JPH07118291A - 核酸と免疫化学的活性物質との複合体、その製法およびその複合体を使用する免疫化学的測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 核酸−免疫化学的活性物質複合体の高回収率
を実現し、その複合体の活性をより高く保持することを
実現し、抗原抗体反応を利用した免疫化学的分析法に使
用できる核酸−免疫化学的活性物質複合体を提供する。 【構成】 核酸に、サクシミド基とマレイミド基を有す
る２官能試薬を反応させることにより、該核酸をサクシ
ミド基と結合させ、次いで、得られた化合物を免疫化学
的活性物質、例えば、酵素、抗体等と反応させることに
より、該免疫化学的活性物質を前記化合物のマレイミド
基に結合させて、下記の一般式で表される核酸と免疫化
学的活性物質との複合体を得る。 【化１】 〔式中、Ａは免疫化学的活性物質をＡ−ＳＨで表したと
きのその残基を表し、Ｂ、_n1、_n2、_n3、Ｒ₁およびＲ₂は
それぞれ化学結合または６員環状炭化水素残基を表
す。〕

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応を利用し
た免疫化学的分析に使用することができる核酸と免疫化
学的活性物質との複合体自体、その製造方法及び核酸と
免疫化学的活性物質との複合体自体を使用する免疫化学
的測定試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野において免疫化学的検出
法は、微量の成分を定量、検出する方法として知られ、
種々の方法が開発されている。その中で抗体の標識物質
として、蛍光物質、発光性物質、酵素等の非放射性物質
を使用する免疫化学的検出法は、標識物質として放射性
物質を使用した際のように特殊な施設を必要とせず、試
薬の扱いやすさ、大量処理が可能などの点から生体成分
分析法で広く利用されている。また、標識物質として放
射性同位元素を用いるラジオイムノアッセイもその測定
レンジの広さ、免疫反応の低下が少なく、薬剤、ペプチ
ドなどの小さな分子量の物質を標識可能であることから
広く利用されている。

【０００３】このような免疫化学的検出法において、標
識された抗体が直接固相に結合して非特異反応を起こ
す、いわゆる測定のバックグランウンドの上昇が近年問
題となっており、このような非特異反応を防ぐことによ
り、測定感度を上げようとする試みが、例えば、特開平
４−２０４３７９号公報によりなされている。

【０００４】（１）特開平４−２０４３７９号公報に開
示の免疫化学的検出方法 図１は該公報に開示された免疫化学的検出法のプロセス
を示す図であり、この図１に基づいて、該公報に記載の
技術を次に説明する。１は固相であり、２は固相１に結
合した核酸である。一方、核酸２と相補的な塩基配列を
有する核酸３の末端には免疫化学的活性物質である抗体
４が結合されており、前記核酸２と核酸３は相補的に結
合することにより、抗体４を固相１に固定している。

【０００５】この固相１に対して測定対象物である抗原
５を含む試料を接触させ（図１（ａ））、抗原抗体反応
により試料中に含まれている抗原５を固相１上に結合し
ている抗体４で捕捉し（図１（ｂ））、さらに捕捉され
た抗原５に対して、標識物７で標識された抗体６を結合
させる。もしこの段階で標識物７を定量することにより
試料中の抗原５を測定する場合、標識物７で標識された
別の抗体が固相１に結合してバックグランウドを上昇さ
せるので正確な測定が困難となる。したがって、制限酵
素８を核酸部分に作用させることにより（図１
（ｃ））、核酸を選択的に切断して（図１（ｄ））、固
相１から分離された標識物７を含んだものを定量するこ
とにより、試料中に含まれる抗原５をバックグラウンド
の影響が無く精度よく定量することができる。

【０００６】前記公報によれば、核酸３とその末端に結
合される抗体４との結合方法は、例えば、ゴッシュらの
方法（Ghosh et al: Bioconjugate Chem.,１，７１〜７
６頁（１９９０）のマレイミド−チオールカップリング
により結合したとされている。前記公報に引用された文
献のゴッシュらの方法には、次の２つの結合方法が示さ
れている。図２及び図３に基づいて、ゴッシュらの方法
を説明する。

【０００７】（２）ゴッシュらの方法 ｉ．その一つは、図２に示される方法であり、核酸の
５′末端にスルフヒドリル基を導入しておき、他方、酵
素に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシイミ
ドエステルを反応させてマレイミド基を導入しておき、
次に、これらの２種の化合物を反応させて前記のスルフ
ヒドリル基とマレイミド基を結合させることにより、核
酸と酵素とを結合させる方法である。

【０００８】この方法によれば、添加したアルカリ性フ
ォスファターゼの８５％がオリゴヌクレオチドに結合し
たアルカリ性フォスファターゼ、即ち、核酸−酵素複合
体として回収されること、及びオリゴヌクレオチドとア
ルカリ性フォスファターゼの結合比は１対１であり、こ
の核酸−酵素複合体は何の処理も施していない酵素の８
０から８５％の活性が保持されていたことが示されてい
る。また、β−ガラクトシダーゼに関しては、その核酸
−酵素複合体として回収率は６５％、この核酸−酵素複
合体は何の処理も施していない酵素の７５％の酵素活性
が保持されていたことが示されている。

【０００９】ｉｉ．ゴッシュらのもう一つの方法は、図
３に示される方法であり、核酸の５′末端に前記の方法
と同じようにスルフヒドリル基を導入し、このスルフヒ
ドリル基にさらにホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ′−
１，２−フェニレンジマレイミドを反応させることによ
り、核酸の５′末端にマレイミド基を導入しておき、他
方、酵素にスルフヒドリル基を導入しておき、得られた
これらの２種の化合物を反応させることにより、核酸と
酵素とを結合させる方法である。この方法によれば、ペ
ルオキシダーゼに関しては、その核酸−酵素複合体とし
ての回収率は５８％であり、この核酸−酵素複合体の何
の処理も施していない酵素に対する酵素活性の回収率は
７０〜７５％であることが示されている。

【００１０】この他に、核酸を一般的なタンパク質に導
入する方法は、例えば、Nucleic Acids Research 第１
５巻５２７５頁（１９８７年）およびNucleic Acids Re
search 第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載され
た方法が知られており、これらの技術を簡単に次に説明
する。

【００１１】（３）Nucleic Acids Research 第１５巻
５２７５頁（１９８７年）に記載の方法 オリゴヌクレオチドの３′末端にアミノ基を導入してお
きホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニッ
クアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応
させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することに
よりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジス
ルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３′末
端にスルフヒドリル基を導入する。

【００１２】一方、一般的なタンパク質であるアルカリ
性フォスファターゼとブロモアセチックアシッド−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ブロモアセ
チル−ＮＨＳ）を反応させることによって、アルカリ性
フォスファターゼの遊離アミノ基にブロモアセチル基を
導入する。この後にスルフヒドリル基導入オリゴヌクレ
オチドとブロモアセチル基導入アルカリ性フォスファタ
ーゼを混合して、スルフヒドリル基とブロモアセチル基
を反応させて結合させることにより、オリゴヌクレオチ
ドとアルカリ性フォスファターゼを結合させる。この方
法では６０から８０％の酵素が酵素−オリゴヌクレオチ
ド複合体として回収される。

【００１３】この文献には、このようにして得られた酵
素−オリゴヌクレオチド複合体は、腸管毒素原性大腸菌
に特異的な遺伝子配列をＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ
ーションにより検出する方法に用いられることが述べら
れているだけで、免疫化学的分析法については示唆はな
い。

