JP2746484B2 - 少なくとも二つの結合成分に対する結合部位を有する測定物質の検出 - Google Patents
少なくとも二つの結合成分に対する結合部位を有する測定物質の検出Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素免疫測定、そして特
には標識酵素としてβ−ガラクトシダーゼを利用した免
疫測定に関する。
には標識酵素としてβ−ガラクトシダーゼを利用した免
疫測定に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素免疫測定は満足しうるタイプのホモ
ジニアス免疫測定である。このような測定の多数は互い
に補完し合い、そして活性化酵素を形成するβ−ガラク
トシダーゼの断片の性能に基づいている。特に、β−ガ
ラクトシダーゼ酵素供与体（ＥＤ）は、β−ガラクトシ
ダーゼ酵素レセプター（ＥＡ）と結合して活性化β−ガ
ラクトシダーゼ酵素を形成する。ＥＤのある部位におけ
る小さな測定物質または測定物質の類似物の複合は、Ｅ
ＤのＥＡに対する相補的反応またはβ−ガラクトシダー
ゼ触媒活性の速さに影響を及ぼさない。しかしながら、
ＥＤ−測定物質複合体に抗−測定物質抗体が結合する
と、反応初期の間の相補的反応及び酵素触媒活性速度は
低下する。この酵素触媒反応速度の低下は、アッセイ媒
体中に存在するＥＤ−測定物質複合体及びサンプル中に
存在する測定物質の両者が、ＥＡ添加前において抗−測
定物質抗体に対して競合する状態において、測定物質の
定量に利用されている。このβ−ガラクトシダーゼ触媒
反応速度は、サンプル中に存在する測定物質の量が増大
するに従って増大し、なぜならより多くのサンプル中の
測定物質は、ＥＤ−測定物質複合体と抗−測定物質抗体
の相互作用を低下させ、活性化β−ガラクトシダーゼ酵
素を形成させるためのより多くのＥＤ−測定物質複合体
のＥＡへの反応を可能にするからである。
ジニアス免疫測定である。このような測定の多数は互い
に補完し合い、そして活性化酵素を形成するβ−ガラク
トシダーゼの断片の性能に基づいている。特に、β−ガ
ラクトシダーゼ酵素供与体（ＥＤ）は、β−ガラクトシ
ダーゼ酵素レセプター（ＥＡ）と結合して活性化β−ガ
ラクトシダーゼ酵素を形成する。ＥＤのある部位におけ
る小さな測定物質または測定物質の類似物の複合は、Ｅ
ＤのＥＡに対する相補的反応またはβ−ガラクトシダー
ゼ触媒活性の速さに影響を及ぼさない。しかしながら、
ＥＤ−測定物質複合体に抗−測定物質抗体が結合する
と、反応初期の間の相補的反応及び酵素触媒活性速度は
低下する。この酵素触媒反応速度の低下は、アッセイ媒
体中に存在するＥＤ−測定物質複合体及びサンプル中に
存在する測定物質の両者が、ＥＡ添加前において抗−測
定物質抗体に対して競合する状態において、測定物質の
定量に利用されている。このβ−ガラクトシダーゼ触媒
反応速度は、サンプル中に存在する測定物質の量が増大
するに従って増大し、なぜならより多くのサンプル中の
測定物質は、ＥＤ−測定物質複合体と抗−測定物質抗体
の相互作用を低下させ、活性化β−ガラクトシダーゼ酵
素を形成させるためのより多くのＥＤ−測定物質複合体
のＥＡへの反応を可能にするからである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この技術は一般に低分
子量測定物質に限られていた。本発明は高分子量測定物
質の測定が可能な方法を提供する。
子量測定物質に限られていた。本発明は高分子量測定物
質の測定が可能な方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための具体的手段】修飾されたβ−ガ
ラクトシダーゼの酵素供与体及び酵素受容体は化学合成
及び組換ＤＮＡ工学により調製される。この修飾断片は
相補性反応の後にβ−ガラクトシダーゼ活性を保持して
いる。例えば、米国特許No. 4,708,929 及び3,378,428
並びにその中に引用している文献を見ていただきたい。
β−ガラクトシダーゼより誘導された変異ポリペプチド
が Langley及びZabin,Bio.Chem.(1976) 15:4866 により
開示されており、この物質は適当なβ−ガラクトシダー
ゼ陰性変異物の抽出物に加えられたとき、相補するかま
たは酵素活性を自発的に復帰させることができる。さら
にLin et al., Bio Chem. Biophys. Res. Comm.(1970)
40:249を参照のこと。
ラクトシダーゼの酵素供与体及び酵素受容体は化学合成
及び組換ＤＮＡ工学により調製される。この修飾断片は
相補性反応の後にβ−ガラクトシダーゼ活性を保持して
いる。例えば、米国特許No. 4,708,929 及び3,378,428
並びにその中に引用している文献を見ていただきたい。
β−ガラクトシダーゼより誘導された変異ポリペプチド
が Langley及びZabin,Bio.Chem.(1976) 15:4866 により
開示されており、この物質は適当なβ−ガラクトシダー
ゼ陰性変異物の抽出物に加えられたとき、相補するかま
たは酵素活性を自発的に復帰させることができる。さら
にLin et al., Bio Chem. Biophys. Res. Comm.(1970)
40:249を参照のこと。
【０００５】本発明の目的は、検出のための方法及び試
薬を提供すること、並びに測定物質、特に高分子量測定
物質であって少なくとも二つの結合成分に対する結合部
位を有するものの定量分析を提供することである。
薬を提供すること、並びに測定物質、特に高分子量測定
物質であって少なくとも二つの結合成分に対する結合部
位を有するものの定量分析を提供することである。
【０００６】本発明は、このような方法及び試薬を修飾
β−ガラクトシダーゼ酵素供与体及び酵素受容体を利用
することによって提供する。特に、少なくとも二つの結
合成分に対する結合部位を有するサンプル中の測定物質
の存在またはその定量は、β−ガラクトシダーゼの相補
的な断片を用いることにより検出される。ここで断片は
酵素供与体（ＥＤ）及び酵素受容体（ＥＡ）として定義
され、そして結合したとき、即ち一緒となったとき活性
化β−ガラクトシダーゼを形成し、ここでＥＤ及びＥＡ
は、別々のＥＤ複合体及びＥＡ複合体を形成するため、
それぞれは連結要素及び測定物質上の結合部位に対して
特異的な結合成分と結合することで修飾される。該ＥＤ
複合体及びＥＡ複合体は測定物質が存在しないときにお
いては活性酵素を形成することはできない。しかしなが
ら、測定物が存在するとき、サンプル中の共通の測定物
質に結合するＥＤ複合体及びＥＡ複合体は一緒となって
活性化β−ガラクトシダーゼ酵素を形成する。
β−ガラクトシダーゼ酵素供与体及び酵素受容体を利用
することによって提供する。特に、少なくとも二つの結
合成分に対する結合部位を有するサンプル中の測定物質
の存在またはその定量は、β−ガラクトシダーゼの相補
的な断片を用いることにより検出される。ここで断片は
酵素供与体（ＥＤ）及び酵素受容体（ＥＡ）として定義
され、そして結合したとき、即ち一緒となったとき活性
化β−ガラクトシダーゼを形成し、ここでＥＤ及びＥＡ
は、別々のＥＤ複合体及びＥＡ複合体を形成するため、
