JP2591738B2 - 特異的結合アッセイにおける成分の分離,混合および検出のための方法および装置 - Google Patents
特異的結合アッセイにおける成分の分離,混合および検出のための方法および装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、一般に、自己収容アッセイ容器における特
異的結合アッセイに関し、さらに詳しくは、不均質結合
アッセイにおいて固相に結合した標識付けされた成分を
結合しない標識付けされた成分から分離し、次いで結合
した標識付けされた成分を測定する方法に関する。本発
明は、また、自己収容アッセイ容器(ここでアッセイ容
器はアッセイ混合物、および1または2以上の層中にあ
らかじめ分配されたクッション(cushion)を含有す
る)内で実施される均質または不均質の結合アッセイを
用いて、流体試料内の分析物の存在および/または量を
検出する方法に関する。
異的結合アッセイに関し、さらに詳しくは、不均質結合
アッセイにおいて固相に結合した標識付けされた成分を
結合しない標識付けされた成分から分離し、次いで結合
した標識付けされた成分を測定する方法に関する。本発
明は、また、自己収容アッセイ容器(ここでアッセイ容
器はアッセイ混合物、および1または2以上の層中にあ
らかじめ分配されたクッション(cushion)を含有す
る)内で実施される均質または不均質の結合アッセイを
用いて、流体試料内の分析物の存在および/または量を
検出する方法に関する。
背景技術 特異的結合アッセイは生医学的研究および臨床的診断
の分野において広く応用されており、前記アッセイは生
物学的流体中において普通に直面する種々の物質(分析
物)の存在または量を決定するために用いられる。この
ような物質は蛋白質、薬物、ホルモン、ビタミン、微生
物などを包含する。さらに、特異的結合アッセイは、他
の分野、例えば、食物の処理および環境の品質管理にお
いて、微生物および微生物の毒素の検出に、あるいは有
機廃棄物の検出に利用することができる。
の分野において広く応用されており、前記アッセイは生
物学的流体中において普通に直面する種々の物質(分析
物)の存在または量を決定するために用いられる。この
ような物質は蛋白質、薬物、ホルモン、ビタミン、微生
物などを包含する。さらに、特異的結合アッセイは、他
の分野、例えば、食物の処理および環境の品質管理にお
いて、微生物および微生物の毒素の検出に、あるいは有
機廃棄物の検出に利用することができる。
特異的結合アッセイは、普通、均質アッセイおよび不
均質アッセイに分類される。均質アッセイにおいては、
結合した標識付けされた成分が発するシグナルは結合し
ない標識付けされた成分が発するシグナルと異なる。そ
れゆえ、2つは物理的分離工程を必要としないで区別す
ることができる。しかしながら、均質アッセイにおいて
さえ、試料と供に2以上のアッセイ反応成分を順次に添
加することを必要とする。古典的な特異的結合アッセイ
は、ルベンステイン(Rubenstein)への米国特許第3,81
7,837号に記載されている、酵素多重(enzyme−multipl
ied)イムノアッセイ(EMIT)である。
均質アッセイに分類される。均質アッセイにおいては、
結合した標識付けされた成分が発するシグナルは結合し
ない標識付けされた成分が発するシグナルと異なる。そ
れゆえ、2つは物理的分離工程を必要としないで区別す
ることができる。しかしながら、均質アッセイにおいて
さえ、試料と供に2以上のアッセイ反応成分を順次に添
加することを必要とする。古典的な特異的結合アッセイ
は、ルベンステイン(Rubenstein)への米国特許第3,81
7,837号に記載されている、酵素多重(enzyme−multipl
ied)イムノアッセイ(EMIT)である。
均質特異的結合アッセイは迅速であり、そして手動的
にあるいは自動化器具を用いて実施することが容易であ
る。しかしながら、これらの試験は、典型的には、試料
プラス抗体の順次的添加および混合、中間のインキュベ
ーション、次いで酵素−分析物接合体、次いで酵素基質
発色溶液の添加を必要とする。自動化は種々の型の分析
装置、例えば、個々の[例えば、デュポンのエイカ(ac
a )]、遠心(ロシュ・コバス・バイオ(Roche Cobas
Bio )]、および線状流[例えば、テクニコン(Tech
nicon)SMAC ]を用いて達成された。しかしながら、
均質アッセイは低分子量の化合物の検出に限定され、干
渉の傾向があり、そして一般に感度がほぼ1ナノモルの
分析物の検出に限定される。
にあるいは自動化器具を用いて実施することが容易であ
る。しかしながら、これらの試験は、典型的には、試料
プラス抗体の順次的添加および混合、中間のインキュベ
ーション、次いで酵素−分析物接合体、次いで酵素基質
発色溶液の添加を必要とする。自動化は種々の型の分析
装置、例えば、個々の[例えば、デュポンのエイカ(ac
a )]、遠心(ロシュ・コバス・バイオ(Roche Cobas
Bio )]、および線状流[例えば、テクニコン(Tech
nicon)SMAC ]を用いて達成された。しかしながら、
均質アッセイは低分子量の化合物の検出に限定され、干
渉の傾向があり、そして一般に感度がほぼ1ナノモルの
分析物の検出に限定される。
不均質アッセイにおいては、大きい分析物および小さ
い分析物の両者を検出することができるが、結合した標
識成分および結合しない標識成分が発するシグナルは同
一であり、それゆえ2つを物理的に分離してそれらを区
別しなくてはならない。古典的な不均質特異的結合アッ
セイは、Yalowが記載する[Science,200:1245、1978]
競合ラジオイムノアッセイ(RIA)である。Cuatrecasas
が記載する(Ann.Rev.Biochem.、43:109−214、1974]
ラジオリセプターアッセイ、およびWideが記載する[Re
dioimmunoassay Methodsの199−206ページ、Kirkhamお
よびHunter、E.&S.Livingstone、エディンバーグ、197
0]サンドイッチラジオイムノアッセイである。干渉は
通常排除され、そして過剰の結合試薬を時々使用できる
ので、不均質結合アッセイは均質アッセイよりもかなり
感受性がありかつ信頼性がある。
い分析物の両者を検出することができるが、結合した標
識成分および結合しない標識成分が発するシグナルは同
一であり、それゆえ2つを物理的に分離してそれらを区
別しなくてはならない。古典的な不均質特異的結合アッ
セイは、Yalowが記載する[Science,200:1245、1978]
競合ラジオイムノアッセイ(RIA)である。Cuatrecasas
が記載する(Ann.Rev.Biochem.、43:109−214、1974]
ラジオリセプターアッセイ、およびWideが記載する[Re
dioimmunoassay Methodsの199−206ページ、Kirkhamお
よびHunter、E.&S.Livingstone、エディンバーグ、197
0]サンドイッチラジオイムノアッセイである。干渉は
通常排除され、そして過剰の結合試薬を時々使用できる
ので、不均質結合アッセイは均質アッセイよりもかなり
感受性がありかつ信頼性がある。
典型的な「二重抗体」競合RIAにおいて、試料中に存
在する既知量の放射線標識リガンドおよび試料中に存在
するリガンドが制限された量の抗体について競合する。
十分な時間を経過させて特異的結合を起こさせ、その後
抗体および結合したリガンドを抗−免疫グロブリンの添
加により沈殿させ、反復した遠心により洗浄して結合し
ない標識を除去し、そして結合した相中に存在する標識
リガンドの量を決定する。
在する既知量の放射線標識リガンドおよび試料中に存在
するリガンドが制限された量の抗体について競合する。
十分な時間を経過させて特異的結合を起こさせ、その後
抗体および結合したリガンドを抗−免疫グロブリンの添
加により沈殿させ、反復した遠心により洗浄して結合し
ない標識を除去し、そして結合した相中に存在する標識
リガンドの量を決定する。
サンドイッチアッセイを使用して、イムノアッセイに
おける分析物、例えば、抗原についてより大きい感度を
達成することができる。このようなアッセイにおいて
は、過剰のリガンドを使用して結合対の解離定数より下
の濃度において結合を強制する。典型的なサンドイッチ
イムノアッセイにおいては、2つの抗体の型を必要と
し、それらの各々は抗原に同時に結合することができ
る。一方の抗体は固相に結合するが、他方は標識付けさ
れる。競合RIAを用いるときのように、結合した標識お
よび結合しない標識を分離するために1または2以上の
個々の洗浄工程を必要とし、そして試薬の順次的添加が
典型的である。
おける分析物、例えば、抗原についてより大きい感度を
達成することができる。このようなアッセイにおいて
は、過剰のリガンドを使用して結合対の解離定数より下
の濃度において結合を強制する。典型的なサンドイッチ
イムノアッセイにおいては、2つの抗体の型を必要と
し、それらの各々は抗原に同時に結合することができ
る。一方の抗体は固相に結合するが、他方は標識付けさ
れる。競合RIAを用いるときのように、結合した標識お
よび結合しない標識を分離するために1または2以上の
個々の洗浄工程を必要とし、そして試薬の順次的添加が
典型的である。
固相を単離しそして洗浄しなくてはならず、そして順
次的試薬の添加が頻繁に要求されるので、非均質アッセ
イは時間を浪費しかつ多い労働を必要とする。しかしな
がら、それらは低分子量および高分子量の化合物につい
て等しく良好に機能し、干渉の傾向が均質アッセイより
少なく、そしてピコモルより低い抗原濃度に対して感受
性であることができる。非均質のイムノアッセイの自動
化は達成された[ARIA II 、ベクトン・ディキンソン
(Becton Dickinson)、CentRIA 、ユニオン・カーバ
イド(Union Crbide)]が、これは液体の流れを注意し
て制御しかつ結合した分画または結合しない分画を監視
するために複雑なかつ高価の装置を必要とするか、ある
いはそれは急速に水和した抗体の固相を通して流れる結
合しない標識のみの検出を与えた。
次的試薬の添加が頻繁に要求されるので、非均質アッセ
イは時間を浪費しかつ多い労働を必要とする。しかしな
がら、それらは低分子量および高分子量の化合物につい
て等しく良好に機能し、干渉の傾向が均質アッセイより
少なく、そしてピコモルより低い抗原濃度に対して感受
性であることができる。非均質のイムノアッセイの自動
化は達成された[ARIA II 、ベクトン・ディキンソン
(Becton Dickinson)、CentRIA 、ユニオン・カーバ
イド(Union Crbide)]が、これは液体の流れを注意し
て制御しかつ結合した分画または結合しない分画を監視
するために複雑なかつ高価の装置を必要とするか、ある
いはそれは急速に水和した抗体の固相を通して流れる結
合しない標識のみの検出を与えた。
非均質結合アッセイの洗浄工程の不便を排除するため
に、いくつかの試みがなされた。例えば、Gloverら、英
国特許(GB)1,411,382号は、結合した(下)層をシー
ルドすることによって、結合した標識から部分的分離
後、結合しない放射線標識の量を測定する方法を記載し
ている。しかしながら、結合した標識成分ではなく結合
しない標識成分を測定する場合、特異的結合アッセイの
感度および精度がきびしく制限されることが、この分野
においてよく知られている。さらに、洗浄工程を欠く方
法に緊密に結合する(特異的)標識および弱く結合する
(非特異的)標識の両者の検出が、非常に高い非特異的
シグナルを生ずるという欠点を有する。Charltonら、米
国特許第4,106,907号、1978年8月15日発行は、管の底
から均一の高さに上の延びる放射線シールドを有するテ
ーパーをもつ反応管から成り、上澄み(結合しない分
画)からの放射線のみを検出できるようにした。放射能
を係数する他の容器を開示している。この方法は、上の
グロウバーと同一の欠点を有する。
に、いくつかの試みがなされた。例えば、Gloverら、英
国特許(GB)1,411,382号は、結合した(下)層をシー
ルドすることによって、結合した標識から部分的分離
後、結合しない放射線標識の量を測定する方法を記載し
ている。しかしながら、結合した標識成分ではなく結合
しない標識成分を測定する場合、特異的結合アッセイの
感度および精度がきびしく制限されることが、この分野
においてよく知られている。さらに、洗浄工程を欠く方
法に緊密に結合する(特異的)標識および弱く結合する
(非特異的)標識の両者の検出が、非常に高い非特異的
シグナルを生ずるという欠点を有する。Charltonら、米
国特許第4,106,907号、1978年8月15日発行は、管の底
から均一の高さに上の延びる放射線シールドを有するテ
ーパーをもつ反応管から成り、上澄み(結合しない分
画)からの放射線のみを検出できるようにした。放射能
を係数する他の容器を開示している。この方法は、上の
グロウバーと同一の欠点を有する。
Chantotら,Anal.Biochem.,84:256、1978は、放射線標
識標識の膜の受容体への結合を測定するラジオリセプタ
ーアッセイ法を記載している。この技術は、存在する放
射線標識の合計量を計数し、試料を遠心し、そして定め
られた量の上澄みから放射線を吸収する役目をする外部
に設置した銅スクリーンで再び計数することを含む。ス
クリーン自体は銅スリーブから成り、この銅スリーブは
底より上に正確に位置してスクリーンを保持する小さい
ノブを有するカスタムメイドの試験管の外側に設置され
ている。この方法は、二重の検出を必要とするという欠
点を有し、そしてGloverおよびCharltonの方法について
前述した高い非特異的結合に同様に悩まされる。さら
に、管は標準的ガンマカウンターにおけるジャミング
(Jamming)および破壊を受けやすい。前述の「スクリ
ーニング」法におけるように、大きい直径のスクリーン
はかなりの量の放射線をスクリーニングした体積から散
乱させ、スクリーニングしない標識の測定を不正確にす
る。また、結合した標識は結合しない標識の直接隣接し
かつそれと接触するので、通常のかつ避けることができ
ない、スクリーンの位置または結合しない相および結合
した相の体積の変動はシグナルを有意に変動させること
がある。
識標識の膜の受容体への結合を測定するラジオリセプタ
ーアッセイ法を記載している。この技術は、存在する放
射線標識の合計量を計数し、試料を遠心し、そして定め
られた量の上澄みから放射線を吸収する役目をする外部
に設置した銅スクリーンで再び計数することを含む。ス
クリーン自体は銅スリーブから成り、この銅スリーブは
底より上に正確に位置してスクリーンを保持する小さい
ノブを有するカスタムメイドの試験管の外側に設置され
ている。この方法は、二重の検出を必要とするという欠
点を有し、そしてGloverおよびCharltonの方法について
前述した高い非特異的結合に同様に悩まされる。さら
に、管は標準的ガンマカウンターにおけるジャミング
(Jamming)および破壊を受けやすい。前述の「スクリ
ーニング」法におけるように、大きい直径のスクリーン
はかなりの量の放射線をスクリーニングした体積から散
乱させ、スクリーニングしない標識の測定を不正確にす
る。また、結合した標識は結合しない標識の直接隣接し
かつそれと接触するので、通常のかつ避けることができ
ない、スクリーンの位置または結合しない相および結合
した相の体積の変動はシグナルを有意に変動させること
がある。
Bennetら(J.Biol.Chem.,252:2753、1977)は、結合
標識を含有する固相の単一工程の単離および洗浄を有す
るラジオリセプターアッセイを記載する。彼らは、延長
した(30分)の高速度の遠心を使用して固相を20%のス
クロースのバリヤーに通させ、次いで直ちに液体窒素中
でアッセイ管を凍結し、そして固相および結合標識を含
有する管の先端を切除した。この方法は、前述よりも効
果的な結合標識および非結合標識の分離を提供するが、
いくつかの有意の欠点を有する。アッセイ混合物はシュ
ークロースバリヤーの上部でその場でインキュベーショ
ンすることができず、こうして反応成分はバリヤー中に
拡散するので、別のインキュベーション容器および分離
容器を必要とする。混合はアッセイ混合物を希釈し、こ
うしてアッセイ反応成分についての平衡を変化させるの
で、これらのスクロースバリヤー上へのアッセイ混合物
の装填において注意を払わなくてはならない。分離は比
較的長い時間を要し、そしてアッセイ管は遠心直後に凍
結しなくてはならない。なぜなら、結合した標識は固相
から解離し、そして分離管の上部から拡散し去るからで
ある。最後に、分離管の先端の切除は不要であり、時間
を浪費し、再現的に実施することが困難であり、使用者
を液体窒素の火傷および凍結した管の破片およびその内
容物の汚染の危険にさらし、そして自動化することが非
常に困難であろう。
標識を含有する固相の単一工程の単離および洗浄を有す
るラジオリセプターアッセイを記載する。彼らは、延長
した(30分)の高速度の遠心を使用して固相を20%のス
クロースのバリヤーに通させ、次いで直ちに液体窒素中
でアッセイ管を凍結し、そして固相および結合標識を含
有する管の先端を切除した。この方法は、前述よりも効
果的な結合標識および非結合標識の分離を提供するが、
いくつかの有意の欠点を有する。アッセイ混合物はシュ
ークロースバリヤーの上部でその場でインキュベーショ
ンすることができず、こうして反応成分はバリヤー中に
拡散するので、別のインキュベーション容器および分離
容器を必要とする。混合はアッセイ混合物を希釈し、こ
うしてアッセイ反応成分についての平衡を変化させるの
で、これらのスクロースバリヤー上へのアッセイ混合物
の装填において注意を払わなくてはならない。分離は比
較的長い時間を要し、そしてアッセイ管は遠心直後に凍
結しなくてはならない。なぜなら、結合した標識は固相
から解離し、そして分離管の上部から拡散し去るからで
ある。最後に、分離管の先端の切除は不要であり、時間
を浪費し、再現的に実施することが困難であり、使用者
を液体窒素の火傷および凍結した管の破片およびその内
容物の汚染の危険にさらし、そして自動化することが非
常に困難であろう。
米国特許第4,125,375号(1978年11月14日発行)にお
いて、Hunterは、シュークロース溶液より高い密度の粒
子を含有する前もって平衡化したイムノアッセイ混合物
より下に、シュークロース溶液を注意して注入すること
によって不均質イムノアッセイを実施する方法および自
動化計器を記載している。粒子を注入されたスクロース
を通して沈降させて、結合しない標識の除去を達成す
る。この方法はBennettらの方法に固有の欠点のいくつ
かを潜在的に排除するが、いくつかの有意な欠点を有す
る。これらの欠点は、次のものを含む:(1)それは結
合した標識および遊離の標識の前にアッセイ混合物の別
の予備平衡化、および液体廃棄物の除去を必要とし、こ
うして自己収容的であることができず、(2)この方法
はほとんどの急速(遠心)分離に容易に適用することが
できず、(3)それはBennettらの方法におけるように
人工的な潜在的および拡散に悩まされ、そして(4)そ
れは便利な再現性ある手動法に適さない。
いて、Hunterは、シュークロース溶液より高い密度の粒
子を含有する前もって平衡化したイムノアッセイ混合物
より下に、シュークロース溶液を注意して注入すること
によって不均質イムノアッセイを実施する方法および自
動化計器を記載している。粒子を注入されたスクロース
を通して沈降させて、結合しない標識の除去を達成す
る。この方法はBennettらの方法に固有の欠点のいくつ
かを潜在的に排除するが、いくつかの有意な欠点を有す
る。これらの欠点は、次のものを含む:(1)それは結
合した標識および遊離の標識の前にアッセイ混合物の別
の予備平衡化、および液体廃棄物の除去を必要とし、こ
うして自己収容的であることができず、(2)この方法
はほとんどの急速(遠心)分離に容易に適用することが
できず、(3)それはBennettらの方法におけるように
人工的な潜在的および拡散に悩まされ、そして(4)そ
れは便利な再現性ある手動法に適さない。
Linsleyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,356、1985は、S.