【００１４】（４）Nucleic Acids Research 第１６巻
３６７１頁（１９８８年）に記載の方法 この方法を簡単に説明する。オリゴヌクレオチドを、シ
スタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾール
と反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５′
末端の水酸基にスルフヒドリル基を導入する。得られる
スルフヒドリル基導入オリゴヌクレオチドを精製した
後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２，
２′−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオ
リゴヌクレオチドの５′末端にジスルフィド結合を介し
てピリジル基を導入する。

【００１５】一方、一般的なタンパク質としてのブラジ
キニン、ペルオキシダーゼ、ＩｇＧに対してイミノチア
レンを反応させてスルフヒドリル基を導入しておく。こ
れらピリジルジスルフィド基導入オリゴヌクレオチドと
スルフヒドリル基導入タンパク質を混合して、ピリジル
基とスルフヒドリル基の特異的な反応により、タンパク
質とオリゴヌクレオチドを結合させる。この報告では、
ＩｇＧを用いたオリゴヌクレオチド−タンパク質複合体
の回収率が３０〜５０％であったことが述べられてい
る。

【００１６】また、この文献においはてそのオリゴヌク
レオチド−ＩｇＧ複合体のＩｇＧに対する抗体を用いた
反応性が確かめられている。すなわち、ヤギ抗ＩｇＧを
固相上に固定しておき、オリゴヌクレオチド−ＩｇＧ複
合体の核酸を³²Ｐで標識することによって、オリゴヌク
レオチド−ＩｇＧ複合体の固相への反応性が報告されて
いるだけであり、このようなオリゴヌクレオチド−Ｉｇ
Ｇ複合体の免疫化学的分析法への適用可能性については
何も記載はない。

【００１７】また、特開平５−４８１００号公報にはタ
ンパク質と核酸の結合体とするためのタンパク質自体を
試薬としたものが知られているので、次に、この方法を
説明する。

【００１８】（５）特開平５−８４１００号公報に記載
の方法 該公報に記載の発明は、タンパク質中の官能基（例え
ば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシン
イミド基）、およびスルフヒドリル基（別名、チオール
基）と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド
基等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、蛋白質を反応
させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入
して予め活性化されたタンパク試薬としており、このよ
うにして得られたタンパク試薬を、チオール化ポリヌク
レオチドのスルフヒドリル基、またはチオール含有タン
パク質のスルフヒドリル基へ共有結合させるためのキッ
トとすることが開示されている。

【００１９】しかしながら、このタンパク試薬を使用し
て得られるタンパク質と核酸の結合体を免疫化学的分析
法に利用することについては何も示唆はない。

【００２０】以上のように、核酸と、酵素または抗体と
を結合させる方法は種々の方法が開発されている。

【００２１】

【発明が解決しようとする課題】ところで、例えば、前
記従来の特開平４−２０４３７９号公報に開示されてい
るような、免疫化学的検出方法において、核酸に結合さ
れた免疫化学的活性物質（核酸−免疫化学的活性物質複
合体と呼ぶ）に保持されている活性は、その測定あるい
は検出系の検出感度を決定するという重要な意義を持
つ。また同時に、その核酸−免疫化学的活性物質複合体
の調製方法において、得られる核酸−免疫化学的活性物
質複合体の回収率は、こうした複合体を用いた免疫化学
的分析試薬のコストに大きな影響を及ぼすものである。

【００２２】一方、核酸と、酵素または抗体とを結合さ
せる前記の種々の従来の方法は、得られる核酸と酵素ま
たは抗体とを結合させた複合体の回収率は６０〜８０％
程度またはそれ以下であり、何れの方法も回収率および
その活性が低いという問題があった。

【００２３】したがって、核酸と、免疫化学的活性物質
（例えば、酵素または抗体等）とを結合させて核酸−免
疫化学的活性物質複合体を提供し、この核酸−免疫化学
的活性物質複合体を用いて免疫化学的分析を行なうため
には、その複合体の回収率およびその複合体の活性を上
げる必要がある。

【００２４】そこで本発明は、従来の核酸と、酵素また
は抗体等のタンパク質との結合法よりも高回収率を実現
した核酸−免疫化学的活性物質複合体とし、その核酸−
免疫化学的活性物質複合体の活性をより高く保持するこ
とを実現し、生体成分分析法、特に抗原抗体反応を利用
した免疫化学的分析法に使用できる核酸−免疫化学的活
性物質複合体自体の提供、その製造方法の提供、および
その核酸−免疫化学的活性物質複合体を使用した免疫化
学的測定試薬を提供することを目的とする。

【００２５】

【課題を解決するための手段】前記した問題点を解決す
るために、本発明は、核酸に次の式（１）で表される化
合物、

【００２６】

【化６】 〔式（１）中、_n1、_n2および_n3はそれぞれ独立した０か
ら１５のあいだの整数を、Ｒ₁ およびＲ₂ はそれぞれ化
学結合または６員環状炭化水素残基を表す。〕を反応さ
せることにより、次の式（２）で示される化合物、

【００２７】

【化７】 〔式（２）中、Ｂは核酸をＢ−ＮＨ₂ で表したときのそ
の残基を表し、_n1、_n2および_n3はそれぞれ独立した０か
ら１５のあいだの整数を、Ｒ₁ およびＲ₂ はそれぞれ化
学結合または６員環状炭化水素残基を表す。〕化合物を
得、ついでこの式（２）の化合物を免疫化学的活性物質
と反応させることにより、次の式（３）で表される化合
物、

【００２８】

【化８】 〔式（３）中、Ａは免疫化学的活性物質をＡ−ＳＨで表
したときのその残基を表し、Ｂ、_n1、_n2、_n3、Ｒ₁ およ
びＲ₂ はそれぞれ化学結合または６員環状炭化水素残基
を表す。〕を得ることを特徴とする核酸と免疫化学的活
性物質との複合体の製造方法とするものである。

【００２９】また本発明は、上記の核酸と免疫化学的活
性物質との複合体の製造方法により得られ、上記式
（３）で表される免疫化学的分析法に使用される核酸と
免疫化学的活性物質との複合体とするものである。

【００３０】また本発明は、このようにして得られた上
記式（３）で表される核酸と免疫化学的活性物質との複
合体を含んだ免疫化学的測定試薬とするものである。

【００３１】本発明において、前記核酸に含有されるア
ミノ基（ＮＨ₂ −）が、核酸の３′末端または５′末端
のもの、あるいは核酸の分子中に導入されたものであっ
てもよい。

【００３２】本発明において免疫化学的活性物質とは、
免疫化学的測定法に使用されて、免疫化学的な反応を生
ずる物質であり、Ａ−ＳＨで表すことができ、その免疫
化学的活性物質は、分子中にスルフヒドリル基を有して
いる。そのスルフヒドリル基は、免疫化学的活性物質に
本来含まれているものでもよいし、Ｓ−アセチルメルカ
プトコハク酸無水物（以下、無水コハク酸と略記する）
などを用いて免疫化学的活性物質にスルフヒドリル基を
導入したものでもよい。また、分子中にジスルフィド基
を有する場合は２−メルカプトエチルアミンなどの還元
剤を用いてスルフヒドリル基を生成させたものでもよ
い。

【００３３】本発明において使用される免疫化学的活性
物質には、抗原、ハプテン、抗体が挙げられる。具体的
には、例えば、免疫グロブリン、その酵素分解物〔例え
ば、Ｆ（ａｂ′）₂ ，Ｆａｂ′，Ｆａｂ等〕、アルブミ
ン、フィブリノーゲン（フィブリンおよびそれらの分解
産物）、α−フェトプロテイン、ガン胎児性抗原、Ｃ反
応性タンパク質、ミオグロブリン、肝炎ウイルス抗原、
ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、
インスリン、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒
素、細菌抗原、酵素、ホルモン、薬剤などが挙げられ
る。

