KR20120107497A - 샘플 내 분석물을 검출하기 위한 신규 분석 및 그것과 관련된 키트 및 조성물 - Google Patents

샘플 내 분석물을 검출하기 위한 신규 분석 및 그것과 관련된 키트 및 조성물 Download PDF

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KR20120107497A
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라제쉬 케이. 메라
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아박시스, 인크.
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Abstract

본 발명은 용액기반 샌드위치 분석 및 용액기반 경쟁 분석에서 부력, 크기, 밀도, 스펙트럼 특성 및/또는 결합 특성과 같은 다른 물리화학적 특성을 가지는 입자를 사용하는 분석물의 검출 방법을 제공한다. 본 방법은 로터 및 벤치탑(bench-top) 원심분리기를 사용하여 수행될 수 있으며, 빠르고, 정성적이고 정량적인 분석물의 검출을 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 본 방법을 수행하여 사용될 수 있는 키트 및 본 방법에 적당한 입자를 함유하는 혼합물을 제공한다.

Description

샘플 내 분석물을 검출하기 위한 신규 분석 및 그것과 관련된 키트 및 조성물{NOVEL ASSAYS FOR DETECTING ANALYTES IN SAMPLES AND KITS AND COMPOSITIONS RELATED THERETO}
관련출원에 대한 상호참조
이 출원은 2009년 12월 17일에 출원된 미국 가특허출원 제61/287,637호의 이익을 주장하며, 이 기초 출원은 본 명세서에 그의 전문이 참조로 포함된다.
발명의 기술분야
본 발명은 샘플 내 분석물의 검출방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 입자들을 포함하는 키트, 그리고, 입자들, 이들 입자들과 분석물을 포함하는 다입자 복합체의 집단을 포함하는 혼합물에 관한 것이다.
많은 분야의 시도, 및 특히 생명의료과학, 수의학 및 환경과학에서, 수집된 샘플 내, 예를 들어 검사 대상체(예를 들어, 환자, 실험실 및 농장 동물, 애완동물 등) 또는 환경으로부터 관심의 분자(즉, 분석물)를 검출할 수 있는 것은 중요하다. 이 필요를 충족시키기 위해, 측방 유동 장치(예를 들어, 가정(home) 임신검사)로부터 면역침강법 및 ELISA, 질량분석법의 범위로 다수의 다른 분석이 개발되었다. 이 분석은 매우 유용하지만 종종, 시행하는데 비용이 들고, 시간 소모적이고, 기술적으로 복잡하고, 큰 샘플 크기 또는 많은 수의 샘플 등에 대해 규모를 크게 하기 어려움과 같은 다수의 중요한 결점을 겪는다.
당업계에서 샘플 내 분석물을 검출하기 위한 새로운 분석에 대한 필요가 남아있다.
본 발명은 부력, 크기, 밀도, 스펙트럼 특징 및/또는 결합 특성과 같은 다른 물리화학적 특성을 가지는 입자가 분석물의 빠르고, 정성적이고 정량적인 검출을 위한 용액기반 샌드위치 분석에 사용될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 본 발명은 또한 부력, 크기, 밀도, 스펙트럼 특징 및/또는 결합 특성과 같은 다른 물리화학적 특성을 가지는 입자가 분석물의 빠르고, 정성적이고 정량적인 검출을 위한 용액기반 샌드위치 분석에 사용될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명은 분석물의 검출 방법, 이러한 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 키트, 및 이러한 방법에 적당한 입자들을 함유하는 혼합물을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 방법(예를 들어, 용액기반 샌드위치 분석)은,
샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 형성단계로서, 이들 입자는 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있는 것인 형성단계,
상기 현탁액으로부터 상기 혼합 시 형성된 다입자 복합체를 제거하는 단계, 및
현탁액 중에 남아있는 제1 및/또는 제2 입자의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
상기 현탁액 중의 제1 및/또는 제2 입자량의 감소는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 현탁액 중에서 검출가능하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시키고 또는 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 표지(예를 들어 형광 표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하고, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하며, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 포스터 공명 에너지 전달(Forster Resonance Energy Transfer: FRET) 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸(core-shell) 구조 입자 또는 공동(hollow) 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 부력이 더 크고 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 또는 그 반대이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 대안으로, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제1 입자, 제2 입자 또는 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 분석물-결합제, 예컨대 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질(nucleoprotein), 앱타머(aptamer) 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물-결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물의 다른 부분(예를 들어, 복합체 분석물 내의 다른 도메인, 다른 에피토프, 다른 서브유닛 또는 분자 등)의 다른 부분과 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물에 동시에 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 동일한 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩). 예를 들어, 제1 및 제2 에피토프는 단순 분석물의 다른 표면 상에 있을 수 있고 또는 복합체 분석물 내 다른 서브유닛 또는 분자일 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물에 의해 인식될 수 있는 항원을 포함하며(예를 들어, 항체 분석물, 예컨대 질병-특이적 항체 또는 자가-항체), 제2 입자는 분석물을 인식할 수 있는 단백질 또는 항체를 포함한다. 예를 들어, 제2 입자는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 항체-결합 단백질인 단백질 또는 항체 불변영역(예를 들어, 항-IgG 또는 항-IgM 항체)에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 상기 복합체를 펠렛화(pellet)하기 위해 중력(gravity)을 허용하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 힘을 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 상기 현탁액에 원심력을 적용하는 것을 포함한다(예를 들어 로터 내 현탁액을 회전시킴으로써). 특정 구체예에서, 적용된 중력 또는 힘은 상기 다입자 복합체를 펠렛화하지만, 상기 다입자 복합체 중 하나에 존재하지 않는 제1 입자 및 제2 입자는 펠렛화하지 않는다. 특정 구체예에서, 중력 또는 힘은 상기 다입자 복합체 및 상기 제1 입자(예를 들어, 유리(free) 제1 입자 및 다입자 복합체에 존재하는 제1 입자) 또는 상기 제2 입자(예를 들어, 유리 제2 입자 및 다입자 복합체에 존재하는 제2 입자)를 펠렛화하지만, 상기 제1 입자와 상기 제2 입자는 펠렛화하지 않는다.
특정 구체예에서, 분석물은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변 등) 또는 환경적 샘플(예를 들어, 지하수, 강, 호수, 폐수 등)에 존재한다. 특정 구체예에서, 분석물은 질병에 대한 마커(예를 들어, 항원 마커 또는 항체 마커)이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석물은 암관련 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자가면역관련 항원, 심혈관계 질병 관련 항원 또는 임의의 앞서 언급한 항원에 대한 항체이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 분석물을 검출하기 위한 방법(예를 들어, 용액기반 샌드위치 분석)을 제공하되, 본 방법은
샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계로서, 이때 이들 입자는 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있는 것인 형성단계,
상기 현탁액으로부터 제2 입자를 제거하는 단계, 및
현탁액 중에 남아있는 제1 입자의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
상기 현탁액 중의 제1 입자량의 감소는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 현탁액 중에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 빛을 산란시키고 또는 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 표지(예를 들어 형광 표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 FRET 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸 구조 입자 또는 공동 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸 구조 입자 또는 공동 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 부력이 더 크다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가진다. 다른 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자보다 더 큰 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제1 입자, 제2 입자 또는 제1 입자와 제2 입자는 분석물-결합제, 예컨대 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물의 다른 부분(예를 들어, 복합체 분석물 내 다른 도메인, 다른 에피토프, 다른 서브유닛 또는 분자 등)에 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물에 동시에 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩). 예를 들어, 제1 및 제2 에피토프는 단순 분석물의 다른 표면상에 또는 복합체 분석물 내 다른 서브유닛 또는 분자에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물에 의해 인식될 수 있는 항원을 포함하며(예를 들어, 항체 분석물, 예컨대 질병-특이적 항체 또는 자가-항체), 제2 입자는 분석물을 인식할 수 있는 단백질 또는 항체를 포함한다. 예를 들어, 제2 입자는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 항체-결합 단백질인 단백질, 또는 항체 불변영역(예를 들어, 항-IgG 또는 항-IgM 항체)에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 상기 다입자 복합체를 제거하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 상기 제2 입자(및 상기 다입자 복합체)를 펠렛화하기 위해 중력을 허용하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 힘을 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어 특정 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 상기 현탁액에 원심력을 적용하는 것을 포함한다(예를 들어 로터 내 현탁액을 회전시킴으로써). 특정 구체예에서, 적용된 중력 또는 힘은 상기 제2 입자를 펠렛화하지만, 제2 입자 중 하나와 복합체화되지 않은 제1 입자를 펠렛화하지 않는다.