それぞれは連結要素及び測定物質上の結合部位に対して
特異的な結合成分と結合することで修飾される。該ＥＤ
複合体及びＥＡ複合体は測定物質が存在しないときにお
いては活性酵素を形成することはできない。しかしなが
ら、測定物が存在するとき、サンプル中の共通の測定物
質に結合するＥＤ複合体及びＥＡ複合体は一緒となって
活性化β−ガラクトシダーゼ酵素を形成する。
【０００７】この結果もたらされた酵素活性は種々のよ
く知られた方法、例えばβ−ガラクトシダーゼによる反
応に基づいて測定可能な生成物を提供する酵素基質の利
用によって検出または測定されることができる。サンプ
ル中に存在する測定物質の量は、それ故、既知の量の測
定物質から形成される測定可能な生成物の量と比較する
ことで測定することができる。
く知られた方法、例えばβ−ガラクトシダーゼによる反
応に基づいて測定可能な生成物を提供する酵素基質の利
用によって検出または測定されることができる。サンプ
ル中に存在する測定物質の量は、それ故、既知の量の測
定物質から形成される測定可能な生成物の量と比較する
ことで測定することができる。
【０００８】本発明はサンプル中の測定物質の量を検出
しそして定量する方法及び試薬を包含する。特に本発明
は、β−ガラクトシダーゼの相補的な断片であって、そ
れらの断片が酵素供与体（ＥＤ）及び酵素受容体（Ｅ
Ａ）として定義され、そして結合したときに活性β−ガ
ラクトシダーゼを形成するものを用いて少なくとも二つ
の結合成分に対する結合部位を有するサンプル中の測定
物質の存在を検出する方法を提供し、そしてこの本方法
は以下の段階： （ａ）連結要素を介して第一の結合成分と連結されたＥ
Ｄを含んで成るＥＤ複合体及び連結要素を介して第二の
結合成分と連結されたＥＡを含んで成るＥＡ複合体を用
意することであって、ここで第一及び第二の結合成分は
測定物質上の結合部位に対して特異的であり、そしてＥ
Ｄ複合体及びＥＡ複合体は該測定物質が存在しないとき
は活性酵素を形成することできない、（ｂ）該ＥＤ複合
体及びＥＡ複合体を該サンプルに接触させること、
（ｃ）該サンプル中の該測定物質の存在を活性酵素の形
成に関連づけること、を含んで成る。
しそして定量する方法及び試薬を包含する。特に本発明
は、β−ガラクトシダーゼの相補的な断片であって、そ
れらの断片が酵素供与体（ＥＤ）及び酵素受容体（Ｅ
Ａ）として定義され、そして結合したときに活性β−ガ
ラクトシダーゼを形成するものを用いて少なくとも二つ
の結合成分に対する結合部位を有するサンプル中の測定
物質の存在を検出する方法を提供し、そしてこの本方法
は以下の段階： （ａ）連結要素を介して第一の結合成分と連結されたＥ
Ｄを含んで成るＥＤ複合体及び連結要素を介して第二の
結合成分と連結されたＥＡを含んで成るＥＡ複合体を用
意することであって、ここで第一及び第二の結合成分は
測定物質上の結合部位に対して特異的であり、そしてＥ
Ｄ複合体及びＥＡ複合体は該測定物質が存在しないとき
は活性酵素を形成することできない、（ｂ）該ＥＤ複合
体及びＥＡ複合体を該サンプルに接触させること、
（ｃ）該サンプル中の該測定物質の存在を活性酵素の形
成に関連づけること、を含んで成る。
【０００９】本発明の方法は前記ＥＤ複合体、ＥＡ複合
体及びサンプルが酵素基質と接触することをさらに考慮
しており、該基質はβ−ガラクトシダーゼとの反応によ
って測定可能な生成物を提供し、これにより既知量の測
定物の存在において形成される測定可能な生成物の量と
比較することで該サンプル中の測定物質の量を測定する
ことができる。本発明はまた、本発明の方法の実施にお
いて有用なキットに関する。
体及びサンプルが酵素基質と接触することをさらに考慮
しており、該基質はβ−ガラクトシダーゼとの反応によ
って測定可能な生成物を提供し、これにより既知量の測
定物の存在において形成される測定可能な生成物の量と
比較することで該サンプル中の測定物質の量を測定する
ことができる。本発明はまた、本発明の方法の実施にお
いて有用なキットに関する。
【００１０】本発明は少なくともある程度は以下の原
理、即ち、ＥＤ／連結要素／結合成分複合体及びＥＡ／
連結要素／結合成分複合体は、それぞれがそれぞれの結
合成分を通じて共通の測定物質と結合したときにのみ活
性酵素を形成するという原理に基づいていると断言す
る。測定物質の量はそれ故酵素活性に直接比例するもの
であり、それは任意の適当な手段、例えば酵素基質の利
用を通じて測定できる。測定物質不存在においてＥＤ複
合体がＥＡ受容体を相補できないことは、従来の多数の
詳述されたＥＤ複合体及びＥＡ複合体を利用したアッセ
イに見られるβ−ガラクトシダーゼ相補現象とは顕著に
異なる。例えば、米国特許 4,708,929に詳述されている
アッセイにおいて、測定物質と複合したＥＤは、アッセ
イ混合物中に抗−測定物質抗体が加えられたときのみＥ
Ａを相補する。この違いは、異なった原理により行われ
るアッセイにおいてＥＤ及びＥＡ成分と接触する測定物
質のサイズに比べ、大きめのサイズである結合成分及び
／または連結成分がもたらしたものであると信じられて
いる。
理、即ち、ＥＤ／連結要素／結合成分複合体及びＥＡ／
連結要素／結合成分複合体は、それぞれがそれぞれの結
合成分を通じて共通の測定物質と結合したときにのみ活
性酵素を形成するという原理に基づいていると断言す
る。測定物質の量はそれ故酵素活性に直接比例するもの
であり、それは任意の適当な手段、例えば酵素基質の利
用を通じて測定できる。測定物質不存在においてＥＤ複
合体がＥＡ受容体を相補できないことは、従来の多数の
詳述されたＥＤ複合体及びＥＡ複合体を利用したアッセ
イに見られるβ−ガラクトシダーゼ相補現象とは顕著に
異なる。例えば、米国特許 4,708,929に詳述されている
アッセイにおいて、測定物質と複合したＥＤは、アッセ
イ混合物中に抗−測定物質抗体が加えられたときのみＥ
Ａを相補する。この違いは、異なった原理により行われ
るアッセイにおいてＥＤ及びＥＡ成分と接触する測定物
質のサイズに比べ、大きめのサイズである結合成分及び
／または連結成分がもたらしたものであると信じられて
いる。
【００１１】前記のＥＤ及びＥＡ成分はβ−ガラクトシ
ダーゼの部分配列である。本発明の目的のために、β−
ガラクトシダーゼのＮ末端部分を酵素供与体（ＥＤ）と
称し、そしてＣ−側の部分を酵素受容体（ＥＡ）と称す
る。該酵素受容体及び酵素供与体は一緒となって活性酵
素複合体を形成することによって特徴づけられる。β−
ガラクトシダーゼ酵素供与体及び受容体の調製は米国特
許No.4,708,929にて詳述され、引用により本明細書に組
み入れられる。
ダーゼの部分配列である。本発明の目的のために、β−
ガラクトシダーゼのＮ末端部分を酵素供与体（ＥＤ）と
称し、そしてＣ−側の部分を酵素受容体（ＥＡ）と称す
る。該酵素受容体及び酵素供与体は一緒となって活性酵
素複合体を形成することによって特徴づけられる。β−
ガラクトシダーゼ酵素供与体及び受容体の調製は米国特
許No.4,708,929にて詳述され、引用により本明細書に組
み入れられる。
【００１２】前記ＥＤ及びＥＡ複合体の連結要素は同一
または異なるものとなることができ、結合成分との組合