アウレウス(S.aureus)を使用する形質転換性生長因子
I型についてのラジオイムノアッセイを記載しており、
ここで結合標識を非結合標識から10%のシュークロース
のクッションを通す急速沈降により分離し、次いで液体
窒素中で凍結し、そして遠心管の先端を切除して沈降し
た結合標識を測定する。この方法は、本質的にBennett
らが記載するラジオリセプターアッセイのイムノアッセ
イの実施態様であり、前者の方法の固有の欠点を有す
る。
アウレウス(S.aureus)を使用する形質転換性生長因子
I型についてのラジオイムノアッセイを記載しており、
ここで結合標識を非結合標識から10%のシュークロース
のクッションを通す急速沈降により分離し、次いで液体
窒素中で凍結し、そして遠心管の先端を切除して沈降し
た結合標識を測定する。この方法は、本質的にBennett
らが記載するラジオリセプターアッセイのイムノアッセ
イの実施態様であり、前者の方法の固有の欠点を有す
る。
前述の方法の各々はこの現技術状態にわずかの改良を
もたらすが、アイソトープおよび非アイソトープの両者
について、均質技術の容易さおよび迅速さ、および不均
質技術に典型的な増大した感度を兼備し、望ましくない
変動、遅延、労力、および洗浄工程において起こる解離
を伴わない特異的結合アッセイ法がこの分野において要
求されている。さらに、この方法は迅速分離を可能と
し、標準的検出器具による手動使用が便利であり、そし
て半自動化されたまたは完全に自動化された計器に容易
に適合することができるべきである。理想的には、この
方法は自己収容的であり、配管および可動部分が最小で
あり、そして完全にあらかじめ分配された試薬と適合性
であるべきである。本発明は、この要求を満足し、そし
てさらに、他の関連する利点を提供する。
もたらすが、アイソトープおよび非アイソトープの両者
について、均質技術の容易さおよび迅速さ、および不均
質技術に典型的な増大した感度を兼備し、望ましくない
変動、遅延、労力、および洗浄工程において起こる解離
を伴わない特異的結合アッセイ法がこの分野において要
求されている。さらに、この方法は迅速分離を可能と
し、標準的検出器具による手動使用が便利であり、そし
て半自動化されたまたは完全に自動化された計器に容易
に適合することができるべきである。理想的には、この
方法は自己収容的であり、配管および可動部分が最小で
あり、そして完全にあらかじめ分配された試薬と適合性
であるべきである。本発明は、この要求を満足し、そし
てさらに、他の関連する利点を提供する。
本発明の開示 簡潔には、本発明は、不均質結合アッセイ混合物内の
結合標識を非結合標識から分離するための、及び1また
は2以上の液体または固体の層においてアッセイ反応成
分およびクッションをあらかじめ分配させて不均質およ
び均質の両者の結合アッセイのための自己収容アッセイ
容器を形成するための方法および関連する装置、ならび
に流体試料内の分析物の存在および/または量を検出す
る方法、およびそこの中でおよび一般に特異的結合アッ
セイ内で使用するために再使用可能な検出容器を開示す
る。本発明の目的に対して、クッションなる用語は任意
の1つの実施態様においてすべの第1層および第2層を
包含すると定義される。
結合標識を非結合標識から分離するための、及び1また
は2以上の液体または固体の層においてアッセイ反応成
分およびクッションをあらかじめ分配させて不均質およ
び均質の両者の結合アッセイのための自己収容アッセイ
容器を形成するための方法および関連する装置、ならび
に流体試料内の分析物の存在および/または量を検出す
る方法、およびそこの中でおよび一般に特異的結合アッ
セイ内で使用するために再使用可能な検出容器を開示す
る。本発明の目的に対して、クッションなる用語は任意
の1つの実施態様においてすべの第1層および第2層を
包含すると定義される。
本発明の1つの面においては、アッセイ混合物内の結
合標識を非結合標識から分離する方法が開示される。こ
のアッセイ混合物はアッセイ容器において層の形態であ
ることができ、この層は滴の形態であるか、あるいはア
ッセイ混合物の体積およびアッセイ容器の形状寸法に依
存して薄いフィルムから数センチメートルまで変化す
る。アッセイ混合物は、一般に、試薬混合物プラス分析
物含有試料を含む。試薬混合物は、さらに、1種または
2種以上の結合成分を含み、そしてさらに、1種または
2種以上の標識を含むことができる。結合性成分は、通
常、2つの部分を含むんで成り、これらは固相およびそ
れに結合された特異的結合剤(これは特異的結合活性を
与える)である。
合標識を非結合標識から分離する方法が開示される。こ
のアッセイ混合物はアッセイ容器において層の形態であ
ることができ、この層は滴の形態であるか、あるいはア
ッセイ混合物の体積およびアッセイ容器の形状寸法に依
存して薄いフィルムから数センチメートルまで変化す
る。アッセイ混合物は、一般に、試薬混合物プラス分析
物含有試料を含む。試薬混合物は、さらに、1種または
2種以上の結合成分を含み、そしてさらに、1種または
2種以上の標識を含むことができる。結合性成分は、通
常、2つの部分を含むんで成り、これらは固相およびそ
れに結合された特異的結合剤(これは特異的結合活性を
与える)である。
いったん試薬混合物および試料が一緒にされてアッセ
イ混合物を形成すると、インキュベーション期間が通常
必要である。インキュベーション期間は、例えば、要求
する感度、結合性成分の結合親和性および濃度のごとき
因子に部分的に依存して、1秒ないし数日の範囲である
ことができる。インキュベーション後、アッセイ混合物
は結合性成分の少なくともあるものに結合した分析物お
よび/又は標識を含み、そしてまた、非結合性成分を含
み、非結合性成分の1つは非結合標識である。他の非結
合性成分は水、緩衝液、防腐剤、および蛋白質を含むこ
とができ、非結合性成分は典型的には大部分水溶液から
なる。
イ混合物を形成すると、インキュベーション期間が通常
必要である。インキュベーション期間は、例えば、要求
する感度、結合性成分の結合親和性および濃度のごとき
因子に部分的に依存して、1秒ないし数日の範囲である
ことができる。インキュベーション後、アッセイ混合物
は結合性成分の少なくともあるものに結合した分析物お
よび/又は標識を含み、そしてまた、非結合性成分を含
み、非結合性成分の1つは非結合標識である。他の非結
合性成分は水、緩衝液、防腐剤、および蛋白質を含むこ
とができ、非結合性成分は典型的には大部分水溶液から
なる。
簡単には、この方法は(a)第1層をアッセイ混合物
と接触させ、結合性成分および非結合性成分の両者は第
1層と不混和性でありかつ密度がそれと異なり、そして
(b)アッセイ混合物を、第1層と接触させながら、結
合性成分および非結合性成分を分離させるために十分な
条件に暴露することからなる。典型的には、結合性成分
は第1層のそれより大きい密度を有し、そして非結合性
成分の溶液は結合性成分のそれまたは第1層のそれより
低い密度を有する。
と接触させ、結合性成分および非結合性成分の両者は第
1層と不混和性でありかつ密度がそれと異なり、そして
(b)アッセイ混合物を、第1層と接触させながら、結
合性成分および非結合性成分を分離させるために十分な
条件に暴露することからなる。典型的には、結合性成分
は第1層のそれより大きい密度を有し、そして非結合性
成分の溶液は結合性成分のそれまたは第1層のそれより
低い密度を有する。
特定の実施態様においては、結合性成分および非結合
性成分のいずれか一方又は両者は第1層と同一の密度を
有することができる。1つのこのような実施態様におい
ては、結合性成分はアッセイ混合物を収容する容器の表
面に固定化されており、そして結合性成分の密度はアッ
セイに無関係である。このような他の1つの実施態様に
おいては、結合性成分はアッセイ混合物中に懸濁された
磁気粒子の表面へ固定化されており、そして非結合性成
分から磁力によって分離される。この場合においては、
結合性成分は密度が第1層と有意に異る必要はないが、
典型的にはアッセイ混合物は第1層のそれより低い密度
を有するであろう。
性成分のいずれか一方又は両者は第1層と同一の密度を
有することができる。1つのこのような実施態様におい
ては、結合性成分はアッセイ混合物を収容する容器の表
面に固定化されており、そして結合性成分の密度はアッ
セイに無関係である。このような他の1つの実施態様に
おいては、結合性成分はアッセイ混合物中に懸濁された
磁気粒子の表面へ固定化されており、そして非結合性成
分から磁力によって分離される。この場合においては、
結合性成分は密度が第1層と有意に異る必要はないが、
典型的にはアッセイ混合物は第1層のそれより低い密度
を有するであろう。
追加の実施態様において、これは典型的には均質結合
アッセイであり、アッセイ混合物全体の密度は第1層の
密度より大きいことができる。1つのこのような実施態
様は、試料の添加およびインキュベーションの間、固体
の形態である第1層を利用し、次いでこの第1層を液化
してアッセイ混合物を酵素基質発色発を含有する高密度
の第2層と混合させる。
アッセイであり、アッセイ混合物全体の密度は第1層の
密度より大きいことができる。1つのこのような実施態
様は、試料の添加およびインキュベーションの間、固体
の形態である第1層を利用し、次いでこの第1層を液化
してアッセイ混合物を酵素基質発色発を含有する高密度
の第2層と混合させる。
クッションおよびアッセイ反応成分(すなわち、アッ
セイ反応成分は第1層と接触する試薬混合物を形成する
試薬、ならびにクッション中の任意の補助アッセイ成分
である)の予備分配を含む本発明の関連する実施態様に
おいては、試薬混合物を、前述のように、試料の添加お
よび引続くアッセイ混合物のインキュベーションに実質
的に先立って、第1層と接触させる。不均質結合アッセ
イおよび均質結合アッセイの両者のため、これは反応成
分を必要に応じて分配しなくてはならない場合のアッセ
イに比較して、より大きい便利さを使用者に提供する。
さらに、正確な自動化された装置を使用してアッセイの
実施の間アッセイ反応成分を予備分配させる場合、要求
されるアッセイ反応成分の手動分配に比較して、より大
きい精度が期待される。
セイ反応成分は第1層と接触する試薬混合物を形成する
試薬、ならびにクッション中の任意の補助アッセイ成分
である)の予備分配を含む本発明の関連する実施態様に
おいては、試薬混合物を、前述のように、試料の添加お
よび引続くアッセイ混合物のインキュベーションに実質
的に先立って、第1層と接触させる。不均質結合アッセ
イおよび均質結合アッセイの両者のため、これは反応成
分を必要に応じて分配しなくてはならない場合のアッセ
イに比較して、より大きい便利さを使用者に提供する。
さらに、正確な自動化された装置を使用してアッセイの
実施の間アッセイ反応成分を予備分配させる場合、要求
されるアッセイ反応成分の手動分配に比較して、より大
きい精度が期待される。
本発明の関連する面において、自己収容アッセイ容器
において実施する均質または不均質結合アッセイを用い
て流体試料中の分析物の存在および/または量を検出す
る方法が開示され、ここでアッセイ容器は1または2以
上の層中に予備分あらかじめ配されたアッセイ反応成分
を含有する。
において実施する均質または不均質結合アッセイを用い
て流体試料中の分析物の存在および/または量を検出す
る方法が開示され、ここでアッセイ容器は1または2以
上の層中に予備分あらかじめ配されたアッセイ反応成分
を含有する。
流体試料内の分析物の存在または量を検出するための
幾つかの実施態様において、標識は分析物それ自体を構
成することができる。例えば、血液中に存在するグリコ
シル化ヘモグロビンの百分率を検出するアッセイは、典
型的には、イオン交換カラムまたはアフィニティーカラ
ムの形態の結合性成分を使用してこの分析物の大部分ま
たはすべてを分離し、次いで結合した分析物(グリゴシ
ル化ヘモブロビン)の吸収ならびに非結合性成分(非グ
リゴシルゴシル化ヘモグロビまたは合計のヘモグロビ
ン)の吸収を適当な比色計で測定することを含む。この
実施態様において、先行技術のカラムにおいて使用する
のと同一の粒子または関連する粒子を本発明のアッセイ
混合物における結合性成分として使用することができ、
これは第1層と不混和性であろう。適当なインキュベー
ション後、アッセイを結合性成分および非結合性成分を
分離させるために十分な条件に暴露し、そして結合した
標識(分析物)を検出する。試料を測定しない場合、結
合した標識および結合しなかった標識の両者を測定し
て、結合した分析物の百分率を計算できるようにする。
幾つかの実施態様において、標識は分析物それ自体を構
成することができる。例えば、血液中に存在するグリコ
シル化ヘモグロビンの百分率を検出するアッセイは、典
型的には、イオン交換カラムまたはアフィニティーカラ
ムの形態の結合性成分を使用してこの分析物の大部分ま
たはすべてを分離し、次いで結合した分析物(グリゴシ
ル化ヘモブロビン)の吸収ならびに非結合性成分(非グ
リゴシルゴシル化ヘモグロビまたは合計のヘモグロビ
ン)の吸収を適当な比色計で測定することを含む。この
実施態様において、先行技術のカラムにおいて使用する
のと同一の粒子または関連する粒子を本発明のアッセイ
混合物における結合性成分として使用することができ、
これは第1層と不混和性であろう。適当なインキュベー
ション後、アッセイを結合性成分および非結合性成分を
分離させるために十分な条件に暴露し、そして結合した
標識(分析物)を検出する。試料を測定しない場合、結
合した標識および結合しなかった標識の両者を測定し
て、結合した分析物の百分率を計算できるようにする。
本発明の追加の関連する面において、前述のようなア
ッセイ混合物内の結合標識を非結合標識から分離するた
めのいくつかの装置が開示される。1つの実施態様にお
いて、この装置は再密閉可能な基部端および閉じた末端
を有するアッセイ容器を含み、この容器は細長い室をそ
の中に構成する。他の実施態様において、この装置は多
ウェル(well)プレートを含む。ほかの実施態様におい
て、この装置は細長いアッセイ容器または連結された細
長いアッセイ容器のストリップを含む。アッセイ容器
は、多ウェルプレート中のウェルと実質的に同一の間隔
を有するように配置される。これらの装置は第1層を有
し、この第1層は室内でまたはウェルを横切って略横方
向にしばしば延びて、その中にバリヤーを形成し、第1
層は結合性成分および非結合性成分の両者の不混和性で
ありかつ典型的にはそれらと異なる密度を有する。
ッセイ混合物内の結合標識を非結合標識から分離するた
めのいくつかの装置が開示される。1つの実施態様にお
いて、この装置は再密閉可能な基部端および閉じた末端
を有するアッセイ容器を含み、この容器は細長い室をそ
の中に構成する。他の実施態様において、この装置は多
ウェル(well)プレートを含む。ほかの実施態様におい
て、この装置は細長いアッセイ容器または連結された細
長いアッセイ容器のストリップを含む。アッセイ容器
は、多ウェルプレート中のウェルと実質的に同一の間隔
を有するように配置される。これらの装置は第1層を有
し、この第1層は室内でまたはウェルを横切って略横方
向にしばしば延びて、その中にバリヤーを形成し、第1
層は結合性成分および非結合性成分の両者の不混和性で
ありかつ典型的にはそれらと異なる密度を有する。
本発明の他の面において、流体試料内の分析物の存在
または量を検出するための他の方法が開示される。簡単
に述べると、この方法は次の工程を含む:(a)流体試
料を試薬混合物とともにインキュベーションしてアッセ
イ混合物を形成し、このアッセイ混合物は1種または2
種以上の結合性成分、標識、および非結合性成分を含有
し、標識の少なくともあるものおよび分析物の少なくと
もあるものは、結合性成分成分に、直接にあるいは間接
的に結合しており、(b)第1層を前記アッセイ混合物
と接触させ、結合性成分はそれに結合した標識および/
または分析物を有し、そして非結合性成分は第1層と不
混和性でありかつそれと異なる密度を有し、(c)アッ
セイ混合物を、第1層と接触させながら、それに結合し
た標識および/または分析物を有する結合性成分と非結
合性成分とを分離するために十分な条件に暴露し、そし
て(d)結合性成分に結合した標識を検出し、そしてそ
れから分析物の存在または量を決定することを含む。
または量を検出するための他の方法が開示される。簡単
に述べると、この方法は次の工程を含む:(a)流体試
料を試薬混合物とともにインキュベーションしてアッセ
イ混合物を形成し、このアッセイ混合物は1種または2
種以上の結合性成分、標識、および非結合性成分を含有
し、標識の少なくともあるものおよび分析物の少なくと
もあるものは、結合性成分成分に、直接にあるいは間接
的に結合しており、(b)第1層を前記アッセイ混合物
と接触させ、結合性成分はそれに結合した標識および/
または分析物を有し、そして非結合性成分は第1層と不
混和性でありかつそれと異なる密度を有し、(c)アッ
セイ混合物を、第1層と接触させながら、それに結合し
た標識および/または分析物を有する結合性成分と非結
合性成分とを分離するために十分な条件に暴露し、そし
て(d)結合性成分に結合した標識を検出し、そしてそ
れから分析物の存在または量を決定することを含む。
上に開示した特に好ましい実施態様は、得られるアッ
セイ混合物のインキュベーションの前に、第1層を流体
試料および試薬混合物と接触させることを含む。この実
施態様内で、アッセイ混合物の形成およびインキュベー
ションをアッセイ容器において実施し、この中で分離を
実施する。
セイ混合物のインキュベーションの前に、第1層を流体
試料および試薬混合物と接触させることを含む。この実
施態様内で、アッセイ混合物の形成およびインキュベー
ションをアッセイ容器において実施し、この中で分離を
実施する。
前述の方法の追加の好ましい実施態様は、1または2
以上の第2層中に、補助アッセイ成分を含み、この補助
アッセイ成分は、インキュベーション後に、あるいは給
合した標識を未結合標識から分離した後に、アッセイ混
合物に添加することが最良である。補助アッセイ成分
は、標識、例えば、酵素接合抗体、酵素基質発色発剤、
および酵素、例えば、プロテアーゼ類を含む。第2層中
に含有される他の物質、例えば、表2に記載するもの
は、ある場合においては、第2層溶液の密度の調節を越
えた追加の機能を達成する場合、補助アッセイ成分であ
ること考えることができる。
以上の第2層中に、補助アッセイ成分を含み、この補助
アッセイ成分は、インキュベーション後に、あるいは給
合した標識を未結合標識から分離した後に、アッセイ混
合物に添加することが最良である。補助アッセイ成分
は、標識、例えば、酵素接合抗体、酵素基質発色発剤、
および酵素、例えば、プロテアーゼ類を含む。第2層中
に含有される他の物質、例えば、表2に記載するもの
は、ある場合においては、第2層溶液の密度の調節を越
えた追加の機能を達成する場合、補助アッセイ成分であ
ること考えることができる。
本発明の追加の面は、放射性標識を使用する特異的結
合アッセイにおいて使用するための再使用可能な検出容
器を開示する。この検出容器は、一般に、開いた端およ
び閉じた端を有する細長い容器、およびこの細長い容器
内に嵌合しかつその中に位置して閉じた端に対してシー
ルドされた部分およびシールドされない部分を提供でき
る放射線シールドを含んでなる。大抵の場合において、
効果的な均一なシールドをよりよく提供する、実質的に
円筒形の穴を有するシールドを使用することが好まし
い。必須ではないが、円筒形の外部を有するシールドを
提供することが便利なことがある。1つの実施態様にお
いて、この設計は、検出容器中に挿入されているアッセ
イ容器の部分が、アッセイ容器の露出部分内の標識の検
出を可能とするために十分な距離でシールドから下方に
突出できるようにする。他の実施態様において、検出容
器はシールドと容器の末端との間に位置する実質的に円
筒形の部材を有し、この円筒形の部材は容器内のシール
ドを支持しかつその位置を維持することができる。なお
他の実施態様において、円筒形部材は末端が閉じてい
て、ディスクの形態の追加の薄い放射線シールドを支持
する。このディスクは、ある種の検出器具、例えば、あ
る種のウェル型ガンマカウンターを使用するとき、より
効果的なシールドを可能にする。
合アッセイにおいて使用するための再使用可能な検出容
器を開示する。この検出容器は、一般に、開いた端およ
び閉じた端を有する細長い容器、およびこの細長い容器
内に嵌合しかつその中に位置して閉じた端に対してシー
ルドされた部分およびシールドされない部分を提供でき
る放射線シールドを含んでなる。大抵の場合において、
効果的な均一なシールドをよりよく提供する、実質的に
円筒形の穴を有するシールドを使用することが好まし
い。必須ではないが、円筒形の外部を有するシールドを
提供することが便利なことがある。1つの実施態様にお
いて、この設計は、検出容器中に挿入されているアッセ
イ容器の部分が、アッセイ容器の露出部分内の標識の検
出を可能とするために十分な距離でシールドから下方に
突出できるようにする。他の実施態様において、検出容
器はシールドと容器の末端との間に位置する実質的に円
筒形の部材を有し、この円筒形の部材は容器内のシール
ドを支持しかつその位置を維持することができる。なお
他の実施態様において、円筒形部材は末端が閉じてい
て、ディスクの形態の追加の薄い放射線シールドを支持
する。このディスクは、ある種の検出器具、例えば、あ
る種のウェル型ガンマカウンターを使用するとき、より
効果的なシールドを可能にする。
本発明の他の面は、以下の詳細な説明および添付図面
を参照すると、明らかとなるであろう。
を参照すると、明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明 第1A図は、本発明のアッセイ容器および関連するクロ
ージャーの側面図である。
ージャーの側面図である。
第1B図は、本発明の別のアッセイ容器の側面図であ
る。
る。
第2図は、本発明の多ウェルプレートの側面断面図で
ある。
ある。
第3図は、アッセイ容器が内部に配置された、本発明
の再使用可能な検出容器の側面図である。
の再使用可能な検出容器の側面図である。
発明を実施する最良の態様 前述の様に、不均質特異的結合アッセイは均質アッセ
イよりも典型的に感度が高い。しかしながら、実際に
は、この利点は典型的には要求されるアッセイ混合物の
労働を要しかつ時間を消費する取扱いによって相殺され
る。均質アッセイを用いてさえ、いくつかの別々のアッ
セイ反応成分の順次的添加を必要とする。本発明は、よ
り便利な、労力が少ない、均質アッセイおよび不均質ア
ッセイを包含する。特異的結合アッセイを実施するため
の材料および方法に関する。このような結合アッセイ
は、手動的に実施することができ、あるいは均質アッセ
イまたは不均質アッセイを実施するために設計された自
動化器具を用いて実施できる。不均質アッセイにおいて
は、固相および結合された特異的結合剤からなり、そし
て典型的には標識の少なくともあるものに結合して結合
した標識および未結合標識の両者を生成する結合性成分
を使用する。均質アッセイにおいては、典型的には溶液
中に溶解した結合剤を使用する。
イよりも典型的に感度が高い。しかしながら、実際に
は、この利点は典型的には要求されるアッセイ混合物の
労働を要しかつ時間を消費する取扱いによって相殺され
る。均質アッセイを用いてさえ、いくつかの別々のアッ
セイ反応成分の順次的添加を必要とする。本発明は、よ
り便利な、労力が少ない、均質アッセイおよび不均質ア
ッセイを包含する。特異的結合アッセイを実施するため
の材料および方法に関する。このような結合アッセイ
は、手動的に実施することができ、あるいは均質アッセ
イまたは不均質アッセイを実施するために設計された自
動化器具を用いて実施できる。不均質アッセイにおいて
は、固相および結合された特異的結合剤からなり、そし
て典型的には標識の少なくともあるものに結合して結合
した標識および未結合標識の両者を生成する結合性成分
を使用する。均質アッセイにおいては、典型的には溶液
中に溶解した結合剤を使用する。
本発明によって提供される不均質アッセイについての
重要な利点は、試薬混合物またはアッセイ混合物(試料
を包含する)を第1層と接触させて貯蔵またはインキュ
ベーションすることができ、ることであり、この第1層
は、典型的には、未結合標識成分から結合した標識を分
離するために使用する密な油様物質である。第1層と接
触させての試薬混合物の貯蔵は、アッセイ反応成分およ
びクッションを予備包装できるので、有利である。これ
はアッセイのための調製およびその実施における操作の
数を減少し、そして便利さ、速度および精度を改良する
ことができる。洗浄緩衝液の貯蔵、および廃液の収集お
よび廃棄が排除されるので、本発明は空間的要件を減少
しかつ実験室の試験の安全性を増加する。さらに、水を
必要としないので、フィールドテストが促進される。
重要な利点は、試薬混合物またはアッセイ混合物(試料
を包含する)を第1層と接触させて貯蔵またはインキュ
ベーションすることができ、ることであり、この第1層
は、典型的には、未結合標識成分から結合した標識を分
離するために使用する密な油様物質である。第1層と接
触させての試薬混合物の貯蔵は、アッセイ反応成分およ
びクッションを予備包装できるので、有利である。これ
はアッセイのための調製およびその実施における操作の
数を減少し、そして便利さ、速度および精度を改良する
ことができる。洗浄緩衝液の貯蔵、および廃液の収集お
よび廃棄が排除されるので、本発明は空間的要件を減少
しかつ実験室の試験の安全性を増加する。さらに、水を
必要としないので、フィールドテストが促進される。
均質アッセイおよび不均質アッセイの両者に関連する
本発明のよって提供される他の重要な利点は、補助アッ
セイ成分をアッセイ混合物の層から分離された1または
2以上の層にあらかじめ分配して、分析物の存在および
/またはレベルを決定するための完全に自己収容的アッ
セイ容器をつることができることである。先行技術にお
いて、このような補助アッセイ成分(例えば、均質アッ
セイのための酵素基質発色発剤、およびサンドイッチイ
ムノアッセイにおける標識抗体)は、典型的には、イン
キュベーション工程後に、そしてある場合においては、
未結合標識および/または分析物から結合した標識を分
離した後に添加する。このような特徴は先行技術に比較
して便利さを増加させるので、アッセイ反応成分のすべ
てをあらかじめ分配する本発明において、有意な工業的
利点が存在する。
本発明のよって提供される他の重要な利点は、補助アッ
セイ成分をアッセイ混合物の層から分離された1または
2以上の層にあらかじめ分配して、分析物の存在および
/またはレベルを決定するための完全に自己収容的アッ
セイ容器をつることができることである。先行技術にお
いて、このような補助アッセイ成分(例えば、均質アッ
セイのための酵素基質発色発剤、およびサンドイッチイ
ムノアッセイにおける標識抗体)は、典型的には、イン
キュベーション工程後に、そしてある場合においては、
未結合標識および/または分析物から結合した標識を分
離した後に添加する。このような特徴は先行技術に比較
して便利さを増加させるので、アッセイ反応成分のすべ
てをあらかじめ分配する本発明において、有意な工業的
利点が存在する。
他の面において、本発明は、分離の実施後、結合した
標識を選択的に測定する方法および装置に関する。ある
実施態様において、結合した標識の測定は未結合標識を
検出器からシールドすることによって促進される。
標識を選択的に測定する方法および装置に関する。ある
実施態様において、結合した標識の測定は未結合標識を
検出器からシールドすることによって促進される。
A.クッションの第1層および第2層 本発明の方法は、一般に、結合性成分及び標識を含有
する十分に水性のアッセイ混合物、およびこのアッセイ
混合物を接触する少なくとも1つの水不混和性層を使用
する。アッセイ混合物と接触する水不混和性層を、以後
「第1層」と呼ぶ。第1層は、結合アッセイが均質また
は不均質かに依存して2つの機能の少なくとも1つをは
たす。不均質アッセイにおいては、第1層は、適当な条
件下において、少なくともある結合した標識および/ま
たは分析物を有する固相の結合性成分がこの層と接触し
そして/またはこの層を浸透し、こうして遊離している
標識から分離されるような密度および性質を有する。主
として第1層によって起こされる結合した標識と未結合
標識のこの分離は、分離工程として知られている。均質
アッセイにおいて、第1層は、適当な条件下に、アッセ
イ混合物がこの層を通過して、補助アッセイ成分、例え
ば、酵素基質発色発剤と接触または混合するような密度
および性質を有する。この工程は補助試薬混合工程と呼
ばれる。
する十分に水性のアッセイ混合物、およびこのアッセイ
混合物を接触する少なくとも1つの水不混和性層を使用
する。アッセイ混合物と接触する水不混和性層を、以後
「第1層」と呼ぶ。第1層は、結合アッセイが均質また
は不均質かに依存して2つの機能の少なくとも1つをは
たす。不均質アッセイにおいては、第1層は、適当な条
件下において、少なくともある結合した標識および/ま
たは分析物を有する固相の結合性成分がこの層と接触し
そして/またはこの層を浸透し、こうして遊離している
標識から分離されるような密度および性質を有する。主
として第1層によって起こされる結合した標識と未結合
標識のこの分離は、分離工程として知られている。均質
アッセイにおいて、第1層は、適当な条件下に、アッセ
イ混合物がこの層を通過して、補助アッセイ成分、例え
ば、酵素基質発色発剤と接触または混合するような密度
および性質を有する。この工程は補助試薬混合工程と呼
ばれる。
クッションは、少なくとも分離および補助混合工程の
間、液体の形態である。第1層は、また、アッセイ混合
物と十分にまたは完全に不混和性である。これらの2つ
の特徴は、また、結合性成分と第1層との有効な接触を
可能とし、同時にアッセイ混合物の水性成分を排除す
る。多くの実施態様において、第1層および第2層は、
また、アッセイ混合物と異なる密度(典型的にはこの密
度はアッセイ混合物のそれより大きい)を有するので、
アッセイ混合物およぶクッション層の相対的位置は重力
または遠心力のもとに維持することができる。
間、液体の形態である。第1層は、また、アッセイ混合
物と十分にまたは完全に不混和性である。これらの2つ
の特徴は、また、結合性成分と第1層との有効な接触を
可能とし、同時にアッセイ混合物の水性成分を排除す
る。多くの実施態様において、第1層および第2層は、
また、アッセイ混合物と異なる密度(典型的にはこの密
度はアッセイ混合物のそれより大きい)を有するので、
アッセイ混合物およぶクッション層の相対的位置は重力
または遠心力のもとに維持することができる。
第1層によりアッセイ混合物から分離し、1または2
以上の追加の層を使用することができ、これらの層は水
溶液と混和性または不混和性であることができる。これ
らの追加の層を、以後「第2層」と呼ぶ。各第2層は、
使用される他の層とは異る密度を有し、そしてさらに、
隣接する層とほとんどあるいは完全に不混和性である。
遠心力を用いない用途のため、すべての層は混合または
逆転に対して抵抗性であるか、あるいは短時間の放置後
それらの相対位置に戻るべきである。これは貯蔵温度に
おいて固体である少なくとも1つの層を選択することに
よって、あるいは密度が大きく異りかつ不混和性である
層(例えば、フタル酸ブチルまたはフルオロカーボン
油)を使用することによって達成することができる。1
または2以上の層の中あるいはアッセイ混合物の中に洗
浄剤を包含させると、ある場合において、混合された液
状層の自発的分離が促進されるであろう。適当な洗浄剤
は非イオン性洗浄剤[例えば、ノニデット(Nonidet)
P−40またはトリトン(Triton)X−100]およびイオ
ン性洗浄剤(例えば、タウロデオキシコレートまたはド
デシルサルフェート)および洗浄剤の種々の混合物を包
含する。
以上の追加の層を使用することができ、これらの層は水
溶液と混和性または不混和性であることができる。これ
らの追加の層を、以後「第2層」と呼ぶ。各第2層は、
使用される他の層とは異る密度を有し、そしてさらに、
隣接する層とほとんどあるいは完全に不混和性である。
遠心力を用いない用途のため、すべての層は混合または
逆転に対して抵抗性であるか、あるいは短時間の放置後
それらの相対位置に戻るべきである。これは貯蔵温度に
おいて固体である少なくとも1つの層を選択することに
よって、あるいは密度が大きく異りかつ不混和性である
層(例えば、フタル酸ブチルまたはフルオロカーボン
油)を使用することによって達成することができる。1
または2以上の層の中あるいはアッセイ混合物の中に洗
浄剤を包含させると、ある場合において、混合された液
状層の自発的分離が促進されるであろう。適当な洗浄剤
は非イオン性洗浄剤[例えば、ノニデット(Nonidet)
P−40またはトリトン(Triton)X−100]およびイオ
ン性洗浄剤(例えば、タウロデオキシコレートまたはド
デシルサルフェート)および洗浄剤の種々の混合物を包
含する。
第1層は種々の化合物のいずれにから構成することも
でき、ただしそれはアッセイ混合物の成分と実質的に不
混和性であり、そして典型的にはアッセイ混合物の固体
または液体の成分と異なるの液体密度を有するであろ
う。第1層がアッセイ混合物の非結合性成分より大きい
密度を有する場合、第1層の密度は通常ほぼ1.01以上で
ある。遠心分離を含むような場合について、第1層の密
度は典型的には1.20を越えず、そして最も好ましくは1.
03より大きくかつ1.15より小さい。さらに、不均質アッ
セイのためには、第1層の密度は、典型的には、結合性
成分の見掛け密度より小さいであろう。さらに、第1層
は、インキュベーション後の少なくとも分離段階又は補
助試験混合段階のために流体状であろう。第2層もま
た、少なくとも補助試薬の混合工程の間、および/また
は結合性成分が第2層を浸透するかあるいは通過するこ
とを望むような期間の間、液体の形態であろう。固体の
第1層の液化は、典型的には、通常4〜50℃の範囲にお
ける溶融を包含する。重力または遠心を利用して不均質
結合アッセイにおいて分離を達成する用途において、あ
るいは補助試薬の混合工程を均質結合アッセイにおいて
望む場合、第1層およびすべての第2層の密度はアッセ
イ混合物の密度と異なるべきである。第1層として使用
するために適する水不混和性の密な油の代表的な列挙を
表1に示す。これらの物質は、また、第2層の成分とし
て使用することができる。
でき、ただしそれはアッセイ混合物の成分と実質的に不
混和性であり、そして典型的にはアッセイ混合物の固体
または液体の成分と異なるの液体密度を有するであろ
う。第1層がアッセイ混合物の非結合性成分より大きい
密度を有する場合、第1層の密度は通常ほぼ1.01以上で
ある。遠心分離を含むような場合について、第1層の密
度は典型的には1.20を越えず、そして最も好ましくは1.