【００３４】本発明における免疫化学的活性物質とし
て、特に、Ｆａｂ′は核酸との複合体、即ち、核酸−免
疫化学的活性物質複合体が高収率で得られる点、および
得られた核酸−免疫化学的活性物質複合体の活性が高い
点において好ましい。

【００３５】本発明において核酸としては、リボ核酸や
デオキシリボ核酸を構成要素とする種々の組み合わせ
の、種々の長さのものを使用することができる。例え
ば、ポリリボヌクレオチド、ポリデオキシリボヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレ
オチド、これら２種以上の複合体、あるいは互いの相補
的な配列により結合した２本鎖以上のポリヌクレオチド
あるいはオリゴヌクレオチドからなる錯体などが挙げら
れるが、１０から２００ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチ
ドあるいはポリヌクレオチドが望ましい。なお、これら
の核酸に放射性あるいは非放射性の標識を導入すること
もできる。

【００３６】上記式（１）〜式（３）中において、Ｒ₁
またはＲ₂ で表される６員環状炭化水素残基としては、
飽和物、不飽和物のいずれでもよい。飽和６員環状炭化
水素残基には、例えば、シクロヘキシレンが挙げられ、
不飽和６員環状炭化水素残基には、例えば、フェニレン
などが挙げられる。該６員環状炭化水素残基には、例え
ば、シクロヘキシレンが好ましい。

【００３７】上記式（１）で表される化合物には、例え
ば、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシン
イミド（別名：Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミド
ヘキサノエート）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキ
シ）スクシンイミド（別名：Ｎ−スクシンイミジル−４
−マレイミドブチレート）、スクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンシミ
ジル−４−（パラ−マレイミドフェニル）ブチレート、
スルホスクシンイミジル−４−（パラ−マレイミドフェ
ニル）ブチレート等が挙げられる。

【００３８】本発明において、免疫化学的測定または免
疫化学的分析とは、核酸−免疫化学的活性物質複合体に
おける免疫化学的活性物質が、免疫反応によって被測定
物質と直接または間接に結合することにより、その被測
定物質の存在及び／又はその量を検出することをいう。

【００３９】本発明の核酸−免疫化学的活性物質複合体
を用いて免疫学的測定を行なう際の被測定物質として
は、臨床診断に利用される物質が挙げられ、例えば体
液、尿、喀痰、糞便中などに含まれるヒトイムノグロブ
リンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリ
ンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒト
フィブリノーゲン（フィブリンおよびそれらの分解産
物）、α−フェトプロテイン、Ｃ反応性タンパク質、ミ
オグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト
絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、イン
スリン、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、
細菌抗原、酵素、ホルモン、薬剤などが挙げられる。

【００４０】つぎに、本発明の核酸−免疫化学的活性物
質複合体において、免疫化学的活性物質（Ａ−ＳＨ）の
Ａが抗体残基であるものを免疫化学的分析法における試
薬として使用した場合のキットの構成例、キットの使用
方法を説明する。

【００４１】（Ｉ）Ａが抗体残基である場合 サンドイッチ法による酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を例に
すれば、次のようなキットの構成例が示される。

【００４２】抗原検出用キットの構成例 抗原検出用ＥＩＡ試薬キットは、例えば、下記の試薬
〜試薬から構成される。

【００４３】試薬：核酸が結合した固相（即ち、核酸
−免疫化学的活性物質複合体中の核酸に相補的な配列を
有する核酸を固相に結合させたものである。）。

【００４４】試薬：核酸−免疫化学的活性物質複合体
（具体例には、核酸と抗体フラグメント、例えば、Ｆａ
ｂ′が核酸に結合されたものが挙げられる。）。

【００４５】試薬：被測定物質の標準品（具体例に
は、前記抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ′に免疫化
学的に結合するもの、例えば、抗原の標準品が挙げられ
る。）。

【００４６】試薬：酵素で標識された抗体フラグメン
ト（具体例には、抗体フラグメント例えば、Ｆａｂ′が
酵素で標識されたものが挙げられる。前記の被測定物
質に反応する抗体に、酵素を結合させたものであればい
ずれでもよく、その標識酵素の一例としては西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、グル
コースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェ
ラーゼなどが挙げられる）。

【００４７】試薬：希釈用緩衝液（上記およびの
試薬の希釈用、並びに被測定試料の希釈用に使用可能な
緩衝液である。その一例として、ｐＨ６〜９のＴＥＳ緩
衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられ
る。）。

【００４８】試薬：洗浄液（インキュベーション後、
固相の洗浄に用いることの可能な緩衝液あるいは溶液で
ある。その一例として、ＴＥＳ緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液、食塩溶液などが挙げられる。）。

【００４９】試薬：酵素活性測定に必要な試薬（その
一例として、試薬において標識酵素が西洋ワサビペル
オキシダーゼであり、測定法が比色法の場合、酵素活性
測定に必要な試薬には３，３′，５，５′−テトラメチ
ルベンジジンと過酸化水素が用いられる。また、測定法
が蛍光法の場合、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸と過酸化
水素が用いられる。また、測定法が発光法の場合、ルミ
ノールと過酸化水素が用いられる。また、何れの測定法
の場合にも酵素基質の溶解に用いる緩衝液および酵素反
応停止液が使用される。）。

【００５０】上記に例示した試薬〜試薬からなるキ
ットは、例えば、下記の方法で使用することができる。

【００５１】抗原検出用キットの使用方法 試薬である被測定物質の標準品もしくは被検液の５〜
１０００μｌに対して、試薬を加えて希釈し、試薬
および試薬を含む溶液の５〜１０００μｌを加えて一
定時間約０〜６０℃で反応させる。反応後、試薬を一
定量加えて、一定時間反応させる。この後、試薬によ
り固相を洗浄し、固相上に結合している酵素の活性を測
定する。この酵素の活性の測定には、この酵素の基質を
約１０〜１０００μｌ加えて、約０〜５０℃で一定時間
反応させて、反応液中の吸光度、蛍光強度あるいは発光
の程度を測定することにより、酵素活性を測定する。

【００５２】または上記とは別の使用方法として、あら
かじめ一定量の試薬と試薬を反応させた後、固相を
洗浄して抗体を固相に結合させておく。この固相と被測
定物質の標準品もしくは被検液の５〜１０００μｌに試
薬を加えて希釈したものを反応させ、反応後、固相を
洗浄し、試薬を添加して反応させる。この後、固相を
洗浄して、固相に結合した酵素量を酵素検出用試薬を
添加して酵素反応を行ない、反応液中の吸光度、蛍光強
度、発光の程度等を測定することもできる。

【００５３】また、酵素の測定にあたっては、固相に結
合している試薬−試薬−試薬からなる免疫複合体
を遊離させてその酵素量を測定することもできる。

【００５４】つぎに、本発明の核酸−免疫化学的活性物
質複合体において、免疫化学的活性物質（Ａ−ＳＨ）の
Ａが抗原残基であるものを免疫化学的分析法における試
薬として使用した場合のキットの構成例、キットの使用
方法を説明する。

【００５５】（ＩＩ）Ａが抗原残基である場合 前記（Ｉ）の場合と同様に、サンドイッチ法による酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）を例にすれば、次のようなキット
の構成例が示される。