わせにおいて共通の測定物質と結合したとき以外にＥＡ
及びＥＤ複合が活性酵素を形成することを防ぐ任意の材
料を含んで成ることができる。連結要素は、好ましくは
約0.01μから約0.１μの粒径、最も好ましくは約0.05μ
から約0.08μの平均粒径を有するビーズの粒子を含んで
成るであろう。該連結要素のための適切な連結材料は有
機ポリマーであって天然及び合成の両者、例えば多糖
類、スチレンポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリ
ルアミド、ヒドロキシエチルポリメタクリレート、ガラ
ス、セラミック、カーボン、ポリビニルクロライド、タ
ンパク質等を含む。スチレンポリマーにはポリスチレ
ン、芳香族成分並びに高級芳香族化合物、例えばナフタ
レン、アントラセン、その他を含むポリマーが含まれ
る。ＥＤ及びＥＡ複合体の連結要素は好ましく同一であ
り、そしてラテックス成分より成る。
または異なるものとなることができ、結合成分との組合
わせにおいて共通の測定物質と結合したとき以外にＥＡ
及びＥＤ複合が活性酵素を形成することを防ぐ任意の材
料を含んで成ることができる。連結要素は、好ましくは
約0.01μから約0.１μの粒径、最も好ましくは約0.05μ
から約0.08μの平均粒径を有するビーズの粒子を含んで
成るであろう。該連結要素のための適切な連結材料は有
機ポリマーであって天然及び合成の両者、例えば多糖
類、スチレンポリマー、ポリアクリレート、ポリアクリ
ルアミド、ヒドロキシエチルポリメタクリレート、ガラ
ス、セラミック、カーボン、ポリビニルクロライド、タ
ンパク質等を含む。スチレンポリマーにはポリスチレ
ン、芳香族成分並びに高級芳香族化合物、例えばナフタ
レン、アントラセン、その他を含むポリマーが含まれ
る。ＥＤ及びＥＡ複合体の連結要素は好ましく同一であ
り、そしてラテックス成分より成る。
【００１３】他方、二価の有機連結基をＥＤ及びＥＡ成
分が結合成分と接するのに用いることができる。タンパ
ク質化学においてよく知られたこのような基の例には、
ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド及びジアミ
ン、例えば１，６−ジアミノヘキサンが含まれる。この
ような二価有機連結基は、結合成分が十分に大きく、大
きな連結成分の存在を必要とせずに相補を防ぐことがで
きる場合に好ましく用いられる。
分が結合成分と接するのに用いることができる。タンパ
ク質化学においてよく知られたこのような基の例には、
ジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド及びジアミ
ン、例えば１，６−ジアミノヘキサンが含まれる。この
ような二価有機連結基は、結合成分が十分に大きく、大
きな連結成分の存在を必要とせずに相補を防ぐことがで
きる場合に好ましく用いられる。
【００１４】種々の連結要素は官能性または非官能性で
あることができ、好ましくは結合成分との共有結合のた
め官能性である。連結成分がポリマー材料の場合、ポリ
マー表面の活性化並びにイムノグロブリン、糖タンパク
質、多糖含有有機分子及びポリヌクレオチドとの接触の
ための種々の方法が当業界において知られている。米国
特許No.4,419,444； 4,775,619； 3,956,219；及び3,86
0,486 並びにヨーロッパ特許出願No.84308143.1 及び S
couten, W.H.(ed.) Solid Phase Biochemistry, Analyt
ical and Synthethic Aspects (1983), Wiley ＆Sons,
Newyork, P779.を参照のこと。
あることができ、好ましくは結合成分との共有結合のた
め官能性である。連結成分がポリマー材料の場合、ポリ
マー表面の活性化並びにイムノグロブリン、糖タンパク
質、多糖含有有機分子及びポリヌクレオチドとの接触の
ための種々の方法が当業界において知られている。米国
特許No.4,419,444； 4,775,619； 3,956,219；及び3,86
0,486 並びにヨーロッパ特許出願No.84308143.1 及び S
couten, W.H.(ed.) Solid Phase Biochemistry, Analyt
ical and Synthethic Aspects (1983), Wiley ＆Sons,
Newyork, P779.を参照のこと。
【００１５】前記結合成分は特定の問題となる測定物質
と結合可能な成分である。該結合成分と測定物質との間
の結合は好ましくは非共有結合である。適当な結合成分
は好ましくは該測定物質に対して、分析のためのサンプ
ル中のその他の成分よりも高親和性、且つ特異性を有す
る。適当な結合成分は抗体、特に、そして好ましくは測
定物質のある部分に特異的なモノクローナル抗体；測定
物質に自然に結合する結合タンパク質、例えば炭水化物
部分を含んで成る測定物に対するレクチン；及び測定物
質が相補性のリガンドを含んで成る場合のリガンドリセ
プター、等を含む多彩な分子のカテゴリーであることが
できる。
と結合可能な成分である。該結合成分と測定物質との間
の結合は好ましくは非共有結合である。適当な結合成分
は好ましくは該測定物質に対して、分析のためのサンプ
ル中のその他の成分よりも高親和性、且つ特異性を有す
る。適当な結合成分は抗体、特に、そして好ましくは測
定物質のある部分に特異的なモノクローナル抗体；測定
物質に自然に結合する結合タンパク質、例えば炭水化物
部分を含んで成る測定物に対するレクチン；及び測定物
質が相補性のリガンドを含んで成る場合のリガンドリセ
プター、等を含む多彩な分子のカテゴリーであることが
できる。
【００１６】ＥＤ複合体の結合成分及びＥＡ複合体の結
合成分は同一または異なるカテゴリーのものであること
ができる；例えば、両者の結合成分は抗体であることが
でき、またはＥＡ複合体の結合成分が抗体であることが
できそしてＥＤ複合体の結合成分がレクチンであること
ができる。
合成分は同一または異なるカテゴリーのものであること
ができる；例えば、両者の結合成分は抗体であることが
でき、またはＥＡ複合体の結合成分が抗体であることが
できそしてＥＤ複合体の結合成分がレクチンであること
ができる。
【００１７】測定物質が核酸の場合、結合成分はSSDNA,
RNAまたは任意のその他の天然もしくは合成単鎖核酸で
あることができる。他方、結合成分は特定のヌクレオチ
ド配列を認識する非核酸分子、例えば測定物質に対する
抗体または特異的ＤＮＡ結合タンパク質であることがで
きる。
RNAまたは任意のその他の天然もしくは合成単鎖核酸で
あることができる。他方、結合成分は特定のヌクレオチ
ド配列を認識する非核酸分子、例えば測定物質に対する
抗体または特異的ＤＮＡ結合タンパク質であることがで
きる。
【００１８】本発明に利用する抗体またはモノクローナ
ル抗体の製造方法は学問上知られている。米国特許No.
4,574,116 及びその中で引用されている文献であって、
引用により本明細書中に組み入れているものを参照のこ
と。他方、モノクローナル抗体または結合断片は商業的
に購入することができる。
ル抗体の製造方法は学問上知られている。米国特許No.