03より大きくかつ1.15より小さい。さらに、不均質アッ
セイのためには、第1層の密度は、典型的には、結合性
成分の見掛け密度より小さいであろう。さらに、第1層
は、インキュベーション後の少なくとも分離段階又は補
助試験混合段階のために流体状であろう。第2層もま
た、少なくとも補助試薬の混合工程の間、および/また
は結合性成分が第2層を浸透するかあるいは通過するこ
とを望むような期間の間、液体の形態であろう。固体の
第1層の液化は、典型的には、通常4〜50℃の範囲にお
ける溶融を包含する。重力または遠心を利用して不均質
結合アッセイにおいて分離を達成する用途において、あ
るいは補助試薬の混合工程を均質結合アッセイにおいて
望む場合、第1層およびすべての第2層の密度はアッセ
イ混合物の密度と異なるべきである。第1層として使用
するために適する水不混和性の密な油の代表的な列挙を
表1に示す。これらの物質は、また、第2層の成分とし
て使用することができる。
第1層がアッセイ混合物の液状成分より密度が高い実
施態様のためには、第1層の物質は水より大きい密度
(>1.00)を有するであろう。しかしながら、反応混合
物の全体が第1層を透過して第2層中の1種または2種
以上の補助アッセイ成分と混合する。補助試薬の混合工
程を必要とするある均質結合アッセイのためには、水の
密度より低いかあるいはそれに等しい密度をもつ油は、
もしこれがインキュベーションの間固体の形態に維持さ
れることができ、引続いて液化され得る場合、使用する
ことができる。このような実施態様において、反応混合
物は密な水溶液を形成する1種または2種以上の物質を
含有することができる。このような物質の代表的列挙を
表2に示す。
施態様のためには、第1層の物質は水より大きい密度
(>1.00)を有するであろう。しかしながら、反応混合
物の全体が第1層を透過して第2層中の1種または2種
以上の補助アッセイ成分と混合する。補助試薬の混合工
程を必要とするある均質結合アッセイのためには、水の
密度より低いかあるいはそれに等しい密度をもつ油は、
もしこれがインキュベーションの間固体の形態に維持さ
れることができ、引続いて液化され得る場合、使用する
ことができる。このような実施態様において、反応混合
物は密な水溶液を形成する1種または2種以上の物質を
含有することができる。このような物質の代表的列挙を
表2に示す。
密な油様物質は典型的には生物有機酸の合成エステル
(通常、メチル、エチル、プロピルまたはブチルエステ
ル)であり、そして通常実質的な酸素、窒素、またはイ
オウを含有するか、あるいはそれらはフルオロカーボン
油またはシリコーンに基く油である。ほとんどの密な油
様物質は互いに混和性であり、そして単独であるいは種
々の混合物の形態で第1層または第2層において使用す
ることができる。しかしながら、ある実施態様において
は、互いに混和性でなくかつ密度が異なる隣接する水不
混和性層つくることが可能でありかつ望ましい(例え
ば、炭化水素に基づく物質または混合物+フルオロカー
ボンに基づく物質または混合物)。このような実施態様
において、水不混和性混合物は第2層を呼ばれるであろ
う。
(通常、メチル、エチル、プロピルまたはブチルエステ
ル)であり、そして通常実質的な酸素、窒素、またはイ
オウを含有するか、あるいはそれらはフルオロカーボン
油またはシリコーンに基く油である。ほとんどの密な油
様物質は互いに混和性であり、そして単独であるいは種
々の混合物の形態で第1層または第2層において使用す
ることができる。しかしながら、ある実施態様において
は、互いに混和性でなくかつ密度が異なる隣接する水不
混和性層つくることが可能でありかつ望ましい(例え
ば、炭化水素に基づく物質または混合物+フルオロカー
ボンに基づく物質または混合物)。このような実施態様
において、水不混和性混合物は第2層を呼ばれるであろ
う。
有機化学において経験を有する者およびこの分野にお
ける他の熟練者にとって、表1に列挙した物質以外の、
所望の性質を有する関連する水不混和性物質は容易に明
らかであろう。このような性質は水および水溶液中の部
分的または完全な不混和性および不都合な匂または毒性
の欠如を包含する。第1層の物質のほかの所望の性質
は、試薬混合物またはアッセイ混合物と混合したとき、
急速にかつ自発的に均質層を再形成する能力である。さ
らに、第1層は分離工程(不均質アッセイにおいて)お
よび補助試薬の混合工程(均質アッセイにおいて)の間
液体の形態でなくてはならない。
ける他の熟練者にとって、表1に列挙した物質以外の、
所望の性質を有する関連する水不混和性物質は容易に明
らかであろう。このような性質は水および水溶液中の部
分的または完全な不混和性および不都合な匂または毒性
の欠如を包含する。第1層の物質のほかの所望の性質
は、試薬混合物またはアッセイ混合物と混合したとき、
急速にかつ自発的に均質層を再形成する能力である。さ
らに、第1層は分離工程(不均質アッセイにおいて)お
よび補助試薬の混合工程(均質アッセイにおいて)の間
液体の形態でなくてはならない。
本発明の方法において固体として有用な水不混和性の
密な油について、液化は典型的には4〜50℃の範囲内で
起こる。ある場合において、溶融可能な水不混和性の密
な油の液化温度は、物質の混合物よりも高い温度で個々
に溶融する2種以上の物質を配合することによって調節
することができる。また、当業者にとって明らかなよう
に、ある場合において液化は溶融以外の手段により、例
えば、固体のポリマーの解重合によって達成することが
できる。
密な油について、液化は典型的には4〜50℃の範囲内で
起こる。ある場合において、溶融可能な水不混和性の密
な油の液化温度は、物質の混合物よりも高い温度で個々
に溶融する2種以上の物質を配合することによって調節
することができる。また、当業者にとって明らかなよう
に、ある場合において液化は溶融以外の手段により、例
えば、固体のポリマーの解重合によって達成することが
できる。
ほぼ1.04〜1.10の範囲の密度を有する第1層の物質ま
たはそれらの混合物、例えば、フタル酸ジプロピル、フ
タル酸ジブチル、桂皮酸メチル、桂皮酸エチル、桂皮酸
ブチル、クエン酸ブチル、フマル酸ジエチル、マレイン
酸ジエチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチルおよ
び酒石酸ジブチルは、遠心法用途のために特に好まし
い。洗剤をアッセイ混合物中に第1層と一緒に使用する
場合、好ましい第1層はフタル酸ブチル、桂皮酸エチ
ル、サリチル酸エチル、シリコーン油(表1、♯38)、
ジメチルジフェニルポリイソシクロヘキサンを包含す
る。なぜなら、これらのような物質は洗剤を含有する反
応混合物と共に望ましくない乳濁液を形成しないからで
ある。洗剤を使用ない場合、好ましい第1層の物質はコ
ハク酸ジエチル、アジピン酸メチル、コハク酸ジメチ
ル、サリチル酸エチル、マロン酸ジメチル、およびマロ
ン酸ジエチル物と混合したとき、2以上の透明な相に容
易に分離するからルを包含する。なぜなら、それらは洗
剤を欠く水性反応混合である。結合性成分がアッセイ容
器の表面に結合さる実施態様においてはフルオロカーボ
ン油の第1層がとくに好ましい。なぜなら、これらの油
は低い粘度および高い密度をもち、これらの性質はこの
ような実施態様において結合性成分からの水の完全な置
換を促進するからである。フルオロカーボン油は、ま
た、ポリスチレンのアッセイ容器をこのような油と一緒
に使用できるので、このような用途のために魅力的であ
る。アッセイ容器が透明なプラスチック、例えば、ポリ
スチレンであることを望む他の実施態様について、好ま
しい第1層の物質は桂皮酸メチルまたはイタコン酸メチ
ル(36℃以下で貯蔵される)、シリコーン油[表1、♯
38、「高い温度の」の融点の浴油、シグマ・ケミカル・
カンパニー(Sigma Chmical Co.)、米国ミゾリー州セ
ントルイス、またはアルドリッヒ・ケミカル・カンパニ
ー(Aldrich Chemical Co.)、米国ウィスコンシン州ミ
ルウォーキー]、およびジメチルジフェニルポリシロキ
シサンを包含する。第1層が0〜50℃の温度範囲のある
部分内で固体の形態であることを望む実施態様につい
て、桂皮酸メチル、桂皮酸エチル、イタコン酸ジメチ
ル、シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、酒石酸ジメ
チル、酒石酸ジエチル、酒石酸ジブチル、およびジフェ
ニルメアンが好ましい。遠心分離および0〜50℃の範囲
で固体の第1層の両者を利用する実施態様について、好
ましい第1層の物質は桂皮酸メチルおよびイタコン酸ジ
メチルである。
たはそれらの混合物、例えば、フタル酸ジプロピル、フ
タル酸ジブチル、桂皮酸メチル、桂皮酸エチル、桂皮酸
ブチル、クエン酸ブチル、フマル酸ジエチル、マレイン
酸ジエチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチルおよ
び酒石酸ジブチルは、遠心法用途のために特に好まし
い。洗剤をアッセイ混合物中に第1層と一緒に使用する
場合、好ましい第1層はフタル酸ブチル、桂皮酸エチ
ル、サリチル酸エチル、シリコーン油(表1、♯38)、
ジメチルジフェニルポリイソシクロヘキサンを包含す
る。なぜなら、これらのような物質は洗剤を含有する反
応混合物と共に望ましくない乳濁液を形成しないからで
ある。洗剤を使用ない場合、好ましい第1層の物質はコ
ハク酸ジエチル、アジピン酸メチル、コハク酸ジメチ
ル、サリチル酸エチル、マロン酸ジメチル、およびマロ
ン酸ジエチル物と混合したとき、2以上の透明な相に容
易に分離するからルを包含する。なぜなら、それらは洗
剤を欠く水性反応混合である。結合性成分がアッセイ容
器の表面に結合さる実施態様においてはフルオロカーボ
ン油の第1層がとくに好ましい。なぜなら、これらの油
は低い粘度および高い密度をもち、これらの性質はこの
ような実施態様において結合性成分からの水の完全な置
換を促進するからである。フルオロカーボン油は、ま
た、ポリスチレンのアッセイ容器をこのような油と一緒
に使用できるので、このような用途のために魅力的であ
る。アッセイ容器が透明なプラスチック、例えば、ポリ
スチレンであることを望む他の実施態様について、好ま
しい第1層の物質は桂皮酸メチルまたはイタコン酸メチ
ル(36℃以下で貯蔵される)、シリコーン油[表1、♯
38、「高い温度の」の融点の浴油、シグマ・ケミカル・
カンパニー(Sigma Chmical Co.)、米国ミゾリー州セ
ントルイス、またはアルドリッヒ・ケミカル・カンパニ
ー(Aldrich Chemical Co.)、米国ウィスコンシン州ミ
ルウォーキー]、およびジメチルジフェニルポリシロキ
シサンを包含する。第1層が0〜50℃の温度範囲のある
部分内で固体の形態であることを望む実施態様につい
て、桂皮酸メチル、桂皮酸エチル、イタコン酸ジメチ
ル、シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、酒石酸ジメ
チル、酒石酸ジエチル、酒石酸ジブチル、およびジフェ
ニルメアンが好ましい。遠心分離および0〜50℃の範囲
で固体の第1層の両者を利用する実施態様について、好
ましい第1層の物質は桂皮酸メチルおよびイタコン酸ジ
メチルである。
標識によって放射されまたは生成されるシグナルの性
質、または要求される洗浄の効果に依存して、1または
2以上の第2層を含めることが望ましいことがある。第
2層は表1からの適当な水不混和性物質を使用して形成
することができるが、第2層は、また、水溶性であるこ
とができる。水溶性の第2層を形成するために、あるい
は均質アッセイのような用途のためにアッセイ混合物の
密度を増加するために、典型的には物質を水中に溶解し
てその密度を増加させる。この目的に適当な物質の代表
的列挙を表2に示す。これらの物質は前述のような第2
層またはアッセイ混合物の成分として使用するためにこ
とによく適する。しかしながら、ある場合において、水
及び水不混和性物質の両者中で可溶性である物質(例え
ば、ホルムアミドまたはジメチルスルホキシド)を第1
層内に使用することができる。他の実施態様において、
ホルムアミドはDNAハイブリダイゼーションアッセイ混
合物および/またはこのようなアッセイのための第1層
中に含めて、ポリヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーシ
ョンを促進することができる。
質、または要求される洗浄の効果に依存して、1または
2以上の第2層を含めることが望ましいことがある。第
2層は表1からの適当な水不混和性物質を使用して形成
することができるが、第2層は、また、水溶性であるこ
とができる。水溶性の第2層を形成するために、あるい
は均質アッセイのような用途のためにアッセイ混合物の
密度を増加するために、典型的には物質を水中に溶解し
てその密度を増加させる。この目的に適当な物質の代表
的列挙を表2に示す。これらの物質は前述のような第2
層またはアッセイ混合物の成分として使用するためにこ
とによく適する。しかしながら、ある場合において、水
及び水不混和性物質の両者中で可溶性である物質(例え
ば、ホルムアミドまたはジメチルスルホキシド)を第1
層内に使用することができる。他の実施態様において、
ホルムアミドはDNAハイブリダイゼーションアッセイ混
合物および/またはこのようなアッセイのための第1層
中に含めて、ポリヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーシ
ョンを促進することができる。
均質酵素標識イムノアッセイとともに使用するため、
酵素基質を含有する水性第2層はアッセイ混合物と同一
または同様な密度を有することができる。このような実
施態様においては、第1層は典型的には発色前のインキ
ュベーションの間において固体であろう。例えば、第1
層がアッセイ混合物および第2層の両者より密度が低い
場合、第1層は溶融のときアッセイ容器の上部に浮くで
あろう。これはアッセイ混合物および基質含有第2層を
アッセイ容器の底に沈めさせるであろう。この実施態様
においては、第1層の物質は、密度がより大きい不混和
性第2層上に分散させた後固化できる場合、水より密度
は低いことができる。いくつかの磁性粒子をアッセイ容
器内に含める場合、第1層の液化後、電磁石を使用して
アッセイ混合物および第2層を効果的に混合することが
できる。
酵素基質を含有する水性第2層はアッセイ混合物と同一
または同様な密度を有することができる。このような実
施態様においては、第1層は典型的には発色前のインキ
ュベーションの間において固体であろう。例えば、第1
層がアッセイ混合物および第2層の両者より密度が低い
場合、第1層は溶融のときアッセイ容器の上部に浮くで
あろう。これはアッセイ混合物および基質含有第2層を
アッセイ容器の底に沈めさせるであろう。この実施態様
においては、第1層の物質は、密度がより大きい不混和
性第2層上に分散させた後固化できる場合、水より密度
は低いことができる。いくつかの磁性粒子をアッセイ容
器内に含める場合、第1層の液化後、電磁石を使用して
アッセイ混合物および第2層を効果的に混合することが
できる。
さらに、補助アッセイ成分を第1層または第2層中に
含めて、シグナルの生成または検出を促進することが望
ましいことがある。第1層または第2層のための添加剤
の例は、シンチレーション蛍光体、例えば、2,5−ジフ
ェニルオキサゾール(PPO)または1,4−ビス[5−フェ
ニル−1,2−オキサゾリル]ベンゼン(POPOP)であり、
これらは標識をシンチレーションカウンターでこのよう
な蛍光体を使用して検出できる場合、第1層または第2
層中に含めることができる。第2層への添加剤は、ま
た、酵素、酵素前駆体、または酵素基質を包含すること
ができ、ここで標識はそれぞれ酵素基質、酵素前駆体活
性化剤、または酵素である。初期のインキュベーション
および遊離分析物からの結合物の分離後に標識をアッセ
イ混合物に添加する実施態様(例えば、ある種のサンド
イッチ結合アッセイ)において、第2層は標識(例え
ば、標識付けされた抗体)を含有することができる。
含めて、シグナルの生成または検出を促進することが望
ましいことがある。第1層または第2層のための添加剤
の例は、シンチレーション蛍光体、例えば、2,5−ジフ
ェニルオキサゾール(PPO)または1,4−ビス[5−フェ
ニル−1,2−オキサゾリル]ベンゼン(POPOP)であり、
これらは標識をシンチレーションカウンターでこのよう
な蛍光体を使用して検出できる場合、第1層または第2
層中に含めることができる。第2層への添加剤は、ま
た、酵素、酵素前駆体、または酵素基質を包含すること
ができ、ここで標識はそれぞれ酵素基質、酵素前駆体活
性化剤、または酵素である。初期のインキュベーション
および遊離分析物からの結合物の分離後に標識をアッセ
イ混合物に添加する実施態様(例えば、ある種のサンド
イッチ結合アッセイ)において、第2層は標識(例え
ば、標識付けされた抗体)を含有することができる。
第2層を、また、チャオトロープ剤(chaotropic age
nt)、例えば、塩類、尿素、塩化グアジニウム、非イオ
ン性洗剤、イオン性洗剤などを含有するように配合し
て、非特異的結合を減少することができる。いずれの場
合においても、これらの添加剤は、結合性成分がこのよ
うな層を通して動く間、特異的に結合した標識をその結
合性成分から有意に解離されるために十分であってはな
らない。第1層および第2層の両者は、また、連続的ま
たは不連続の勾配として配合することができる。例え
ば、シュークロース層は、ほぼ5重量%からほぼ40重量
%に増加する濃度の勾配として配合することができる。
あるいは、交互する層を配合することができ、ここで各
連続層はその隣接層と実質的に不混和性でありかつ異な
る密度を有することができる。例えば、このような勾配
は交互する炭化水素層およびフルオロカーボン層から、
あるいは交互する水性層および非水性層から構成できる
であろう。このような勾配は、好ましくは層の偶発的混
合(例えば、取扱いの間)に対して抵抗性であり、最も
好ましくは偶発的に混合した場合再生するように、自律
形成性である。
nt)、例えば、塩類、尿素、塩化グアジニウム、非イオ
ン性洗剤、イオン性洗剤などを含有するように配合し
て、非特異的結合を減少することができる。いずれの場
合においても、これらの添加剤は、結合性成分がこのよ
うな層を通して動く間、特異的に結合した標識をその結
合性成分から有意に解離されるために十分であってはな
らない。第1層および第2層の両者は、また、連続的ま
たは不連続の勾配として配合することができる。例え
ば、シュークロース層は、ほぼ5重量%からほぼ40重量
%に増加する濃度の勾配として配合することができる。
あるいは、交互する層を配合することができ、ここで各
連続層はその隣接層と実質的に不混和性でありかつ異な
る密度を有することができる。例えば、このような勾配
は交互する炭化水素層およびフルオロカーボン層から、
あるいは交互する水性層および非水性層から構成できる
であろう。このような勾配は、好ましくは層の偶発的混
合(例えば、取扱いの間)に対して抵抗性であり、最も
好ましくは偶発的に混合した場合再生するように、自律
形成性である。
前述のように、本発明の目的のため、用語「クッショ
ン」は単独であるいは組み合わせで使用されるすべての
第1層または第2層を包含すると定義される。異なる実
施態様におけるクッションの体積は、可変であり、そし
て多数の因子、例えば、とくに使用される標識、検出の
方法、アッセイの要求される感度、およびアッセイ混合
物の体積に依存するであろう。クッションの体積および
配合の両者は、実験的に決定することができる。しかし
ながら、大抵のアイソトープを用いる用途について、未
結合標識標識から発生する放射能をシールドすることが
必要な場合、2.5容量のクッション対1容量の試料の比
が適切であろう。
ン」は単独であるいは組み合わせで使用されるすべての
第1層または第2層を包含すると定義される。異なる実
施態様におけるクッションの体積は、可変であり、そし
て多数の因子、例えば、とくに使用される標識、検出の
方法、アッセイの要求される感度、およびアッセイ混合
物の体積に依存するであろう。クッションの体積および
配合の両者は、実験的に決定することができる。しかし
ながら、大抵のアイソトープを用いる用途について、未
結合標識標識から発生する放射能をシールドすることが
必要な場合、2.5容量のクッション対1容量の試料の比
が適切であろう。
多層のクッションの実施態様について、そして非特異
的結合が適切に低い場合、第1層の体積は用いる条件下
で1または2以上の第2層からアッセイ混合物を完全に
隔離するために十分であればよい。典型的には、競合ア
ッセイについて、ほぼ3〜4%の非特異的結合が許容さ
れうるが、1〜2%であるのが非常によい。過剰の標識
を使用できるサンドイッチアッセイについて、非特異的
結合は0.2%以下であることが要求されるであろう。非
特異的結合は、標識および結合性成分の物理的性質によ
って決定され、そして変化するであろう。
的結合が適切に低い場合、第1層の体積は用いる条件下
で1または2以上の第2層からアッセイ混合物を完全に
隔離するために十分であればよい。典型的には、競合ア
ッセイについて、ほぼ3〜4%の非特異的結合が許容さ
れうるが、1〜2%であるのが非常によい。過剰の標識
を使用できるサンドイッチアッセイについて、非特異的
結合は0.2%以下であることが要求されるであろう。非
特異的結合は、標識および結合性成分の物理的性質によ
って決定され、そして変化するであろう。
例えば、96ウェルのプレートを使用するとき、1容量
の第1層対1容量の試料の比が通常適切であろう。第1
層が試料の負荷の間固体の形態である場合、あるいはア
ッセイ混合物がすべての第1層および第2層と不混和性
である場合、より少ない量の第1層を使用することがで
きるであろう。
の第1層対1容量の試料の比が通常適切であろう。第1
層が試料の負荷の間固体の形態である場合、あるいはア
ッセイ混合物がすべての第1層および第2層と不混和性
である場合、より少ない量の第1層を使用することがで
きるであろう。
アッセイ容器の形状寸法および向き、アッセイ混合
物、およびクッションは特定の用途よって支配されるで
あろう。遠心分離または重量分離を含む典型的な使用に
おいて、多くの型の試験管または多ウェルプレートの1
つを使用することができる。大抵の使用において、試
料、結合性成分、および第2成分は便利に添加され、混
合され、そしてあらかじめ分配された第1層と接触して
インキュベーションされる。ある場合において、結合性
成分および/または第2成分は、クッションと一緒に、
密閉したアッセイ容器/分離容器内であらかじめ分配す
ることができる。このような場合において、より少数の
成分(1程度に少ない、試料)を混合およびインキュベ
ーションの前に使用さが添加することが必要である。
物、およびクッションは特定の用途よって支配されるで
あろう。遠心分離または重量分離を含む典型的な使用に
おいて、多くの型の試験管または多ウェルプレートの1
つを使用することができる。大抵の使用において、試
料、結合性成分、および第2成分は便利に添加され、混
合され、そしてあらかじめ分配された第1層と接触して
インキュベーションされる。ある場合において、結合性
成分および/または第2成分は、クッションと一緒に、
密閉したアッセイ容器/分離容器内であらかじめ分配す
ることができる。このような場合において、より少数の
成分(1程度に少ない、試料)を混合およびインキュベ
ーションの前に使用さが添加することが必要である。
追加の機会は磁気分離を使用して得られ、ここで1ま
たは2以上の層をアッセイ混合物に対して横方向に向け
ることができ、あるいは反応混合物の密度が1または2
以上の層のそれより大きい場合、反応混合物より上に向
けることができる。
たは2以上の層をアッセイ混合物に対して横方向に向け
ることができ、あるいは反応混合物の密度が1または2
以上の層のそれより大きい場合、反応混合物より上に向
けることができる。
結合性成分をアッセイ容器の表面へ結合せしめる場
合、アッセイ混合物はアッセイ容器の底において結合性
成分と接触させて予備平衡化することができる。未結合
標識からの結合した標識の分離を達成するために、第1
層の物質をアッセイ容器に注ぐかあるいはピペットに入
れて、密度が低い第2成分(未結合標識を含む)を第1
層の上部に置換する。ある場合において、第2層を第1
層の添加と同時にあるいはそれに引続いて添加すること
ができる。
合、アッセイ混合物はアッセイ容器の底において結合性
成分と接触させて予備平衡化することができる。未結合
標識からの結合した標識の分離を達成するために、第1
層の物質をアッセイ容器に注ぐかあるいはピペットに入
れて、密度が低い第2成分(未結合標識を含む)を第1
層の上部に置換する。ある場合において、第2層を第1
層の添加と同時にあるいはそれに引続いて添加すること
ができる。
B.結合性成分において使用する固相 結合性成分は通常2つの部分からなる:固相、および
特異的結合活性を付与するそれに結合された特異的結合
剤である。いくつかの型の固相が特異的結合アッセイの
実施において有用である。一般に、それらは3つの型で
ある:あらかじめ形成された粒子、容器の表面、および
特異的に結合性の成分に取付けることができかつ結合ア
ッセイの間に不溶性とされることのできる可溶性ポリマ
ーである。これらの固相の型の各々について、特異的な
結合活性は固有の性質であってもよく、あるいは後刻
「特異的結合剤」と呼ぶ固相に特異的結合性質を付与す
る物質の共有結合または非共有結合によって発生させる
ことができる。
特異的結合活性を付与するそれに結合された特異的結合
剤である。いくつかの型の固相が特異的結合アッセイの
実施において有用である。一般に、それらは3つの型で
ある:あらかじめ形成された粒子、容器の表面、および
特異的に結合性の成分に取付けることができかつ結合ア
ッセイの間に不溶性とされることのできる可溶性ポリマ
ーである。これらの固相の型の各々について、特異的な
結合活性は固有の性質であってもよく、あるいは後刻
「特異的結合剤」と呼ぶ固相に特異的結合性質を付与す
る物質の共有結合または非共有結合によって発生させる
ことができる。
あらかじめ形成された粒子の固相は、安定化された微
生物の懸濁液、例えば、免疫グロブリン結合分子である
「プロテインA」を自然に生産するスタフィロコッカス
・アウレウス(Staphylococcus aureus)菌株を包含す
る。あるいは、固相は微生物以外の鉱物(ヒドロキシア
パタイト、ガラス、または金属)の粒子の懸濁液、不溶