특정 구체예에서, 분석물은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변 등) 또는 환경적 샘플(예를 들어, 지하수, 강, 호수, 폐수 등)에 존재한다. 특정 구체예에서, 분석물은 질병에 대한 마커(예를 들어, 항원 마커 또는 항체 마커)이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석물은 암관련 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자가면역관련 항원, 심혈관계 질병 관련 항원 또는 임의의 앞서 언급한 항원에 대한 항체이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 분석물을 검출하기 위한 방법(예를 들어, 용액기반 경쟁 분석)을 제공하며, 본 방법은
샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 형성단계로서, 이때 이들 입자는 제1 입자는 분석물을 포함하고, 이들 입자는 제1 입자 및 제2 입자를 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있는 것인 형성단계,
상기 현탁액으로부터 상기 혼합 시 형성된 다입자 복합체를 제거하는 단계, 및
상기 현탁액 중에 남아있는 제1 및/또는 제2 입자의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
상기 현탁액 중의 제1 및/또는 제2 입자량의 증가는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다.
특정 구체예에서, 제1 입자 및/또는 제2 입자는 현탁액 중에서 검출될 수 있다. 예를 들어 특정 구체예에서, 제1 입자 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시키고 또는 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 표지(예를 들어 형광 표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 FRET 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸 구조 입자 또는 공동 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 부력을 가지며 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 또는 그 반대이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 대안으로, 특정 구체예에서 제1 입자는 제2 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가지며 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제2 입자는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 분석물 결합제는 상기 제1 입자에 존재하는 분석물에 결합할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 상기 다입자 복합체를 펠렛화하기 위해 중력을 허용하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 힘을 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 상기 현탁액에 원심력을 적용하는 것을 포함한다(예를 들어 로터 내 현탁액을 회전시킴으로써). 특정 구체예에서, 적용된 중력 또는 힘은 상기 다입자 복합체를 펠렛화하지만, 상기 다입자 복합체 중 하나에 존재하지 않는 제1 입자 및 제2 입자를 펠렛화하지 않는다. 특정 구체예에서, 적용된 중력 또는 힘은 상기 다입자 복합체 및 상기 제1 입자(예를 들어, 유리 제1 입자 및 다입자 복합체에 존재하는 제1 입자) 또는 상기 제2 입자(예를 들어, 유리 제2 입자 및 다입자 복합체에 존재하는 제2 입자) 중 하나를 펠렛화하지만, 상기 제1 입자와 상기 제2 입자 둘 다를 펠렛화하지 않는다.
특정 구체예에서, 분석물은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변 등) 또는 환경적 샘플(예를 들어, 지하수, 강, 호수, 폐수 등)에 존재한다. 특정 구체예에서, 분석물은 질병에 대한 마커(예를 들어, 항원 마커 또는 항체 마커)이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석물은 암관련 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자가면역관련 항원, 심혈관계 질병 관련 항원 또는 임의의 앞서 언급한 항원에 대한 항체이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 분석물을 검출하기 위한 방법(예를 들어, 용액기반 경쟁 분석)을 제공하며, 본 방법은
샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 형성단계로서, 이때 제1 입자는 분석물을 포함하고, 상기 입자들은 제1 입자 및 제2 입자를 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있는 것인 형성단계,
상기 현탁액으로부터 상기 제2 입자를 제거하는 단계, 및
현탁액 중에 남아있는 제1 입자의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
상기 현탁액 중의 제1 입자량의 증가는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 현탁액 중에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 빛을 산란시키고 또는 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 표지(예를 들어 형광 표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 FRET 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸 구조 입자 또는 공동 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 부력을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가진다. 다른 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자보다 더 큰 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제2 입자는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 분석물 결합제는 상기 제1 입자에 존재하는 분석물에 결합할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 제2 입자 제거하는 단계는 상기 다입자 복합체를 제거하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 상기 제2 입자(및 상기 다입자 복합체)를 펠렛화하기 위해 중력을 허용하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 힘을 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 상기 제2 입자를 제거하는 단계는 상기 현탁액에 원심력을 적용하는 것을 포함한다(예를 들어 로터 내 현탁액을 회전시킴으로써). 특정 구체예에서, 적용된 중력 또는 힘은 상기 제2 입자를 펠렛화하지만, 상기 제2 입자 중 하나와 복합체화하지 않는 제1 입자를 펠렛화하지 않는다.
특정 구체예에서, 분석물은 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변 등) 또는 환경적 샘플(예를 들어, 지하수, 강, 호수, 폐수 등)에 존재한다. 특정 구체예에서, 분석물은 질병에 대한 마커(예를 들어, 항원 마커 또는 항체 마커)이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석물은 암관련 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 자가면역관련 항원, 심혈관계 질병 관련 항원 또는 임의의 앞서 언급한 항원에 대한 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에서 사용에 적당한 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단을 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 용액기반 경쟁 분석에서 사용에 적당하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 유리 분석물은 상기 다입자 복합체의 형성을 방해한다(예를 들어, 경쟁적으로 억제한다). 다른 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 용액기반 샌드위치 분석(예를 들어, 간접 또는 직접적 샌드위치 분석)에서 사용에 적당하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 특정 관련 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 제1 입자 및 제2 입자는 각각 동일한 분석물에 결합하고, 상기 분석물은 상기 제1 입자를 상기 제2 입자에 연결한다.
특정 구체예에서, 상기 제1 및/또는 제2 입자는 현탁액 중에서 검출가능하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시키거나 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸 구조 입자 또는 공동 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 부력을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가지며 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물을 포함하며, 제2 입자는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 대응하는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함하며, 분석물 결합제는 동일 분석물에 결합한다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물의 다른 부분(예를 들어, 복합체 분석물 내 다른 도메인, 다른 에피토프, 다른 서브유닛 또는 분자 등)에 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물에 동시에 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩). 예를 들어, 제1 및 제2 에피토프는 단순 분석물의 다른 표면상에 또는 복합체 분석물 내 다른 서브유닛 또는 분자에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물에 의해 인식될 수 있는 항원을 포함하며(예를 들어, 항체 분석물, 예컨대 질병-특이적 항체 또는 자가-항체), 제2 입자는 분석물을 인식할 수 있는 단백질 또는 항체를 포함한다. 예를 들어, 제2 입자는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 항체-결합 단백질인 단백질 또는 항체 불변영역(예를 들어, 항-IgG 또는 항-IgM 항체)에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자의 집단은 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태이다. 특정 구체예에서, 제2 입자의 집단은 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태이다. 특정 구체예에서, 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단은 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태이다.
특정 구체예에서, 키트는 상기 제1 입자의 집단, 상기 제2 입자의 집단, 또는 상기 제1과 상기 제2 입자의 집단을 포함하는 용기(예를 들어, 테스트 튜브, 보틀(bottle) 또는 큐벳(cuvette))를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 로터를 추가로 포함하며, 상기 로터는 상기 제1 입자의 집단, 상기 제2 입자의 집단 또는 상기 제1 입자와 제2 입자의 집단을 둘 다 포함하는 용기를 포함하거나 보유할 수 있다.