4,574,116 及びその中で引用されている文献であって、
引用により本明細書中に組み入れているものを参照のこ
と。他方、モノクローナル抗体または結合断片は商業的
に購入することができる。
【００１９】結合成分が核酸分子の場合、該成分は通常
少なくとも８個の核酸、さらに通常は10個の核酸、そし
て好ましくは少なくともおよそ12個の核酸を含んで成
る。この結合成分のサイズは、測定物質の性質、サンプ
ル中の測定物質の量及び測定方法において利用した条件
によって異なる。結合成分において利用される核酸配列
は天然物からの単離、合成物またはその他の当業界に知
られている手段により提供され得る。
少なくとも８個の核酸、さらに通常は10個の核酸、そし
て好ましくは少なくともおよそ12個の核酸を含んで成
る。この結合成分のサイズは、測定物質の性質、サンプ
ル中の測定物質の量及び測定方法において利用した条件
によって異なる。結合成分において利用される核酸配列
は天然物からの単離、合成物またはその他の当業界に知
られている手段により提供され得る。
【００２０】本発明は、結合成分のＥＤ複合体またはＥ
Ａ複合体のいずれかと標的測定物質との間の単結合相互
作用から起こる特異性よりも高い特異性のアッセイを提
供する。このような測定物質に対して比較的特異性の低
い結合成分を、ＥＤ及びＥＡが相補して提供する特異性
の高いアッセイに用いることができる。本発明の高い特
異性が得られるのは、β−ガラクトシダーゼ活性の提供
が二つの独立した結合作用の発生に依存するからであ
る。特異的結合相互作用はＥＤ及びＥＡが互いを相補し
合うために、測定物質と両方の結合成分との間で起こら
なければならない。
Ａ複合体のいずれかと標的測定物質との間の単結合相互
作用から起こる特異性よりも高い特異性のアッセイを提
供する。このような測定物質に対して比較的特異性の低
い結合成分を、ＥＤ及びＥＡが相補して提供する特異性
の高いアッセイに用いることができる。本発明の高い特
異性が得られるのは、β−ガラクトシダーゼ活性の提供
が二つの独立した結合作用の発生に依存するからであ
る。特異的結合相互作用はＥＤ及びＥＡが互いを相補し
合うために、測定物質と両方の結合成分との間で起こら
なければならない。
【００２１】本発明のアッセイ方法はＥＤ複合体及びＥ
Ａ複合体の結合成分に同時に結合可能な任意の測定物質
の検出に利用することができる。一般に、測定物質はポ
リペプチド、タンパク質、多糖、核酸またはそれらの組
み合わせであることができるであろう。
Ａ複合体の結合成分に同時に結合可能な任意の測定物質
の検出に利用することができる。一般に、測定物質はポ
リペプチド、タンパク質、多糖、核酸またはそれらの組
み合わせであることができるであろう。
【００２２】本発明に従って検出または定量される測定
物質の大部分は好ましくは少なくとも 5,000、さらに通
常は少なくとも10,000の分子量を有するであろう。問題
となるポリペプチドは一般に約5,000 から約5,000,000
の分子量、さらに通常は約10,000から1,000,000 の分子
量であるであろう。測定物質が核酸分子である場合、該
分子は一般に約12個の核酸から約２×106 個の核酸の範
囲であろう。核酸サンプルは染色体または染色体外のＤ
ＮＡを含むことができ、例えばプラスミド、ウイルス、
合成物等；またはメッセンジャーＲＮＡ、トランスファ
ーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ウイルス等のようなＲＮ
Ａが挙げられる。核酸配列は翻訳領域上の構造遺伝子、
調節領域、イントロン、エキソン等を含むことができ
る。本発明により検出または定量される測定物質は約5,
000 より小さい分子量を有することもできる。分子量が
5,000 より小さい適当な測定物質の例には低分子ポリヌ
クレオチド、低分子ポリペプチドホルモン、ステロイド
ホルモン、コレステロール、薬剤及び毒素が含まれる。
しかしながら、このような小分子量測定物質は本明細書
で説明している二つの別々の結合成分に結合することが
可能でなくてはならない。
物質の大部分は好ましくは少なくとも 5,000、さらに通
常は少なくとも10,000の分子量を有するであろう。問題
となるポリペプチドは一般に約5,000 から約5,000,000
の分子量、さらに通常は約10,000から1,000,000 の分子
量であるであろう。測定物質が核酸分子である場合、該
分子は一般に約12個の核酸から約２×106 個の核酸の範
囲であろう。核酸サンプルは染色体または染色体外のＤ
ＮＡを含むことができ、例えばプラスミド、ウイルス、
合成物等；またはメッセンジャーＲＮＡ、トランスファ
ーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ウイルス等のようなＲＮ
Ａが挙げられる。核酸配列は翻訳領域上の構造遺伝子、
調節領域、イントロン、エキソン等を含むことができ
る。本発明により検出または定量される測定物質は約5,
000 より小さい分子量を有することもできる。分子量が
5,000 より小さい適当な測定物質の例には低分子ポリヌ
クレオチド、低分子ポリペプチドホルモン、ステロイド
ホルモン、コレステロール、薬剤及び毒素が含まれる。
しかしながら、このような小分子量測定物質は本明細書
で説明している二つの別々の結合成分に結合することが
可能でなくてはならない。
【００２３】アッセイの方法は広い範囲にわたって変更
することが可能であり、それは利用したシステム、例え
ばアッセイの感度、アッセイが行われるスピード、測定
物質の性質等に依存する。ＥＡ及びＥＤ複合体並びにサ
ンプルは結合を可能とする厳密な適切な条件のもとで混
合される。これらの試薬は同時または順々に添加されて
混合することができる。順に添加した場合、サンプル、
ＥＤ複合体、ＥＡ複合体及び緩衝液の混合物を好ましく
は約５から25分間、通常約15分間、酵素基質の添加の前
にインキュベートする。
することが可能であり、それは利用したシステム、例え
ばアッセイの感度、アッセイが行われるスピード、測定
物質の性質等に依存する。ＥＡ及びＥＤ複合体並びにサ
ンプルは結合を可能とする厳密な適切な条件のもとで混
合される。これらの試薬は同時または順々に添加されて
混合することができる。順に添加した場合、サンプル、
ＥＤ複合体、ＥＡ複合体及び緩衝液の混合物を好ましく
は約５から25分間、通常約15分間、酵素基質の添加の前
にインキュベートする。
【００２４】前記のサンプルを予備調製にかけることが
でき、または予備処理なしで用いることができる。サン
プル中の測定物質が結合成分と結合することが可能な状
態においては、サンプルの予備調製は一般に必要とされ
ない。サンプル中の測定物質が結合成分と直ちに結合す
ることができない状態においては、サンプルの予備調製
が必要とされるであろう。例えば、測定物質が二本鎖の
核酸であり、そして結合成分が相補性の核酸鎖であると
き、該サンプルをＥＤ及びＥＡ複合体と混合する前に二
重鎖の分子を変性させるためのサンプルの処理が必要と
なるであろう。変性は、サンプルを高温度、一般には約
90℃から約 100℃に約３から15分間かけることで最も容
易に達成することができる。変性のためのその他の手段
は例えばサンプルをアルカリ溶液もしくは、ホルムアル
デヒドの濃い溶液で処理すること、または当業界に知ら
れたその他の方法の利用を用いたものであることができ
る。
でき、または予備処理なしで用いることができる。サン
プル中の測定物質が結合成分と結合することが可能な状
態においては、サンプルの予備調製は一般に必要とされ
ない。サンプル中の測定物質が結合成分と直ちに結合す
ることができない状態においては、サンプルの予備調製
が必要とされるであろう。例えば、測定物質が二本鎖の
核酸であり、そして結合成分が相補性の核酸鎖であると
き、該サンプルをＥＤ及びＥＡ複合体と混合する前に二
重鎖の分子を変性させるためのサンプルの処理が必要と
なるであろう。変性は、サンプルを高温度、一般には約
90℃から約 100℃に約３から15分間かけることで最も容
易に達成することができる。変性のためのその他の手段
は例えばサンプルをアルカリ溶液もしくは、ホルムアル
デヒドの濃い溶液で処理すること、または当業界に知ら
れたその他の方法の利用を用いたものであることができ
る。
【００２５】アッセイの溶液は好ましくは常用の緩衝
液、例えばリン酸、トリス等で約６から９の範囲のpHに
緩衝される。適当な緩衝液の選択に重要な事項は、該緩
衝液が酵素反応または結合を阻害しないことである。
液、例えばリン酸、トリス等で約６から９の範囲のpHに
緩衝される。適当な緩衝液の選択に重要な事項は、該緩
衝液が酵素反応または結合を阻害しないことである。
【００２６】本アッセイは目的の反応を阻害しない任意
の適切な温度、一般には約20℃、しかし好ましくは約40
℃以下までの高められた温度で行われることができる。
本アッセイは一般に、そして好ましくは大気圧で行われ
る。
の適切な温度、一般には約20℃、しかし好ましくは約40
℃以下までの高められた温度で行われることができる。
本アッセイは一般に、そして好ましくは大気圧で行われ
る。
【００２７】望ましい反応の完結のために必要な時間は
アッセイの特徴に依存して変わる。例えば結合成分が核
酸の場合において、ハイブリダイゼーションまたは結合
のために必要とされる時間は核酸プローブの濃度及び配
列交叉性並びにアッセイ温度、溶剤及び塩濃度に依存す
る。一般に、ハイブリドの形成を可能とするためハイブ
リダイゼーションは約20℃から約50℃の温度、0.15Ｍの
塩化ナトリウム及び 0.015Ｍのクエン酸ナトリウムで約
30分間から約18時間にわたって行われる。
アッセイの特徴に依存して変わる。例えば結合成分が核
酸の場合において、ハイブリダイゼーションまたは結合
のために必要とされる時間は核酸プローブの濃度及び配
列交叉性並びにアッセイ温度、溶剤及び塩濃度に依存す
る。一般に、ハイブリドの形成を可能とするためハイブ
リダイゼーションは約20℃から約50℃の温度、0.15Ｍの
塩化ナトリウム及び 0.015Ｍのクエン酸ナトリウムで約
30分間から約18時間にわたって行われる。
【００２８】ＤＮＡのハイブリダイゼーションの技術は
多くの文献に開示され、その中にWalker and Gaastra(e
ds.) Techniques in Mdecular Biology(1983) MacMill
an Publishing Company, New York, pp 113-135 and 27
3-283 ； Maniatis etal., (eds) Molecular Cloning
(1982) Cold Spring Harbor Laboratory, pp 309 ； E.