性ポリマーのピーズ(例えば、デキストラン[セファデ
ックス(Sephadex)G−10またはG−25]、アガロー
ス、またはポリスチレン)であることができる。これら
の微生物以外の粒子のあるものは、自然に有用な活性を
示す(例えば、ヒドロキシアパタイト)。しかしなが
ら、大抵の他のものは適当な物質により、この分野にお
いてよく知られた手順を使用して被覆しなくはならな
い。上に記載したこれらの固相は、また、固有の磁性ま
たは常磁性をもつように調製することができ、あるいは
それらを示すことができ、これらの性質は結合した標識
の未結合標識からの分離あるいは混合のために利用でき
る。非磁性、非遠心の実施態様について、好ましい固相
物質は非常に高い密度の粒子、例えば、プラスチック被
覆した金属ビーズ(典型的には直径3〜6mm)を包含す
る。これらは、この分野においてよく知られているよう
に、金属ビーズを溶液、例えば、アセトンまたはクロロ
ホルム中に溶解したポリスチレン中に浸漬し、次いでビ
ーズを取り出し、溶媒を蒸発させ、次いでビーズを1種
または2種以上の特異的結合剤、例えば、抗体とともに
インキュベーションすることによって容易に製造するこ
とができる。
生物の懸濁液、例えば、免疫グロブリン結合分子である
「プロテインA」を自然に生産するスタフィロコッカス
・アウレウス(Staphylococcus aureus)菌株を包含す
る。あるいは、固相は微生物以外の鉱物(ヒドロキシア
パタイト、ガラス、または金属)の粒子の懸濁液、不溶
性ポリマーのピーズ(例えば、デキストラン[セファデ
ックス(Sephadex)G−10またはG−25]、アガロー
ス、またはポリスチレン)であることができる。これら
の微生物以外の粒子のあるものは、自然に有用な活性を
示す(例えば、ヒドロキシアパタイト)。しかしなが
ら、大抵の他のものは適当な物質により、この分野にお
いてよく知られた手順を使用して被覆しなくはならな
い。上に記載したこれらの固相は、また、固有の磁性ま
たは常磁性をもつように調製することができ、あるいは
それらを示すことができ、これらの性質は結合した標識
の未結合標識からの分離あるいは混合のために利用でき
る。非磁性、非遠心の実施態様について、好ましい固相
物質は非常に高い密度の粒子、例えば、プラスチック被
覆した金属ビーズ(典型的には直径3〜6mm)を包含す
る。これらは、この分野においてよく知られているよう
に、金属ビーズを溶液、例えば、アセトンまたはクロロ
ホルム中に溶解したポリスチレン中に浸漬し、次いでビ
ーズを取り出し、溶媒を蒸発させ、次いでビーズを1種
または2種以上の特異的結合剤、例えば、抗体とともに
インキュベーションすることによって容易に製造するこ
とができる。
ある粒子は分析物と非生物学的機構で特異的に結合す
る。1つのこのような実施態様において、グリコシル化
ヘモグロビンは、バイオラド(BioRad)、米国カリフォ
ルニア州リッチモンドからのイオン交換樹脂に結合し、
そしてピアース・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemi
cal Co.)、米国イリノイ州ロックフォードからのもの
のようなホウ酸をそれらの表面上に有する粒子に特異的
に結合する。このような粒子は血液中のこの分析物の百
分率をカラムクロマトグラフィーによって決定するため
に使用され、そしてこれらの粒子および関連する粒子は
本発明の方法における結合性成分の役目をするために適
する。
る。1つのこのような実施態様において、グリコシル化
ヘモグロビンは、バイオラド(BioRad)、米国カリフォ
ルニア州リッチモンドからのイオン交換樹脂に結合し、
そしてピアース・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemi
cal Co.)、米国イリノイ州ロックフォードからのもの
のようなホウ酸をそれらの表面上に有する粒子に特異的
に結合する。このような粒子は血液中のこの分析物の百
分率をカラムクロマトグラフィーによって決定するため
に使用され、そしてこれらの粒子および関連する粒子は
本発明の方法における結合性成分の役目をするために適
する。
結合性成分は、また、アッセイ容器を予備被覆するこ
とによって製造することができる。最も安定な予備被覆
アッセイ容器は、結合活性に寄与する分子を相互におよ
び/またはアッセイ容器の表面に化学的に架橋すること
によって製造されるであろう。このような被覆されたア
ッセイ容器(マウス、ウサギ、ヤギに対する抗IgG)
は、例えば、マイクロメディック・システムス・インコ
ーポレーテッド(Micromedic Systems,Inc.)、(米国
ペンジルベニア州ホーシャム)から商業的に入手可能で
ある。
とによって製造することができる。最も安定な予備被覆
アッセイ容器は、結合活性に寄与する分子を相互におよ
び/またはアッセイ容器の表面に化学的に架橋すること
によって製造されるであろう。このような被覆されたア
ッセイ容器(マウス、ウサギ、ヤギに対する抗IgG)
は、例えば、マイクロメディック・システムス・インコ
ーポレーテッド(Micromedic Systems,Inc.)、(米国
ペンジルベニア州ホーシャム)から商業的に入手可能で
ある。
あるいは、固相はアッセイ混合物のインキュベーショ
ンの間またはそれに引続いて、有用な結合剤に結合した
可溶性サブユニットを重合または凝集させることによっ
て製造することができる。すべての反応成分が溶液中に
存在するとき、反応の平衡はより急速に達成されるの
で、このようなアプローチは予備形成した不溶性結合性
成分を使用する方法よりも短いインキュベーション時間
を提供する。
ンの間またはそれに引続いて、有用な結合剤に結合した
可溶性サブユニットを重合または凝集させることによっ
て製造することができる。すべての反応成分が溶液中に
存在するとき、反応の平衡はより急速に達成されるの
で、このようなアプローチは予備形成した不溶性結合性
成分を使用する方法よりも短いインキュベーション時間
を提供する。
イムノアッセイにおいて、結合性成分は典型的には、
特異的結合剤、例えば、抗体、抗原、プロテインA、ま
たはビオチンを、固相に吸着されたあるいはそれに化学
的に結合した形態で含有するであろう。容量が高い固相
はスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を抗体
(非常に強く結合する、ことにウサギまたは霊長類のIg
G)で予備被覆することによってつくることができる。
使用すべき特異的抗体がウサギまたは霊長類からのもの
でない場合、ウサギまたは霊長類抗−免疫グロブリン抗
体を予備吸着させて種特異的高い容量の結合性成分をつ
くることができる[Frohmanら、J.Lab.Clin.Med.,93614
−621、1979およびBennetおよびO′Keefe,J.Biol.Che
m.、1980、ここに引用によって加える]。安定性を最大
にするために、このような予備吸着した結合性成分を化
学的に安定化して(例えば、グルタルアルデヒドまたは
カーボンジイミドで)結合剤の分子を互いにおよび/ま
たは結合性成分の粒子表面に架橋結合するすることがで
きる。これらの変性された「生物学的」固相は、免疫グ
ロブリン分子からの干渉、例えば、血清試料中において
高いレベルで起こる干渉を経験しないという利点を有す
る。
特異的結合剤、例えば、抗体、抗原、プロテインA、ま
たはビオチンを、固相に吸着されたあるいはそれに化学
的に結合した形態で含有するであろう。容量が高い固相
はスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を抗体
(非常に強く結合する、ことにウサギまたは霊長類のIg
G)で予備被覆することによってつくることができる。
使用すべき特異的抗体がウサギまたは霊長類からのもの
でない場合、ウサギまたは霊長類抗−免疫グロブリン抗
体を予備吸着させて種特異的高い容量の結合性成分をつ
くることができる[Frohmanら、J.Lab.Clin.Med.,93614
−621、1979およびBennetおよびO′Keefe,J.Biol.Che
m.、1980、ここに引用によって加える]。安定性を最大
にするために、このような予備吸着した結合性成分を化
学的に安定化して(例えば、グルタルアルデヒドまたは
カーボンジイミドで)結合剤の分子を互いにおよび/ま
たは結合性成分の粒子表面に架橋結合するすることがで
きる。これらの変性された「生物学的」固相は、免疫グ
ロブリン分子からの干渉、例えば、血清試料中において
高いレベルで起こる干渉を経験しないという利点を有す
る。
遠心の用途のために好ましい粒子の固相は、適当な密
度および粒子サイズを有して、標準的な実験室および臨
床的遠心機内で急速回転沈降し、しかもアッセイ容器へ
の分配の間懸濁したままであるものである。また、使用
されるべき標識の非特異性結合が低くかつ高い再現性を
もって製造できる結合容量の特性が好ましい。スタフィ
ロコッカス・アウレウス(S.aureus)の商用調製物[ベ
ーリング・ダイアグノスチクス(Behring Diagnostic
s)、カリフォルニア州サンジエゴおよびイムレ・コー
ポレーション(Imre Corp.)、ワシントン州シアトル]
は、これらの望ましい性質を示す。化学的に安定化され
た抗−免疫グロブリン被覆スタフィロコッカス・アウレ
ウス(S.aureus)の懸濁液はベーリング・ダイアグノス
チクス(Behring Diagnostics)から商業的に入手可能
である。
度および粒子サイズを有して、標準的な実験室および臨
床的遠心機内で急速回転沈降し、しかもアッセイ容器へ
の分配の間懸濁したままであるものである。また、使用
されるべき標識の非特異性結合が低くかつ高い再現性を
もって製造できる結合容量の特性が好ましい。スタフィ
ロコッカス・アウレウス(S.aureus)の商用調製物[ベ
ーリング・ダイアグノスチクス(Behring Diagnostic
s)、カリフォルニア州サンジエゴおよびイムレ・コー
ポレーション(Imre Corp.)、ワシントン州シアトル]
は、これらの望ましい性質を示す。化学的に安定化され
た抗−免疫グロブリン被覆スタフィロコッカス・アウレ
ウス(S.aureus)の懸濁液はベーリング・ダイアグノス
チクス(Behring Diagnostics)から商業的に入手可能
である。
遠心分離を用いる実施態様のための他の望ましい固相
は、セファデックスG10、G15、およびG25[ファーマシ
ア(Pharmacia)であり、これらは過塩素酸塩で酸化さ
れて、蛋白質および他の分子上のアミノ基との化学的結
合に適するアルデヒドを形成することができる。大きい
分子はこれらの粒子のマトリックスから排除されるた
め、ほとんどの標識の非特異的結合は非常に低く、そし
て適当な化学剤(例えば、塩化ナトリウム>0.1モル)
のアッセイ溶液中に含めることによって、さらに、最小
とすることができる。
は、セファデックスG10、G15、およびG25[ファーマシ
ア(Pharmacia)であり、これらは過塩素酸塩で酸化さ
れて、蛋白質および他の分子上のアミノ基との化学的結
合に適するアルデヒドを形成することができる。大きい
分子はこれらの粒子のマトリックスから排除されるた
め、ほとんどの標識の非特異的結合は非常に低く、そし
て適当な化学剤(例えば、塩化ナトリウム>0.1モル)
のアッセイ溶液中に含めることによって、さらに、最小
とすることができる。
C.アッセイ法 簡潔のため、本発明の特異的結合アッセイを抗原およ
び抗体によって説明する。しかしながら、当業者にとっ
て明らかなように、任意の実質的に特異的な結合の対を
本発明において使用することができ、これれらは次のも
のを包含するが、これらに限定されない:すなわち相補
的核酸配列の結合;レクチン類と炭水化物との結合;ホ
ルモンと受容体との結合;ビタミンと輸送蛋白質との結
合;および免疫グロブリンと非免疫グロブリンである抗
体結合性蛋白質との結合等である。
び抗体によって説明する。しかしながら、当業者にとっ
て明らかなように、任意の実質的に特異的な結合の対を
本発明において使用することができ、これれらは次のも
のを包含するが、これらに限定されない:すなわち相補
的核酸配列の結合;レクチン類と炭水化物との結合;ホ
ルモンと受容体との結合;ビタミンと輸送蛋白質との結
合;および免疫グロブリンと非免疫グロブリンである抗
体結合性蛋白質との結合等である。
本発明のアッセイは、この分野においてよく知られて
いる種々の標識付け物質のいずれを使用することもでき
る。これらは次のものを包含するが、これらに限定され
ない:ラジオアイソトープ(例えば、32−P、3−H、
124−I、35−S、14−C);酵素(例えば、セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ベータガラクト
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキ
シダーゼ、エンテロペプチダーゼ);蛍光団(例えば、
フルオレセイ、ローダミン、ダンシル、フィコビリタン
パク質、ナイルブルー(Nile blue)、テキサスレッド
(Texas red)、ウンベリフェロン);発光体または発
光体源物質;遷移金属キレート;酵素基質、コファクタ
ー、または阻害剤;粒子(例えば、磁性、色素、高い屈
折率);および酵素。これらは一部分次の刊行物によっ
て例示されている:米国特許第4,181,636号;米国特許
第4,401,765号;米国特許第3,646,346号;米国特許第4,
201,763号;米国特許第3,992,631号;米国特許第4,160,
016号;米国特許出願第486016号[欧州特許出願(EP)0
123265A1号]、これらのすべてを引用によってここに加
える。
いる種々の標識付け物質のいずれを使用することもでき
る。これらは次のものを包含するが、これらに限定され
ない:ラジオアイソトープ(例えば、32−P、3−H、
124−I、35−S、14−C);酵素(例えば、セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、ベータガラクト
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキ
シダーゼ、エンテロペプチダーゼ);蛍光団(例えば、
フルオレセイ、ローダミン、ダンシル、フィコビリタン
パク質、ナイルブルー(Nile blue)、テキサスレッド
(Texas red)、ウンベリフェロン);発光体または発
光体源物質;遷移金属キレート;酵素基質、コファクタ
ー、または阻害剤;粒子(例えば、磁性、色素、高い屈
折率);および酵素。これらは一部分次の刊行物によっ
て例示されている:米国特許第4,181,636号;米国特許
第4,401,765号;米国特許第3,646,346号;米国特許第4,
201,763号;米国特許第3,992,631号;米国特許第4,160,
016号;米国特許出願第486016号[欧州特許出願(EP)0
123265A1号]、これらのすべてを引用によってここに加
える。
特異的結合アッセイを実施できる種々の機能的の立体
的配置は、この分野においてよく知られており、そし
て、例えば、Maggio(編者),Enzyme Immuno assay,CRC
プレス、米国フロリダ州ボカレイトン、1980(ここに引
用によって加える)に広く記載されている。本発明の方
法を用いるいくつかの実施例を下に記載する。これらの
方法を使用して広範な種類の分析物の存在および/また
は量を検出することができる。代表的分析物は、欧州特
許(EP)128,265号に列挙されている。
的配置は、この分野においてよく知られており、そし
て、例えば、Maggio(編者),Enzyme Immuno assay,CRC
プレス、米国フロリダ州ボカレイトン、1980(ここに引
用によって加える)に広く記載されている。本発明の方
法を用いるいくつかの実施例を下に記載する。これらの
方法を使用して広範な種類の分析物の存在および/また
は量を検出することができる。代表的分析物は、欧州特
許(EP)128,265号に列挙されている。
簡単に述べると、競合イムノアッセイにおいては、抗
原(分析物)を含有すると疑われる試料および既知量の
標識付けされた抗原(トレーサー)を限定された量の分
析物特異的抗体について競合させる。不均質競合イムノ
アッセイにおいては、固相上に固定化されて結合性成分
を構成する抗−免疫グロブリン抗体またはスタフィロコ
ッカス(Staphylococcas)プロテインAを、同時にある
いは引続く工程において添加する。特異的結合が起こる
間のインキュベーション後、結合性成分を1または2以
上の層のクッションに通過させ、これにより結合した標
識を未結合標識から分離する。均質競合酵素標識アッセ
イにおいては、アッセイ混合物をクッションに通過させ
て、第2層中の酵素基質発色発剤と混合させる。
原(分析物)を含有すると疑われる試料および既知量の
標識付けされた抗原(トレーサー)を限定された量の分
析物特異的抗体について競合させる。不均質競合イムノ
アッセイにおいては、固相上に固定化されて結合性成分
を構成する抗−免疫グロブリン抗体またはスタフィロコ
ッカス(Staphylococcas)プロテインAを、同時にある
いは引続く工程において添加する。特異的結合が起こる
間のインキュベーション後、結合性成分を1または2以
上の層のクッションに通過させ、これにより結合した標
識を未結合標識から分離する。均質競合酵素標識アッセ
イにおいては、アッセイ混合物をクッションに通過させ
て、第2層中の酵素基質発色発剤と混合させる。
結合性成分(不均質アッセイにおいて)またはアッセ
イ混合物(均質アッセイにおいて)は重力のためにクッ
ションを通過することができるか、あるいはアッセイ容
器を遠心力に暴露することができる。結合性成分が磁化
可能であるか、あるいは磁性である場合、アッセイ容器
を磁場に暴露して結合性成分をクッションを通して動か
すか、あるいは混合のために動かすことができる。次い
で、結合した標識の存在または量を標識に対する適当な
手段により決定し、そして試料中最初に存在する分析物
の存在または量を、1系列の既知の標識との比較によっ
て、関係づける。例えば、ガンマカウンターまたはシン
チレーションカウターはラジオアイソトープの検出に適
し、分光光度計は光を吸収する物質または溶液の検出に
適する。
イ混合物(均質アッセイにおいて)は重力のためにクッ
ションを通過することができるか、あるいはアッセイ容
器を遠心力に暴露することができる。結合性成分が磁化
可能であるか、あるいは磁性である場合、アッセイ容器
を磁場に暴露して結合性成分をクッションを通して動か
すか、あるいは混合のために動かすことができる。次い
で、結合した標識の存在または量を標識に対する適当な
手段により決定し、そして試料中最初に存在する分析物
の存在または量を、1系列の既知の標識との比較によっ
て、関係づける。例えば、ガンマカウンターまたはシン
チレーションカウターはラジオアイソトープの検出に適
し、分光光度計は光を吸収する物質または溶液の検出に
適する。
反応混合物を構成するすべての試薬(結合性成分およ
び標識を包含する)を予備混合し、そして試料の添加に
よってアッセイを開始する。この場合において、反応は
典型的には実質的にまたは完全に平衡化させた後、結合
性成分またはアッセイ混合物を第1層に通過させる。こ
のような実施態様においては、インキュベーション期間
の正確なタイミングは不必要である。あるいは、試料お
よび標識を予備混合し、そして試薬混合物に同時に添加
し、そして固定した間隔の間インキュベーションして非
平衡混合物を形成し、次いで結合性成分(不均質アッセ
イのために)または混合物全体を第1層に通過させるこ
とができる。
び標識を包含する)を予備混合し、そして試料の添加に
よってアッセイを開始する。この場合において、反応は
典型的には実質的にまたは完全に平衡化させた後、結合
性成分またはアッセイ混合物を第1層に通過させる。こ
のような実施態様においては、インキュベーション期間
の正確なタイミングは不必要である。あるいは、試料お
よび標識を予備混合し、そして試薬混合物に同時に添加
し、そして固定した間隔の間インキュベーションして非
平衡混合物を形成し、次いで結合性成分(不均質アッセ
イのために)または混合物全体を第1層に通過させるこ
とができる。
競合結合アッセイの別なものとして、不均質サンドイ
ッチアッセイを実施することができる。サンドイッチイ
ムノアッセイのため、分析物を過剰で存在できる2種類
の抗体とともにインキュベーションし、一方の抗体は固
定化されているか、あるいは固定化することができ(結
合性成分である)、そして他方の抗体は標識に接合され
ている。抗体は分析物上の2つの異なる非競合的決定因
子(エピトープ)に対して向けることができるか、ある
いは分析物上に多数の反復する決定因子が存在する場
合、それらは同一の決定因子に向けることができる。
ッチアッセイを実施することができる。サンドイッチイ
ムノアッセイのため、分析物を過剰で存在できる2種類
の抗体とともにインキュベーションし、一方の抗体は固
定化されているか、あるいは固定化することができ(結
合性成分である)、そして他方の抗体は標識に接合され
ている。抗体は分析物上の2つの異なる非競合的決定因
子(エピトープ)に対して向けることができるか、ある
いは分析物上に多数の反復する決定因子が存在する場
合、それらは同一の決定因子に向けることができる。
サンドイッチイムノアッセイは、分析物および抗体を
添加する順序に依存して、同時的、先進的または逆方向
的配置[米国特許第4,376,110号(ここに引用によって
加える)、に記載されているような]で実施することが
できる。次いで、分析物を介して固相に結合する標識付
けされた抗体は、前述のように、クッションを通過させ
ることによって未結合標識から分離し、そして結合した
標識の量をその標識にとって適当な手段により決定す
る。
添加する順序に依存して、同時的、先進的または逆方向
的配置[米国特許第4,376,110号(ここに引用によって
加える)、に記載されているような]で実施することが
できる。次いで、分析物を介して固相に結合する標識付
けされた抗体は、前述のように、クッションを通過させ
ることによって未結合標識から分離し、そして結合した
標識の量をその標識にとって適当な手段により決定す
る。
あるサンドイッチアッセイは結合性成分の添加、引続
く結合した標識および未結合標識の分離、及びこれに続
く標識(標識付けされた抗体)の添加を必要とする。本
発明において、結合性成分への標識の添加は第2層中で
起こさせることができるであろう。これは、このような
アッセイ法における手動工程を排除し、便利さを加え、
そして誤差の機会を減少するという利点を有する。最も
末端の第2層へ移動に先立つ特異的第2層への結合性成
分の選択的移動は、適当な順序に力を加えること、およ
び適当な密度をもつ第1層および第2層の選択によって
達成することができる。例えば、低速および高速の遠心
分離を利用して、結合性成分をまず中間の第2層に通
し、次いでより末端の高密度の層に通過させることがで
きるであろう。あるいは、第1分離工程の間に維持した
温度より高い溶融温度をもつ水不混和性第2層を使用で
きるであろう。温度はこの固体の第2層の融点より高く
してアッセイを完結することができるであろう。
く結合した標識および未結合標識の分離、及びこれに続
く標識(標識付けされた抗体)の添加を必要とする。本
発明において、結合性成分への標識の添加は第2層中で
起こさせることができるであろう。これは、このような
アッセイ法における手動工程を排除し、便利さを加え、
そして誤差の機会を減少するという利点を有する。最も
末端の第2層へ移動に先立つ特異的第2層への結合性成
分の選択的移動は、適当な順序に力を加えること、およ
び適当な密度をもつ第1層および第2層の選択によって
達成することができる。例えば、低速および高速の遠心
分離を利用して、結合性成分をまず中間の第2層に通
し、次いでより末端の高密度の層に通過させることがで
きるであろう。あるいは、第1分離工程の間に維持した
温度より高い溶融温度をもつ水不混和性第2層を使用で
きるであろう。温度はこの固体の第2層の融点より高く
してアッセイを完結することができるであろう。
サンドイッチイムノアッセイのための結合性成分は、
非標識付け抗体を固相に、例えば、カーボジイミド化学
またはシッフの塩基の化学を介して、共有結合させるこ
とによって調製することができる。あるいは、抗体はプ
ロテインA、抗−免疫グロブリンを介して、あるいは
「粘着性」固相、例えば、ポリスチレンの表面への非特
異的吸着を介して非共有結合的に固相へ取付けることが
できる。固相は、前述のように、この分野において知ら
れた種々の物質から選択することができる。サンドイッ
チアッセイは、両者の抗体を過剰で存在させることがで
き、それゆえアッセイの感度は抗体の親和定数によって
厳格に限定されないという利点を提供する。
非標識付け抗体を固相に、例えば、カーボジイミド化学
またはシッフの塩基の化学を介して、共有結合させるこ
とによって調製することができる。あるいは、抗体はプ
ロテインA、抗−免疫グロブリンを介して、あるいは
「粘着性」固相、例えば、ポリスチレンの表面への非特
異的吸着を介して非共有結合的に固相へ取付けることが
できる。固相は、前述のように、この分野において知ら
れた種々の物質から選択することができる。サンドイッ
チアッセイは、両者の抗体を過剰で存在させることがで
き、それゆえアッセイの感度は抗体の親和定数によって
厳格に限定されないという利点を提供する。
本発明の1つの面において、非競合的サンドイッチ結
合アッセイを使用して試料中の抗体を選択することがで
き、こうしてそれは臨床的血清学において、およびハイ
ブリドーマの培養物のスクリーニングにおいて有用であ
る。例えば、抗−マウスIgGまたは抗原を前述のように
固相上に被覆することができる。ハイブリドーマのスク
リーニングにおいて使用する標準的手順に比較して、操
作の実質的な減少が、本発明を用いて達成することがで
きる。追加の利点は、抗体が固相に結合する場合、1ナ
ノモル以下の標識付けされた抗原への結合を検出するこ
とによって高い親和性の抗体の迅速な選択が可能である
という利点である。
合アッセイを使用して試料中の抗体を選択することがで
き、こうしてそれは臨床的血清学において、およびハイ
ブリドーマの培養物のスクリーニングにおいて有用であ
る。例えば、抗−マウスIgGまたは抗原を前述のように
固相上に被覆することができる。ハイブリドーマのスク
リーニングにおいて使用する標準的手順に比較して、操
作の実質的な減少が、本発明を用いて達成することがで