【００５６】抗体検出用キットの構成例 抗体検出用ＥＩＡ試薬キットは、例えば、下記の試薬
〜試薬から構成される。

【００５７】試薬：核酸が結合した固相（即ち、核酸
−免疫化学的活性物質複合体中の核酸に相補的な配列を
有する核酸を固相に結合させたものである。）。

【００５８】試薬：核酸−免疫化学的活性物質複合体
（具体例には、核酸と抗原を結合させたものが挙げられ
る。）。

【００５９】試薬：被測定物質の標準品（具体例に
は、前記抗原と免疫化学的に結合するものの標準品が挙
げられる。）。

【００６０】試薬：酵素で標識された抗体フラグメン
ト（具体例には、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ′
が酵素で標識されたものが挙げられる。前記の被測定
物質に反応する抗体に、酵素を結合させたものであれば
いずれでもよく、その標識酵素の一例としては西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフ
ェラーゼなどが挙げられる。）。

【００６１】試薬：希釈用緩衝液（上記およびの
試薬の希釈用、並びに被測定試料の希釈用に使用可能な
緩衝液である。その一例として、ｐＨ６〜９のＴＥＳ緩
衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられ
る。）。

【００６２】試薬：洗浄液（インキュベーション後、
固相の洗浄に用いることの可能な緩衝液あるいは溶液で
ある。その一例として、ＴＥＳ緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液、食塩溶液などが挙げられる。）。

【００６３】試薬：酵素活性測定に必要な試薬（その
一例として、試薬において標識酵素が西洋ワサビペル
オキシダーゼであり、測定法が比色法の場合、酵素活性
測定に必要な試薬には３，３′，５，５′−テトラメチ
ルベンジジンと過酸化水素が用いられる。また、測定法
が蛍光法の場合、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸と過酸化
水素が用いられる。また、測定法が発光法の場合、ルミ
ノールと過酸化水素が用いられる。また、何れの測定法
の場合にも酵素基質の溶解に用いる緩衝液および酵素反
応停止液が使用される。）。

【００６４】上記に例示した試薬〜試薬からなるキ
ットは、例えば、下記の方法で使用することができる。

【００６５】抗体検出用キットの使用方法 試薬である被測定物質の標準品もしくは被検液の５〜
１０００μｌに対して、試薬を加えて希釈し、試薬
および試薬を含む溶液の５〜１０００μｌを加えて一
定時間約０〜６０℃で反応させる。反応後、試薬を一
定量加えて、一定時間反応させる。この後、試薬によ
り固相を洗浄し、固相上に結合している酵素の活性を測
定する。この酵素の活性の測定には、この酵素の基質を
約１０〜１０００μｌ加えて、約０〜５０℃で一定時間
反応させて、反応液中の吸光度、蛍光強度あるいは発光
の程度を測定する。

【００６６】または上記とは別の使用方法として、あら
かじめ一定量の試薬と試薬を反応させた後、固相を
洗浄して抗原を固相に結合させておく。この固相と被測
定物質の標準品もしくは被検液の５〜１０００μｌに試
薬を加えて希釈したものを反応させ、反応後、固相を
洗浄し、試薬を添加して反応させる。この後、固相を
洗浄して、固相に結合した酵素量を酵素検出用試薬を
添加して酵素反応を行ない、反応液中の吸光度、蛍光強
度、発光の程度等を測定することもできる。

【００６７】また、酵素の測定にあたっては、固相に結
合した試薬−試薬−試薬からなる免疫複合体をさ
らに遊離させてその酵素量を測定することもできる。

【００６８】本発明は、標識抗体に酵素標識抗体を用い
た酵素免疫化学的分析法以外にも、放射性同位元素を標
識抗体に用いたラジオイムノアッセイ、金コロイドなど
で標識した抗体を用いる免疫分析法、アクリジュウムエ
ステルなどの発光性物質で標識された抗体を用いる免疫
分析法、フルオロセインなどの蛍光物質で標識された抗
体を用いる免疫化学的分析法などに利用することができ
る。

【００６９】

【実施例】本発明を実施例により具体的に説明する。

【００７０】〔実施例１〕オリゴヌクレオチド−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体の製造およびその複合体の回収 ５′末端にアミノ基を有する次に示す塩基配列のオリゴ
ヌクレオチドをアプライド バイオシステム社製自動Ｄ
ＮＡ合成装置３９１Ａを用いて合成した。

【００７１】アミノ基−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴ
Ｔ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴ このヌクレオチドを１６９．１６ｎｍｏｌ含む０．１Ｍ
ＴＥＳ 〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル１，２アミ
ノエタンスルフォニックアシッド）〕ｐＨ７．０、１．
０ｍｌに対して、１００μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミドに溶解した前記式（１）で表され、式（１）中に
おいて、_n1＝０、_n2＝０、_n3＝５、Ｒ₁，Ｒ₂ が化学結
合である場合の結合試薬、即ち、Ｎ−（ε−マレイミド
カプロイルオキシ）スクシンイミド５．２５ｍｇを加え
て、３７℃、６０分間反応させることにより、マレイミ
ド基をオリゴヌクレオチドに結合させた。反応後セファ
デックスＧ−２５によりオリゴヌクレオチドと結合試薬
を分離し、オリゴヌクレオチドを分子量２０００を限界
排除とする限外濾過膜を用いて濃縮した。

【００７２】一方、抗原としての西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ３７５ｎｍｏｌを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウ
ム緩衝液ｐＨ７．０に対して、３６６μｌのＮ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドに溶解した６．５３ｍｍｏｌの無水
コハク酸を加えて、３０℃、３０分間反応させた。反応
後０．１ｍｌの１Ｍ トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０お
よび０．１ｍｌの１ＭハイドロキシルアミンｐＨ７．０
を加えて３０℃、３０分間反応させ脱保護を行なった。
この後、過剰の無水コハク酸などをセファデックスＧ−
２５カラムクロマトグラフィーにより除き、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに相当する画分を集めた。この集めた
画分を限界排除分子量が１００００である限外濾過膜を
用いて濃縮し、４，４′−ジチオピリジンを用いてスル
フヒドリル基の定量を行なうとスルフヒドリル基：ペル
オキシダーゼ＝３．９８：１であることがわかった。

【００７３】前記マレイミド基導入オリゴヌクレオチド
２６．１ｎｍｏｌと前記スルフヒドリル基導入西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ２６．１ｎｍｏｌを混合し、３７
℃、１時間反応させ、西洋ワサビペルオキシダーゼに導
入されたスルフヒドリル基とオリゴヌクレオチドに導入
されたマレイミド基を結合させることによってオリゴヌ
クレオチドと西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させ
た。その後この混合物をウルトロゲルＡｃＡ４４カラム
にかけ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラア
セチックアシッド）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
６．０により溶出させて、オリゴヌクレオチド−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体を回収した。前記カラムか
ら溶出された各フラクションに対して、２６０ｎｍ、２
８０ｎｍ、４０３ｎｍにおけるそれぞれの吸光度を測定
した。この結果を図４に示す。

【００７４】図４中の白四角印□は、西洋ワサビペルオ
キシダーゼの特異的な吸収波長４０３ｎｍにおける吸光
度を示す。黒三角印▲はオリゴヌクレオチドの最大吸収
波長２６０ｎｍにおける吸光度を、白丸印〇はタンパク
質の最大吸収波長２８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ
示す。図４からは、本発明の方法において、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼとオリゴヌクレオチドが結合したもの
と、結合していないオリゴヌクレオチドが効率よく分離
されていることが分かる。