Southern, J.Mol.Biol (1975)98：503 ; Botchan eta
l., Cell (1976) 9：269； Jeffreys etal., Cell(197
7) 12：429 を含む。これらの開示内容は引用により本
明細書中に組み入れている。
多くの文献に開示され、その中にWalker and Gaastra(e
ds.) Techniques in Mdecular Biology(1983) MacMill
an Publishing Company, New York, pp 113-135 and 27
3-283 ； Maniatis etal., (eds) Molecular Cloning
(1982) Cold Spring Harbor Laboratory, pp 309 ； E.
Southern, J.Mol.Biol (1975)98：503 ; Botchan eta
l., Cell (1976) 9：269； Jeffreys etal., Cell(197
7) 12：429 を含む。これらの開示内容は引用により本
明細書中に組み入れている。
【００２９】本発明に関して用いることができるサンプ
ルの量は、その他の要因の中で測定物質の濃度、サンプ
ルの性質及びアッセイの感度等に依存する。
ルの量は、その他の要因の中で測定物質の濃度、サンプ
ルの性質及びアッセイの感度等に依存する。
【００３０】本発明の利用において、活性酵素の量を検
出し、且つ定量するため、そしてその結果をサンプル中
に存在する測定物質の量の検出及び測定値に関連づける
ための任意の適当な手段を用いることができる。酵素基
質は一般に、そして好ましくはこのような目的のために
用いられ、これは基質が活性β−ガラクトシダーゼ酵素
の反応に基づく測定可能な生成物を提供することによ
る。よって、既知量の測定物の存在において形成された
測定可能な生成物の量と比較することでサンプル中の測
定物質の量を決定することができる。
出し、且つ定量するため、そしてその結果をサンプル中
に存在する測定物質の量の検出及び測定値に関連づける
ための任意の適当な手段を用いることができる。酵素基
質は一般に、そして好ましくはこのような目的のために
用いられ、これは基質が活性β−ガラクトシダーゼ酵素
の反応に基づく測定可能な生成物を提供することによ
る。よって、既知量の測定物の存在において形成された
測定可能な生成物の量と比較することでサンプル中の測
定物質の量を決定することができる。
【００３１】典型的に、そして好ましく利用される酵素
基質は活性酵素によって分解されたとき、アッセイ溶液
の光吸収（吸光度）または励起の値の変化のもたらす。
すなわち、基質の分解は、有色生成物または蛍光生成物
の出現または消失をもたらす。好ましい酵素基質にはＯ
−ニトロフェニルガラクトシド(ONPG)及びクロロフェノ
ールレッド−β−ガラクトシダーゼ(CPRG)が含まれる。
ONPG, CPRG及びその他の同様の酵素基質は商業的に入手
できる。ONPGは一般に約0.５から約2.０mg／mlの濃度で
用いられる。その他の基質は、ONPGと同様のシグナルを
提供する濃度で用いられる。
基質は活性酵素によって分解されたとき、アッセイ溶液
の光吸収（吸光度）または励起の値の変化のもたらす。
すなわち、基質の分解は、有色生成物または蛍光生成物
の出現または消失をもたらす。好ましい酵素基質にはＯ
−ニトロフェニルガラクトシド(ONPG)及びクロロフェノ
ールレッド−β−ガラクトシダーゼ(CPRG)が含まれる。
ONPG, CPRG及びその他の同様の酵素基質は商業的に入手
できる。ONPGは一般に約0.５から約2.０mg／mlの濃度で
用いられる。その他の基質は、ONPGと同様のシグナルを
提供する濃度で用いられる。
【００３２】ＥＤ複合体及びＥＡ複合体を酵素基質を有
する適当なアッセイ溶液に混合し、サンプルを逐次添加
したところで、酵素活性のバックグランド測定を提供す
るための最初の測定を実行することができる。大体にお
いてＥＤ複合体及びＥＡ複合体の混合物はゼロ反応を示
すが、しかし相補性によりもたらされる酵素活性の低い
レベルのものは許容される。このバックグランド活性の
本質的な必要条件は、それらを検出限界で存在する測定
物質による酵素活性と区別できるかにある。
する適当なアッセイ溶液に混合し、サンプルを逐次添加
したところで、酵素活性のバックグランド測定を提供す
るための最初の測定を実行することができる。大体にお
いてＥＤ複合体及びＥＡ複合体の混合物はゼロ反応を示
すが、しかし相補性によりもたらされる酵素活性の低い
レベルのものは許容される。このバックグランド活性の
本質的な必要条件は、それらを検出限界で存在する測定
物質による酵素活性と区別できるかにある。
【００３３】サンプルを添加後、１又は複数回のさらな
る測定をインキュベート開始後行うことができ、測定間
隔は約１分から約１時間、通常約５分間から約15分間の
間で変更される。一回の測定を行うことができるが、あ
りふれたエラーを削除できるよう通常１回より多くの測
定を行うのが望ましい。好ましくは、標準液はサンプル
との対比のための標準物質として寄与する既知濃度の測
定物質で調製される。この方法において、正確な定量測
定値を得ることができる。
る測定をインキュベート開始後行うことができ、測定間
隔は約１分から約１時間、通常約５分間から約15分間の
間で変更される。一回の測定を行うことができるが、あ
りふれたエラーを削除できるよう通常１回より多くの測
定を行うのが望ましい。好ましくは、標準液はサンプル
との対比のための標準物質として寄与する既知濃度の測
定物質で調製される。この方法において、正確な定量測
定値を得ることができる。
【００３４】本発明はまた、本発明方法を実施するため
の試薬を含むキットに関する。このキットは少なくとも
一つのコンテナーを含んで成り、β−ガラクトシダーゼ
酵素供与体複合物及び酵素受容体複合物は通常別々のコ
ンテナーに入っている。酵素供与体複合物及び酵素受容
体複合物はさらに酵素基質を含むことができ、または酵
素基質は別に提供されることもできる。あるいは、該キ
ットはＥＤ及びＥＡをそれぞれの結合成分に結合させる
ことなく別々の連結要素に結合させて含むように組み立
てられることができる。特定の結合成分をキットのＥＤ
及びＥＡ連結要素との結合させた後に、目的とする問題
の測定物質を測定することができる。
の試薬を含むキットに関する。このキットは少なくとも
一つのコンテナーを含んで成り、β−ガラクトシダーゼ
酵素供与体複合物及び酵素受容体複合物は通常別々のコ
ンテナーに入っている。酵素供与体複合物及び酵素受容
体複合物はさらに酵素基質を含むことができ、または酵
素基質は別に提供されることもできる。あるいは、該キ
ットはＥＤ及びＥＡをそれぞれの結合成分に結合させる
ことなく別々の連結要素に結合させて含むように組み立
てられることができる。特定の結合成分をキットのＥＤ
及びＥＡ連結要素との結合させた後に、目的とする問題
の測定物質を測定することができる。
【００３５】以下の実施例は実例を示すために提供した
ものであり、本発明を限定するためではない。
ものであり、本発明を限定するためではない。
【００３６】
測定原理 ｈＣＧ（ヒト絨毛膜ゴナドトロピン）測定のために本ア
ッセイの形態は二種類のラテックス調製物を利用した。
一方のラテックス調製物はＥＤ（酵素供与体）及びｈＣ
Ｇのα−サブユニットに対するＭＡｂ（モノクローナル
抗体）と結合したラテックスであり、そして他方のラテ
ックス調製物はＥＡ（酵素受容体）及びｈＣＧのβ−サ
ブユニットに対するＭＡｂ（モノクローナル抗体）と結
合したラテックスである。ラテックス調製物の混合物は
アッセイ系の中に抗原(hCG）が全っく存在しないときは
ゼロの反応またはゼロのアッセイバックグランドを付与
する。アッセイ系中の抗原の種々の濃度により、ＥＤ及
びＥＡは抗原−抗体結合によって一緒になって、活性酵
素を形成し、それ故抗原濃度に比例した酵素活性が示さ
れる。アッセイの検量曲線は種々の抗原濃度の測定吸収
から作成され、そして未知ｈＣＧはこの検量曲線を用い
て測定される。
ッセイの形態は二種類のラテックス調製物を利用した。
一方のラテックス調製物はＥＤ（酵素供与体）及びｈＣ
Ｇのα−サブユニットに対するＭＡｂ（モノクローナル
抗体）と結合したラテックスであり、そして他方のラテ
ックス調製物はＥＡ（酵素受容体）及びｈＣＧのβ−サ
ブユニットに対するＭＡｂ（モノクローナル抗体）と結
合したラテックスである。ラテックス調製物の混合物は
アッセイ系の中に抗原(hCG）が全っく存在しないときは
ゼロの反応またはゼロのアッセイバックグランドを付与
する。アッセイ系中の抗原の種々の濃度により、ＥＤ及
びＥＡは抗原−抗体結合によって一緒になって、活性酵
素を形成し、それ故抗原濃度に比例した酵素活性が示さ