きる。追加の利点は、抗体が固相に結合する場合、1ナ
ノモル以下の標識付けされた抗原への結合を検出するこ
とによって高い親和性の抗体の迅速な選択が可能である
という利点である。
D.インキュベーションおよび分離のためのアッセイ容器 クッション(第1層および任意の第2層)を収容する
容器を、ここで「アッセイ容器」と呼ぶ。アッセイ容器
の異なる大きさおよび形状を使用する多数の幾何学的配
置が本発明の範囲内で可能である。第1A図を参照する
と、ほとんどの用途において、ここで第1層12からなる
クッションがアッセイ容器10内に収容され、このアッセ
イ容器10はその末端または底端13で閉じられている。
容器を、ここで「アッセイ容器」と呼ぶ。アッセイ容器
の異なる大きさおよび形状を使用する多数の幾何学的配
置が本発明の範囲内で可能である。第1A図を参照する
と、ほとんどの用途において、ここで第1層12からなる
クッションがアッセイ容器10内に収容され、このアッセ
イ容器10はその末端または底端13で閉じられている。
アッセイ容器は、細長い室16を構成する実質的に円筒
形の本体14を有する。第1層12は室内を略横方向に延び
てその中にバリヤーを形成し、このバリヤーは室の体積
の典型的にはほぼ1/3〜7/8、好ましくは、15/24〜3/4を
充たす。第1層の最適な体積は、一部分アッセイ容器の
形状寸法、標識の性質、検出法および、存在する場合装
置、および存在する場合シールドによって決定されるで
あろう。
形の本体14を有する。第1層12は室内を略横方向に延び
てその中にバリヤーを形成し、このバリヤーは室の体積
の典型的にはほぼ1/3〜7/8、好ましくは、15/24〜3/4を
充たす。第1層の最適な体積は、一部分アッセイ容器の
形状寸法、標識の性質、検出法および、存在する場合装
置、および存在する場合シールドによって決定されるで
あろう。
第一層および第2層の両者を使用する場合、典型的に
は第2層の体積は第1層の体積に等しいか、あるいはそ
れより大きい。2層より多い層を使用する場合、末端の
層が典型的には最大である。当業者にとって明らかなよ
うに、使用する第1層対第2層の比は使用する特定の層
の物質、使用する標識および結合性成分の性質によって
影響を受けるであろう。例えば、酵素を標識として使用
しかつ酵素基質が第2層への添加剤である場合、第1層
対第2層の比を小さく(典型的には1:10程度に小さく)
して感度を最大にすることができる。これと対照的に、
標識が蛍光物質でありかつ第2層を利用して検出のため
の最適な溶媒の環境をつくる場合、この比は大きく(5:
1程度に大きく)することができる。
は第2層の体積は第1層の体積に等しいか、あるいはそ
れより大きい。2層より多い層を使用する場合、末端の
層が典型的には最大である。当業者にとって明らかなよ
うに、使用する第1層対第2層の比は使用する特定の層
の物質、使用する標識および結合性成分の性質によって
影響を受けるであろう。例えば、酵素を標識として使用
しかつ酵素基質が第2層への添加剤である場合、第1層
対第2層の比を小さく(典型的には1:10程度に小さく)
して感度を最大にすることができる。これと対照的に、
標識が蛍光物質でありかつ第2層を利用して検出のため
の最適な溶媒の環境をつくる場合、この比は大きく(5:
1程度に大きく)することができる。
適当なアッセイ容器は、試験管またはウェル、あるい
は多ウェルプレート中のウェルの群を包含する。アッセ
イ容器は上部または基端17において再密閉可能であっ
て、使用者および環境を試料またはアッセイ試薬中の生
物災害または化学的災害から保護できることが好まし
い。また、貫通可能な隔膜18をもつアッセイ容器を提供
することが好ましい。簡単な金属箔またはポリエチレン
フィルムはこの目的に十分であるが、弾性シール、例え
ば、ゴム(例えば、シリコーン、ネオプレン、またはEP
DM)から作られた隔膜または熱溶融性成形可能なゴム様
プラスチックから作られた隔膜が好ましい。
は多ウェルプレート中のウェルの群を包含する。アッセ
イ容器は上部または基端17において再密閉可能であっ
て、使用者および環境を試料またはアッセイ試薬中の生
物災害または化学的災害から保護できることが好まし
い。また、貫通可能な隔膜18をもつアッセイ容器を提供
することが好ましい。簡単な金属箔またはポリエチレン
フィルムはこの目的に十分であるが、弾性シール、例え
ば、ゴム(例えば、シリコーン、ネオプレン、またはEP
DM)から作られた隔膜または熱溶融性成形可能なゴム様
プラスチックから作られた隔膜が好ましい。
鈍い末端をもつ器具、例えば、鈍い針または使い捨て
ピペットの先端によって貫通可能な再密閉可能な隔膜
は、製作が容易であり使用が容易であり、しかも安全で
あるため、さらにいっそう好ましい。薄い領域を有する
ように前成形されているかあるいはスリットで完全又は
部分的にあらかじめカットして、液状アッセイ反応成分
の添加の間通気できるようにした、再密閉可能な弾性隔
膜はとくに好ましい。このような容器は製造のとき本質
的に永久的に密閉し、キャップの取扱いを排除し、しか
もアッセイ反応成分および/または試料の安全かつ便利
な添加を可能とする。
ピペットの先端によって貫通可能な再密閉可能な隔膜
は、製作が容易であり使用が容易であり、しかも安全で
あるため、さらにいっそう好ましい。薄い領域を有する
ように前成形されているかあるいはスリットで完全又は
部分的にあらかじめカットして、液状アッセイ反応成分
の添加の間通気できるようにした、再密閉可能な弾性隔
膜はとくに好ましい。このような容器は製造のとき本質
的に永久的に密閉し、キャップの取扱いを排除し、しか
もアッセイ反応成分および/または試料の安全かつ便利
な添加を可能とする。
ラジオアイソトープの応用のためには、アッセイ容器
は、強度および溶媒抵抗性をもつために、ポリエチレン
または、より好ましくは、ポリプロピレンから構成する
ことができる。アイソトープ以外の方法は、典型的に
は、最高の透明度を有するアッセイ容器から利益を得る
ことができ、このアッセイ容器はガラス、ポリスチレ
ン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、および光学
銘柄のポリプロピレン[ベクトン・ディクソン・ラブウ
ェアー(Becton Dickson Labware)、米国カリフォルニ
ア州オクスフォード]から作ることができる。本発明の
驚くべき特徴は、アイソトープ以外のアッセイに望まし
い透明プラスチック、例えば、ポリスチレンから構成さ
れた試験管は、このようなプラスチックが有機溶媒およ
び炭化水素油により損傷しやすいこととが知られている
にもかかわらずいくつかの第1層物質とともに使用する
ことができることである。ゴムおよび他の隔膜材料はプ
ラスチックまたはガラス管に容易に接着することができ
る。1つの実施態様においては、予備カットしたスリッ
トを含有する弾性隔膜を有する緊密な嵌合性の成形され
たキャップを使用する。他の実施態様においては、予備
カットしたスリットをもつゴムのディスクを、ポリマー
工業においてよく知られた方法により、管の上部に永久
的に締結する。例えば、シリコーン接着剤は、ガラスお
よびプラスチックを含含する多くの種類の管にシリコー
ンゴムを効果的に結合するであろう。適当な化学的プラ
イマー塗布を用いると、ポリプロピレン管を種々のゴ
ム、例えば、EPDMポリマーのブレンドに接着することが
できる。シアノアクリート接着剤は、プライマーを塗布
しなくてさえ、EPDMゴムをオリプロピレンに結合するで
あろう。
は、強度および溶媒抵抗性をもつために、ポリエチレン
または、より好ましくは、ポリプロピレンから構成する
ことができる。アイソトープ以外の方法は、典型的に
は、最高の透明度を有するアッセイ容器から利益を得る
ことができ、このアッセイ容器はガラス、ポリスチレ
ン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、および光学
銘柄のポリプロピレン[ベクトン・ディクソン・ラブウ
ェアー(Becton Dickson Labware)、米国カリフォルニ
ア州オクスフォード]から作ることができる。本発明の
驚くべき特徴は、アイソトープ以外のアッセイに望まし
い透明プラスチック、例えば、ポリスチレンから構成さ
れた試験管は、このようなプラスチックが有機溶媒およ
び炭化水素油により損傷しやすいこととが知られている
にもかかわらずいくつかの第1層物質とともに使用する
ことができることである。ゴムおよび他の隔膜材料はプ
ラスチックまたはガラス管に容易に接着することができ
る。1つの実施態様においては、予備カットしたスリッ
トを含有する弾性隔膜を有する緊密な嵌合性の成形され
たキャップを使用する。他の実施態様においては、予備
カットしたスリットをもつゴムのディスクを、ポリマー
工業においてよく知られた方法により、管の上部に永久
的に締結する。例えば、シリコーン接着剤は、ガラスお
よびプラスチックを含含する多くの種類の管にシリコー
ンゴムを効果的に結合するであろう。適当な化学的プラ
イマー塗布を用いると、ポリプロピレン管を種々のゴ
ム、例えば、EPDMポリマーのブレンドに接着することが
できる。シアノアクリート接着剤は、プライマーを塗布
しなくてさえ、EPDMゴムをオリプロピレンに結合するで
あろう。
アイソトープアッセイに殊に適する1つの好ましい実
施態様において、アッセイ容器はポリプロピレンにより
構成された、例えば、サルステット(Sarstedt)(ニュ
ージャージイ州プリンセトン)、ウェスト・コースト・
サイアンティフィック(West Coast Scientific)(カ
リフォルニア州エメリビレ)から、そして多数の他の製
造会社および販売会社から商業的に入手可能な、0.4ml
のマイクロ遠心管(適当な寸法5×45mm)である。
施態様において、アッセイ容器はポリプロピレンにより
構成された、例えば、サルステット(Sarstedt)(ニュ
ージャージイ州プリンセトン)、ウェスト・コースト・
サイアンティフィック(West Coast Scientific)(カ
リフォルニア州エメリビレ)から、そして多数の他の製
造会社および販売会社から商業的に入手可能な、0.4ml
のマイクロ遠心管(適当な寸法5×45mm)である。
第1A図に示されているように、アッセイ容器の使用の
間、特異的結合性成分26を含むアッセイ混合物24を第1
層12と接触させて配置する。アッセイ混合物の非結合性
成分からの結合性成分の分離と実質的に同時に、結合性
成分は第1層の入りかつ典型的には末端13へ入り続ける
であろう。
間、特異的結合性成分26を含むアッセイ混合物24を第1
層12と接触させて配置する。アッセイ混合物の非結合性
成分からの結合性成分の分離と実質的に同時に、結合性
成分は第1層の入りかつ典型的には末端13へ入り続ける
であろう。
ここで第1B図を参照すると、アッセイ容器10の別の大
きい(2ml)実施態様が示されている。他の同様な実施
態様は外部の寸法が、例えば、8×55、10×55、10×7
5、12×55、および12×75mmの試験管を使用する。この
実施態様の範囲内で、アッセイ容器によって構成される
室16は1または2以上の前形成されたビーズを受容する
ために十分な大きさをもち、これらのビーズは第1層12
の上表面上に最初に位置し、固体の形態である。特異的
結合剤をビーズに結合させて結合性成分26を形成する。
第1B図に示すように、クッションは第1層12および第2
層28からなる。第1層12はアッセイ混合物24と接触する
唯一の層であろう。第1層のインキュベーションおよび
液体の形態への第1層の転化後、結合した標識をもつ結
合性成分は第1層を通過し、第2層に入り、そしてアッ
セイ容器の末端12へ沈降する。第1A図に示すキャップ20
の代替物として、このアッセイ容器は適当なキャップ
(図示せず)とかみ合うことのできるねじ込み部分30を
有することができる。
きい(2ml)実施態様が示されている。他の同様な実施
態様は外部の寸法が、例えば、8×55、10×55、10×7
5、12×55、および12×75mmの試験管を使用する。この
実施態様の範囲内で、アッセイ容器によって構成される
室16は1または2以上の前形成されたビーズを受容する
ために十分な大きさをもち、これらのビーズは第1層12
の上表面上に最初に位置し、固体の形態である。特異的
結合剤をビーズに結合させて結合性成分26を形成する。
第1B図に示すように、クッションは第1層12および第2
層28からなる。第1層12はアッセイ混合物24と接触する
唯一の層であろう。第1層のインキュベーションおよび
液体の形態への第1層の転化後、結合した標識をもつ結
合性成分は第1層を通過し、第2層に入り、そしてアッ
セイ容器の末端12へ沈降する。第1A図に示すキャップ20
の代替物として、このアッセイ容器は適当なキャップ
(図示せず)とかみ合うことのできるねじ込み部分30を
有することができる。
液体の第1層を使用し、そして典型的には第2層を欠
く、第1B図に示すものに関係する実施態様において、結
合性成分26を最初にアッセイ容器の末端に位置させ、次
いでアッセイ混合物の他の成分とともにインキュベーシ
ョンする。最後に、第1層の物質をアッセイ容器中に注
ぐか、あるいは他の方法でその中に分配し、アッセイ容
器の底に洗浄された結合性成分および結合した標識を残
し、アッセイ混合物の他の成分(遊離の標識を含む)は
第1層の上部に移す。この実施態様または、アッセイ容
器の末端の内部表面が被覆されて結合性成分を形成して
いる場合に有効である。
く、第1B図に示すものに関係する実施態様において、結
合性成分26を最初にアッセイ容器の末端に位置させ、次
いでアッセイ混合物の他の成分とともにインキュベーシ
ョンする。最後に、第1層の物質をアッセイ容器中に注
ぐか、あるいは他の方法でその中に分配し、アッセイ容
器の底に洗浄された結合性成分および結合した標識を残
し、アッセイ混合物の他の成分(遊離の標識を含む)は
第1層の上部に移す。この実施態様または、アッセイ容
器の末端の内部表面が被覆されて結合性成分を形成して
いる場合に有効である。
ここで第2図を参照すると、第1B図に類似し多ウェル
プレート内にウェル32を使用する他の好ましい実施態様
が示されている。ある用途のために好ましい他の実施態
様は、標準的96ウェルのプレートの列の中に嵌合する1
または1.4mlの管[外径8mm、スカトロン(Skatron)A.
S.、ノルウェー国リエアー]のストリップを使用する。
これらの実施態様は貫通可能な隔膜で密閉することがで
き、典型的にはアイソトープ以外の標識を使用し、そし
て遠心力、重力、または磁力による達成される分離のた
めに適する。ウェル32は、一般に、開いた空間36を構成
する本体34からなる。ウェルは1または2以上のビー
ズ、およびあらかじめ分配された第1層、およびある場
合1または2以上のあらかじめ分配された第2層を受容
するために十分な大きさを有する。第2図に示す実施態
様において、ビーズを第1層12の上表面上に最初に位置
させる。ビーズはそれに結合された特異的結合剤を有
し、こうして結合性成分26を形成する。第1層より下に
第2層28が位置する。第1層のインキュベーションおよ
び液体の形態への転化後、結合した標識をもつ結合性成
分は第1層を通過し、第2層へ入り、そしてウェルの底
へ沈降する。第1層からウェルの底までの距離が短いた
め、この実施態様は磁力を用いる分離のためにことに適
する。
プレート内にウェル32を使用する他の好ましい実施態様
が示されている。ある用途のために好ましい他の実施態
様は、標準的96ウェルのプレートの列の中に嵌合する1
または1.4mlの管[外径8mm、スカトロン(Skatron)A.
S.、ノルウェー国リエアー]のストリップを使用する。
これらの実施態様は貫通可能な隔膜で密閉することがで
き、典型的にはアイソトープ以外の標識を使用し、そし
て遠心力、重力、または磁力による達成される分離のた
めに適する。ウェル32は、一般に、開いた空間36を構成
する本体34からなる。ウェルは1または2以上のビー
ズ、およびあらかじめ分配された第1層、およびある場
合1または2以上のあらかじめ分配された第2層を受容
するために十分な大きさを有する。第2図に示す実施態
様において、ビーズを第1層12の上表面上に最初に位置
させる。ビーズはそれに結合された特異的結合剤を有
し、こうして結合性成分26を形成する。第1層より下に
第2層28が位置する。第1層のインキュベーションおよ
び液体の形態への転化後、結合した標識をもつ結合性成
分は第1層を通過し、第2層へ入り、そしてウェルの底
へ沈降する。第1層からウェルの底までの距離が短いた
め、この実施態様は磁力を用いる分離のためにことに適
する。
シグナルの発生は遊離した標識を含有する第2成分か
ら分離した層中でのみ起こるので、第2図に示す実施態
様においてシールドは不必要である。好ましい実施態様
は酵素標識、第1層、および第2層を利用し、第1層は
インキュベーションの間固体の形態でありそして分離の
間に液体の形態に転化され、そして第2層は標識の存在
下に検出可能なシグナルを生成する酵素基質を含む。
ら分離した層中でのみ起こるので、第2図に示す実施態
様においてシールドは不必要である。好ましい実施態様
は酵素標識、第1層、および第2層を利用し、第1層は
インキュベーションの間固体の形態でありそして分離の
間に液体の形態に転化され、そして第2層は標識の存在
下に検出可能なシグナルを生成する酵素基質を含む。
標識が蛍光であり、そして検出器がウェルの底を通し
て「見」る他の好ましい実施態様において、クッション
の底領域中の側面の励起を使用して遊離標識の励起を防
止することができる。あるいは、このような場合におい
て、クエンチング剤(quenching agent)(例えば、蛍
光が標識である場合、ローダミンのような共鳴エネルギ
ー伝達受容体)を結合アッセイに添加することができ
る。蛍光クエンチング化合物の使用は均質結合アッセイ
について記載されている[U11manおよびSchwarzberg、
米国特許第3,996,345号、ここに引用によって加え
る]。クッションにより結合性成分から除去されるであ
ろうから、このようなクエンチャーは未結合標識の蛍光
をクエンチングするが、結合した標識のそれをクエンチ
ングぜず、不均質結合アッセイにおいて有用であろう。
粒状固相の水性区画がクッション中の通過によって除去
されないある場合において、アッセイ混合物中にこのよ
うなクエンチャーを含めることは非特異的シグナルを減
少するためにとくに有用であろう。
て「見」る他の好ましい実施態様において、クッション
の底領域中の側面の励起を使用して遊離標識の励起を防
止することができる。あるいは、このような場合におい
て、クエンチング剤(quenching agent)(例えば、蛍
光が標識である場合、ローダミンのような共鳴エネルギ
ー伝達受容体)を結合アッセイに添加することができ
る。蛍光クエンチング化合物の使用は均質結合アッセイ
について記載されている[U11manおよびSchwarzberg、
米国特許第3,996,345号、ここに引用によって加え
る]。クッションにより結合性成分から除去されるであ
ろうから、このようなクエンチャーは未結合標識の蛍光
をクエンチングするが、結合した標識のそれをクエンチ
ングぜず、不均質結合アッセイにおいて有用であろう。
粒状固相の水性区画がクッション中の通過によって除去
されないある場合において、アッセイ混合物中にこのよ
うなクエンチャーを含めることは非特異的シグナルを減
少するためにとくに有用であろう。
E.シールド 標識により放射または生成されるシグナルの性質およ
びクッションの高さに依存して、結合性成分から放射さ
れるシグナルのみが検出されるように、第2成分(遊離
標識を含む)を含有する容器の部分を物理的にシールド
することが望ましいこと、あるいは望まいくないことが
ある。第3図を参照すると、アッセイ容器が内部に配置
されている再使用可能な検出容器が示されている。検出
容器38は、一般に、内部の室42を構成する本体40からな
る。例えば、標識がガンマ放射性アイソトープである場
合、検出容器38の上部(およびある場合最末端)は、金
属または金属化シールド44を有することができ、このシ
ールド44は好ましくは鉛または鉛添加プラスチック、ま
たは銅から構成される。標識が蛍光団または発光体であ
る場合、検出容器の上部は光不透過性材料から構成され
たシールドを有することができる。明らかなように、あ
る用途において、異なるアッセイ容器および異なるシー
ルドが好ましいであろう。
びクッションの高さに依存して、結合性成分から放射さ
れるシグナルのみが検出されるように、第2成分(遊離
標識を含む)を含有する容器の部分を物理的にシールド
することが望ましいこと、あるいは望まいくないことが
ある。第3図を参照すると、アッセイ容器が内部に配置
されている再使用可能な検出容器が示されている。検出
容器38は、一般に、内部の室42を構成する本体40からな
る。例えば、標識がガンマ放射性アイソトープである場
合、検出容器38の上部(およびある場合最末端)は、金
属または金属化シールド44を有することができ、このシ
ールド44は好ましくは鉛または鉛添加プラスチック、ま
たは銅から構成される。標識が蛍光団または発光体であ
る場合、検出容器の上部は光不透過性材料から構成され
たシールドを有することができる。明らかなように、あ
る用途において、異なるアッセイ容器および異なるシー
ルドが好ましいであろう。
シールドが望ましい場合、シールド44は検出容器の本
体と一体的であることができるか、あるいは検出容器の
本体によって閉じられた別のシールドであることがで
き、その中にアッセイ容器10が滑動可能に嵌合する。後
者の配置は、一般に、その耐久性およびシールドのため
のよりすぐれた形状寸法のために好ましい。最良のシー
ルドの性能のために、シールドの穴は典型的には円筒形
でありかつアッセイ容器の便利な挿入および取出しのた
めに要求される最小の大きさをもつ。
体と一体的であることができるか、あるいは検出容器の
本体によって閉じられた別のシールドであることがで
き、その中にアッセイ容器10が滑動可能に嵌合する。後
者の配置は、一般に、その耐久性およびシールドのため
のよりすぐれた形状寸法のために好ましい。最良のシー
ルドの性能のために、シールドの穴は典型的には円筒形
でありかつアッセイ容器の便利な挿入および取出しのた
めに要求される最小の大きさをもつ。
第3図を参照すると、アッセイ容器10は放射線遮断材
料から構成されたシールド中に滑動可能に嵌合する。シ
ールドは両端が開いており、そしてシールド中にアッセ
イ容器を容易にすべりこませることができるために十分
に大きい内径を有する。1つのとくに便利な配置は、ア
ッセイ容器が試験管であり、そしてこの試験管がシール
ドの上部とかみ合いかつそれをシールド内に支持するリ
ップを有するものである。ほぼ0.4mlの体積を有するマ
イクロ遠心管は、多数の入手源から商業的に入手可能で
あり、そしてほぼ1/8インチの内径のシールドに容易に
滑動可能に出入させることができるであろう。同様な外
径を有するが、0.4mlの管より長い管は、ある用途にお
いて有利であろう。
料から構成されたシールド中に滑動可能に嵌合する。シ
ールドは両端が開いており、そしてシールド中にアッセ
イ容器を容易にすべりこませることができるために十分
に大きい内径を有する。1つのとくに便利な配置は、ア
ッセイ容器が試験管であり、そしてこの試験管がシール
ドの上部とかみ合いかつそれをシールド内に支持するリ
ップを有するものである。ほぼ0.4mlの体積を有するマ
イクロ遠心管は、多数の入手源から商業的に入手可能で
あり、そしてほぼ1/8インチの内径のシールドに容易に
滑動可能に出入させることができるであろう。同様な外
径を有するが、0.4mlの管より長い管は、ある用途にお
いて有利であろう。
この実施態様において、アッセイ容器は直径が小さい
ので、シールドも小さい直径であることができ、それゆ
え、上澄みまたはクッションから検出される散乱した放
射は比較的少ない。したがって、結合したラジオアイソ
トープ標識の検出は、先行技術の装置および方法と異な
り、未結合標識の不注意の同時的検出によって本質的に
妨害されない。
ので、シールドも小さい直径であることができ、それゆ
え、上澄みまたはクッションから検出される散乱した放
射は比較的少ない。したがって、結合したラジオアイソ
トープ標識の検出は、先行技術の装置および方法と異な
り、未結合標識の不注意の同時的検出によって本質的に
妨害されない。
シールドの組成は標識により放射されまたは生成する
シグナルの性質に依存して変化するであろうが、その設
計および材料は、アッセイ混合物の結合した(固体)の
成分および結合しない(上澄み)の成分の分離後、結合
しない分画中の標識の少なくとも90%、より典型的には
99%より大きい、最適には99.75%より大きい検出を遮
断するために十分なものである。
シグナルの性質に依存して変化するであろうが、その設
計および材料は、アッセイ混合物の結合した(固体)の
成分および結合しない(上澄み)の成分の分離後、結合
しない分画中の標識の少なくとも90%、より典型的には
99%より大きい、最適には99.75%より大きい検出を遮
断するために十分なものである。
例えば、標識がガンマ放射性アイソトープ、例えば、
125−ヨウ素である場合、シールドは鉛、鉛添加プラス
チック、銅、または他の適当な材料から構成できるであ
ろう。検出のため、環状結晶をもつガンマカウンターか
らなる器具[マイクロメディック・システムス(Microd
emic Systems)、ペンシルバニア州ホーシャム、LKBイ
ンスツルメンツ(Instruments)、マリイランド州ガイ
サーバーグ、およびベックマン・インスツルメンツ(Be
ckman Instruments)、カリフォルニア州ブレア、厚さ1
/8インチのスリーブ(外径3/8インチ、内径1/4イン
チ)]は、強度(製作の操作および使用時の少なくとも
3000×gまでの遠心に耐える)および放射線の遮断のき
わめて優れた組み合わせを提供する。しかしながら、Ma
ckenzie,[J.Immunol,Methods、67:201−203、1984、
(ここに引用によって加える)]は、鉛の非常に薄い
(1mm)シートは125−ヨウ素の線量の99.999964%を遮
断することを計算した。こうして、99.0%の遮断を達成
するためには、1インチの厚さのわずかに3600万分の1
の鉛箔を理論的に必要とするだけである。
125−ヨウ素である場合、シールドは鉛、鉛添加プラス
チック、銅、または他の適当な材料から構成できるであ
ろう。検出のため、環状結晶をもつガンマカウンターか