특정 구체예에서, 키트는 설명서(예를 들어, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트의 내용물을 사용하기 위한 설명서)를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 입자의 집단, 제2 입자의 집단 및 선택적으로 분석물을 포함하는 혼합물을 제공한다. 특정 구체예에서, 혼합물은 용액기반 경쟁 분석의 부분이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 유리 분석물은 상기 다입자 복합체의 형성을 방해한다(예를 들어, 경쟁적으로 억제한다). 다른 구체예에서, 혼합물은 용액기반 샌드위치 분석(예를 들어, 간접 또는 직접적 샌드위치 분석)의 부분이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 특정 관련 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 제1 입자 및 제2 입자는 각각 동일한 분석물에 결합하고, 상기 분석물은 상기 1 입자를 상기 제2 입자에 연결한다.
특정 구체예에서, 상기 제1 및/또는 제2 입자는 현탁액 중에서 검출가능하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시키거나 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 표지(예를 들어, 형광 표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1과 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 콜로이드 입자(예를 들어, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 코어 셸 구조 입자 또는 공동 나노입자)이다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 혼합된 금속을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리, 또는 혼합된 금속을 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 부력을 가지며, 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작으며, 또는 그 반대이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 대안으로, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가지며, 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물을 포함하며, 제2 입자는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 대응하는 분석물 결합제를 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함하며, 분석물 결합제는 동일 분석물에 결합한다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물의 다른 부분(예를 들어, 복합체 분석물 내 다른 도메인, 다른 에피토프, 다른 서브유닛 또는 분자 등)에 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물에 동시에 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩 상태이다). 예를 들어, 제1 및 제2 에피토프는 단순 분석물의 다른 표면상에 또는 복합체 분석물 내 다른 서브유닛 또는 분자에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물에 의해 인식될 수 있는 항원(예를 들어, 항체 분석물, 예컨대 질병-특이적 항체 또는 자가-항체)을 포함하며, 제2 입자는 분석물을 인식할 수 있는 단백질 또는 항체를 포함한다. 예를 들어, 제2 입자는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 항체-결합 단백질인 단백질, 또는 항체 불변영역(예를 들어, 항-IgG 또는 항-IgM 항체)에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명 및 그것의 추가적인 구체예는 다음의 상세한 설명에서 더욱 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 본 발명의 샌드위치 분석을 나타낸 도면. 도 1a는 분석물과 혼합한 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단을 나타낸다. 제1 입자와 제2 입자는 부력, 크기 및 밀도에 기반하여 서로 다르다. 제1 및 제2 입자로부터의 분지 구조 돌출부는 분석물 결합제이다. 도 1b는 제1 입자와 제2 입자 사이의 복합체의 형성을 나타내며, 유리 분석물 분자는 제1 입자와 제2 입자에 결합하고, 그것에 의해 복합체 형성을 가능하게 한다. 도 1c는 중력 또는 원심력과 같은 힘의 적용이 용액을 이탈하는 더 큰 입자와 함께 제2 입자로부터 제1 입자의 분리를 야기하여 더 큰 입자들을 포함하는 임의의 복합체와 함께 펠렛을 형성할 수 있는 방법을 나타낸다. 도 1d는 (1) 제1 입자와 제2 입자 및 분석물의 혼합물의 흡광도와 (2) 적절한 힘의 적용 후 혼합물 내 분석물의 농도 사이의 관계를 나타낸다. 처음에, 분석물 농도가 올라감에 따라 혼합물의 흡광도는 내려가고, 증가된 분석물 농도는 힘의 적용 시 복합체가 펠렛화되는 증가된 복합체 형성을 유발한다는 사실을 반영한다.
도 2는 본 발명의 경쟁 분석을 나타낸 도면. 도 2a는 제1 입자의 집단과 제2 입자의 집단을 나타내며, 제1 집단의 입자는 분석물로 코팅되고, 제2 집단의 입자는 대응하는 분석물 결합 분자로 코팅된다. 2 집단의 입자는 추가로 부력, 크기 및 밀도를 기반으로 서로 다르다. 도 2b는 혼합 시 제1 및 제2 집단 입자 사이의 복합체의 형성을 나타낸다. 도 2c는 제2 집단의 입자에 존재하는 분석물 결합 분자에 결합을 위해 제1 집단의 입자와 경쟁하고, 그것에 의하여 복합체 형성을 방지하고 및/또는 제1 및 제2 집단의 입자 사이에 형성된 복합체를 방해하는 유리 분석물 분자를 나타낸다. 도 2d는 중력 또는 원심력과 같은 힘의 적용이 용액을 이탈하는 더 큰 입자와 함께 제1 및 제2 입자의 분리를 야기하여 더 큰 입자들을 포함하는 임의의 복합체와 함께 펠렛을 형성할 수 있는 방법을 나타낸다. 도 2e는 적절한 힘의 적용 후 (1) 제1 입자와 제2 입자 및 유리 분석물의 혼합물의 흡광도와 (2) 혼합물 내 유리 분석물의 농도 사이의 한 관계를 나타낸다. 처음에, 유리 분석물의 농도가 올라감에 따라 혼합물의 흡광도는 올라가고, 증가된 분석물 농도가 감소된 복합체 형성을 유발하고, 따라서 힘의 적용시 복합체가 거의 펠렛화되지 않는다는 사실을 반영한다.
본 명세서에서 사용되는 다음의 용어는 다음의 의미를 가질 것이다.
용어 "분석물"은 분석 절차에 의해 검출되고 및/또는 정량될 수 있는 샘플 내 잠재적으로 존재하는 물질을 말한다. 본 발명의 방법을 사용하여 검출될 수 있는 분석물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항원(예를 들어, 질병관련 항원), 항체(예를 들어, 질병관련 항체), 거대분자(예를 들어, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 그것의 조합), 복합체(예를 들어, 다단백질 복합체, 핵단백질 복합체, 탄수화물을 포함하는 복합체, 지질, 보결분자단 또는 다른 소분자 등), 입자(예를 들어, 바이러스 입자 또는 아포토시스 소체(apoptotic body), 소수포, 세포 및 그것의 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "복합체 분석물"은 복합체(예를 들어, 다단백질 복합체, 핵단백질 복합체, 거대분자 복합체 등)로 이루어지는 분석물이다.
용어 "항체"는 면역글로불린 도메인 및 항원 결합 자리를 포함하는 단백질을 말한다. 따라서, 본 용어는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 임의의 이소형의 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD), 그것의 단편(예를 들어, Fab, Fab2, Fc), 단일쇄 항체(예를 들어, Fv), 변형된 항체, 및 면역글로불린 도메인 및 항원 결합 자리을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드"와 상호호환적으로 사용되며, 전장 단백질, 단백질 도메인, 단백질 단편, 돌연변이체 단백질, 및 변형된 단백질(예를 들어, 화학적으로 변형된 아미노산 또는 비천연적으로 발생하는 아미노산을 포함하는 단백질)을 포함한다.
용어 "핵산", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호호환적으로 사용되며, 단일가닥이든 이중가닥이든 DNA, RNA 및 cDNA뿐만 아니라 화학적으로 변형된 염기 또는 비천연적으로 발생하는 염기(예를 들어, LNA, PNA 등)를 포함하는 핵산을 포함한다.
추가 용어는 필요하다면, 다음의 상세한 설명에서 정의될 것이다.