れる。アッセイの検量曲線は種々の抗原濃度の測定吸収
から作成され、そして未知ｈＣＧはこの検量曲線を用い
て測定される。
【００３７】材料 固形成分15％の溶液のカルボキシル−改質ラテックス
（粒径70nm）をPolymerLaboratories, Ltd., Essez Roa
d, Church Stretton, U.K. より購入した。ヒト絨毛ゴ
ナドトロピンをSigma Chemical Companyより入手した。
EDAC（１−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピ
ル〕カルボジイミド）及びスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロ
キシスルホスクシニミド）をPierce Chemical Company
より購入した。ｈＣＧのα及びβ−サブユニットに対す
るモノクローナル抗体はMedix Biochemica, Helsincei,
Finlandより購入した。CPRG（クロロフェノールレッド
β−ガラクトシダーゼ）はBoehringer Mannhheimより入
手した。酵素供与体及び受容体は、本明細にて参照文献
として引用した明細書である米国特許No. 4,708,209 の
示す通りに調製した。その他の化学物質はSigma Chemic
al Companyより購入した。
（粒径70nm）をPolymerLaboratories, Ltd., Essez Roa
d, Church Stretton, U.K. より購入した。ヒト絨毛ゴ
ナドトロピンをSigma Chemical Companyより入手した。
EDAC（１−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピ
ル〕カルボジイミド）及びスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロ
キシスルホスクシニミド）をPierce Chemical Company
より購入した。ｈＣＧのα及びβ−サブユニットに対す
るモノクローナル抗体はMedix Biochemica, Helsincei,
Finlandより購入した。CPRG（クロロフェノールレッド
β−ガラクトシダーゼ）はBoehringer Mannhheimより入
手した。酵素供与体及び受容体は、本明細にて参照文献
として引用した明細書である米国特許No. 4,708,209 の
示す通りに調製した。その他の化学物質はSigma Chemic
al Companyより購入した。
【００３８】ラテックス複合体の調製 １．ラテックスの活性化 １mlのラテックス溶液をAmicon濃縮装置を用いて、50ml
の0.１Ｍの炭酸ナトリウム、pH9.６で洗浄した。洗浄工
程を１回繰り返した。該ラテックスを次に50mlの0.02Ｍ
のリン酸ナトリウム、pH4.５で２回洗浄した。該ラテッ
クスを２mlの0.02Ｍのリン酸ナトリウム、pH4.５の中に
再懸濁させ、そして同様の緩衝液中の２％のEDACを等量
加えた。この混合物をエンドトゥーエンドミキサー(end
-to-endmixer)の中で、室温で３時間にわたってインキ
ュベートした。等量の３％のスルホ−ＮＨＳをカップリ
ング効率を増大させるために加えることができる。イン
キュベーション後、この活性化ラテックスを50mlの0.２
Ｍのホウ酸緩衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして次に４
mlの同様の緩衝液中にて再懸濁させた。
の0.１Ｍの炭酸ナトリウム、pH9.６で洗浄した。洗浄工
程を１回繰り返した。該ラテックスを次に50mlの0.02Ｍ
のリン酸ナトリウム、pH4.５で２回洗浄した。該ラテッ
クスを２mlの0.02Ｍのリン酸ナトリウム、pH4.５の中に
再懸濁させ、そして同様の緩衝液中の２％のEDACを等量
加えた。この混合物をエンドトゥーエンドミキサー(end
-to-endmixer)の中で、室温で３時間にわたってインキ
ュベートした。等量の３％のスルホ−ＮＨＳをカップリ
ング効率を増大させるために加えることができる。イン
キュベーション後、この活性化ラテックスを50mlの0.２
Ｍのホウ酸緩衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして次に４
mlの同様の緩衝液中にて再懸濁させた。
【００３９】２．ＥＤ及びｈＣＧのα−サブユニットに
対するＭＡｂとのラテックスの結合１mgのＥＤ４及びα
−サブユニットに対するＭＡｂ１mgの混合物を２mlの活
性化ラテックスの中に加えた。この混合物をエンドトゥ
ーエンドミキサー中で４℃にて一夜インキュベートし
た。インキュベート後、このラテックスを50mlの0.２Ｍ
のホウ酸緩衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして次に２ml
の同様の緩衝液中に再懸濁させた。該ラテックス懸濁物
に、溶液１mlあたり50μｌの0.25Ｍのエタノールアミン
を加え、そして該混合物を次に室温で30分間インキュベ
ートした。該ラテックス溶液を50mlの0.２Ｍのホウ酸緩
衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして同様の緩衝液５ml中
に再懸濁させた。２％の牛血清アルブミン（BSA)、２％
のＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テル及び0.２％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）の含む
等量の緩衝液をこのラテックス懸濁物に加え、そして該
混合物を４℃で一夜インキュベートした。該ラテックス
を50mlのホウ酸緩衝液で２回洗浄し、そして使用する
迄、４℃、５mlの保存緩衝液（0.１Ｍのリン酸ナトリウ
ム、pH7.４、0.15ＭのNaCl、１％BSA ５％グリセロール
及び0.１％のアジ化ナトリウム）中に再懸濁させた。
対するＭＡｂとのラテックスの結合１mgのＥＤ４及びα
−サブユニットに対するＭＡｂ１mgの混合物を２mlの活
性化ラテックスの中に加えた。この混合物をエンドトゥ
ーエンドミキサー中で４℃にて一夜インキュベートし
た。インキュベート後、このラテックスを50mlの0.２Ｍ
のホウ酸緩衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして次に２ml
の同様の緩衝液中に再懸濁させた。該ラテックス懸濁物
に、溶液１mlあたり50μｌの0.25Ｍのエタノールアミン
を加え、そして該混合物を次に室温で30分間インキュベ
ートした。該ラテックス溶液を50mlの0.２Ｍのホウ酸緩
衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして同様の緩衝液５ml中
に再懸濁させた。２％の牛血清アルブミン（BSA)、２％
のＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テル及び0.２％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）の含む
等量の緩衝液をこのラテックス懸濁物に加え、そして該
混合物を４℃で一夜インキュベートした。該ラテックス
を50mlのホウ酸緩衝液で２回洗浄し、そして使用する
迄、４℃、５mlの保存緩衝液（0.１Ｍのリン酸ナトリウ
ム、pH7.４、0.15ＭのNaCl、１％BSA ５％グリセロール
及び0.１％のアジ化ナトリウム）中に再懸濁させた。
【００４０】３．ＥＡ及びｈＣＧのβ−サブユニットに
対するＭＡｂとのラテックスの結合0.２Ｍのホウ酸緩衝
液、pH8.５中の５mgのオブムコイド１mlを２mlの活性化
ラテックスに加え、そしてこの混合物を４℃で一夜イン
キュベートした。インキュベート後、ラテックス懸濁物
１mlあたり50μｌの0.25Ｍのエタノールアミンを加え
た。該混合物を室温で30分間インキュベートし、そして
次にAmicon濃縮装置を用いて50mlのリン酸緩衝食塩水(2
0mＭのリン酸ナトリウム、pH7.５及び0.15ＭのNaCl）で
２回洗浄した。該ラテックスを50mlの0.１Ｍの酢酸ナト
リウム緩衝液、pH4.５で洗浄し、最終容量が５mlを保つ
ようにした。等量の0.１Ｍの酢酸ナトリウム、pH4.５中
の0.２Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムを該ラテックス懸濁物
に加えた。該混合物を暗室、室温で20分間インキュベー
トした。インキュベート後、該ラテックスを30mlの0.１
Ｍの酢酸ナトリウム、pH4.５及び30mlの0.１Ｍの酢酸ナ
トリウム、pH6.５で洗浄した。該ラテックスを５mlの0.