らなる器具[マイクロメディック・システムス(Microd
emic Systems)、ペンシルバニア州ホーシャム、LKBイ
ンスツルメンツ(Instruments)、マリイランド州ガイ
サーバーグ、およびベックマン・インスツルメンツ(Be
ckman Instruments)、カリフォルニア州ブレア、厚さ1
/8インチのスリーブ(外径3/8インチ、内径1/4イン
チ)]は、強度(製作の操作および使用時の少なくとも
3000×gまでの遠心に耐える)および放射線の遮断のき
わめて優れた組み合わせを提供する。しかしながら、Ma
ckenzie,[J.Immunol,Methods、67:201−203、1984、
(ここに引用によって加える)]は、鉛の非常に薄い
(1mm)シートは125−ヨウ素の線量の99.999964%を遮
断することを計算した。こうして、99.0%の遮断を達成
するためには、1インチの厚さのわずかに3600万分の1
の鉛箔を理論的に必要とするだけである。
高い一体性の鉛箔(0.006インチおよび0.012インチの
厚さ)は商業的に入手可能であり[ニュークリアー・ア
ソシエーツ(Nuclear Associates)、ニューヨーク州カ
ールプレイス]そして1/8インチの厚さのスリーブより
非常に小さい重量で本質的に完全な放射線シールドを提
供する。1/8インチの厚さのスリーブが望まいくないほ
どに重い用途において、鉛箔を使用してシールドを形成
できる。成形した鉛または鉛箔から製造した鉛被覆また
は鉛含有複合プラスチックまたは布はくは、また、効果
的な軽量シールド材料である。このような箔および薄い
フィルムのために、強度はプラスチック支持スリーブに
よって提供される。鉛以外の金属、例えば、黄銅を包含
する他の材料を125−ヨウ素によって放射されるものを
包含する放射線のためのシールドとして使用できる。
厚さ)は商業的に入手可能であり[ニュークリアー・ア
ソシエーツ(Nuclear Associates)、ニューヨーク州カ
ールプレイス]そして1/8インチの厚さのスリーブより
非常に小さい重量で本質的に完全な放射線シールドを提
供する。1/8インチの厚さのスリーブが望まいくないほ
どに重い用途において、鉛箔を使用してシールドを形成
できる。成形した鉛または鉛箔から製造した鉛被覆また
は鉛含有複合プラスチックまたは布はくは、また、効果
的な軽量シールド材料である。このような箔および薄い
フィルムのために、強度はプラスチック支持スリーブに
よって提供される。鉛以外の金属、例えば、黄銅を包含
する他の材料を125−ヨウ素によって放射されるものを
包含する放射線のためのシールドとして使用できる。
標識がベータ放射性アイソトープ、例えば、チタンま
たは32−リンである場合、シールドは不透明プラスチッ
クから構成することができる。標識が蛍光団または発光
体である場合、シールドは黒色プラスチックであること
ができる。しかしながら、ほとんどの用途において、標
識、例えば、蛍光団および低エネルギーのベータ放射性
ラジオアイソトープはシールドを必要としないであろ
う。
たは32−リンである場合、シールドは不透明プラスチッ
クから構成することができる。標識が蛍光団または発光
体である場合、シールドは黒色プラスチックであること
ができる。しかしながら、ほとんどの用途において、標
識、例えば、蛍光団および低エネルギーのベータ放射性
ラジオアイソトープはシールドを必要としないであろ
う。
必要な場合、シールドはアッセイ容器の上のほぼ75%
およびアッセイ容器の上のほぼ90%よりなくマスクする
ように設計される。一般の目的のシールドは、典型的に
は、シールドされない部分46における検出可能な標識を
有意に減少しないで、できるだけ長いであろう。環状の
結晶を有するガンマカウンターおよびアッセイ容器、例
えば、第1A図に示すものについて、外径3/8インチ、内
径1/8インチ、長さほぼ1 3/8インチの鉛のスリーブが
好ましい。このようなアッセイ容器は、典型的には、ほ
ぼ250μlのクッション液体および10μl以下の結合性
成分を含有する。しかしながら、ある検出器具および異
なるクッション高さについて、シールドの長さおよびク
ッションの体積および/または結合性成分の体積の変更
が望ましいであろう。
およびアッセイ容器の上のほぼ90%よりなくマスクする
ように設計される。一般の目的のシールドは、典型的に
は、シールドされない部分46における検出可能な標識を
有意に減少しないで、できるだけ長いであろう。環状の
結晶を有するガンマカウンターおよびアッセイ容器、例
えば、第1A図に示すものについて、外径3/8インチ、内
径1/8インチ、長さほぼ1 3/8インチの鉛のスリーブが
好ましい。このようなアッセイ容器は、典型的には、ほ
ぼ250μlのクッション液体および10μl以下の結合性
成分を含有する。しかしながら、ある検出器具および異
なるクッション高さについて、シールドの長さおよびク
ッションの体積および/または結合性成分の体積の変更
が望ましいであろう。
検出器がアッセイ管の底付近の中央に位置する場合、
下のシールドは望ましくない放射を遮断するであろうか
ら、アッセイ混合物の一部または全部を横方向にシール
ドすることは不必要であることがある。この形態のシー
ルドは効果的にはスカートであり、そしてシールドが働
いておりかつアッセイ容器がその最終位置に存在する間
でさえ、アッセイ混合物を直接観察できる(例えば、ク
ッションの上部への試薬の添加の間に)という追加の利
点を有する。
下のシールドは望ましくない放射を遮断するであろうか
ら、アッセイ混合物の一部または全部を横方向にシール
ドすることは不必要であることがある。この形態のシー
ルドは効果的にはスカートであり、そしてシールドが働
いておりかつアッセイ容器がその最終位置に存在する間
でさえ、アッセイ混合物を直接観察できる(例えば、ク
ッションの上部への試薬の添加の間に)という追加の利
点を有する。
アッセイ容器をそれ自体内に収容することに加えて、
シールドは、第3図に示すように、検出容器の本体の内
側に嵌合すべきである。検出容器を底で閉じ、そして同
様によく上部で密閉することができ、あるいは密閉しな
いことができる。典型的には、検出容器の本体は試験管
であり、その内径はシールドの外径より十分に大きくし
て、半永久的アセンブリーの目的でその中に緊密にすべ
り込ませることができるようにする。第3図に示すよう
に、シールドはシム48を有することができ、シム48は、
好ましくは、接着性紙ラベル、ニカワ、または適当な弾
性材料から構成して、検出容器内のシールドの位置を維
持する。
シールドは、第3図に示すように、検出容器の本体の内
側に嵌合すべきである。検出容器を底で閉じ、そして同
様によく上部で密閉することができ、あるいは密閉しな
いことができる。典型的には、検出容器の本体は試験管
であり、その内径はシールドの外径より十分に大きくし
て、半永久的アセンブリーの目的でその中に緊密にすべ
り込ませることができるようにする。第3図に示すよう
に、シールドはシム48を有することができ、シム48は、
好ましくは、接着性紙ラベル、ニカワ、または適当な弾
性材料から構成して、検出容器内のシールドの位置を維
持する。
ポリプロピレン、ポリエチレン、またはガラスから構
成され、典型的にはほぼ12×75または12×55mmの外側寸
法を有する試験管が、検出容器の本体として使用するた
めに適当である。このような管は種々の製造元から商業
的に入手可能であり、そしてガンマカウンターおよび/
またはシンチレーションカウタンーの中に容易の嵌合す
るということにおいて有利である。0.4mlのアッセイ容
器が検出容器の内壁上に結合する拘束キャップを有する
場合、簡単な工具[例えば、スタンレイ・ツール・カン
パニー(Stanley Tool Company)からの61−008型]を
使用してアッセイ容器の挿入および取出しを行なうこと
ができる。あるいは、短い(12×55cm)検出容器をこの
ようなアッセイ容器と一緒に使用できる。なぜなら、拘
束キャップを有するアッセイ容器は工具を使用しないで
容易に挿入しかつ取出すことができるからである。
成され、典型的にはほぼ12×75または12×55mmの外側寸
法を有する試験管が、検出容器の本体として使用するた
めに適当である。このような管は種々の製造元から商業
的に入手可能であり、そしてガンマカウンターおよび/
またはシンチレーションカウタンーの中に容易の嵌合す
るということにおいて有利である。0.4mlのアッセイ容
器が検出容器の内壁上に結合する拘束キャップを有する
場合、簡単な工具[例えば、スタンレイ・ツール・カン
パニー(Stanley Tool Company)からの61−008型]を
使用してアッセイ容器の挿入および取出しを行なうこと
ができる。あるいは、短い(12×55cm)検出容器をこの
ようなアッセイ容器と一緒に使用できる。なぜなら、拘
束キャップを有するアッセイ容器は工具を使用しないで
容易に挿入しかつ取出すことができるからである。
一般に、プラスチック管(ことにポリプロピレン)
は、破壊の危険がなくかつ典型的にはより大きい遠心力
に耐えることができるので、検出容器の本体として使用
するためにガラス管より好ましい。一般に、また、検出
容器は再使用可能であることが好ましい。
は、破壊の危険がなくかつ典型的にはより大きい遠心力
に耐えることができるので、検出容器の本体として使用
するためにガラス管より好ましい。一般に、また、検出
容器は再使用可能であることが好ましい。
前述の外径3/8インチの鉛の円筒を使用して作ったシ
ールド内でアッセイ容器を直接遠心する好ましい実施態
様においては、検出容器は円筒部材50によって支持され
たシールドを内部に収容するであろう。このような円筒
部材50は好ましくはプラスチック、例えば、ポリスチレ
ンから構成され、そしてアッセイ容器を一定高さに支持
するために、シールドから末端のレベルにおいて閉じる
ことができる。
ールド内でアッセイ容器を直接遠心する好ましい実施態
様においては、検出容器は円筒部材50によって支持され
たシールドを内部に収容するであろう。このような円筒
部材50は好ましくはプラスチック、例えば、ポリスチレ
ンから構成され、そしてアッセイ容器を一定高さに支持
するために、シールドから末端のレベルにおいて閉じる
ことができる。
ほとんどの商業的に入手可能なガンマカウンターは前
述の直径3/8インチの鉛円筒を使用してすぐれたシール
ドを示すが、ウェル型結晶を有するあるもの(ことに4
より多い結晶を有する多くのガンマカウンター)はシー
ルドの設計の変更を必要とする。前述のように1端が閉
じた支持体円筒は、適当なシールド材料、例えば、鉛か
ら作られたシールドディスク52を含有できる。このディ
スクは部材50によって形成されたウェルの底に位置し
て、アッセイ容器の長軸を略平行に移動する非結合標識
の放射線からのガンマカウンターを遮断する。この設計
の驚くべき利点は、すべてのガンマカウンターを使用し
て改良されたシールドが得られると同時に、アッセイ容
器の末端に位置する結合した標識の検出可能性をほんの
わずかに減少させるだけであるということである。
述の直径3/8インチの鉛円筒を使用してすぐれたシール
ドを示すが、ウェル型結晶を有するあるもの(ことに4
より多い結晶を有する多くのガンマカウンター)はシー
ルドの設計の変更を必要とする。前述のように1端が閉
じた支持体円筒は、適当なシールド材料、例えば、鉛か
ら作られたシールドディスク52を含有できる。このディ
スクは部材50によって形成されたウェルの底に位置し
て、アッセイ容器の長軸を略平行に移動する非結合標識
の放射線からのガンマカウンターを遮断する。この設計
の驚くべき利点は、すべてのガンマカウンターを使用し
て改良されたシールドが得られると同時に、アッセイ容
器の末端に位置する結合した標識の検出可能性をほんの
わずかに減少させるだけであるということである。
前述の方法で構成すると、すなわち、ここの記載する
ようにクッションを予備充填しかつ検出容器の本体内の
シールド中に滑動可能に嵌合した内側アッセイ容器で
は、シールドが円筒部材によって支持される場合、1つ
の液体添加(試料)工程および結合した標識の検出前の
1つの短時間の遠心工程の少ない工程で、特異的結合ア
ッセイを自己収容マイクロ管内で急速にかつ便利に実施
することができる。ある場合において、遠心工程は排除
することができる。例えば、1つのこのような場合は、
高密度の粒子および溶融可能な第1層を使用して重力の
分離を用いる場合である。これらの結合アッセイ法は、
このようなアッセイを実施する大抵の実験室において現
在入手可能な装置を使用できる。これらのアッセイは、
現在実施されている特異的結合アッセイ法と比較して、
時間、熟練した労力、およびラジオアイソトープの廃棄
物の体積をかなり減少させて達成することができる。匹
敵する利点はアイソトープおよびアイソトープ以外の両
者の用途について経験されるであろう。
ようにクッションを予備充填しかつ検出容器の本体内の
シールド中に滑動可能に嵌合した内側アッセイ容器で
は、シールドが円筒部材によって支持される場合、1つ
の液体添加(試料)工程および結合した標識の検出前の
1つの短時間の遠心工程の少ない工程で、特異的結合ア
ッセイを自己収容マイクロ管内で急速にかつ便利に実施
することができる。ある場合において、遠心工程は排除
することができる。例えば、1つのこのような場合は、
高密度の粒子および溶融可能な第1層を使用して重力の
分離を用いる場合である。これらの結合アッセイ法は、
このようなアッセイを実施する大抵の実験室において現
在入手可能な装置を使用できる。これらのアッセイは、
現在実施されている特異的結合アッセイ法と比較して、
時間、熟練した労力、およびラジオアイソトープの廃棄
物の体積をかなり減少させて達成することができる。匹
敵する利点はアイソトープおよびアイソトープ以外の両
者の用途について経験されるであろう。
F.クッションおよびシールドの組み合わせた使用 驚くべきかつ価値ある特徴は、水不混和性第1層およ
び放射線シールドの組み合わせた使用において本質的で
ある。抗体被覆管または大きい抗体被覆ビーズを使用す
る最も便利な現在入手可能なアイソトープアッセイでさ
え、熟練者により、あるいは複雑な液体取扱い装置によ
り、インキュベーションの前および後に処理しなくては
ならない。このような処理は、遊離の標識を除去するた
めに、インキュベーション後の洗浄溶液の添加、吸引ま
たはデカンテーション、および通常これらの工程の反復
を含む。これらの工程は不便であるばかりでなく、かつ
また試料における生物災害およびラジオアイソトープア
ッセイの成分からの放射能の両者からのこぼれおよび汚
染の危険をもたらす。
び放射線シールドの組み合わせた使用において本質的で
ある。抗体被覆管または大きい抗体被覆ビーズを使用す
る最も便利な現在入手可能なアイソトープアッセイでさ
え、熟練者により、あるいは複雑な液体取扱い装置によ
り、インキュベーションの前および後に処理しなくては
ならない。このような処理は、遊離の標識を除去するた
めに、インキュベーション後の洗浄溶液の添加、吸引ま
たはデカンテーション、および通常これらの工程の反復
を含む。これらの工程は不便であるばかりでなく、かつ
また試料における生物災害およびラジオアイソトープア
ッセイの成分からの放射能の両者からのこぼれおよび汚
染の危険をもたらす。
注意して制御しないと、この洗浄はいくつかの理由で
不利である。第1に、アッセイの精度は洗浄工程の間に
起こり、シグナルを潜在的に減少させる抗体−抗原複合
体の解離に悩まされることがある。これは、抗体および
抗原の間の単一の結合が形成されるモノエピトープアッ
セイ(例えば、小さい抗原を使用する、あるいはモノク
ローナル抗体を使用する多くのアッセイにおいて)にお
いてはことに有意である。さらに、従来の不均質結合ア
ッセイにおける洗浄液体の体積はアッセイ混合物の体積
よりかなり大きくなくてはならず、そして洗浄体積が大
きくなるほど、洗浄手順はより有効である。この洗浄溶
液を、典型的には吸着パッド上へのデカンテーションに
よって、除去するとき、初期の混合物の体積に比較して
放射性廃棄物の体積の有意な増加が生ずる。
不利である。第1に、アッセイの精度は洗浄工程の間に
起こり、シグナルを潜在的に減少させる抗体−抗原複合
体の解離に悩まされることがある。これは、抗体および
抗原の間の単一の結合が形成されるモノエピトープアッ
セイ(例えば、小さい抗原を使用する、あるいはモノク
ローナル抗体を使用する多くのアッセイにおいて)にお
いてはことに有意である。さらに、従来の不均質結合ア
ッセイにおける洗浄液体の体積はアッセイ混合物の体積
よりかなり大きくなくてはならず、そして洗浄体積が大
きくなるほど、洗浄手順はより有効である。この洗浄溶
液を、典型的には吸着パッド上へのデカンテーションに
よって、除去するとき、初期の混合物の体積に比較して
放射性廃棄物の体積の有意な増加が生ずる。
本発明の価値がありかつ驚くべき特徴は、前述の洗浄
溶液を排除でき、そして試薬をアッセイ容器内に完全に
収容して保持できるということである。この特徴は、従
来の方法に比較して安全性を改良する。なぜなら、潜在
的に危険な材料(例えば、放射能および/または感染物
質)が安全で便利な廃棄のために完全に収容されている
からである。アッセイ混合物の挿入に引続いて、特別の
技能および注意の必要性が排除される。他の驚くべき特
徴は、水不混和性層を混合物の体積に関して小さくする
ことができ、そして伝統的に不均質アッセイにおいて使
用された典型的な洗浄体積よりも非常に小さくすること
ができることである。結合性成分がクッションを通過す
ると、結合性成分は新しい媒質に連続的に直面し、こう
して小さい体積で効果的に洗浄される。
溶液を排除でき、そして試薬をアッセイ容器内に完全に
収容して保持できるということである。この特徴は、従
来の方法に比較して安全性を改良する。なぜなら、潜在
的に危険な材料(例えば、放射能および/または感染物
質)が安全で便利な廃棄のために完全に収容されている
からである。アッセイ混合物の挿入に引続いて、特別の
技能および注意の必要性が排除される。他の驚くべき特
徴は、水不混和性層を混合物の体積に関して小さくする
ことができ、そして伝統的に不均質アッセイにおいて使
用された典型的な洗浄体積よりも非常に小さくすること
ができることである。結合性成分がクッションを通過す
ると、結合性成分は新しい媒質に連続的に直面し、こう
して小さい体積で効果的に洗浄される。
上記の配置は、また、先行技術よりの有意の改良を表
わす。なぜなら、アッセイと結合性成分との間の不混和
性相の導入は、未結合標識の分画からの結合した標識の
分離の精度および完全さを劇的増加するからである。前
述のシールド特徴と組み合わされたこの不混和性相は、
自己収容結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ
を効果的に実施できるようにさせる。このようなアッセ
イにおける結合した標識および未結合標識の分離は事実
上瞬間的であり、かつ結合対のための相互作用の緊密性
を特徴ずける場合の用途のための平衡結合アッセイのデ
ータを生成できる。
わす。なぜなら、アッセイと結合性成分との間の不混和
性相の導入は、未結合標識の分画からの結合した標識の
分離の精度および完全さを劇的増加するからである。前
述のシールド特徴と組み合わされたこの不混和性相は、
自己収容結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ
を効果的に実施できるようにさせる。このようなアッセ
イにおける結合した標識および未結合標識の分離は事実
上瞬間的であり、かつ結合対のための相互作用の緊密性
を特徴ずける場合の用途のための平衡結合アッセイのデ
ータを生成できる。
アッセイ容器およびシールドの形状寸法は、両者とも
細長くかつ直径が比較的小さく、測定する合計のシグナ
ルへの散乱した放射の寄与を事実上排除し、それゆえデ
ータの数学的補正は実際に不必要である。アッセイ混合
物およびその成分は第1層で不混和性であるので、混合
物のインキュベーションの間希釈または解離は起こら
ず、そしてシュークロースおよび関連する物質をバリヤ
ーとして使用する先行技術において観察されるような結
合対の解離は起こらない。こうして混合およびインキュ
ベーションの工程を含むアッセイ全体を第1層と接触さ
せて実施することができ、インキュベーションした混合
物のクッション上への移送の必要性が排除され、あるい
は先行技術におけるような、インキュベーションした混
合物より下へのシュークロースのような物質の洗浄溶液
の注入の必要性が排除される。
細長くかつ直径が比較的小さく、測定する合計のシグナ
ルへの散乱した放射の寄与を事実上排除し、それゆえデ
ータの数学的補正は実際に不必要である。アッセイ混合
物およびその成分は第1層で不混和性であるので、混合
物のインキュベーションの間希釈または解離は起こら
ず、そしてシュークロースおよび関連する物質をバリヤ
ーとして使用する先行技術において観察されるような結
合対の解離は起こらない。こうして混合およびインキュ
ベーションの工程を含むアッセイ全体を第1層と接触さ
せて実施することができ、インキュベーションした混合
物のクッション上への移送の必要性が排除され、あるい
は先行技術におけるような、インキュベーションした混
合物より下へのシュークロースのような物質の洗浄溶液
の注入の必要性が排除される。
本発明の他の特徴は、アッセイ容器または大きい高密
度のビーズへ結合された結合性成分の使用で明らかであ
る。密度が第2成分より高いが、大きいビーズ(使用す
る場合)より小さい水不混和性クッションを、必要に応
じて、アッセイの終りに添加し、未結合標識および他の
アッセイ混合物の成分をアッセイ容器から除去すること
を必要としないで、遊離した標識から結合した標識を分
離することができる。
度のビーズへ結合された結合性成分の使用で明らかであ
る。密度が第2成分より高いが、大きいビーズ(使用す
る場合)より小さい水不混和性クッションを、必要に応
じて、アッセイの終りに添加し、未結合標識および他の
アッセイ混合物の成分をアッセイ容器から除去すること
を必要としないで、遊離した標識から結合した標識を分
離することができる。
水不混和性液体上でのアッセイ混合物のインキュベー
ションを用いる結合アッセイの他の寄与は、混合物の体
積の劇的な減少である。可視のペレットの操作は不必要
であり、そしてアッセイ混合物の成分は第1層の上部上
にあらかじめ分配することができる。このようなあらか
じめ分配されるアッセイ混合物の成分は液体として貯蔵
するか、あるいは濃縮および/または凍結乾燥により安
定化し、次いで再水和または少量の(例えば10μl)の
試料の添加により使用のため希釈することができる。
ションを用いる結合アッセイの他の寄与は、混合物の体
積の劇的な減少である。可視のペレットの操作は不必要
であり、そしてアッセイ混合物の成分は第1層の上部上
にあらかじめ分配することができる。このようなあらか
じめ分配されるアッセイ混合物の成分は液体として貯蔵
するか、あるいは濃縮および/または凍結乾燥により安
定化し、次いで再水和または少量の(例えば10μl)の
試料の添加により使用のため希釈することができる。
こうして、アッセイを小型化し、廃棄物を劇的に減少
し、そして安全性を有意に増加すると同時に特異的結合
アッセイの実施における労働を節約しかつ誤差の生成を
減少することができる。
し、そして安全性を有意に増加すると同時に特異的結合
アッセイの実施における労働を節約しかつ誤差の生成を
減少することができる。
G.シールドしないクッションの実施態様 ことに酵素または蛍光標識を多ウェルプレートにおい
て使用する。シールドしない用途のため、不混和性第1
層および水性第2層の使用は、完全に水性のクッション
を使用して有効であるためには小さ過ぎる距離にわたっ
て、遊離水性標識からの結合性成分の有効な分離(重
力、遠心力、または磁力による)を可能とする。このよ
うな応用において、冷却により容易に固化するか、ある
いは0〜50℃の範囲内の貯蔵および/またはインキュベ
ーションの温度で固化しており、そしてこの温度範囲に
おける分離工程のため液化(典型的には溶融)すること
ができる第1層はことに有用である。第1層を加温によ
り液化するとき、第1層を通して沈む、非常に高密度の
結合性成分の固相粒子(例えば、ガラスまたは金属の
球)を使用することができる。明らかなように、本発明
を使用する方法は比色および蛍光測定の臨床的アッセイ
のために設計された現存する自動化臨床分析器と適合す
る。
て使用する。シールドしない用途のため、不混和性第1
層および水性第2層の使用は、完全に水性のクッション
を使用して有効であるためには小さ過ぎる距離にわたっ
て、遊離水性標識からの結合性成分の有効な分離(重
力、遠心力、または磁力による)を可能とする。このよ
うな応用において、冷却により容易に固化するか、ある
いは0〜50℃の範囲内の貯蔵および/またはインキュベ
ーションの温度で固化しており、そしてこの温度範囲に
おける分離工程のため液化(典型的には溶融)すること
ができる第1層はことに有用である。第1層を加温によ
り液化するとき、第1層を通して沈む、非常に高密度の
結合性成分の固相粒子(例えば、ガラスまたは金属の
球)を使用することができる。明らかなように、本発明
を使用する方法は比色および蛍光測定の臨床的アッセイ
のために設計された現存する自動化臨床分析器と適合す
る。
次の実施例は例示のために提供され、本発明を限定す
るものではない。
るものではない。
実施例 実施例において使用する略号は、次のものを包含す
る:PBS(リン酸塩緩衝化塩溶液)、BSA(ウシ血清アル
ブミン)、TGF−α(形質転換増殖因子アルファ)、RIA
(ラジオイムノアッセイ)、DTT(ジチオスレイトー
ル)、およびCPM(計数/分)。
る:PBS(リン酸塩緩衝化塩溶液)、BSA(ウシ血清アル
ブミン)、TGF−α(形質転換増殖因子アルファ)、RIA
(ラジオイムノアッセイ)、DTT(ジチオスレイトー
ル)、およびCPM(計数/分)。
実施例1 形質転換増殖因子アルファについての小型化競合ラジオ
イムノアッセイ すべてのアッセイは、アッセイ容器として、0.25〜0.
3mlのクッション物質を収容する0.4mlのマイクロ遠心管
を使用した。標識付けしたペプチドをクラアミンTヨー
ド化によって製造した(200〜500μCi/μgの比活性の
範囲)。特記しないかぎり、すべての固相はスタフィロ
コッカス・アウレウス(S.aureus)の懸濁液を使用して
調製した。遠心はほぼ10,000×gにおいてマイクロ遠心
機内で30〜60秒間であった。
イムノアッセイ すべてのアッセイは、アッセイ容器として、0.25〜0.