방법
본 발명은, 부력, 크기, 밀도, 스펙트럼 특징 및/또는 결합 특성과 같은 다른 물리적 또는 다른 물리화학적 특성을 가지는 입자가 분석물의 빠르고, 정성적이고 및/또는 정량적인 검출을 위해 용액기반 샌드위치 분석에서 사용될 수 있다는 발견에 기반한다.
따라서 한 양태에서, 본 발명은 샘플 내 분석물의 검출 방법을 제공한다. 본 방법은 샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "현탁액"은 제1 및 제2 입자가 서로 및 샘플 내 존재할 수 있는 임의의 분석물과 상호작용할 수 있는 액체 혼합물을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "상호작용하다"는, 입자 및 분석물에 관해서 충돌하는 것과, 적절하다면, 서로 결합하는 것(예를 들어, 비공유 또는 공유적 화학 결합을 형성)을 의미한다.
전형적으로, 제1 입자 및/또는 제2 입자는 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다. 특정 구체예에서, 제1 입자 및/또는 제2 입자는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "콜로이드 나노입자", "콜로이드 공동 나노구" 및 "콜로이드 코어 셸 구조 입자"는 각각 약 1㎚ 내지 약 500㎚의 직경을 가지고, 수성 배지 내 현탁액 중에 남아있는 나노입자, 공동 나노구, 및 코어 셸 구조 입자를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "콜로이드 나노튜브"는 약 1㎚ 내지 약 500㎚의 직경 및 약 1㎚ 내지 약 500㎚의 길이를 가지며, 수성 배지 중의 현탁액에 남아있는 나노입자를 말한다. 일반적으로, 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자는 균질한 외관을 유지하지만, 수성 배지 중에서 용해하지 않는다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 관련 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 조성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함하며, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 크기를 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 약 1㎚ 내지 약 200㎚의 평균 직경을 가지고, 제2 입자는 약 200㎚ 내지 약 2000㎚의 평균 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 약 2㎚ 내지 약 150㎚, 약 3㎚ 내지 약 100㎚, 약 4㎚ 내지 약 70㎚, 또는 약 5㎚ 내지 약 40㎚의 평균 직경을 가지고, 제2 입자는 약 220㎚ 내지 약 1800㎚, 약 240㎚ 내지 약 1600㎚, 약 260㎚ 내지 약 1400㎚, 약 280㎚ 내지 약 1200㎚, 약 300㎚ 내지 약 1000㎚, 약 320㎚ 내지 약 900㎚, 약 340㎚ 내지 약 800㎚, 약 350㎚ 내지 약 700㎚, 약 360㎚ 내지 약 600㎚, 약 370㎚ 내지 약 500㎚, 약 380㎚ 내지 약 450㎚, 약 390㎚ 내지 약 425㎚, 또는 약 400㎚의 평균 직경을 가진다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이고, 약 1㎚ 내지 약 200㎚, 약 2㎚ 내지 약 150㎚, 약 3㎚ 내지 약 100㎚, 약 4㎚ 내지 약 70㎚, 또는 약 5㎚ 내지 약 40㎚의 평균 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하며, 약 200㎚ 내지 약 2000㎚, 약 220㎚ 내지 약 1800㎚, 약 240㎚ 내지 약 1600㎚, 약 260㎚ 내지 약 1400㎚, 약 280㎚ 내지 약 1200㎚, 약 300㎚ 내지 약 1000㎚, 약 320㎚ 내지 약 900㎚, 약 340㎚ 내지 약 800㎚, 약 350㎚ 내지 약 700㎚, 약 360㎚ 내지 약 600㎚, 약 370㎚ 내지 약 500㎚, 약 380㎚ 내지 약 450㎚, 약 390㎚ 내지 약 425㎚, 또는 약 400㎚의 평균 직경을 가진다.
특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 평균 직경보다 더 큰 약 2배의 평균 직경을 가진다. 다른 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 평균 직경보다 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 배수로 더 큰 평균 직경을 가진다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이고, 제2 입자의 평균 직경보다 약 2 내지 약 100, 약 3 내지 약 80, 약 4 내지 약 65, 약 5 내지 약 50배 더 작은 평균 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하며, 제1 입자의 평균 직경보다 약 2 내지 약 100, 약 3 내지 약 80, 약 4 내지 약 65, 약 5 내지 약 50배 더 큰 평균 직경을 가진다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 밀도를 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 밀도보다 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 배수로 더 큰 밀도를 가진다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이고, 제2 입자의 밀도보다 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 배수로 더 큰 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하며, 제1 입자의 밀도보다 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 배수로 더 작은 밀도를 가진다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 수성 배지 중에서 다른 부력을 가진다. 예를 들어 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 평균 부력보다 약 1.5 내지 약 250배 더 큰 평균 부력을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 평균 부력보다 약 2 내지 약 225, 약 3 내지 약 200, 약 4 내지 약 175, 약 5 내지 약 150, 약 6 내지 약 140, 약 7 내지 약 130, 약 8 내지 약 120, 약 9 내지 약 110, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 90, 약 30 내지 약 80, 약 40 내지 약 70, 약 50 내지 약 60 또는 약 55배 더 큰 평균 부력을 가진다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이고, 제2 입자의 평균 부력보다 약 1.5 내지 약 250, 약 2 내지 약 225, 약 3 내지 약 200, 약 4 내지 약 175, 약 5 내지 약 150, 약 6 내지 약 140, 약 7 내지 약 130, 약 8 내지 약 120, 약 9 내지 약 110, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 90, 약 30 내지 약 80, 약 40 내지 약 70, 약 50 내지 약 60 또는 약 55배 더 큰 평균 부력을 가진다. 특정 구체예에서, 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하며, 제1 입자의 평균 부력보다 약 1.5 내지 약 250, 약 2 내지 약 225, 약 3 내지 약 200, 약 4 내지 약 175, 약 5 내지 약 150, 약 6 내지 약 140, 약 7 내지 약 130, 약 8 내지 약 120, 약 9 내지 약 110, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 90, 약 30 내지 약 80, 약 40 내지 약 70, 약 50 내지 약 60 또는 약 55배 더 작은 평균 부력을 가진다.
"제1" 및 "제2" 입자의 표지는 한 구체예와 다른 구체예 사이에서 임의의 방식으로 앞서 언급한 구체예로 사용된다. 따라서, 제1 입자가 제2 입자와 비교하여 더 작은 크기, 더 큰 밀도, 및 더 큰 부력을 가지는 다양한 구체예로 설명되지만, 이 특징들은 제1 입자와 배타적으로 연관되지 않는다. 예를 들어, 제1 입자는 제2 입자와 비교하여 더 작은 크기, 더 작은 밀도 및 더 큰 부력을 가질 수 있다. 대안으로, 제1 입자는 제2 입자와 비교하여 더 큰 크기, 더 작은 밀도, 및 더 큰 부력을 가질 수 있다. 게다가, 제1 입자는 제2 입자와 비교하여 동일한 크기, 동일한 밀도, 및/또는 동일한 부력을 가질 수 있다. 따라서, 당업자는 제1 및 제2 입자가 물리화학적 특성에 대해 임의의 혼합을 가질 수 있으며, 단 (1) 그것들은 다른 결합 특성을 가지고 (2) 적어도 제1 입자, 적어도 제2 입자, 또는 제1 또는 제2 입자 중 하나의 수반되는 침강 없이 복합체의 침강을 허용하는 것에 관해서 제1 입자와 제2 입자 사이에 형성된 복합체는 충분히 낮은 부력을 가진다는 것을 인식할 것이다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "다입자 복합체"는 적어도 하나의 제1 입자 및 적어도 하나의 제2 입자를 포함하는 임의의 분자 덩어리이며, 제1 및 제2 입자는 직접적 또는 간접적 방식으로 서로 결합된다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 간접적 결합 상호작용에 의해 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 이에 관해서 사용되는 용어 "간접 결합"은 상호작용을 가교하기 위하여 제1 및 제2 입자로부터 추가적인 분자 분리를 필요로 하지 않는 임의의 결합을 말한다. 따라서, 제1 입자는 공유적으로 결합된 또는 그것의 표면에 달리 안정하게 연결된 분자 A를 가지며, 제2 입자는 공유적으로 결합된 또는 그것의 표면에 달리 안정하게 연결된 분자 B를 가지고, 분자 A와 분자 B의 결합은 제1 입자와 제2 입자 사이의 간접적 결합 상호작용을 구성한다.