１Ｍの酢酸ナトリウム、pH6.５に再懸濁させた。１mgの
ＥＡ及び１mgのｈＣＧのβ−サブユニットに対するＭＡ
ｂを含む溶液１mlを該ラテックス懸濁物に加えた。固形
のソジウムシアノーボロハイドライドを最終濃度が１mg
／mlとなる迄す早く添加し、そして該混合物を４℃で一
夜インキュベートした。該ラテックス懸濁物を50mlの0.
２Ｍのホウ酸緩衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして５ml
の同様の緩衝液に再懸濁させた。２％ＢＳＡ、Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル及び0.
２％のＰＶＰを含む等量のホウ酸緩衝液を該ラテックス
懸濁物に加え、そして該混合物を４℃で一夜、インキュ
ベートした。該ラテックスを30mlのホウ酸緩衝液で洗浄
し、そして使用する迄４℃の保存液（0.１Ｍのリン酸ナ
トリウム、pH7.４及び0.15ＭのNaCl、１％のＢＳＡ、５
％のグリセロール及び0.１％のアジ化ナトリウム）にて
再懸濁させた。
対するＭＡｂとのラテックスの結合0.２Ｍのホウ酸緩衝
液、pH8.５中の５mgのオブムコイド１mlを２mlの活性化
ラテックスに加え、そしてこの混合物を４℃で一夜イン
キュベートした。インキュベート後、ラテックス懸濁物
１mlあたり50μｌの0.25Ｍのエタノールアミンを加え
た。該混合物を室温で30分間インキュベートし、そして
次にAmicon濃縮装置を用いて50mlのリン酸緩衝食塩水(2
0mＭのリン酸ナトリウム、pH7.５及び0.15ＭのNaCl）で
２回洗浄した。該ラテックスを50mlの0.１Ｍの酢酸ナト
リウム緩衝液、pH4.５で洗浄し、最終容量が５mlを保つ
ようにした。等量の0.１Ｍの酢酸ナトリウム、pH4.５中
の0.２Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムを該ラテックス懸濁物
に加えた。該混合物を暗室、室温で20分間インキュベー
トした。インキュベート後、該ラテックスを30mlの0.１
Ｍの酢酸ナトリウム、pH4.５及び30mlの0.１Ｍの酢酸ナ
トリウム、pH6.５で洗浄した。該ラテックスを５mlの0.
１Ｍの酢酸ナトリウム、pH6.５に再懸濁させた。１mgの
ＥＡ及び１mgのｈＣＧのβ−サブユニットに対するＭＡ
ｂを含む溶液１mlを該ラテックス懸濁物に加えた。固形
のソジウムシアノーボロハイドライドを最終濃度が１mg
／mlとなる迄す早く添加し、そして該混合物を４℃で一
夜インキュベートした。該ラテックス懸濁物を50mlの0.
２Ｍのホウ酸緩衝液、pH8.５で２回洗浄し、そして５ml
の同様の緩衝液に再懸濁させた。２％ＢＳＡ、Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル及び0.
２％のＰＶＰを含む等量のホウ酸緩衝液を該ラテックス
懸濁物に加え、そして該混合物を４℃で一夜、インキュ
ベートした。該ラテックスを30mlのホウ酸緩衝液で洗浄
し、そして使用する迄４℃の保存液（0.１Ｍのリン酸ナ
トリウム、pH7.４及び0.15ＭのNaCl、１％のＢＳＡ、５
％のグリセロール及び0.１％のアジ化ナトリウム）にて
再懸濁させた。
【００４１】アッセイ工程 ｈＣＧの測定に二つの方法を用いた。測定前に、両方の
ラテックス調製物を別々に50mlのＥＡ緩衝液で洗浄し、
そして適当な容量で再懸濁させた。ＥＡ緩衝液は 60mＭ
のMOPS緩衝液、pH6.85、200mＭのNaCl、 10mＭのEGTA、
３％のエチレングリコール、0.05％のTween20 、 0.05m
ＭのＤＴＴ、３ mＭの酢酸マグネシウム及び0.１％のア
ジ化ナトリウムを含んだ。
ラテックス調製物を別々に50mlのＥＡ緩衝液で洗浄し、
そして適当な容量で再懸濁させた。ＥＡ緩衝液は 60mＭ
のMOPS緩衝液、pH6.85、200mＭのNaCl、 10mＭのEGTA、
３％のエチレングリコール、0.05％のTween20 、 0.05m
ＭのＤＴＴ、３ mＭの酢酸マグネシウム及び0.１％のア
ジ化ナトリウムを含んだ。
【００４２】１．方法１ 方法１は全ての試薬の同時添加を包含する。各試験管
に、20μｌのヒト血清ベースの標準液（０, 500, 1000
、及び 2000mIU／mlのｈＣＧ）、 120μｌのＥＡ緩衝
液、20μｌのＥＡ／ＭＡｂ／ラテックス（１μｌ等量の
ラテックス）、20μｌのＥＤ／ＭＡｂ／ラテックス（１
μｌ等量のラテックス）及び20μｌのCPRG（ＥＡ緩衝液
中に１mg／ml）を加え、そして該混合物を37℃で15分間
インキュベートした。インキュベート後、該反応混合物
をミクロフューズ（microfuge)にて４℃、10分間遠心し
た。この上清液を除去した。残ったペレットをそれぞれ
100μｌのＥＡ緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロタイ
タープレートのウェルに移し入れた。混合後、各ウェル
の570nm の波長における吸光度をマイクロタイタープレ
ートリーダーを用いて測定した。
に、20μｌのヒト血清ベースの標準液（０, 500, 1000
、及び 2000mIU／mlのｈＣＧ）、 120μｌのＥＡ緩衝
液、20μｌのＥＡ／ＭＡｂ／ラテックス（１μｌ等量の
ラテックス）、20μｌのＥＤ／ＭＡｂ／ラテックス（１
μｌ等量のラテックス）及び20μｌのCPRG（ＥＡ緩衝液
中に１mg／ml）を加え、そして該混合物を37℃で15分間
インキュベートした。インキュベート後、該反応混合物
をミクロフューズ（microfuge)にて４℃、10分間遠心し
た。この上清液を除去した。残ったペレットをそれぞれ
100μｌのＥＡ緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロタイ
タープレートのウェルに移し入れた。混合後、各ウェル
の570nm の波長における吸光度をマイクロタイタープレ
ートリーダーを用いて測定した。
【００４３】方法２は基質の逐次添加を包含する。各試
験管に、ヒト血清ベースの標準液20μｌ（０, 1000, 及
び 5000mIU／mlのｈＣＧ）、10μｌのＥＡ／ＭＡｂ／ラ
テックス（１μｌ等量のラテックス）、10μｌのＥＤ／
ＭＡｂ／ラテックス（１μｌ等量のラテックス）及び 1
00μｌのＥＡ緩衝液を加え、そして37℃で15分間インキ
ュベートした。この反応混合物を次にミクロフューズで
４℃にて６分間遠心した。この上清液を除去した。残っ
たペレットをそれぞれＥＡ緩衝液中のCPRG（１mg／ml）
150μｌに再懸濁し、そしてマイクロタイタープレート
ウェルに移し入れた。室温で60分間のインキュベート
後、各ウェルの570nm の波長における吸光度をマイクロ
タイタープレートリーダーを用いて測定した。
験管に、ヒト血清ベースの標準液20μｌ（０, 1000, 及
び 5000mIU／mlのｈＣＧ）、10μｌのＥＡ／ＭＡｂ／ラ
テックス（１μｌ等量のラテックス）、10μｌのＥＤ／
ＭＡｂ／ラテックス（１μｌ等量のラテックス）及び 1
00μｌのＥＡ緩衝液を加え、そして37℃で15分間インキ
ュベートした。この反応混合物を次にミクロフューズで
４℃にて６分間遠心した。この上清液を除去した。残っ
たペレットをそれぞれＥＡ緩衝液中のCPRG（１mg／ml）
150μｌに再懸濁し、そしてマイクロタイタープレート
ウェルに移し入れた。室温で60分間のインキュベート
後、各ウェルの570nm の波長における吸光度をマイクロ
タイタープレートリーダーを用いて測定した。
【００４４】 結果 方法１（基質の同時添加）を用いたとき、以下の結果が得られた。 ──────────────────────────────── ＜表 １＞ ｈＣＧ(mIU／ml) Ａ（570nm) １ 0.000 0.958 ２ 500.000 1.056 ３ 1000.000 1.337 ４ 2000.000 1.491 この結果よりＨＣＧアッセイの検量曲線を作成すること
ができた。抗原抗体反応により一緒にされた二種のラテ
ックス複合位からの活性酵素形態に寄因する発色の度合
はアッセイ系中のＨＣＧの濃度に比例した。
ができた。抗原抗体反応により一緒にされた二種のラテ
ックス複合位からの活性酵素形態に寄因する発色の度合
はアッセイ系中のＨＣＧの濃度に比例した。
【００４５】 方法２（基質の逐次添加）を用いたとき、以下の結果が得られた。 ──────────────────────────────── ＜表 ２＞ ｈＣＧ(mIU／ml) Ａ（570nm) １ 0.000 0.744 ２ 1000.000 0.833 ３ 5000.000 0.971
【００４６】上記の結果より、この提示した方法は検出
レベルの測定物、特に複合体混合物のための正確な、高
感度な、そして迅速な技術を提供することが明らかであ
る。観察された酵素活性はサンプル中の測定物の量に比
例した。この方法は高分子量測定物の測定であって、従
来知られたアッセイ技術による測定に従っては容易とさ
れていないものに特に適する。
レベルの測定物、特に複合体混合物のための正確な、高
感度な、そして迅速な技術を提供することが明らかであ
る。観察された酵素活性はサンプル中の測定物の量に比
例した。この方法は高分子量測定物の測定であって、従
来知られたアッセイ技術による測定に従っては容易とさ
れていないものに特に適する。
【００４７】上記の発明を実例を示すことである程度詳
しく、そして明確な理解の目的で実施例を詳述してきた
が、当業者にとってはすでに明らかであるが、本発明の
教示するところにかんがみて行われる多少の変更及び改
良は本発明の範囲を逸脱しない。
しく、そして明確な理解の目的で実施例を詳述してきた
が、当業者にとってはすでに明らかであるが、本発明の
教示するところにかんがみて行われる多少の変更及び改
良は本発明の範囲を逸脱しない。
Claims (16)
- 【請求項１】 β−ガラクトシダーゼの相補性の断片を