3mlのクッション物質を収容する0.4mlのマイクロ遠心管
を使用した。標識付けしたペプチドをクラアミンTヨー
ド化によって製造した(200〜500μCi/μgの比活性の
範囲)。特記しないかぎり、すべての固相はスタフィロ
コッカス・アウレウス(S.aureus)の懸濁液を使用して
調製した。遠心はほぼ10,000×gにおいてマイクロ遠心
機内で30〜60秒間であった。
(A)ペプチド断片およびフタル酸ブチルのクッション
を使用するRIA: ウサギの免疫感作に使用した合成ペプチドは、ラット
rTGF−αのc−末端17アミノ酸の蛋白質とグルタルアル
デヒドとの接合体であった[Marquardtら,Science,223:
1079−1082、1984]。このペプチド(接合されていな
い)を、また、参照標準としておよび標識(125−ヨウ
素標識付けした)として使用した。抗血清または正常ウ
サギ血清(比特異的結合の決定のため)をホルマリン固
定スタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)の商用
調製物[レイム・コーポレーション(Imre Corp.)、ワ
シントン州シアトル]上に吸着させて、PBS中固形分5
%の抗体固相懸濁液を形成した。100μl(250,000CP
M)の標識付けしたペプチド、100μlの10%(0.65モ
ル)のジチオスレイトール、30μlの10mg/mlのBSA、5
μlの10%のアジ化ナトリウム、50μlの10×PBSおよ
び215μlの蒸留水を、500μlの合計体積で、混合する
ことによって、標識カクテルを調製した。
を使用するRIA: ウサギの免疫感作に使用した合成ペプチドは、ラット
rTGF−αのc−末端17アミノ酸の蛋白質とグルタルアル
デヒドとの接合体であった[Marquardtら,Science,223:
1079−1082、1984]。このペプチド(接合されていな
い)を、また、参照標準としておよび標識(125−ヨウ
素標識付けした)として使用した。抗血清または正常ウ
サギ血清(比特異的結合の決定のため)をホルマリン固
定スタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)の商用
調製物[レイム・コーポレーション(Imre Corp.)、ワ
シントン州シアトル]上に吸着させて、PBS中固形分5
%の抗体固相懸濁液を形成した。100μl(250,000CP
M)の標識付けしたペプチド、100μlの10%(0.65モ
ル)のジチオスレイトール、30μlの10mg/mlのBSA、5
μlの10%のアジ化ナトリウム、50μlの10×PBSおよ
び215μlの蒸留水を、500μlの合計体積で、混合する
ことによって、標識カクテルを調製した。
各アッセイ容器中に、30μlの標識カクテル、40μl
の試料、および30μlの抗体懸濁液を負荷した。アッセ
イ混合物を混合し、そして4℃で一夜インキュベーショ
ンした後、アッセイ容器を遠心し、次いで放射線シール
ド(第3図)内に配置し、そしてガンマバイアル(Gamm
avial)を使用するベックマンLS−100シンチレーション
カウンターで計数した[コーホーライト・リミテッド
(Koch−Light Ltd.)、英国サフォーク;計数効率は約
40%であった]。
の試料、および30μlの抗体懸濁液を負荷した。アッセ
イ混合物を混合し、そして4℃で一夜インキュベーショ
ンした後、アッセイ容器を遠心し、次いで放射線シール
ド(第3図)内に配置し、そしてガンマバイアル(Gamm
avial)を使用するベックマンLS−100シンチレーション
カウンターで計数した[コーホーライト・リミテッド
(Koch−Light Ltd.)、英国サフォーク;計数効率は約
40%であった]。
合成ペプチドの検量装置を使用して得られたデータを
下に示す。生物活性合成ラットおよびヒトTGF−アルフ
ァは、ほぼ0.6nMのペプチドで50%の競合で、モル基準
でペプチド断片に等しい競合曲線を与えた。
下に示す。生物活性合成ラットおよびヒトTGF−アルフ
ァは、ほぼ0.6nMのペプチドで50%の競合で、モル基準
でペプチド断片に等しい競合曲線を与えた。
TGF−α RIA:ペプチド試薬、フタル酸ブチルのクッショ
ン 試料* 抗体 結合した標識 緩衝液 抗−ペプチト断片 43% 0.5nM 〃 30 1.0nM 〃 24 2.0nM 〃 16 10nM 〃 7 緩衝液 正常ウサギ血清 3 緩衝液 抗体不含懸濁液 0.1 *アッセイにおける最終濃度 (B)トレーサーおよび参照標準として抗−断片血清お
よび生物活性合成ペプチドを使用し、あらかじめ分配し
た桂皮酸メチルおよびアッセイ反応成分を使用するRIA トランス−桂皮酸メチル(表1、項目11、アルドリッ
ヒ・ケミカル・カンパニー、ミゾリー州セントルイス)
を、アッセイ容器中への分配の直前にマイクロ波の炉内
で短時間加熱することによって溶融した。クッションは
室温で自発的に固化した。固相を上の(A)におけるよ
うにして二倍濃度のアッセイ緩衝液(4%のNP−40非イ
オン性洗浄剤を含む)中で調製した。この懸濁液は4℃
で少なくとも1年間安定であった。0.2mlの10×アッセ
イ緩衝液(非イオン性洗浄剤を含まず)、0.6mlの10%
のNP−40、0.58mlの蒸留水、および30μlの標識濃厚物
(600,000CPM)(生物活性合成ラットTGF−アルファか
ら調製した)(残基1−50)を使用して、標識カクテル
(1.5ml)を調製した。
ン 試料* 抗体 結合した標識 緩衝液 抗−ペプチト断片 43% 0.5nM 〃 30 1.0nM 〃 24 2.0nM 〃 16 10nM 〃 7 緩衝液 正常ウサギ血清 3 緩衝液 抗体不含懸濁液 0.1 *アッセイにおける最終濃度 (B)トレーサーおよび参照標準として抗−断片血清お
よび生物活性合成ペプチドを使用し、あらかじめ分配し
た桂皮酸メチルおよびアッセイ反応成分を使用するRIA トランス−桂皮酸メチル(表1、項目11、アルドリッ
ヒ・ケミカル・カンパニー、ミゾリー州セントルイス)
を、アッセイ容器中への分配の直前にマイクロ波の炉内
で短時間加熱することによって溶融した。クッションは
室温で自発的に固化した。固相を上の(A)におけるよ
うにして二倍濃度のアッセイ緩衝液(4%のNP−40非イ
オン性洗浄剤を含む)中で調製した。この懸濁液は4℃
で少なくとも1年間安定であった。0.2mlの10×アッセ
イ緩衝液(非イオン性洗浄剤を含まず)、0.6mlの10%
のNP−40、0.58mlの蒸留水、および30μlの標識濃厚物
(600,000CPM)(生物活性合成ラットTGF−アルファか
ら調製した)(残基1−50)を使用して、標識カクテル
(1.5ml)を調製した。
各アッセイ容器中に50μlの参照標準試料(生物活
性、合成ラットTGF−α、残基1−50)、25μlの標識
カクテルを負荷し、次いで25μlの固相懸濁液を負荷し
た。示されるように、すべてのアッセイ反応成分はあら
かじめ分配し、そして試料の添加および混合によるアッ
セイの開始の前に、4℃で少なくとも3日間平衡化し
た。示された期間後、アッセイ容器を遠心し、そしてガ
ンマカウンター(アボット200型)中で放射線シールド
(第3図、ディスク52を欠く)を使用して計数した。
性、合成ラットTGF−α、残基1−50)、25μlの標識
カクテルを負荷し、次いで25μlの固相懸濁液を負荷し
た。示されるように、すべてのアッセイ反応成分はあら
かじめ分配し、そして試料の添加および混合によるアッ
セイの開始の前に、4℃で少なくとも3日間平衡化し
た。示された期間後、アッセイ容器を遠心し、そしてガ
ンマカウンター(アボット200型)中で放射線シールド
(第3図、ディスク52を欠く)を使用して計数した。
2種類の温度および混合の処理を4種類のインキュベ
ーション時間と組合わせた。1つの処理はクッションの
溶融温度直前の32℃におけるインキュベーション、およ
び15分の間隔の混合から成っていた。第2の処理はクッ
ションの溶融温度より上の40℃におけるインキュベーシ
ョン、およびインキュベーションの開始時のみの混合
(加温前)から成っていた。両者のアッセイは低い非特
異的結合、高い特異的結合、および高い参照標準との競
合を、わずかに30分のインキュベーション後でさえ、生
じた。詳細な結果を下に示す: (C)ヒト血清試料および抗−ウサギIgG被覆固相を使
用する TGF−α RIA このアッセイは上の(A)に記載するフタル酸ブチル
のクッションを使用して実施したが、ただし抗体被覆固
相は固定したスタフィロコッカス・アウレウス(S.aure
us)[パンソルビン(Pnsorbin )、ベーリング・ダイ
アグノスチクス、カリフォルニア州ラジョラ]またはグ
ルタルアルデヒド架橋抗−ウサギIgG被覆スタフィロコ
ッカス・アウレウス(S.aureus)[タチソルブ(Tachis
orb )、ベーリング・ダイアグノスチクス]を使用し
て調製した。各場合における固体の濃度は、アッセイ混
合物の体積100μlにつき12.5μlの10%w/v懸濁液に等
しかった。すべての管は二重反復実験として調製し、そ
して37℃で2時間インキュベーションした。50μlの希
釈された正常ヒト血清試料を、あらかじめ分配したクッ
ションを含有する各管に添加し、次いで直ちに25μlの
標識ペプチドおよび25μlの抗体固相懸濁液を添加して
反応を開始した。
ーション時間と組合わせた。1つの処理はクッションの
溶融温度直前の32℃におけるインキュベーション、およ
び15分の間隔の混合から成っていた。第2の処理はクッ
ションの溶融温度より上の40℃におけるインキュベーシ
ョン、およびインキュベーションの開始時のみの混合
(加温前)から成っていた。両者のアッセイは低い非特
異的結合、高い特異的結合、および高い参照標準との競
合を、わずかに30分のインキュベーション後でさえ、生
じた。詳細な結果を下に示す: (C)ヒト血清試料および抗−ウサギIgG被覆固相を使
用する TGF−α RIA このアッセイは上の(A)に記載するフタル酸ブチル
のクッションを使用して実施したが、ただし抗体被覆固
相は固定したスタフィロコッカス・アウレウス(S.aure
us)[パンソルビン(Pnsorbin )、ベーリング・ダイ
アグノスチクス、カリフォルニア州ラジョラ]またはグ
ルタルアルデヒド架橋抗−ウサギIgG被覆スタフィロコ
ッカス・アウレウス(S.aureus)[タチソルブ(Tachis
orb )、ベーリング・ダイアグノスチクス]を使用し
て調製した。各場合における固体の濃度は、アッセイ混
合物の体積100μlにつき12.5μlの10%w/v懸濁液に等
しかった。すべての管は二重反復実験として調製し、そ
して37℃で2時間インキュベーションした。50μlの希
釈された正常ヒト血清試料を、あらかじめ分配したクッ
ションを含有する各管に添加し、次いで直ちに25μlの
標識ペプチドおよび25μlの抗体固相懸濁液を添加して
反応を開始した。
結果が示すように、最高の濃度のヒト血清さえタチソ
ルブアッセイに有意な効果を有さないが、パンソルビン
では最高の希釈したヒト血清試料でさえ41%の有意の非
特異的競合を生じ、これは多分固相上のプロテインAへ
結合したウサギ抗体の置換のためであろう。タチソルブ
では、非特異的結合はより低く、特異的結合はより高
く、そして1.25nMの標準との競合はパンソルビンよりも
大きかった。詳細な結果を下表3に示す。
ルブアッセイに有意な効果を有さないが、パンソルビン
では最高の希釈したヒト血清試料でさえ41%の有意の非
特異的競合を生じ、これは多分固相上のプロテインAへ
結合したウサギ抗体の置換のためであろう。タチソルブ
では、非特異的結合はより低く、特異的結合はより高
く、そして1.25nMの標準との競合はパンソルビンよりも
大きかった。詳細な結果を下表3に示す。
(D)完全な生物活性合成ホルモンを認識する抗血清を
使用する RIAhTGF−α(1−50)の合成および免疫感
作: DeRynckら、[Cell,38:287−297、1985]により決定
されたヒトTGF−αの配列を使用して、自動化器具(バ
イオサーチ)により低分子量の形態のホルモン(残基1
−50)を合成した。得られるペプチドを使用して、0.5m
gのペプチドを多重部位において反復的に使用してウサ
ギを免疫感作した。
使用する RIAhTGF−α(1−50)の合成および免疫感
作: DeRynckら、[Cell,38:287−297、1985]により決定
されたヒトTGF−αの配列を使用して、自動化器具(バ
イオサーチ)により低分子量の形態のホルモン(残基1
−50)を合成した。得られるペプチドを使用して、0.5m
gのペプチドを多重部位において反復的に使用してウサ
ギを免疫感作した。
イムノアッセイの手順: このアッセイは、参照標準、および精製した生物活性
合成ラットTGF−αから調製した放射性ヨード化トレー
サーを使用した[ベニスラ・ラボラオトリーズ(Pnisul
a Laboratories,カリフォルニア州ベルモント]。300μ
lの10×緩衝液[0.5モルのヘペス(Hepes)、20mg/ml
のBSA、0.2%のアジ化ナトリウム]、600μlの10%の
ノニデット(Nonidet)P−40(シェル・オイル・カン
パニー)、580μlの蒸留水、および30μlの標識ペプ
チド(rTGF−α、800,000SPM)を、合計1.5mlの体積
で、混合することによって、標識カクテルを調製した。
抗体懸濁液を本質的に上の(A)に記載するようにして
調製した。0.25〜0.3mlのフタル酸ブチルのクッション
を収容する各0.4mlの管に、25μlの標識カクテル、50
μlの試料、および25μlの抗体懸濁液を添加した。示
される場合、10μlの1モルのDTT(0.5モルの重炭酸ナ
トリウム中に新しく溶解した)を各アッセイ混合物に添
加した。混合後、管を4℃で一夜インキュベーション
し、次いで(A)に記載するようにして処理したが、た
だし検出器具はガンマカウンター(アボット200型)で
あった。
合成ラットTGF−αから調製した放射性ヨード化トレー
サーを使用した[ベニスラ・ラボラオトリーズ(Pnisul
a Laboratories,カリフォルニア州ベルモント]。300μ
lの10×緩衝液[0.5モルのヘペス(Hepes)、20mg/ml
のBSA、0.2%のアジ化ナトリウム]、600μlの10%の
ノニデット(Nonidet)P−40(シェル・オイル・カン
パニー)、580μlの蒸留水、および30μlの標識ペプ
チド(rTGF−α、800,000SPM)を、合計1.5mlの体積
で、混合することによって、標識カクテルを調製した。
抗体懸濁液を本質的に上の(A)に記載するようにして
調製した。0.25〜0.3mlのフタル酸ブチルのクッション
を収容する各0.4mlの管に、25μlの標識カクテル、50
μlの試料、および25μlの抗体懸濁液を添加した。示
される場合、10μlの1モルのDTT(0.5モルの重炭酸ナ
トリウム中に新しく溶解した)を各アッセイ混合物に添
加した。混合後、管を4℃で一夜インキュベーション
し、次いで(A)に記載するようにして処理したが、た
だし検出器具はガンマカウンター(アボット200型)で
あった。
このアッセイはラットおよびヒト合成TGF−α(残基
1−50)を等しく、ペプチドがDTTによる還元により巻
戻されたか否かについて検出した。さらに、このアッセ
イはA375細胞でコンディショニングした細胞培地からの
真正生物学的ヒトTGF−αを検出した(マルクアート
ら、PNAS80:4684−4688、1983)。詳細な結果を下に示
す: *生物学的TGF−α、培養液(A375細胞)から部分的に
精製 実施例II 酸素標識ウサギ免疫グロブリンおよびクッションを使用
する、試料中のウサギIgGを検出するための、底層に酵
素基質を収容する0.4mlの管内における酵素標識定量的
遠心競合結合アッセイ (A)試薬:標識抗体は、1mg/mlのウシ血清アルブミン
を含有するリン酸塩緩衝化塩溶液中に1:3000で希釈し
た、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したアフィ
ニティー親和精製されたウサギ抗−ヤギ免疫グロブリン
[ザイムド(Zymed)]であった。固相は、熱で殺した
ホルマリン固定スタフィロコッカス・アウレウス(S.au
reus)の10%懸濁液(イムレ・コーポレーション、ワシ
ントン州シアトルア)であった。
1−50)を等しく、ペプチドがDTTによる還元により巻
戻されたか否かについて検出した。さらに、このアッセ
イはA375細胞でコンディショニングした細胞培地からの
真正生物学的ヒトTGF−αを検出した(マルクアート
ら、PNAS80:4684−4688、1983)。詳細な結果を下に示
す: *生物学的TGF−α、培養液(A375細胞)から部分的に
精製 実施例II 酸素標識ウサギ免疫グロブリンおよびクッションを使用
する、試料中のウサギIgGを検出するための、底層に酵
素基質を収容する0.4mlの管内における酵素標識定量的
遠心競合結合アッセイ (A)試薬:標識抗体は、1mg/mlのウシ血清アルブミン
を含有するリン酸塩緩衝化塩溶液中に1:3000で希釈し
た、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したアフィ
ニティー親和精製されたウサギ抗−ヤギ免疫グロブリン
[ザイムド(Zymed)]であった。固相は、熱で殺した
ホルマリン固定スタフィロコッカス・アウレウス(S.au
reus)の10%懸濁液(イムレ・コーポレーション、ワシ
ントン州シアトルア)であった。
22gのソルビトールを50mlの蒸留水中に溶解し、次い
で100mgの発色性基質(OPD、ザイムド、カリフォルニア
州サンフランシスコ)を1mlの水中に溶解し、そして0.1
mlのOPD原溶液および0.1mlの3%の過酸化水素を9.8ml
のソルビトールに添加することによって、ソレビトール
基質クッション溶液を調製した。
で100mgの発色性基質(OPD、ザイムド、カリフォルニア
州サンフランシスコ)を1mlの水中に溶解し、そして0.1
mlのOPD原溶液および0.1mlの3%の過酸化水素を9.8ml
のソルビトールに添加することによって、ソレビトール
基質クッション溶液を調製した。
(B)アッセイ:次いでアッセイ容器(0.4mlのポリエ
チレンのマイクロ遠心管、ウェスト・コースト・サイエ
ンTティフィク、カリフォルニア州エメリビレ)に0.1m
lのソルビトール基質溶液を負荷し、次いで0.2mlのフタ
ル酸ジブチルを上に重ねた。他の組のアッセイ容器に0.
3mlのソルビトール基質溶液を負荷した。
チレンのマイクロ遠心管、ウェスト・コースト・サイエ
ンTティフィク、カリフォルニア州エメリビレ)に0.1m
lのソルビトール基質溶液を負荷し、次いで0.2mlのフタ
ル酸ジブチルを上に重ねた。他の組のアッセイ容器に0.
3mlのソルビトール基質溶液を負荷した。
フタル酸ブチルのクッションの上部に、0.1%のアジ
化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝液化塩溶液中10%
のパンソルビン0.05mlをピペットで添加した。一方の管
に0.005mlのウサギ血清を添加し、次いでアフィニティ
ー精製しかつセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識付
けしたウサギ抗−ヤギIgG(RAG−HRP、ザイムド、1mg/m
lのBSAを含有するPBS中で1:3000に希釈した)0.05mlを
添加した。他方の管に0.005mlの希釈緩衝液および0.05m
lのRAG−HRPを添加した。2分後、管を高速のマイクロ
遠心器(フィッシャー235B型)内で1分間遠心し、そし
てシグナルの発生について検査した。
化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝液化塩溶液中10%
のパンソルビン0.05mlをピペットで添加した。一方の管
に0.005mlのウサギ血清を添加し、次いでアフィニティ
ー精製しかつセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識付
けしたウサギ抗−ヤギIgG(RAG−HRP、ザイムド、1mg/m
lのBSAを含有するPBS中で1:3000に希釈した)0.05mlを
添加した。他方の管に0.005mlの希釈緩衝液および0.05m
lのRAG−HRPを添加した。2分後、管を高速のマイクロ
遠心器(フィッシャー235B型)内で1分間遠心し、そし
てシグナルの発生について検査した。
対照沈殿物はその上の表面上で直ちに「陰性」(暗色
−褐色または黒色)であったが、管と接触する側面は淡
い琥珀色のままであった。試料で処理した沈殿物は「陽
性」(淡い琥珀色)であった。試料の層または分離した
透明に見える第1クッション層において色は発現せず、
ここで基質は存在しなかった。驚くべきことには、ほん
のわずかの色が下方の基質溶液中に発現したが、期待す
るように、試料の管はそれにもかかわらず対照の管(琥
珀色)に比較して可視的に陽性(淡い黄色)であった。
固相それ自体の表面上の基質の予期しない濃度は、劇的
な濃縮効果を提供し、陽性の試料と陰性と試料との間の
差を増幅した。基質溶液における差は注意深い視的検査
で明らかであるが、沈殿物は見ただけでは容易に識別さ
れた。試料を25℃に保持する間次の30分にわたってそれ
以上の変化は存在しなかったが、次の2時間にわたっ
て、ほとんどの黒色の対照試料は多少淡く(暗褐色)に
なり、淡い琥珀色の試料の沈殿物は多少より暗色(淡い
褐色またはオレンジ色)になった。明らかなそれ以上の
変化は起こらず、そして2つの沈殿物は室温(18−25
℃)において1週間以上貯蔵した後、容易に識別され
た。延長した貯蔵後、あたかも水性の下相から発色団が
抽出されるように、フタル酸ブチル層は琥珀色になっ
た。対照管中の油層はより暗い琥珀色であり、試料管か
らの油層と目によって区別することができた。
−褐色または黒色)であったが、管と接触する側面は淡
い琥珀色のままであった。試料で処理した沈殿物は「陽
性」(淡い琥珀色)であった。試料の層または分離した
透明に見える第1クッション層において色は発現せず、
ここで基質は存在しなかった。驚くべきことには、ほん
のわずかの色が下方の基質溶液中に発現したが、期待す
るように、試料の管はそれにもかかわらず対照の管(琥
珀色)に比較して可視的に陽性(淡い黄色)であった。
固相それ自体の表面上の基質の予期しない濃度は、劇的
な濃縮効果を提供し、陽性の試料と陰性と試料との間の
差を増幅した。基質溶液における差は注意深い視的検査
で明らかであるが、沈殿物は見ただけでは容易に識別さ
れた。試料を25℃に保持する間次の30分にわたってそれ
以上の変化は存在しなかったが、次の2時間にわたっ
て、ほとんどの黒色の対照試料は多少淡く(暗褐色)に
なり、淡い琥珀色の試料の沈殿物は多少より暗色(淡い
褐色またはオレンジ色)になった。明らかなそれ以上の
変化は起こらず、そして2つの沈殿物は室温(18−25
℃)において1週間以上貯蔵した後、容易に識別され
た。延長した貯蔵後、あたかも水性の下相から発色団が
抽出されるように、フタル酸ブチル層は琥珀色になっ
た。対照管中の油層はより暗い琥珀色であり、試料管か
らの油層と目によって区別することができた。
油層を介在させないでソルビトール基質のクッション
を使用し、そして試料と基質のクッションとの間に空気
の空間を使用する類似の実験は、また、視的に識別でき
る結果を与えた。遠心後、試料およびクッションの層の
境界は見えなかった。着色したしまがアッセイ容器の壁
を下る固体の通路を追跡したので、固相の洗浄は有効で
はなかった。しかしながら、対照容器のしま、および沈
殿物は試料の容器におけるそれらより明瞭により暗色な
琥珀色であった。時間とともに、溶液全体(試料および
クッション)は琥珀色となったが、1週後、対照容器は
試料容器よりも全体がなおより暗い琥珀色であった。
を使用し、そして試料と基質のクッションとの間に空気
の空間を使用する類似の実験は、また、視的に識別でき
る結果を与えた。遠心後、試料およびクッションの層の
境界は見えなかった。着色したしまがアッセイ容器の壁
を下る固体の通路を追跡したので、固相の洗浄は有効で
はなかった。しかしながら、対照容器のしま、および沈
殿物は試料の容器におけるそれらより明瞭により暗色な
琥珀色であった。時間とともに、溶液全体(試料および
クッション)は琥珀色となったが、1週後、対照容器は
試料容器よりも全体がなおより暗い琥珀色であった。
実施例III 第1クッションの上部に凍結乾燥した試薬を使用する小
型化イムノアッセイ 試薬は実施例Iにおけるように調製したが、ただし試
料は省略し、そして油は36℃以下で固体である桂皮酸メ
チルであった。アッセイ容器を凍結し、そしてスピード
・バク(Speed Vzc )[サバント(Savant)]中で低
速遠心下で凍結乾燥した。反応成分が乾燥したとき、管
を室温で貯蔵した。試料(0.05ml)を添加したとき、反
応成分を再水和し、そして室温で2時間後、管を37〜40
℃に加温し、そして上の実施例Iにおけるように回転
し、そしてシグナルを測定した。
型化イムノアッセイ 試薬は実施例Iにおけるように調製したが、ただし試
料は省略し、そして油は36℃以下で固体である桂皮酸メ
チルであった。アッセイ容器を凍結し、そしてスピード
・バク(Speed Vzc )[サバント(Savant)]中で低
速遠心下で凍結乾燥した。反応成分が乾燥したとき、管
を室温で貯蔵した。試料(0.05ml)を添加したとき、反
応成分を再水和し、そして室温で2時間後、管を37〜40
℃に加温し、そして上の実施例Iにおけるように回転
し、そしてシグナルを測定した。
実施例IV フタル酸ジブチルのクッションを通す遠心によるヒトロ
キシアパタイトへ結合した32−P標識DNAの検出 (A)試薬:32P標識二本鎖DNAを2つのアリコートに分
割した。一方の部分を2分間沸騰させ、次いで氷上に配
置した。各アリコート(20μl、10ミリモルのトリス緩
衝液、pH8.2中)に、同一緩衝液中の10%のヒドロキシ
アパタイトの懸濁液の100μlを添加した。0.4mlのマイ
クロ遠心管中で0.3mlの次の溶液の1つをピペットで加
えることのよってクッション溶液を調製した:(1)40
g/lのオムニ蛍光体(omnifluor)を含有するフタル酸ブ
チル、(2)1.25g/lのオムニ蛍光体を含有するフタル
酸ブチル、(3)フタル酸ブチル単独。
キシアパタイトへ結合した32−P標識DNAの検出 (A)試薬:32P標識二本鎖DNAを2つのアリコートに分
割した。一方の部分を2分間沸騰させ、次いで氷上に配
置した。各アリコート(20μl、10ミリモルのトリス緩
衝液、pH8.2中)に、同一緩衝液中の10%のヒドロキシ
アパタイトの懸濁液の100μlを添加した。0.4mlのマイ
クロ遠心管中で0.3mlの次の溶液の1つをピペットで加
えることのよってクッション溶液を調製した:(1)40
g/lのオムニ蛍光体(omnifluor)を含有するフタル酸ブ
チル、(2)1.25g/lのオムニ蛍光体を含有するフタル
酸ブチル、(3)フタル酸ブチル単独。
(B)結合アッセイ:各クッションの上に、未加熱の標
識付けしたDNAおよび固相を含有する懸濁液の10μlの
ピペットで加えた。この混合物をフィッシャーマイクロ
遠心機(235B型)中で1分間回転した。管はベックマン
LS−100C液体シンチレーションカウンターで計数した。
識付けしたDNAおよび固相を含有する懸濁液の10μlの
ピペットで加えた。この混合物をフィッシャーマイクロ
遠心機(235B型)中で1分間回転した。管はベックマン
LS−100C液体シンチレーションカウンターで計数した。
14−Cチャンネルで計数する場合、32−Pをクッショ
ン中の蛍光体の存在下または不存在下に検出した。1/8
インチの厚さの鉛シールドの存在下に14−Cチャンネル
で計数したとき、計数の10%より低い減少が得られ、こ
のことによりDNAの大部分はこれらの低塩条件下に固相
に結合したことが示された。これらの結果が示すよう
に、ここで試験した場合、蛍光体含有フタル酸ブチルの
使用はシールドの必要性を排除した。なぜなら32−Pチ
ャンネルを使用するとき、クッションに入らなかった遊
離標識は検出されなかったからである。これらのデータ
が、また示すように、32−Pチャンネルより多少より高
いシグナルを与えた14チャンネルにおいてさえ、クッシ
ョン中の蛍光体の包含は蛍光体を欠くクッションに比較
して50%より大きいシグナルを与えた。しかしながら、
このチャンネルでは、シールドは上澄み中の遊離標識を
マスクするために必要である。
ン中の蛍光体の存在下または不存在下に検出した。1/8
インチの厚さの鉛シールドの存在下に14−Cチャンネル
で計数したとき、計数の10%より低い減少が得られ、こ
のことによりDNAの大部分はこれらの低塩条件下に固相
に結合したことが示された。これらの結果が示すよう
に、ここで試験した場合、蛍光体含有フタル酸ブチルの
使用はシールドの必要性を排除した。なぜなら32−Pチ
ャンネルを使用するとき、クッションに入らなかった遊
離標識は検出されなかったからである。これらのデータ
が、また示すように、32−Pチャンネルより多少より高
いシグナルを与えた14チャンネルにおいてさえ、クッシ
ョン中の蛍光体の包含は蛍光体を欠くクッションに比較
して50%より大きいシグナルを与えた。しかしながら、
このチャンネルでは、シールドは上澄み中の遊離標識を
マスクするために必要である。
32−チャンネルを使用してさえ、クッションに入る上
澄みからの放射により生ずるバックグラウンドのシグナ
ルはシールドの使用によって大きく減少できるか、ある
いは排除でき、そしてシールドは14−Cチャンネルを使
用するときよりも有効である。これは、この系列の実験
において固相にそれほど完全には結合しない加熱したDN
Aを使用して立証される。加熱したDNAを、前述のよう
に、フタル酸ブチルのクッション上で処理した。
澄みからの放射により生ずるバックグラウンドのシグナ
ルはシールドの使用によって大きく減少できるか、ある
いは排除でき、そしてシールドは14−Cチャンネルを使
用するときよりも有効である。これは、この系列の実験
において固相にそれほど完全には結合しない加熱したDN
Aを使用して立証される。加熱したDNAを、前述のよう
に、フタル酸ブチルのクッション上で処理した。
32−Pチャンネルでは、蛍光体含有クッションを伴う
鉛シールドはシールドを使用しない同一クッションより
もほとんど40%だけ少ないシグナルを与え、これにより
上澄みまたはクッションの上部から有意のシグナルが発
生することが示される。シグナルのほぼ20%の遮断が同
一試料について14−チャンネルを使用して得られた。
鉛シールドはシールドを使用しない同一クッションより
もほとんど40%だけ少ないシグナルを与え、これにより
上澄みまたはクッションの上部から有意のシグナルが発
生することが示される。シグナルのほぼ20%の遮断が同
一試料について14−チャンネルを使用して得られた。
実施例V 水不混和性「クッション」の添加により遊離している標
識を除去する抗体被覆管の使用 50μlのBSA溶液(1mg/ml、PBS中)またはrTGF−αc
−末端17残基の断片(同一BSA溶液中で1:1000に前希釈
したもの)をヤギ抗−ウサギIgG(マイクロメディッ
ク、ペンシベニア州ホーシャム)を前被覆した8×50mm
のポリプロピレン管に添加した。これらの管の各々に、
50μlの125−ヨウ素標識ペプチド断片(0.2mg/mlのBSA
を含むPBS中の1nM)を添加した。室温で5分後、二重反
復実験の管に1mlのフタル酸ジブチルまたはフルオロカ
ーボン油、FC40(両者共シグマ・ケミカル・カンパニ
ー、セントルイス)を添加した。
識を除去する抗体被覆管の使用 50μlのBSA溶液(1mg/ml、PBS中)またはrTGF−αc
−末端17残基の断片(同一BSA溶液中で1:1000に前希釈
したもの)をヤギ抗−ウサギIgG(マイクロメディッ
ク、ペンシベニア州ホーシャム)を前被覆した8×50mm
のポリプロピレン管に添加した。これらの管の各々に、
50μlの125−ヨウ素標識ペプチド断片(0.2mg/mlのBSA
を含むPBS中の1nM)を添加した。室温で5分後、二重反
復実験の管に1mlのフタル酸ジブチルまたはフルオロカ
ーボン油、FC40(両者共シグマ・ケミカル・カンパニ
ー、セントルイス)を添加した。
高密度の油が管の底から水性アッセイ混合物を除去し
た。フタル酸ジブチルを有するものは、底付近で捕捉さ
れた水性アッセイ混合物の滴を除去するために多少の攪
拌を必要とし、そして水の薄いフィルムが油と管の内部
表面との間に接続するように見えた。FC40では、水は直
ちに表面へ浮上し、油相中での見掛けの保持はなかっ
た。
た。フタル酸ジブチルを有するものは、底付近で捕捉さ
れた水性アッセイ混合物の滴を除去するために多少の攪
拌を必要とし、そして水の薄いフィルムが油と管の内部
表面との間に接続するように見えた。FC40では、水は直
ちに表面へ浮上し、油相中での見掛けの保持はなかっ
た。
すべての管を直ちにシンチレーションカウンター内
で、12×50mmのプラスチック管をガンマバイアル(コー
ホーライト)のためのホルダーとして使用し、上澄みお
よび油層の大部分を0.006インチの鉛箔の1.25インチの
長さのシリンダー(プラスチックのシリンダーで底から
7/8インチ上で保持した)内に包んで計数した。
で、12×50mmのプラスチック管をガンマバイアル(コー
ホーライト)のためのホルダーとして使用し、上澄みお
よび油層の大部分を0.006インチの鉛箔の1.25インチの
長さのシリンダー(プラスチックのシリンダーで底から
7/8インチ上で保持した)内に包んで計数した。
両者の油は有意のシグナルを生成したが、それらは性
能が異なった。フタル酸ブチルは多少の操作を必要と
し、そして高いバックグラウンドを生じさせたが、短い