다른 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 간접적 결합 상호작용에 의해서 복합체를 형성할 수 있다. 이에 관해서 사용되는 용어 "간접적 결합"은 상호작용을 가교하기 위하여 제1 및 제2 입자로부터 하나 이상의 분자 분리를 필요로 하지 않는 임의의 결합을 말한다. 따라서, 제1 입자는 분리 분자 C에 (예를 들어, 입자의 표면에 공유적으로 연결된 분자 A를 통해) 결합하고, 제2 입자는 또한 분자 C에 (예를 들어, 입자의 표면에 공유적으로 연결된 분자 B를 통해) 결합하고, 중간체 분자 C를 통한 제1 입자 상의 분자 A와 제2 입자 상의 분자 B의 결합은 제1 입자와 제2 입자 사이의 간접적 결합 상호작용을 구성한다.
특정 구체예에서, 제1 입자, 제2 입자 또는 제1 입자와 제2 입자 둘 다는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민, 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함한다. 따라서, 용액기반 샌드위치 분석에 적당하기 때문에, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물 결합제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일 분석물의 다른 부분(예를 들어 복합체 분석물 내 다른 도메인, 다른 에피토프, 다른 서브유닛 또는 분자 등)과 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물 분자에 동시에 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다.
따라서, 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물(예를 들어, 질병 관련 항원 또는 항체, 바이러스 또는 바이러스 항원, 미생물 또는 그것의 항원 등) 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 및 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩 또는 분석물이 제1 입자 및 제2 입자와 동시에 결합하는 것을 막지 않는 최소의 방법으로 중첩). 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물(예를 들어, 질병 관련 항원 또는 항체, 바이러스 또는 바이러스 항원, 미생물 또는 그것의 항원 등) 상의 제1 표면와 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물 상의 제2 표면과 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하고, 제1 및 제2 표면은 다르다(예를 들어, 비중첩 또는 분석물이 제1 입자 및 제2 입자와 동시에 결합하는 것을 막지 않는 최소의 방법으로 중첩한다). 또 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물의 제1 부분(예를 들어, 질병 관련 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드 분석물, 또는 바이러스 입자와 같은 핵단백질 분석물의 제1 부분)과 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물의 제2 부분에 결합할 수 있고, 제1과 제2 부분은 다르다(예를 들어, 비중첩 또는 분석물이 제1 입자 및 제2 입자와 동시에 결합하는 것을 막지 않는 최소의 방법으로 중첩한다).
당업자는 제1 및 제2 입자가 동일한 유형의 분석물 결합제를 포함할 필요가 없고, 다수의 다른 조합의 제1 입자 분석물 결합제와 제2 입자 분석물 결합제가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 제1 입자는 항체를 포함할 수 있는 한편, 제2 입자는, 예를 들어 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 뉴크레오단백질, 앱타머 또는 리간드를 포함한다. 마찬가지로, 제1 입자는 항원을 포함할 수 있는 한편, 제2 입자는, 예를 들어 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드를 포함한다. 대안으로, 제1 입자는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 한편, 제2 입자는 예를 들어, 항체, 항원, 폴리펩티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드 등을 포함할 수 있다.
대안으로, 용액기반 경쟁 분석에 대해 적당한 것에 대해, 제1 입자는 분석물을 포함할 수 있는 한편, 제2 입자는 대응하는 분석물 결합제를 포함한다. 분석물은 본 명세서에서 설명되는 임의의 유형의 분석물일 수 있다(예를 들어, 항원(예를 들어, 질병관련 항원), 항체(예를 들어, 질병관련 항체), 거대분자(예를 들어, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 그것의 조합), 복합체(예를 들어, 다단백질 복합체, 핵단백질 복합체, 탄수화물을 포함하는 복합체, 지질, 보결분자단 또는 다른 소분자 등), 입자(예를 들어, 바이러스 입자 또는 아포토시스 소체), 소수포, 세포 및 그것의 단편). 유사하게, 대응하는 분석물 결합제는 다수의 다른 형태, 예컨대 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머, 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)를 취할 수 있다.
따라서, 특정 구체예에서, 제1 입자는 항체를 포함하는 한편(예를 들어, 자가면역-항체와 같은 질병관련 항체), 제2 입자는 항체에 의해 인식되는 항원(예를 들어, 자기 항원)을 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 바이러스 항원 또는 바이러스 입자를 포함하는 한편, 제2 입자는 바이러스 항원 및/또는 바이러스 입자에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제1 입자는 질병관련 항원(예를 들어, 감염성 미생물로부터의 항원)을 포함하는 한편, 제2 입자는 질병관련 항원에 결합하는 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다.
또한, 당업자는 본 발명의 방법에서 사용을 위한 제1 및 제2 입자에 부착될 수 있는 분석물 및 분석물 결합제의 다수의 다른 조합이 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 앞서 언급한 구체예로 제한되지 않지만, 대신 본 발명의 명세서에 의해 설명되거나 제안되는 다수의 다른 분석물 및 분석물 결합제 조합을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법은 샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합한 후 형성된 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 다입자 복합체는 침강에 의해 현탁액으로부터 제거된다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 현탁액은 충분한 시간 동안 두어서 중력이 작용하도록 하고, 그것에 의해서 다입자 복합체를 침강시킨다(즉, 펠렛화한다). 다른 구체예에서, 힘이 현탁액에 적용되어 다입자 복합체를 펠렛화한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 원심력이 현탁액에 적용되어, 침전물에 존재하는 임의의 다입자 복합체가 침강물에 존재하도록 야기한다. 특정 구체예에서, 현탁액은 원심분리되어(예를 들어 로터 내 현탁액을 회전시킴으로써) 다입자 복합체의 침전물을 이룬다. 또 다른 구체예에서, 다입자 복합체는 자기력에 의해(예를 들어, 제1 또는 제2 입자는 강자성 또는 상자성 물질을 포함한다) 또는 전기장에 의해(예를 들어, 입자 중 하나 또는 유형 둘 다로부터의 복합체의 전하 기반 분리에 대해) 현탁액으로부터 제거된다.
특정 구체예에서, 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계는 제1 입자(예를 들어, 유리 제1 입자 또는 다입자 복합체에 존재하는 제1 입자) 또는 제2 입자(예를 들어, 유리 제2 입자 및 다입자 복합체에 존재하는 제2 입자) 중 하나를 현탁액으로부터 제거하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "유리 제1 입자" 또는 "유리 제2 입자"는 각각 제1 입자 또는 제2 입자이며, 다입자 복합체의 부분이 아니다. 입자의 침강이 입자 직경의 제곱에 직접 비례하기 때문에(일정한 입자 밀도를 추정), 현탁액에 제1 입자 또는 제2 입자를 침강시키기에 충분한 힘을 적용하는 것은 상기 제1 또는 제2 입자 중 하나 이상을 포함하는 더 큰 복합체의 침강을 초래한다. 따라서, 제1 입자 및 제2 입자의 상대적 부력이 선택될 수 있고, 주어진 침강력에 대해, 제1 입자 또는 제2 입자 중 하나(그러나 입자의 유형 둘 다는 아님)는 하나 이상의 상기 제1 입자 및 하나 이상의 상기 제2 입자를 포함하는 임의의 다입자 복합체와 함께 침강한다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 제1 입자 또는 제2 입자 중 하나를 현탁액으로부터 제거하는 단계를(적절한 침강력의 적용에 의해) 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자의 부력은 제2 입자의 부력보다 크고, 현탁액에 적용되는 힘(예를 들어, 원심력)은 제2 입자의 침강을 야기하지만(즉, 유리 제2 입자 및 적어도 하나의 제2 입자를 포함하는 임의의 복합체), 유리 제1 입자의 침강을 야기하지 않는다.