利用した少なくとも二つの結合成分に対する結合部位を
有するサンプル中の測定物質の存在を検出する方法であ
って、ここでこの断片は、結合し合ったときに活性のβ
−ガラクトシダーゼを形成する酵素供与体（ＥＤ）及び
酵素受容体（ＥＡ）と定義されるものであり、以下の段
階： （ａ）第一の連結要素を介して第一の結合成分と連結さ
れたＥＤを含んで成るＥＤ複合体及び第二の連結要素を
介して第二の結合成分と連結されたＥＡを含んで成るＥ
Ａ複合体を用意すること、ここでこの第一及び第二の結
合成分は前記の測定物質上の結合部位に対して特異的で
あり、そして該ＥＤ複合体及び該ＥＡ複合体は該測定物
質が存在しないときは活性酵素を形成しにくくなってい
る、 （ｂ）前記ＥＤ複合体及びＥＡ複合体を、前記サンプル
と、並びにβ−ガラクトシダーゼとの反応に基づいて測
定可能な生成物を提供する基質と接触させること、そし
て （ｃ）前記サンプル中の前記測定物質の存在を、前記基
質に対する前記活性酵素の作用に基づく測定可能生成物
を検出することにより、前記活性化酵素の形成に関連づ
けること、 を含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記測定物質がポリペプチドである請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記の測定物質が少なくとも 5,000の分
子量を有する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記の測定物質が少なくとも10,000の分
子量を有する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 前記の測定物質がデオキシリボ核酸であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記の測定物質がリボ核酸である請求項
１記載の方法。 - 【請求項７】 前記結合成分がポリクローナル抗体又は
モノクローナル抗体である請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記結合成分が核酸である請求項１記載
の方法。 - 【請求項９】 前記基質がＣＰＲＧである請求項１記載
の方法。 - 【請求項１０】 前記第一及び第二の連結要素がラテッ
クスビーズである請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 β−ガラクトシダーゼの相補性の断片
を利用した少なくとも二つの結合成分に対する結合部位
を有するサンプル中の測定物質の存在を検出するキット
であって、ここでこの断片は酵素供与体（ＥＤ）及び酵
素受容体（ＥＡ）として定義され、そして結合して活性
β−ガラクトシダーゼを形成するものであり、以下のも
の： 連結要素を介して第一の結合成分と連結されたＥＤを含
んで成るＥＤ複合体、並びに連結要素を介して第二の結
合成分と連結されたＥＡを含んで成るＥＡ複合体を含ん
で成り、 ここでこの第一及び第二の結合成分は前記の測定物質上
の結合部位に対して特異的であり、そして該ＥＤ複合体
及びＥＡ複合体は該測定物質が存在しないときは活性酵
素を形成しにくくなっていることを特徴とする、キッ
ト。 - 【請求項１２】 β−ガラクトシダーゼとの反応に基づ
いて測定可能な生成物を提供し、且つ既知の量の測定物
質から形成される測定可能な生成物の量との比較により
前記サンプル中の前記測定物質の量の測定を可能とする
酵素基質をさらに含んで成る、請求項１１に記載のキッ
ト。 - 【請求項１３】 前記の結合成分がポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体である請求項１２に記載のキッ
ト。 - 【請求項１４】 前記の結合成分が核酸である請求項１
２に記載のキット。 - 【請求項１５】 前記基質がＣＰＲＧである請求項１２
記載のキット。 - 【請求項１６】 前記の第一及び第二の連結要素がラテ
ックスビーズである請求項１２に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/537,905 US5223393A (en) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | Detection of analytes having binding sites for at least two binding moieties |
| US537905 | 1990-06-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595799A JPH0595799A (ja) | 1993-04-20 |
| JP2746484B2 true JP2746484B2 (ja) | 1998-05-06 |
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ID=24144597
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| US (1) | US5223393A (ja) |
| EP (1) | EP0461828B1 (ja) |
| JP (1) | JP2746484B2 (ja) |
| DE (1) | DE69116236T2 (ja) |
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| DE4420742A1 (de) * | 1993-10-20 | 1995-04-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetischer Standard für Immunoassays |
| CA2179315A1 (en) * | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Roger S. Cubicciotti | Nucleotide-directed assembly of bimolecular and multimolecular drugs and devices |
| FR2728687A1 (fr) * | 1994-12-21 | 1996-06-28 | Bio Merieux | Procede de dosage d'un haptene selon une technique de competition |
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| US8148110B2 (en) * | 1999-03-15 | 2012-04-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Detection of molecular interactions by β-lactamase reporter fragment complementation |
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| ATE346287T1 (de) | 1999-07-16 | 2006-12-15 | Univ Texas | Verfahren und vorrichtung zur zuführung von proben zu einer chemischen sensormatrix |
| WO2001055704A1 (en) * | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | System for transferring fluid samples through a sensor array |
| WO2002061392A2 (en) * | 2001-01-31 | 2002-08-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method and apparatus for the confinement of materials in a micromachined chemical sensor array |
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| US20060257941A1 (en) * | 2004-02-27 | 2006-11-16 | Mcdevitt John T | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle and membrane sensor elements |
| US20060257991A1 (en) * | 2004-02-27 | 2006-11-16 | Mcdevitt John T | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle-based sensor elements and membrane-based sensor elements |
| US8105849B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements |
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| US4708929A (en) * | 1984-10-29 | 1987-11-24 | Microgenics Corporation | Methods for protein binding enzyme complementation assays |
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