光物質結合タンパク質、又はビオチン導入放射性同位元素である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- 前記ビオチン導入酵素が、ビオチンが導入された酵素−ビオチンアクセプター融合タンパク質である、請求項5に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- 前記ビオチン導入酵素が、ビオチン導入ルシフェラーゼである、請求項5に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- 架橋アビジンが、架橋卵白アビジン、架橋ストレプトアビジン、又は架橋リコンビナントアビジンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- ビオチン導入結合成分が、1分子中に含まれるビオチン数が1であるビオチン導入結合成分である、請求項2〜8のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体。
- (1)アビジンを架橋剤で処理することにより、架橋アビジンを調製する工程、
(2)同種又は異種のビオチン導入対象物をビオチン化することにより、同種又は異種のビオチン導入物を調製する工程、及び
(3)前記架橋アビジンと、同種又は異種の前記ビオチン導入物とを結合させることにより、請求項1〜9のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を形成させる工程
を含むことを特徴とする、前記ビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体の製造方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を使用することを特徴とする、分析方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用試薬。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のビオチン−架橋アビジン−ビオチン型複合体を含むことを特徴とする、分析用キット。
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