다른 구체예에서, 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계는 제1 입자(즉, 유리 제1 입자) 또는 제2 입자(즉, 유리 제2 입자) 중 하나의 침강을 포함하지 않는다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 현탁액에 적용된 힘은 다입자 복합체의 침강을 야기하지만, 유리 제1 입자 또는 유리 제2 입자의 침강을 야기하기에 충분하지 않다.
특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1400g 또는 그 미만, 약 1500g 또는 그 미만, 약 1600g 또는 그 미만, 약 1700g 또는 그 미만, 약 1800g 또는 그 미만, 약 1900g 또는 그 미만, 약 2000g 또는 그 미만, 약 2100g 또는 그 미만, 약 2200g 또는 그 미만, 약 2300g 또는 그 미만, 약 2400g 또는 그 미만, 또는 약 2500g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아있다.
특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1000g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있고, 약 1000g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1100g 또는 그 미만의 원심력으로 남아있고, 약 1100g 초과의 큰 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1200g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1200g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1300g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1300g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1350g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1350g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1400g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1400g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1450g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1450g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1500g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1500g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제2 입자는 약 1550g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액에서 남아있고, 약 1550g 초과의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다.
특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1000g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 500g 내지 약 1000g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1100g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 600g 내지 약 1100g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1200g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 700g 내지 약 1200g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1300g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 800g 내지 약 1300g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1350g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 850g 내지 약 1350g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1400g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 900g 내지 약 1400g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1450g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 950g 내지 약 1450g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1500g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1000g 내지 약 1500g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1550g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1050g 내지 약 1550g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1600g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1100g 내지 약 1600g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1650g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1150g 내지 약 1650g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1700g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1200g 내지 약 1700g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1800g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1300g 내지 약 1800g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 1900g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1400g 내지 약 1900g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다. 특정 구체예에서, 유리 제1 입자는 약 2000g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아 있는 한편, 유리 제2 입자는 약 1500g 내지 약 2000g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강된다.
특정 구체예에서, 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계는 현탁액에 약 1000g 내지 약 2500g의 원심력을 적용함으로써 달성된다. 특정 구체예에서, 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계는 현탁액에 약 1200g 내지 약 2000g, 약 1350g 내지 약 2150g, 약 1500g 내지 약 2300g, 약 1000g 내지 약 1200g, 약 1100g 내지 약 1300g, 약 1200g 내지 약 1400g, 약 1300g 내지 약 1500g, 약 1400g 내지 약 1600g, 약 1500g 내지 약 1700g, 약 1600g 내지 약 1800g, 약 1700g 내지 약 1900g, 약 1800g 내지 약 2000g, 약 1900g 내지 약 2100g, 약 2000g 내지 약 2200g, 약 2100g 내지 약 2300g, 약 2200g 내지 약 2400g 또는 약 2300g 내지 약 2500g의 원심력을 적용함으로써 달성된다.
특정 구체예에서, 현탁액으로부터 유리 제1 입자 또는 유리 제2 입자를 제거하는 단계는 약 1000g 내지 약 2500g의 원심력을 적용함으로써 달성된다. 특정 구체예에서, 현탁액으로부터 제1 입자 또는 제2 입자를 제거하는 단계는 현탁액에 약 1200g 내지 약 2000g, 약 1350g 내지 약 2150g, 약 1500g 내지 약 2300g, 약 1000g 내지 약 1200g, 약 1100g 내지 약 1300g, 약 1200g 내지 약 1400g, 약 1300g 내지 약 1500g, 약 1400g 내지 약 1600g, 약 1500g 내지 약 1700g, 약 1600g 내지 약 1800g, 약 1700g 내지 약 1900g, 약 1800g 내지 약 2000g, 약 1900g 내지 약 2100g, 약 2000g 내지 약 2200g, 약 2100g 내지 약 2300g, 약 2200g 내지 약 2400g 또는 약 2300g 내지 약 2500g의 원심력을 적용함으로써 달성된다.
특정 구체예에서, 현탁액에 약 1000g 내지 약 2500g(예를 들어, 약 1300g 내지 약 1800g)의 원심력을 적용하는 단계는 제1 입자(예를 들어 유리 제1 입자 및 복합체에 존재하는 제1 입자) 또는 제2 입자(예를 들어, 유리 제2 입자 및 복합체에 존재하는 제2 입자)의 현탁액을 초래하지만, 둘 다는 아니다. 특정 구체예에서, 현탁액에 약 1000g 내지 약 2500g(예를 들어, 약 1300g 내지 약 1800g)의 원심력을 적용하는 단계는 제1 입자(예를 들어 유리 제1 입자) 또는 제2 입자(예를 들어, 유리 제2 입자) 중 하나의 침강을 초래하지 않는다.
본 발명의 방법은 현탁액 중에 남아있는 제1 및/또는 제2 입자의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시킨다. 이러한 구체예에서, 현탁액 중의 제1 및/또는 제2 입자의 존재는, 예를 들어 현탁액을 통해 빛을 통과시키고, 제1 및 제2 입자가 없는 등가의 현탁액과 비교하여 산란하는 빛의 양을 측정함으로써 검출될 수 있다. 다른 구체예에서, 현탁액 중에서 제1 및/또는 제2 입자의 존재는, 예를 들어 현탁액을 통해 빛을 통과시키고, 흡광도(예를 들어, 특정 파장에서 또는 파장 범위 전체에 걸친 흡광도)를 측정함으로써 검출될 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 형광 표지와 같은 표지를 포함한다. 이러한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자의 존재는, 예를 들어 형광 표지를 여기시키고, 결과된 형광성을 검출함으로써 검출될 수 있다. 관련 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 방출 파장을 가지고, 그것에 의해 제1 및 제2 입자의 별개의 검출을 허용하는 다른 표지, 예를 들어 Qdot와 같은 형광 표지를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제1 또는 제2 입자는 금속(예를 들어, 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속 또는 이들의 복합체)를 포함하며, 표면 증감 라만 산란(surface-enhanced raman scattering: SERS)을 사용하여 검출된다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자의 존재를 검출하는 단계는 정성적 평가를 제공한다. 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자의 존재를 검출하는 단계는 제1 및/또는 제2 입자량의 정량적 측정을 제공한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 예를 들어 광 산란, 광 흡수, 형광/발광 방출, 또는 SERS의 측정은 정량적으로 결정되는 현탁액에 남아있는 제1 및/또는 제2 입자량을 허용한다.
특정 구체예에서, 현탁액 중에서 제1 및/또는 제2 입자량의 감소는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석은 샌드위치 분석이며(예를 들어, 간접적 또는 직접적 샌드위치 분석), 이때 제1 및 제2 입자는 동일 분석물에 결합함으로써 복합체를 형성하고, 현탁액 중에서 제1 및/또는 제2 입자량의 감소는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다. 다른 구체예에서, 현탁액 중에서 제1 및/또는 제2 입자량의 증가는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석은 경쟁 분석이며, 이때 제1 입자는 분석물을 포함하고, 제2 입자는 대응하는 분석물 결합제를 포함하며, 현탁액 중에서 제1 및/또는 제2 입자의 증가는 샘플 내 분석물의 존재를 나타낸다. 당업자가 용이하게 이해하는 것과 같이, 감소 또는 증가는 적절한 표준에 비례한다. 예를 들어, 적절한 표준은 등몰량의 제1 및 제2 입자 및 적절한 식염수 용액 또는 관심의 분석물을 함유하지 않는 것으로 알려진 샘플을 포함할 것이다.