【００７５】フラクション３１から４５を収集し、その
オリゴヌクレオチド−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体の回収率はほぼ１００％であった。なお、スルフヒド
リル基の導入処理をしていない西洋ワサビペルオキシダ
ーゼは、フラクション４６をピークとして溶出されるこ
とが分かっている。この画分の一部と処理を施していな
い西洋ワサビペルオキシダーゼを、ドデシル硫酸ナトリ
ウムを含む１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気
泳動分析法で分子量を比較してみたところ、前者は後者
と同一の分子量のバンドを持たず分子量として５０００
から６０００程度高分子のところにメジャーなバンドが
移動していることが確認された。

【００７６】〔実施例２〕オリゴヌクレオチド−抗ＣＴＦａｂ′複合体の製造およ
びその複合体の回収 抗原としてコレラ菌が産生するコレラ毒素（略号：Ｃ
Ｔ）を家兎に免疫して、ＣＴに対する抗血清を調製し
た。この抗血清１ｍに対して０．１８ｇの硫酸ナトリウ
ムを加えて３０分間攪拌して塩析を行ない、この後、遠
心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を少量
の１７．５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．３で
溶解した後、同緩衝液に対して透析した。透析した溶液
をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィーにより
ＩｇＧ画分を分取した。ＩｇＧ画分をペプシンで処理し
た後、ウルトロゲルＡｃＡ４４カラムを用いたクロマト
グラフィーを行ない、抗ＣＴＦ（ａｂ′）₂ を２−メル
カプトエチルアミンで還元し、セファデックスＧ−２５
カラムクロマトグラフィーにより抗ＣＴＦａｂ′を調製
した。

【００７７】一方、５′末端にアミノ基を有する次に示
す塩基配列のオリゴヌクレオチドをアプライドバイオシ
ステム社製自動ＤＮＡ合成装置３９１Ａを用いて合成
し、固相導入用オリゴヌクレオチドとした。

【００７８】アミノ基−ＣＧ ＡＣＧ ＧＡＴ ＣＣＣ
ＣＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ このオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有し、且つそ
のオリゴヌクレオチドの５′末端にアミノ基を導入した
オリゴヌクレオチドを上記と同様に合成し、このヌクレ
オチドを２５３．７４ｎｍｏｌ含む０．１Ｍ ＴＥＳ、
ｐＨ７．０、０．５ｍｌに対して、５０μｌのＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミドに溶解した、前記式（１）で表さ
れ、その式（１）中において、_n1＝０、_n2＝０、_n3＝
５、Ｒ₁ ，Ｒ₂ が化学結合である場合の結合試薬、即
ち、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシン
イミド７．８ｍｇを加えて３７℃、６０分間反応させる
ことにより、マレイミド基をオリゴヌクレオチドに導入
した。反応後セファデックスＧ−２５によりオリゴヌク
レオチドと結合試薬を分離し、オリゴヌクレオチドを分
子量２０００を限界排除とする限外濾過膜を用いて濃縮
した。濃縮したオリゴヌクレオチドは２０５．６ｎｍｏ
ｌであった。またＹ．Ｏｋｕらの方法（Microbiol.Immu
nol., 32,807-816, 1988）にしたがってマレイミド基の
定量を行なうと、オリゴヌクレオチド：マレイミド基＝
１：１．４２であった。

【００７９】前記抗ＣＴＦａｂ′１０１ｎｍｏｌに対し
て前記マレイミド基導入オリゴヌクレオチド１４４．３
ｎｍｏｌを混合し、３７℃、１時間反応させることによ
り、前記抗ＣＴＦａｂ′のヒンジ部ＳＨ基とマレイミド
基導入オリゴヌクレオチドを結合させた。その後この混
合物をウルトロゲルＡｃＡ４４カラムにかけ０．１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ６．０により溶出させた。溶出物に、オ
リゴヌクレオチドと抗ＣＴＦａｂ′が結合しているオリ
ゴヌクレオチド−抗ＣＴＦａｂ′複合体が存在すること
は２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定す
ることによって確認した。

【００８０】図５に各フラクションに対する吸光度の測
定結果をグラフとして示した。図５中におるけ白三角印
△は２６０ｎｍにおける吸光度を、白丸印○は２８０ｎ
ｍにおける吸光度をそれぞれ示す。フラクション４０前
後で溶出されてくるものがオリゴヌクレオチド−抗ＣＴ
Ｆａｂ′複合体であり、フラクション５５前後に溶出さ
れているのが抗ＣＴＦａｂ′に結合しなかったオリゴヌ
クレオチドである。

【００８１】図５からわかるように本実施例２の製造方
法を用いると、効率よくオリゴヌクレオチド−抗ＣＴＦ
ａｂ′複合体が得られることが分かる。フラクション３
３から４５までを収集し吸光度の比からオリゴヌクレオ
チドの導入率を調べたところ、１モルの抗ＣＴＦａｂ′
に対して１モルのオリゴヌクレオチドが導入されている
ことが分かった。また反応に使用した抗ＣＴＦａｂ′の
ほぼ１００％がオリゴヌクレオチド−抗ＣＴＦａｂ′複
合体として回収された。

【００８２】〔実施例３〕オリゴヌクレオチド導入固相とオリゴヌクレオチド−抗
ＣＴＦａｂ′複合体によるコレラ毒素の検出 前記実施例２で製造した固相導入用オリゴヌクレオチド
を、アミノ基が導入されたポリスチレンビーズにグルタ
ルアルデヒドで共有結合させることにより、オリゴヌク
レオチド導入固相を製造した。このオリゴヌクレオチド
導入固相を０．１％アジ化ナトリウム、０．１％スキム
ミルクおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液、０．１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．０中
に保存した。

【００８３】このオリゴヌクレオチド導入固相と、前記
実施例２で製造したオリゴヌクレオチド−抗ＣＴＦａ
ｂ′複合体を用いて、コレラ毒素がどの程度の量まで検
出できるかを調べた。すなわち、各３０．５ｐｇ／ｍ
ｌ、１２２ｐｇ／ｍｌ、４８８ｐｇ／ｍｌ、１．９５ｎ
ｇ／ｍｌ、７．８ｎｇ／ｍｌ、３１．２ｎｇ／ｍｌの濃
度のコレラ毒素溶液２５０μｌに、オリゴヌクレオチド
−抗ＣＴＦａｂ′複合体と西洋ワサビペルオキシダーゼ
標識抗ＣＴＦａｂ′をそれぞれ２０ｐｍｏｌ／ｍｌおよ
び８００ｎｇ／ｍｌ含む緩衝液２５０μｌ中で、３７
℃、１時間反応させ、前記オリゴヌクレオチド導入固相
を投入し、３７℃、１時間反応させた。この後、０．３
Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、テトラメチルベン
ジジンを用いて酵素活性を測定し検量線を作製した。こ
のコレラ毒素濃度に対する４５０ｎｍにおける吸光度の
測定結果を図６に示した。なお、図６中のプロット点は
実際のコレラ毒素濃度、すなわち上記濃度の２倍希釈濃
度を示している。その結果６１ｐｇ／ｍｌ以上のコレラ
毒素の検出が可能であることがわかった。

【００８４】〔実施例４〕オリゴヌクレオチド導入固相とオリゴヌクレオチド−抗
ＣＴＦａｂ′複合体によるコレラ毒素の検出 前記実施例３に記載したオリゴヌクレオチド導入固相
と、前記実施例２に記載したオリゴヌクレオチド結合Ｆ
ａｂ′を用いて、コレラ毒素がどの程度の量まで検出で
きるかを調べた。本実施例４においては前記実施例３と
異なり、オリゴヌクレオチド導入抗体とオリゴヌクレオ
チド導入固相をあらかじめ反応させた後洗浄し、固相に
抗体を結合させたものを使用した。