インキュベーションおよび比較的高い抗体の希釈(1:20
00の抗体希釈における平衡結合はほぼ35〜40%の特異的
結合を生ずることが期待されるであろう)を考慮してき
わめて高いシグナルを生じさせた。FC40は非常の低いバ
ックグラウンド、および5分のインキュベーションの間
に期待される値に近いシグナルを生じさせた。両者の場
合において、シグナル対ノイズ比は類似した。
能が異なった。フタル酸ブチルは多少の操作を必要と
し、そして高いバックグラウンドを生じさせたが、短い
インキュベーションおよび比較的高い抗体の希釈(1:20
00の抗体希釈における平衡結合はほぼ35〜40%の特異的
結合を生ずることが期待されるであろう)を考慮してき
わめて高いシグナルを生じさせた。FC40は非常の低いバ
ックグラウンド、および5分のインキュベーションの間
に期待される値に近いシグナルを生じさせた。両者の場
合において、シグナル対ノイズ比は類似した。
実施例VI TGF−α(抗−断片)およびHEGF RIAを使用する癌患者
からの尿の試料の試験 TGFのアッセイのため、2.5mlの尿をG15セファデック
スのカラム(PD−10、ファルマシア)(重炭酸アンモニ
ウム緩衝液で平衡化したもの)に通して脱塩した。尿の
ペプチドを含有するボイドボリウム分画を凍結し、そし
て120μlの水+1モルのジチオスレイトールおよび0.5
モルの重炭酸ナトリウムを含有する還元溶液12μlで再
構成した。骨髄腫の試料に余分の10μlの還元溶液およ
びわずかに110μlの水を加えた。hEGFのアッセイのた
め、尿を緩衝液で5倍に希釈した。
からの尿の試料の試験 TGFのアッセイのため、2.5mlの尿をG15セファデック
スのカラム(PD−10、ファルマシア)(重炭酸アンモニ
ウム緩衝液で平衡化したもの)に通して脱塩した。尿の
ペプチドを含有するボイドボリウム分画を凍結し、そし
て120μlの水+1モルのジチオスレイトールおよび0.5
モルの重炭酸ナトリウムを含有する還元溶液12μlで再
構成した。骨髄腫の試料に余分の10μlの還元溶液およ
びわずかに110μlの水を加えた。hEGFのアッセイのた
め、尿を緩衝液で5倍に希釈した。
0.050μlの各処理した尿の試料を、0.025mlの抗体懸
濁液および0.025mlの放射線ヨー素化トレーサー(全長T
GF−α、残基1−50、またはhEGF、残基1−53、250−2
75μCi/μG、ほぼ10,000cpm)と0.25mlのフタル酸ジブ
チルを含有するインキュベーション/分離容器内で混合
した。4℃で一夜インキュベーションした後、容器を30
秒間ほぼ10,000×gで遠心し、そして放射線シールド
(第3図参照)中に配置し、そしてLKBラックガンマ(R
ackgamma)カウンターで1分間計数した。標準は0.2mg/
mlのウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中の全長のTG
F−αおよびhEGFから成り、そして尿の試料と同一の方
法で処理した。
濁液および0.025mlの放射線ヨー素化トレーサー(全長T
GF−α、残基1−50、またはhEGF、残基1−53、250−2
75μCi/μG、ほぼ10,000cpm)と0.25mlのフタル酸ジブ
チルを含有するインキュベーション/分離容器内で混合
した。4℃で一夜インキュベーションした後、容器を30
秒間ほぼ10,000×gで遠心し、そして放射線シールド
(第3図参照)中に配置し、そしてLKBラックガンマ(R
ackgamma)カウンターで1分間計数した。標準は0.2mg/
mlのウシ血清アルブミンを含有する緩衝液中の全長のTG
F−αおよびhEGFから成り、そして尿の試料と同一の方
法で処理した。
実施例VII 多重層のクッションの使用 第1クッション層または第2クッション層として潜在
的に使用する異なる物質を、クッションの形成の間およ
び引続く遠心の間の明確な境界を維持し、そしてスタフ
ィロコッカス・アウレウス(S.aureus)粒子を短時間の
回転で沈殿させる能力について試験した。すべての潜在
的クッションの物質を、マイクロ遠心機[サバント(Sa
vant)、10,000rpm)中で全速で1分間遠心する間、0.4
mlのポリプロピレンのマイクロ遠心管中の固定したスタ
フィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を沈殿させる
能力について試験した。これらの条件を使用して、沈殿
はシュークロース溶液(10〜40%w/v、d=1.0374−1.1
758、22℃)および次の列挙した水不混和性物質につい
て等しく良好に起こった:コハク酸ジエチル、桂皮酸エ
チル、フタル酸ジブチル、アジピン酸メチル、およびマ
レイン酸ジエチル。
的に使用する異なる物質を、クッションの形成の間およ
び引続く遠心の間の明確な境界を維持し、そしてスタフ
ィロコッカス・アウレウス(S.aureus)粒子を短時間の
回転で沈殿させる能力について試験した。すべての潜在
的クッションの物質を、マイクロ遠心機[サバント(Sa
vant)、10,000rpm)中で全速で1分間遠心する間、0.4
mlのポリプロピレンのマイクロ遠心管中の固定したスタ
フィロコッカス・アウレウス(S.aureus)を沈殿させる
能力について試験した。これらの条件を使用して、沈殿
はシュークロース溶液(10〜40%w/v、d=1.0374−1.1
758、22℃)および次の列挙した水不混和性物質につい
て等しく良好に起こった:コハク酸ジエチル、桂皮酸エ
チル、フタル酸ジブチル、アジピン酸メチル、およびマ
レイン酸ジエチル。
実施例VIII 甲状腺刺激ホルモン(TSH)についての競合RIA TSHを決定するための商用125−ヨウ素RIAキットを、
アメリカン・バイオクリニカル(American Bioclinca
l)(オレゴン州ポートランド)から入手し、そして本
発明の分離および検出の方法に適合させた。すべてのア
ッセイ反応成分は製造業者の指示に従って使用したが、
ただし反応成分の体積は4分の1に減少させ、そしてス
タフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)(25μl/試
験の10%w/vの懸濁液)を「第2抗体」沈殿溶液の代わ
りに使用した。適合した試験は、0.25mlのフタル酸ブチ
ルのクッションを含有する0.4mlのマイクロ遠心管を使
用して実施した。
アメリカン・バイオクリニカル(American Bioclinca
l)(オレゴン州ポートランド)から入手し、そして本
発明の分離および検出の方法に適合させた。すべてのア
ッセイ反応成分は製造業者の指示に従って使用したが、
ただし反応成分の体積は4分の1に減少させ、そしてス
タフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)(25μl/試
験の10%w/vの懸濁液)を「第2抗体」沈殿溶液の代わ
りに使用した。適合した試験は、0.25mlのフタル酸ブチ
ルのクッションを含有する0.4mlのマイクロ遠心管を使
用して実施した。
適合させた試験はわずかに2時間(37℃)インキュベ
ーションし、これに対して標準試験は4時間(25℃)イ
ンキュベーションしてさえ、適合させた試験は有意に低
い非特異的結合をし、合計の結合は同等であり、そして
全体の感度は大きかった。詳細な結果を下に示す。
ーションし、これに対して標準試験は4時間(25℃)イ
ンキュベーションしてさえ、適合させた試験は有意に低
い非特異的結合をし、合計の結合は同等であり、そして
全体の感度は大きかった。詳細な結果を下に示す。
実施例IX RIA成分の性能:精度およびシールド効率 (A)放射線シールドの遮断効果 放射線シールド(42、第3図)を125−ヨウ素放射の
遮断の効率について、シールドディスク52の存在下また
は不存在下に試験した。125−I含有溶液のアリコート
を0.4mlのアッセイ容器にピペットで入れた。合計の遮
断されない計数を、クッションを含まない管を使用し
て、シールドの不存在下に計数した。検出効率は、2つ
の型のシールド中でこれらの同じ管を計数することによ
って決定した。遮断効率は、2種類のシールド(第3
図、ディスク52の存在下および不存在下)を伴ってクッ
ションを収容する管を計数することによって決定した。
遮断の効率について、シールドディスク52の存在下また
は不存在下に試験した。125−I含有溶液のアリコート
を0.4mlのアッセイ容器にピペットで入れた。合計の遮
断されない計数を、クッションを含まない管を使用し
て、シールドの不存在下に計数した。検出効率は、2つ
の型のシールド中でこれらの同じ管を計数することによ
って決定した。遮断効率は、2種類のシールド(第3
図、ディスク52の存在下および不存在下)を伴ってクッ
ションを収容する管を計数することによって決定した。
(B)RIAについての精度 合計の結合したトレーサーの反復実験物をTGFアッセ
イを使用して測定した(実施例IA)。各々15本の管の4
つの群を2つの異なるガンマカウンターで計数した。
イを使用して測定した(実施例IA)。各々15本の管の4
つの群を2つの異なるガンマカウンターで計数した。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−73766(JP,A) 特開 昭49−89389(JP,A)
Claims (18)
- 【請求項1】アッセイ混合物内の結合した標識を結合し
ていない標識から分離する方法であって、該アッセイ混
合物は1種または2種以上の結合性成分、前記結合性成
分の少なくともあるものに結合した標識、および結合し
ていない標識を含有する実質的に水性の溶液を含み、該
結合性成分は見掛け密度が該水性溶液と異なり、又は該
結合性成分は磁性を有しており、該方法は、 第1層をアッセイ容器中に形成された前記アッセイ混合
物と接触させ、該第1層は前記結合していない標識及び
前記結合性成分の両者と非混和性でありそして該結合性
成分とは異なる見掛け密度を有し、前記第1層と前記結
合性成分との間の密度の相違は前記非混和性のもとで
は、該結合性成分と該結合していない標識とを分離する
のに十分な追加の条件の適用なくしては、前記結合性成
分と前記結合していない標識とが分離するのを防止する
程度のものであり、そして 前記アッセイ混合物を、前記結合性成分と前記結合して
いない標識とを、前記第一層と接触させながら分離させ
るために遠心分離又は磁場の適用を行う、 ことを含んでなることを特徴とする方法。 - 【請求項2】前記第1層が実質的に酸素、窒素またはイ
オウを含有する芳香族および非芳香族の炭化水素化合物
から成る群より選択される水不混和性の密な油を含んで
なり、ここで前記化合物は1〜4個のRでエステル化さ
れており、ここでRはメチル、エチル、プロピルまたは
ブチルである請求の範囲1に記載の方法。 - 【請求項3】前記第1層がフルオロカーボンまたはシリ
コーン含有油である水不混和性油を含んでなる請求の範
囲1に記載の方法。 - 【請求項4】前記遠心分離又は磁場の適用の工程後、前
記結合性成分を第2層と接触させ、前記第2層は前記第
1層と実質的に不混和性でありかつそれと異なる密度を
有する請求の範囲1に記載の方法。 - 【請求項5】前記第2層が糖溶液、塩溶液、高密度の粒
子のコロイド懸濁液および水混和性有機溶媒から成る群
より選択される請求の範囲4に記載の方法。 - 【請求項6】前記標識がラジオアイソトープ、酵素、酵
素前駆体、着色された染料、顔料、および蛍光化合物か
ら成る群より選択される請求の範囲1に記載の方法。 - 【請求項7】前記標識が分析物である請求の範囲4に記
載の方法。 - 【請求項8】アッセイ混合物内の結合した標識を結合し
ていない標識から分離するアッセイ容器であって、該ア
ッセイ混合物は1種または2種以上の結合性成分、該結
合性成分の少なくともあるものに結合した標識、および
結合していない標識を含有する実質的に水性の溶液を含
み、該結合性成分は見掛け密度が該水性溶液と異なり、
又は該結合性成分は磁性を有しており、該容器は、 貫通性シールを有する基部端および閉じた末端を有する
容器であって細長い室をその中に構成するもの、 前記室内を略横方向に延びてその中に選択的バリヤーを
形成する第1層であって前記結合していない標識及び前
記結合性成分の両者と非混和性でありそして該結合性成
分とは異なる見掛け密度を有し、前記第1層と前記結合
性成分との間の密度の相違は前記非混和性のもとでは、
該結合性成分と該結合していない標識とを分離するのに
十分な追加の条件を適用しなくては、前記結合性成分と
前記結合していない標識とが分離するのを防止する程度
のものでるもの、および 1又は複数の第2層であって、隣接する第1層及び/又
は第2層と実質的に非混和性であり且つそれと異なる密
度を有するもの、 を有するアッセイ容器。 - 【請求項9】前記第1層が実質的に酸素、窒素またはイ
オウを含有する芳香族および非芳香族の炭化水素化合物
から成る群より選択される水不混和性の密な油を含んで
なり、ここで該化合物は1〜4個のRでエステル化され
ており、ここでRはメチル、エチル、プロピルまたはブ
チルである請求の範囲8に記載のアッセイ容器。 - 【請求項10】前記第1層がフルオロカーボンまたはシ
リコーン含有油である水不混和性油を含んでなる請求の
範囲8に記載のアッセイ容器。 - 【請求項11】前記第2層が糖溶液、塩溶液、高密度の
粒子のコロイド懸濁液および水混和性有機溶媒から成る
群より選択される請求の範囲8に記載のアッセイ容器。 - 【請求項12】前記標識がラジオアイソトープ、酵素、
酵素前駆体、着色された染料、顔料、および蛍光化合物
から成る群より選択される請求の範囲8に記載のアッセ
イ容器。 - 【請求項13】前記標識が分析物である請求の範囲8に
記載のアッセイ容器。 - 【請求項14】流体試料内の分析物の存在または量を検
出する方法であって、 該流体試料を試薬混合物と一緒にしてアッセイ混合物を
形成し、該アッセイ混合物は1種または2種以上の結合
性成分および標識を含有する実質的に水溶性の溶液を含
み、該結合性成分は見掛け密度が該水溶液とは異り、又
は該結合性成分は磁性を有しており、該標識の少なくと
もあるものおよび該分析物の少なくともあるものは、前
記結合性成分に直接的にあるいは間接的に結合し、 前記アッセイ混合物を第1層と接触させ、前記結合性成
分および結合していない標識は前記第1層と非混和性で
ありかつ前記結合性成分はそれと異なる密度を有し、前
記第1層と前記結合性成分との間の密度の相違は前記非
混和性のもとでは、該結合性成分と該結合していない標
識とを分離するために十分な追加の条件の適用なくして
は、前記結合性成分と結合していない標識とが分離する
のを防止する程度のものであり、 前記アッセイ混合物を、前記第1層と接触させながら、
前記結合性成分と前記結合していない標識とを分離させ
るために遠心分離又は磁場の適用を行い、そして 前記結合性成分に結合した標識を検出し、そしてそれか
ら前記分析物の存在または量を決定する、 ことを含んでなる方法。 - 【請求項15】分析物が形質転換増殖因子アルファまた
はヒト表皮増殖因子である請求の範囲14に記載の方法。 - 【請求項16】特異的結合アッセイのための再使用可能
な検出容器であって、 この検出器は次の方法、すなわち、流体試料内の分析物
の存在または量を検出する方法であって、 前記流体試料と試薬混合物を一緒にしてアッセイ容器内
にアッセイ混合物を形成し、該アッセイ混合物は1種ま
たは2種以上の結合性成分および標識を含有する実質的
に水溶性の溶液を含み、該結合性成分は見掛け密度が該
水溶液とは異り、又は該結合性成分は磁性を有してお
り、該標識の少なくともあるものおよび該分析物の少な
くともあるものは、前記結合性成分に直接的にあるいは
間接的に結合しており、 前記アッセイ混合物を第1層と接触させ、前記結合性成
分および結合していない標識は前記第1層と非混和性で
ありかつ前記結合性成分はそれと異なる密度を有し、前
記第1層と前記結合性成分との間の密度の相違は前記非
混和性のもとでは、該結合性成分と該結合していない標
識とを分離するのに十分な追加の条件を適用しなくて
は、前記結合性成分と前記結合していない標識とが分離
するのを防止する程度のものであり、 前記アッセイ混合物を、前記第1層と接触させながら、
前記結合性成分と前記結合していない標識とを分離させ
るために遠心分離又は磁場の適用を行い、そして 前記結合性成分に結合した標識を検出し、そしてそれか
ら前記分析物の存在または量を決定する、 ことを含んでなる方法において使用するものであり、 再使用可能な該検出容器は、 開いた基部端および閉じた末端を有する細長い容器であ
り、アッセイ容器を内側に挿入しうるもの、および 該細長い容器内に嵌合できる結合していない標識からの
放射線をシールドする放射線吸収シールド、 を含んでなり、前記アッセイ容器は、貫通性シールを有
する基部端と閉じた末端を有し、その中に細長い室を構
成し、該室内を略横方向に延びる第一層が形成されてい
て選択的バリヤーが形成されている ことを特徴とする再使用可能な検出器。 - 【請求項17】前記シールドと前記管の閉じた末端との
間に位置し、そして前記管内の前記シールドとかみ合い
かつその位置を維持する大きさを有する部材を含む請求
の範囲16に記載の検出容器。 - 【請求項18】基部端と閉じた末端を有するアッセイ容
器と前記シールドが滑動可能である、請求の範囲16に記
載の検出容器。
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ATE91023T1 (de) * | 1987-12-01 | 1993-07-15 | Biotope Inc | Verfahren und vorrichtungen zur durchfuehrung von untersuchungen. |
US5145784A (en) * | 1988-05-04 | 1992-09-08 | Cambridge Biotech Corporation | Double capture assay method employing a capillary flow device |
US5484735A (en) * | 1989-08-23 | 1996-01-16 | Northwestern University | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids |
US5279936A (en) * | 1989-12-22 | 1994-01-18 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method of separation employing magnetic particles and second medium |
DE4041300A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Syntex Inc | Verfahren zur trennung von komponenten in einer mischung |
US5223393A (en) * | 1990-06-12 | 1993-06-29 | Microgenics Corporation | Detection of analytes having binding sites for at least two binding moieties |
US6703236B2 (en) * | 1990-11-29 | 2004-03-09 | Applera Corporation | Thermal cycler for automatic performance of the polymerase chain reaction with close temperature control |
KR100236506B1 (ko) * | 1990-11-29 | 2000-01-15 | 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 | 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치 |
US5506114A (en) * | 1992-02-07 | 1996-04-09 | Osborn Laboratories | Methods and kits for detecting the presence or concentration of biological analytes |
US5629168A (en) * | 1992-02-10 | 1997-05-13 | British Technology Group Limited | Chemiluminescent enhancers |
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US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
US6752965B2 (en) * | 1998-03-06 | 2004-06-22 | Abner Levy | Self resealing elastomeric closure |
US6030582A (en) * | 1998-03-06 | 2000-02-29 | Levy; Abner | Self-resealing, puncturable container cap |
US7060431B2 (en) | 1998-06-24 | 2006-06-13 | Illumina, Inc. | Method of making and decoding of array sensors with microspheres |
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ATE427159T1 (de) † | 1999-05-14 | 2009-04-15 | Gen Probe Inc | Fluid-transfer-gerat zur verwendung mit durchdringbarer kappe |
US6623982B1 (en) * | 1999-07-12 | 2003-09-23 | Immunivest Corporation | Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles |
CA2441206A1 (en) | 2001-03-19 | 2002-09-26 | Gyros Ab | Characterization of reaction variables |
CA2513985C (en) | 2003-01-21 | 2012-05-29 | Illumina Inc. | Chemical reaction monitor |
US20050181513A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-08-18 | Viorica Lopez-Avila | Methods and compositions for assessing a sample by MAILDI mass spectrometry |
US7776531B1 (en) | 2004-03-25 | 2010-08-17 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for stabilizing surface bound probes |
WO2005113147A2 (en) * | 2004-04-08 | 2005-12-01 | Biomatrica, Inc. | Integration of sample storage and sample management for life science |
US9488665B2 (en) * | 2005-09-13 | 2016-11-08 | Chrome Red Technologies, Llc | Magnetic particle tagged reagents and techniques |
US20070113908A1 (en) * | 2005-11-18 | 2007-05-24 | The Ohio State University And Bioloc, Inc. | Valve for microfluidic chips |
EP2559666B1 (en) | 2007-08-27 | 2014-07-23 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | pH gradients controlled by electrolysis, and their use in isoelectric focusing |
MX2011004169A (es) * | 2008-10-31 | 2011-09-27 | Bio Merieux Inc | Metodos para la separacion y caracterizacion de microorganismos utilizando agentes identificadores. |
AU2010245860B2 (en) * | 2009-05-07 | 2015-07-16 | Biomerieux, Inc. | Methods for antimicrobial resistance determination |
WO2010132453A2 (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Nexus Dx, Inc. | Methods and compositions for analyte detection |
US9028664B2 (en) | 2009-08-18 | 2015-05-12 | Technion Research & Development Foundation Limited | Proton concentration topographies, methods and devices for producing the same |
EP2467710B1 (en) | 2009-08-18 | 2020-04-22 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Methods and devices for separating molecular analytes |
KR20120107497A (ko) | 2009-12-17 | 2012-10-02 | 아박시스, 인크. | 샘플 내 분석물을 검출하기 위한 신규 분석 및 그것과 관련된 키트 및 조성물 |
US9845489B2 (en) | 2010-07-26 | 2017-12-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
WO2012018638A2 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
US20130071946A1 (en) | 2011-09-21 | 2013-03-21 | Roche Molecular Systems, Inc. | Suspension Container For Binding Particles For The Isolation Of Biological Material |
US20130164860A1 (en) * | 2011-11-04 | 2013-06-27 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Affinity methods and compositions employing electronic control of ph |
US9766207B2 (en) | 2011-11-04 | 2017-09-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Affinity methods and compositions employing electronic control of pH |
EP2773221B1 (en) | 2011-11-04 | 2019-01-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Simultaneous purification of cell components |
EP2814597A4 (en) | 2012-02-15 | 2015-10-28 | Bio Rad Laboratories | ELECTRONIC CONTROL OF PH AND IONIC FORCE |
US9321012B2 (en) | 2012-04-04 | 2016-04-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Electronic protein fractionation |
WO2013158340A1 (en) * | 2012-04-18 | 2013-10-24 | Rarecyte, Inc. | Systems and methods for separation and analysis of target analytes |
WO2014100755A2 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Biomatrica, Inc. | Formulations and methods for stabilizing pcr reagents |
US10364453B1 (en) * | 2013-02-04 | 2019-07-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Detecting of bacteria using fluorescently-labeled phage immobilized on an optically transparent surface |
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KR20230145258A (ko) | 2015-12-08 | 2023-10-17 | 바이오매트리카 인코포레이티드 | 적혈구 침강 속도의 감소 |
DK3400754T3 (da) * | 2016-01-08 | 2021-11-01 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Varmeelement til sensorarray |
IT201600079328A1 (it) * | 2016-07-28 | 2018-01-28 | Altergon Sa | Metodo migliorato per la decontaminazione di materiale biologico mediante partizione e inattivazione |
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GB1411382A (en) * | 1971-12-16 | 1975-10-22 | Radiochemical Centre Ltd | Methods of analysis |
US3852194A (en) * | 1972-12-11 | 1974-12-03 | Corning Glass Works | Apparatus and method for fluid collection and partitioning |
GB1566098A (en) * | 1975-11-14 | 1980-04-30 | Nat Res Dev | Separation of solid and liquid components of mixtures |
GB1533272A (en) * | 1976-02-13 | 1978-11-22 | Radiochemical Centre Ltd | Centrifuge tube |
IL56839A0 (en) * | 1979-03-11 | 1979-05-31 | Technion Res & Dev Foundation | Improvement in specific binding assay technique |
IL58943A (en) * | 1979-12-12 | 1983-05-15 | Cais Michael | Method and device for mass transfer operations in immunoassays and other applications |
JPS58205854A (ja) * | 1982-05-25 | 1983-11-30 | Mihama Hisaharu | 潜血反応検査用の固定化抗体 |
DE3222962C2 (de) * | 1982-06-19 | 1987-02-19 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Siliconpasten für die Trennung von Blutproben |
AU1912783A (en) * | 1982-09-15 | 1984-03-22 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Carousel microparticle separating, washing + reading device |
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