특정 구체예에서, 분석물은 생물학적 분석물이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 분석물은 병원성 항원 또는 그것에 대한 항체이다. 적당한 병원성 항원은 바이러스(예를 들어, 고양이 백혈병 바이러스, 개 파보바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, a, b 또는 c형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 인유두종 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 광견병 바이러스 등), 박테리아(예를 들어, 에를리키아(Ehrlichia), 보렐리아(Borellia), 안스락스(Anthrax), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus) 등), 진균 또는 기생충(예를 들어, 개 심장사상충, 지알디아 람블리아(Giardia lamblia), 플라스모디움 팔시파럼(Plasmodium falciparum), 아프리칸 트리파노소마이어시스(African trypanosomiasis), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) 등)으로부터 유래한다. 특정 구체예에서, 분석물은 질병 관련 항원 또는 그것에 대한 항체이다. 질병관련 항원은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 암 관련 항원(예를 들어, PSA, AFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CEA, NY-ESO-1, MUC1, GM3, GD2, ERBB2 등), 심혈관계 질병 관련 항원(예를 들어, 심장 트로포닌, C-반응성 단백질, CK-MB, 지방산 결합 단백질 등) 또는 자가면역 질병 관련 항원(예를 들어, 자가-항체)을 포함한다. 특정 구체예에서, 분석물은 염증 항원(예를 들어, C-반응성 단백질, MRP14, MRP8, 25F9 등)이다. 특정 구체예에서, 분석물은 임신 관련 항원(예를 들어, 태아 항원)이다.
다른 구체예에서, 분석물은 환경적 분석물(예를 들어, 환경 오염물질)과 같은 비생물학적 분석물이다.
특정 구체예에서, 분석물은 생물학적 샘플에 존재한다. 생물학적 샘플은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 생물학적 유체(예를 들어, 혈액, 혈장, 소변, 대뇌척수액, 침 등), 조직 호모게네이트, 세포 용해물 또는 그것의 추출물을 포함한다. 특정 구체예에서, 분석물은 지하수, 강, 호수, 폐수 등과 같은 환경적 샘플 중에 존재한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 튜브 또는 큐벳과 같은 용기 내에서 수행된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 로터(예를 들어, 원심분리를 위한 로터)를 사용하여 수행된다. 특정 구체예에서, 용기(예를 들어, 튜브 또는 큐벳)는 로터에 들어맞는다. 다른 구체예에서, 용기(예를 들어, 튜브 또는 큐벳)는 로터의 일부로 만들어진다. 특정 관련 구체예에서, 본 발명의 방법은 샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단을 함유하는 로터에 부가하는 단계를 포함하며, 상기 혼합은 상기 로터 내에서 일어난다.
특정 구체예에서, 제1 입자의 집단은 샘플과 혼합되기 전 건조 형태이다. 특정 구체예에서, 제2 입자의 집단은 샘플과 혼합되기 전 건조 형태이다. 특정 구체예에서, 제1 입자의 집단과 제2 입자의 집단은 둘 다 샘플과 혼합되기 전 건조형태이다. 특정 구체예에서, 건조 형태는 입자의 동결건조된 비드이다. 비드의 크기는 비드 입자의 수 및 크기에 의존할 것이다. 특정 구체예에서, 비드는 약 108 내지 약 1012, 약 109 내지 약 1011, 또는 약 2×109, 약 3×109, 약 4×109, 약 5×109, 약 6×109, 약 7×109, 약 8×109, 약 9×109, 약 1×1010, 약 2×1010, 약 3×1010, 약 4×1010, 약 5×1010, 약 6×1010, 약 7×1010, 약 8×1010, 약 9×1010 개 입자를 포함하며, 입자는 약 10 내지 약 40㎚의 평균 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 비드는 약 105 내지 약 109, 약 106 내지 약 108, 또는 약 2×106, 약 3×106, 약 4×106, 약 5×106, 약 6×106, 약 7×106, 약 8×106, 약 9×106, 약 1×107, 약 2×107, 약 3×107, 약 4×107, 약 5×107, 약 6×107, 약 7×107, 약 8×107, 약 9×107개의 입자를 포함하며, 입자는 약 200 내지 약 500㎚의 평균 직경을 가진다.
특정 구체예에서, 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단은 로터 내에서 건조 형태(예를 들어, 동결건조된 비드로서)로 제공되며, 로터에 액체 샘플의 부가는 샘플과 제1 및 제2 입자 집단을 혼합하는 것을 초래한다. 특정 관련 구체예에서, 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단은 개별적으로, 예를 들어 로터의 혼합 챔버 내에 위치되는 별개의 동결건조된 비드로 제공된다.
키트
다른 양태에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단을 포함하며, 상기 집단은 본 발명의 방법에서 사용에 적당하다. 제1 및 제2 입자는 본 명세서에서 설명되거나 제안되는 임의의 제1 및 제2 입자일 수 있다. 따라서 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 복합체를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 용액기반 경쟁 분석에서 사용에 적당하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 유리 분석물은 상기 다입자 복합체의 형성을 방해한다(예를 들어, 경쟁적으로 억제한다). 다른 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 용액기반 샌드위치 분석에서 사용에 적당하다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 특정 관련 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 제1 입자 및 상기 제2 입자 각각은 동일한 분석물과 결합하고, 상기 분석물은 상기 제1 입자를 상기 제2 입자에 연결한다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 현탁액 중에서 검출가능하다. 예를 들어 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시키거나 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 표지(예를 들어, 형광표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다. 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 부력을 가지며, 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작으며, 또는 그 반대이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가지며, 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물을 포함하며, 제2 입자는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 대응하는 분석물 결합제를 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질, 앱타머 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함하며, 분석물 결합제는 동일 분석물에 결합한다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물의 다른 부분(예를 들어, 복합체 분석물 내 다른 도메인, 다른 에피토프, 다른 서브유닛 또는 분자 등)에 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물에 동시에 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 예를 들어 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩). 예를 들어, 제1 및 제2 에피토프는 단순 분석물의 다른 표면상에 또는 복합체 분석물 내 다른 서브유닛 또는 분자에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물에 의해 인식될 수 있는 항원을 포함하며(예를 들어, 항체 분석물, 예컨대 질병-특이적 항체 또는 자가-항체), 제2 입자는 분석물을 인식할 수 있는 단백질 또는 항체를 포함한다. 예를 들어, 제2 입자는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 항체-결합 단백질인 단백질, 또는 항체 불변영역(예를 들어, 항-IgG 또는 항-IgM 항체)에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제1 입자의 집단은 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태이다. 특정 구체예에서, 제2 입자의 집단은 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태이다. 특정 구체예에서, 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단은 고체(예를 들어, 동결건조된) 형태이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 제1 입자의 집단, 상기 제2 입자의 집단 또는 상기 제1 및 상기 제2 입자의 집단을 둘 다 포함하는 용기(예를 들어, 큐벳)를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 로터를 추가로 포함하며, 상기 로터는 상기 제1 입자의 집단, 상기 제2 입자의 집단, 또는 상기 제1 및 상기 제2 입자의 집단을 둘 다 포함하는 용기(예를 들어, 큐벳)를 포함한다.
특정 구체예에서, 키트는 설명서(예를 들어 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트의 내용물을 사용하기 위한 설명서)를 추가로 포함한다.