【００８５】すなわち、前記実施例２に記載したオリゴ
ヌクレオチド結合Ｆａｂ′と前記実施例３に記載したオ
リゴヌクレオチド導入固相とを予め核酸の相補的結合に
より結合させたものに対して、１５ｐｇ／ｍｌ、６１ｐ
ｇ／ｍｌ、２４４ｐｇ／ｍｌ、９７６ｐｇ／ｍｌ、３．
９ｎｇ／ｍｌ、１５．６ｎｇ／ｍｌの濃度のコレラ毒素
溶液５００μｌを３７℃、１時間反応させて、固相上に
コレラ毒素を結合させた。

【００８６】得られた固相を０．３Ｍ 塩化ナトリウム
溶液で洗浄した後、４００ｎｇ／ｍｌの西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識抗コレラ毒素Ｆａｂ′を３７℃で１時
間反応させた。その後、固相を再度０．３Ｍ 塩化ナト
リウム溶液で洗浄した後、テトラメチルベンジジンを用
いて固相に結合した酵素量を調べ、検量線を作製した。
このコレラ毒素濃度に対する４５０ｎｍにおける吸光度
の測定結果を図７に示す。コレラ毒素は１５ｐｇ／ｍｌ
以上が検出可能であることがわかった。

【００８７】〔実施例５〕オリゴヌクレオチド導入固相とオリゴヌクレオチド−抗
ＴＤＨＦａｂ′複合体によるＴＤＨの検出 抗原として腸炎ビブリオの産生する耐熱性溶血清（ＴＤ
Ｈ；Thermodirect haemolysin)を家兎に免疫して抗血清
を調製し、この抗血清から前記実施例２と同様の手法に
よりＦａｂ′を調製した。

【００８８】また５′末端にアミノ基を導入したアミノ
基−ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＧＧ
ＴＣに、マレイミド基を導入したマレイミド基導入オ
リゴヌクレオチドを前記実施例２と同様の方法で調製し
た。前記Ｆａｂ′とこのマレイミド基導入オリゴヌクレ
オチドを反応させてオリゴヌクレオチド−抗ＴＤＨＦａ
ｂ′複合体を調製した。

【００８９】一方、前記オリゴヌクレオチドに相補的な
オリゴヌクレオチドを合成し前記実施例３と同様にして
固相に結合させた。こうして調製したオリゴヌクレオチ
ド導入固相とオリゴヌクレオチド−抗ＴＤＨＦａｂ′複
合体を用いて、前記実施例３と同様にＴＤＨがどの程度
の量まで検出できるか調べた。

【００９０】すなわち、３０．５ｐｇ／ｍｌ、１２２ｐ
ｇ／ｍｌ、４８８ｐｇ／ｍｌ、１．９５ｎｇ／ｍｌ、
７．８ｎｇ／ｍｌ、３１．２ｎｇ／ｍｌの濃度のコレラ
毒素溶液２５０μｌに、オリゴヌクレオチド結合Ｆａ
ｂ′と西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＴＤＨＦａ
ｂ′をそれぞれ２０ｐｍｏｌ／ｍｌおよび８００ｎｇ／
ｍｌ含む緩衝液２５０μｌと３７℃、１時間反応させ、
前記オリゴヌクレオチド固相を投入し、３７℃１時間反
応させた。この後、０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄
した後、テトラメチルベンジジンを用いて酵素活性を測
定し検量線を作製した。この耐熱性溶血毒素濃度に対す
る４５０ｎｍにおける吸光度の測定結果を図８に示す。
なお、図８中のプロット点は実際の耐熱性溶血毒濃度、
すなわち、上記濃度の２倍希釈濃度を示している。その
結果２４４ｐｇ／ｍｌ以上のＴＤＨの検出が可能である
ことがわかった。

【００９１】〔実施例６〕オリゴヌクレオチド導入固相とオリゴヌクレオチド−抗
ＴＤＨＦａｂ′複合体によるＴＤＨの検出 前記実施例５に記載したオリゴヌクレオチド導入固相と
オリゴヌクレオチド結合Ｆａｂ′を用いて、ＴＤＨがど
の程度の量まで検出できるかを調べた。本実施例６にお
いては、前記実施例５と異なり、ヌクレオチド導入抗体
とヌクレオチド導入固相を予め反応させた後、洗浄し、
固相に抗体を結合させたものを使用した。

【００９２】すなわち、前記実施例５に記載したオリゴ
ヌクレオチド−抗ＴＤＨＦａｂ′複合体と前記実施例５
に記載したオリゴヌクレオチド導入固相とを、予め核酸
の相補的結合により結合させておいた。得られた抗ＴＤ
ＨＦａｂ′が結合された固相に対して、各１５ｐｇ／ｍ
ｌ、６１ｐｇ／ｍｌ、２４４ｐｇ／ｍｌ、９７６ｐｇ／
ｍｌ、３．９ｎｇ／ｍｌ、１５．６ｎｇ／ｍｌの濃度の
ＴＤＨ溶液５００μｌを３７℃、１時間反応させて固相
上にＴＤＨを結合させた。得られた固相を０．３Ｍ 塩
化ナトリウム溶液で洗浄した後、４００ｎｇ／ｍｌの西
洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＴＤＨＦａｂ′を３７
℃で１時間反応させた。この後、固相を再度０．３Ｍ
塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、テトラメチルベンジ
ジンを用いて固相に結合した酵素量を調べ、検量線を作
製した。この耐熱性溶血毒濃度に対する４５０ｎｍにお
ける吸光度の測定結果を図９に示す。ＴＤＨは１５ｐｇ
／ｍｌ以上が検出可能であることがわかった。

【００９３】〔比較例１〕ゴシュらの方法によるオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒
素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体の製造およびその複合体の回収 オリゴヌクレオチド−免疫化学的活性物質複合体の調製
を、Bioconjugate Chemistry,(1,71-76, 1990, S.S.Gho
sh,P.M.Kao, A.W.McCue, and H.L.Chappele)に記載され
ている方法により行なった。

【００９４】フルオレセイン標識ウサギＦ（ａｂ′）₂
０．１ｍｇを添加したウサギの抗コレラ毒素Ｆ（ａ
ｂ′）₂ ４．０９ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７．０に溶解した。これに５０モル過剰のＮ−
（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド
（以下ＥＭＣＳと略記する）を添加して、３０℃、３０
分間インキュベートした後、セファデックスＧ−２５樹
脂を用いたゲルカラムクロマトグラフィーを行なうこと
により、マレイミド基を導入した抗コレラ毒素Ｆ（ａ
ｂ′）₂ と、未反応のＥＭＣＳを分離した。マレイミド
基導入抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ をアミコンＹＭ−３
０限外濾過膜を用いて濃縮した。

【００９５】一方、アプイライドバイオシテムス社製Ｄ
ＮＡ合成装置３９１Ａを用いて５′末端にアミノ基を有
する次に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成し
た。

【００９６】アミノ基−ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＧ ＧＧ
Ｇ ＡＴＣ ＣＧＴ ＣＧ このオリゴヌクレオチドに５０モル過剰のＮ−スクシン
イミジル−Ｓ−アセチルチオエート（以下ＳＡＴＡと略
記する）を添加して３０℃３０分間インキュベートし
た。インキュベート後、それぞれ終濃度０．１Ｍとなる
ように１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０と１Ｍハイド
ロキシルアミンｐＨ７．０を添加し、３０℃１０分間イ
ンキュベートした。この後、オリゴヌクレオチドを常法
にしたがってエタノール沈殿により分画した。

【００９７】沈殿として得られたオリゴヌクレオチドを
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で溶解し、
限外濾過により濃縮したマレイミド基導入抗コレラ毒素
Ｆ（ａｂ′）₂ と混合して、３０℃、１時間反応させ
た。反応後、ウルトロゲルＡｘＡ３４樹脂を用いたゲル
カラムクロマトグラフィーを行ない、オリゴヌクレオチ
ドが結合した抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ と未反応オリ
ゴヌクレオチドを分離し、オリゴヌクレオチド−抗コレ
ラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体に相当する分画、フラクシ
ョン番号３３から４５までを収集した。図１０に、各フ
ラクションに対する２８０ｎｍにおける吸光度と蛍光強
度を測定して得たグラフを示す。図１０中黒丸印●は２
８０ｎｍにおける吸光度を示し、黒三角印▲は蛍光強度
を示す。

【００９８】さらに、このフラクション番号３３から４
５まで収集した画分を東ソー社製Ｇ３０００ＳＷ樹脂を
用いたゲルカラムクロマトグラフィーにより純度を調べ
た。図１１に、そのゲルクロマトグラフィーによる流出
経過時間に対する各成分の流出量（％）のパターンを示
す。その結果、オリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ
（ａｂ′）₂ 複合体に相当する画分は全体の２８０ｎｍ
における吸光度の５７．６％であることがわかった。

【００９９】〔実施例７〕本発明によるオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａ
ｂ′）₂ 複合体の製造およびその複合体の回収 前記比較例１と対比するために、本発明のオリゴヌクレ
オチド−免疫化学的活性物質複合体の調製を次のように
行なった。

【０１００】フルオレセイン標識ウサギＦ（ａｂ′）₂
０．１ｍｇを添加したウサギの抗コレラ毒素Ｆ（ａ
ｂ′）₂ ４．０９ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７．０に溶解した。これに５０モル過剰のＳＡＴ
Ａを添加して、３０℃、３０分間インキュベートした
後、それぞれ終濃度０．１Ｍとなるように１Ｍトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ７．０と１ＭハイドロキシルアミンｐＨ
７．０を添加し、３０℃、１０分間インキュベートし
た。セファデックスＧ−２５樹脂を用いたゲルカラムク
ロマトグラフィーを行なうことにより、スルフヒドリル
基が導入された抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ と未反応の
ＳＡＴＡを分離した。得られたスルフヒドリル基導入抗
コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ をアミコンＹＭ−３０限外濾
過膜を用いて濃縮した。

【０１０１】一方、アプイライドバイオシテムス社製Ｄ
ＮＡ合成装置３９１Ａを用いて５′末端にアミノ基を有
する次に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成し
た。

【０１０２】アミノ基−ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＧ ＧＧ
Ｇ ＡＴＣ ＣＧＴ ＣＧ このオリゴヌクレオチドに５０モル過剰のＥＭＣＳを添
加して３０℃３０分間インキュベートした。インキュベ
ート後、オリゴヌクレオチドを常法にしたがってエタノ
ール沈殿により分画した。沈殿として得られたオリゴヌ
クレオチドを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．
０で溶解し、限外濾過により濃縮したスルフヒドリル基
導入ウサギ抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ と混合して、３
０℃、１時間反応させた。

【０１０３】反応後、ウルトロゲルＡｃＡ３４樹脂を用
いたゲルカラムクロマトグラフィーを行ない、オリゴヌ
クレオチドが結合した抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ と未
反応オリゴヌクレオチドを分離し、オリゴヌクレオチド
−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体に相当する分画、
フラクション番号３２から４７までを収集した。図１２
に各フラクションに対する、２８０ｎｍにおける吸光度
と蛍光強度を測定して得たグラフを示す。図１２中、黒
丸印●は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、黒三角印▲
は蛍光強度を示す。

【０１０４】さらに、このフラクション番号３２から４
７まで収集した分画を東ソー社製Ｇ３０００ＳＷ樹脂を
用いたゲルカラムクロマトグラフィーにより純度を調べ
た。図１３にそのゲルクロマトグラフィーによる流出経
過時間に対する各成分の流出量（％）のパターンを示
す。その結果、オリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ
（ａｂ′）₂ 複合体に相当する画分は全体の２８０ｎｍ
における吸光度の７５．４％であった。

【０１０５】この結果を前記比較例１のゴシュらの方法
と比較すると、ゴシュらの方法により調製して得たオリ
ゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体の
画分％に比較して、本実施例７の画分％は１７．８％高
く、本発明による方法の方が核酸−免疫化学的活性物質
複合体の純度において優れていることがわかる。

【０１０６】〔比較例２〕オリゴヌクレオチド導入固相とオリゴヌクレオチド−抗
コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体によるコレラ毒素の検
出 前記比較例１および前記実施例７において調製した、各
オリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合
体を用いて、コレラ毒素に対する反応性を次の方法によ
り調べた。

【０１０７】すなわち、オリゴヌクレオチド−抗コレラ
毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体と、該複合体中のヌクレオチ
ドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合さ
せた固相とをあらかじめそれぞれ一定濃度で一定時間反
応させ、双方のオリゴヌクレオチドの相補的な結合によ
り固相にオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａ
ｂ′）₂ を固定した。その後、０．３Ｍ塩化ナトリウム
を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０
（以下洗浄用緩衝液と略す）で、固相結合抗コレラ毒素
Ｆ（ａｂ′）₂ を洗浄した。

【０１０８】一方、種々の濃度のコレラ毒素を含む溶液
を、０．００２％チメロサール、０．１％牛血清アルブ
ミン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭビシン−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ８．３
（以下、希釈緩衝液と略す）を用いて調製した。

【０１０９】前記の種々のコレラ毒素を含む各溶液のそ
れぞれに、前記のオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ
（ａｂ′）₂ 複合体が結合した固相を投入して、３７
℃、１時間反応させた。洗浄用緩衝液で固相を洗浄後、
Ｙ．Ｏｋｕらの方法（Microbiol. Immunol.,32, 807-81
6, 1988 ）により調製したペルオキシダーゼ標識抗コレ
ラ毒素Ｆａｂ′を４００ｎｇ／ｍｌの濃度で含む希釈緩
衝液と３７℃１時間反応させた。固相を再び洗浄後、前
記Ｙ．Ｏｋｕらの方法にしたがって固相に結合したペル
オキシダーゼを調べた。

【０１１０】図１４は種々のコレラ毒素濃度に対する４
５０ｎｍにおける吸光度の測定値をグラフにしたもので
ある。図１４中、黒丸印●は、本発明の前記実施例７に
より得られたオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａ
ｂ′）₂ 複合体を示し、白三角印▲はゴシュらの方法に
基づいて作製した前記比較例１のオリゴヌクレオチド−
抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体を示す。

【０１１１】その結果、前記比較例１のゴシュらの方法
により調製したオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ
（ａｂ′）₂ 複合体よりも前記実施例７の本発明による
オリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合
体を用いたほうが高い反応性を示すことが分かった。

【０１１２】〔比較例３〕本発明によるオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆａ
ｂ′複合体、およびゴシュらの方法によるオリゴヌクレ
オチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体の反応性の
比較 前記実施例２の本発明による方法で調製したオリゴヌク
レオチド−抗コレラ毒素Ｆａｂ′複合体と、前記比較例
１のゴシュらの方法により調製したオリゴヌクレオチド
−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体のコレラ毒素に対
する反応性を次のようにして調べた。

【０１１３】すなわち、各々、一定濃度の前記実施例２
のオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆａｂ′複合体お
よび前記比較例１のオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素
Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体に対して、一定濃度のペルオキシ
ダーゼ標識抗コレラ毒素Ｆａｂ′〔Ｙ．Ｏｋｕらの方法
（Microbiol. Immunol.,32, 807-816, 1988 ）にしたが
って調製した〕を含む希釈用緩衝液と、一定量のコレラ
毒素を含む希釈緩衝液を混合し、３７℃、１時間反応さ
せた。反応後、得られた反応溶液を前記オリゴヌクレオ
チドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを結合
させた固相と３７℃、１時間反応させた。反応後、洗浄
用緩衝液で固相を洗浄し、Ｙ．Ｏｋｕらの方法（Microb
iol. Immunol.,32, 807-816, 1988 ）にしたがって固相
に結合したペルオキシダーゼを調べた。

【０１１４】図１５は種々のコレラ毒素濃度に対する４
５０ｎｍにおける吸光度の測定値をグラフにしたもので
ある。図１５中、黒丸印●は、本発明の前記実施例２に
より得られたオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆａ
ｂ′複合体を示し、白三角印▲はゴシュらの方法に基づ
いて作製した前記比較例１のオリゴヌクレオチド−抗コ
レラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体を示す。

【０１１５】その結果、本発明の前記実施例２により調
製したオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆａｂ′複合
体を用いた方が、前記比較例１のゴシュらの方法により
作製した複合体よりも反応性が高いことがわかった。な
お、ゴシュらの方法ではＦａｂ′のヒンジ部スルフヒド
リル基に特異的にオリゴヌクレオチドを導入することは
不可能である。

【０１１６】

【発明の効果】本発明によれば、本発明は、核酸の３′
あるいは５′末端にマレイミド基を導入しておき、免疫
化学的活性物質の側にスルフヒドリル基を導入し、この
両者を混合して反応させることによって、免疫化学的測
定法に有用な核酸−免疫化学的活性物質複合体を作製す
るので、本発明の核酸−免疫化学的活性物質複合体の回
収率は９５〜１００％と高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】特開平４−２０４３７９号公報に開示の免疫化
学的検出法のプロセスを示す。

【図２】ゴシュらの核酸とその末端に結合される抗体と
の結合方法のフローを示す。

【図３】ゴシュらの核酸とその末端に結合される抗体と
の結合方法の別のフローを示す。

【図４】実施例１におけるオリゴヌクレオチド−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体の各溶出フラクションの吸
光度を示す。

【図５】実施例２におけるオリゴヌクレオチド−抗ＣＴ
Ｆａｂ′複合体の各溶出フラクションの吸光度を示す。

【図６】実施例３におけるオリゴヌクレオチド導入固相
とオリゴヌクレオチド−抗ＣＴＦａｂ′複合体によるコ
レラ毒素の検出曲線を示す。

【図７】実施例４におけるオリゴヌクレオチド導入固相
とオリゴヌクレオチド−抗ＣＴＦａｂ′複合体によるコ
レラ毒素の検出曲線を示す。

【図８】実施例５におけるオリゴヌクレオチド導入固相
とオリゴヌクレオチド−抗ＴＤＨＦａｂ′複合体による
ＴＤＨ（耐熱性溶血毒素）の検出曲線を示す。

【図９】実施例６におけるオリゴヌクレオチド導入固相
とオリゴヌクレオチド−抗ＴＤＨＦａｂ′複合体による
ＴＤＨ（耐熱性溶血毒素）の検出曲線を示す。

【図１０】比較例１のゴシュらの方法により得られたオ
リゴヌクレオチド−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体
の各溶出フラクションの吸光度および蛍光強度を示す。

【図１１】図１０の溶出フラクション番号３３から４５
まで収集した画分のゲルクロマトグラフィーにおける流
出経過時間に対する各成分の流出量（％）のパターンを
示す。

【図１２】実施例７におけるオリゴヌクレオチド−抗コ
レラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体の各溶出フラクションの
吸光度および蛍光強度を示す。

【図１３】図１２の溶出フラクション番号３２から４７
まで収集した画分のゲルクロマトグラフィーによる流出
経過時間に対する各成分の流出量（％）のパターンを示
す。

【図１４】比較例１および実施例７の各オリゴヌクレオ
チド−抗コレラ毒素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体の種々のコレ
ラ毒素濃度に対する４５０ｎｍにおける吸光度の測定値
を示す。

【図１５】比較例１のオリゴヌクレオチド−抗コレラ毒
素Ｆ（ａｂ′）₂ 複合体および実施例２のオリゴヌクレ
オチド−抗コレラ毒素Ｆａｂ′複合体の、種々のコレラ
毒素濃度に対する４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を
示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸に次の一般式で表される化合物 【化１】 〔式中、_n1、_n2および_n3はそれぞれ独立した０から１５
   のあいだの整数を、Ｒ₁およびＲ₂ はそれぞれ化学結合
   または６員環状炭化水素残基を表す。〕を反応させるこ
   とにより、次の一般式で示される化合物 【化２】 〔式中、Ｂは核酸をＢ−ＮＨ₂ で表したときのその残基
   を表し、_n1、_n2および_n3はそれぞれ独立した０から１５
   のあいだの整数を、Ｒ₁ およびＲ₂ はそれぞれ化学結合
   または６員環状炭化水素残基を表す。〕を得、 次いでこの化合物を免疫化学的活性物質と反応させるこ
   とにより、次の一般式で表される化合物 【化３】 〔式中、Ａは免疫化学的活性物質をＡ−ＳＨで表したと
   きのその残基を表し、Ｂ、_n1、_n2、_n3、Ｒ₁ およびＲ₂
   はそれぞれ化学結合または６員環状炭化水素残基を表
   す。〕を得ることを特徴とする核酸と免疫化学的活性物
   質との複合体の製造方法。
2. 【請求項２】 前記核酸が、ポリリボヌクレオチド、ポ
   リデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチ
   ド、オリゴデオキシリボヌクレオチドあるいはこれら２
   種以上の複合体から選ばれたものである請求項１記載の
   核酸と免疫化学的活性物質との複合体の製造方法。
3. 【請求項３】 前記免疫化学的活性物質が抗体である請
   求項１または２記載の核酸と免疫化学的活性物質との複
   合体の製造方法。
4. 【請求項４】 前記免疫化学的活性物質が抗原である請
   求項１、２または３記載の核酸と免疫化学的活性物質と
   の複合体の製造方法。
5. 【請求項５】 前記抗体がＩｇＧまたはその消化物であ
   る請求項４記載の核酸と免疫化学的活性物質との複合体
   の製造方法。
6. 【請求項６】 前記ＩｇＧの消化物がＦａｂ′である請
   求項５記載の核酸と免疫化学的活性物質との複合体の製
   造方法。
7. 【請求項７】 前記核酸に含有されるアミノ基（ＮＨ₂
   −）が、核酸の３′末端または５′末端のもの、あるい
   は核酸の分子中に導入されたものである請求項１、２、
   ３、４、５または６記載の核酸と免疫化学的活性物質と
   の複合体の製造方法。
8. 【請求項８】 請求項１、２、３、４、５、６または７
   記載の核酸と免疫化学的活性物質との複合体の製造方法
   により得られ、次の一般式で表される免疫化学的分析に
   使用されることを特徴とする核酸と免疫化学的活性物質
   との複合体。 【化４】
9. 【請求項９】 請求項１、２、３、４、５、６または７
   記載の核酸と免疫化学的活性物質との複合体の製造方法
   により得られ、次の一般式で表される核酸と免疫化学的
   活性物質との複合体を含んだことを特徴とする免疫化学
   的測定試薬。 【化５】