혼합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 혼합물을 제공한다. 특정 구체예에서, 혼합물은 제1 입자의 집단, 제2 입자의 집단, 및 선택적으로 분석물을 포함한다. 제1 및 제2 입자는 본 명세서에서 설명되거나 제안되는 임의의 제1 및 제2 입자일 수 있다. 유리하게, 분석물은 본 명세서에서 설명되거나 제안되는 임의의 분석물일 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 혼합물은 용액기반 경쟁 분석의 부분이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있고, 유리 분석물은 상기 다입자 복합체의 형성을 방해한다(예를 들어, 경쟁적으로 억제한다). 다른 구체예에서, 혼합물은 용액기반 샌드위치 분석의 부분이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있다. 특정 관련 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 제1 입자 및 상기 제2 입자는 각각 동일한 분석물에 결합하고, 상기 분석물은 상기 제1 입자를 상기 제2 입자에 연결한다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 현탁액 중에서 검출가능하다. 예를 들어 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 빛을 산란시키거나 검출가능한 색(예를 들어, 시각적으로 또는 분광학적으로 검출가능한 색)을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 표지(예를 들어, 형광표지)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 표지(예를 들어 다른 형광 표지 또는 다른 발색단)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 공여체 발색단을 포함하며, 제2 입자는 수용체 발색단을 포함하고, 또는 그 반대일 수 있고, 공여체 및 수용체 발색단은 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 분석에 의해서 제1 입자와 제2 입자 사이의 상호작용을 검출하는데 적당하다.
특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 금, 은, 백금, 유사한 특성을 가지는 금속, 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다. 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함한다. 특정 관련 구체예에서, 제1 및/또는 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 실리카, 임의의 앞서 언급한 폴리머와 유사한 특성을 가지는 폴리머, 또는 이들의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조 입자이다.
특정 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 다른 물리화학적 특성을 가진다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 부력을 가지며, 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작으며, 또는 그 반대이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 제2 입자는 제1 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자의 직경보다 약 5 내지 약 50배 더 큰 직경을 가진다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 큰 밀도를 가지며, 또는 그 반대이다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고 더 부력이 있다. 특정 구체예에서, 제1 입자는 제2 입자보다 더 작고, 더 조밀하고, 더 부력이 있다.
특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물을 포함하며, 제2 입자는 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 대응하는 분석물 결합제를 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 입자와 제2 입자는 둘 다 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질 또는 리간드(예를 들어, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 비타민 또는 다른 소분자 리간드)와 같은 분석물 결합제를 포함하며, 분석물 결합제는 동일 분석물에 결합한다.
특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 다른 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물의 다른 부분(예를 들어, 다른 도메인, 다른 에피토프 등)에 결합할 수 있는 분석물 결합제를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 입자는 동일한 분석물에 동시에 결합할 수 있는 분석물-결합제를 포함한다. 예를 들어 특정 구체예에서, 제1 입자는 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 제1 항체를 포함하며, 제2 입자는 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 제2 항체를 포함하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 다르다(예를 들어, 비중첩). 예를 들어, 제1 및 제2 에피토프는 단순 분석물의 다른 표면상에 또는 복합체 분석물 내 다른 서브유닛 또는 분자에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 입자는 분석물에 의해 인식될 수 있는 항원을 포함하며(예를 들어, 항체 분석물, 예컨대 질병-특이적 항체 또는 자가-항체), 제2 입자는 분석물을 인식할 수 있는 단백질 또는 항체를 포함한다. 예를 들어, 제2 입자는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 항체-결합 단백질인 단백질, 또는 항체 불변영역(예를 들어, 항-IgG 또는 항-IgM 항체)에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명은 단지 예로써, 제한의 방법에 의하지 않고 특정 구체예에 대해서 상세하게 예증되고 설명되었다. 당업자는 개시된 구체예에 대해 다양한 변형이 본 명세서의 본 발명의 범주와 의도 내에 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부하는 특허청구범위의 범주에 의해서만 제한되는 것으로 해석되도록 의도된다.

Claims (37)

  1. 샘플 내 분석물의 검출방법으로서,
    샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 형성단계로서, 상기 제1 입자와 제2 입자는 다르며, 해당 제1 입자, 제2 입자 및 상기 분석물을 포함하는 다입자 복합체를 형성할 수 있는 것인 형성단계;
    상기 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계; 및
    상기 현탁액 중에서 제1 입자의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 현탁액 중의 제1 입자의 감소는 샘플 내 분석물의 존재를 나타내는 것인, 샘플 내 분석물의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자 또는 제2 입자는 항체, 항원, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵단백질(nucleoprotein) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자는 상기 분석물 상의 제1 에피토프를 인식하는 제1 단클론성 항체 또는 제1 다클론성 항체를 포함하고, 상기 제2 입자는 분석물 상의 제2 에피토프를 인식하는 제2 단클론성 항체 또는 제2 다클론성 항체를 포함하며, 상기 제1 에피토프는 상기 제2 에피토프와 중첩하지 않는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 임의의 앞서 언급한 금속의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동(hollow) 나노구 또는 코어 셸 구조인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 유리(free) 제1 입자는 약 1600g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아있는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자는 상기 제2 입자보다 작은 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 임의의 앞서 언급한 금속의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이며, 상기 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카를 포함하는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 유리 제1 입자는 약 1600g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아있고, 유리 제2 입자는 약 1000g 내지 약 1600g의 원심력으로 현탁액 밖으로 침강되는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자는 약 5㎚ 내지 약 40㎚의 평균 직경을 가지며, 상기 제2 입자는 약 400㎚ 내지 약 2000㎚의 평균 직경을 가지는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 액체 형태이며, 상기 제1 입자의 집단 및 상기 제2 입자의 집단은 혼합 전 고체 형태인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 분석물은 개 심장사상충, 고양이 백혈병 바이러스, 개 파보바이러스, C-반응성 단백질, 지알디아 람블리아(Giardia lamblia), 에를리키아(Ehrlichia) 항원 또는 항체, 보렐리아(Borellia) 항원 또는 항체 및 심장 마커 항원인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 다입자 복합체를 제거하는 단계는 원심력을 사용하는 것을 포함하는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 입자의 집단 및 상기 제2 입자의 집단은 상기 샘플과 혼합 전 분리되는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 제2 입자의 평균 직경 대 상기 제1 입자의 평균 직경의 비는 약 5:1 내지 약 50:1인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  15. 샘플 내 분석물의 검출방법으로서,
    샘플을 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단과 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계로서, 상기 제1 입자는 상기 분석물을 포함하고, 상기 제1 입자 및 제2 입자는 다입자 복합체를 형성할 수 있는 것인 형성단계;
    상기 현탁액으로부터 다입자 복합체를 제거하는 단계; 및
    상기 현탁액 중에서 상기 제1 입자의 존재를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 현탁액 중의 제1 입자의 증가는 샘플 내 분석물의 존재를 나타내는 것인 상기 샘플 내 분석물의 검출방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 임의의 앞서 언급한 금속의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리아크릴레이트, PVDF 또는 실리카를 포함하는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  18. 제15항에 있어서, 유리 제1 입자는 약 1600g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아있는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 제1 입자는 상기 제2 입자보다 작은 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 임의의 앞서 언급한 금속의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이며, 상기 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카를 포함하는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  21. 제15항에 있어서, 유리 제1 입자는 약 1600g 또는 그 미만의 원심력으로 현탁액 중에 남아있고, 유리 제2 입자는 약 1000g 내지 약 1600g의 원심력으로 현탁에 밖으로 침강되는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 제1 입자는 약 5㎚ 내지 약 40㎚의 직경을 가지며, 상기 제2 입자는 약 400㎚ 내지 약 2000㎚의 직경을 가지는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 샘플은 액체 형태이고, 상기 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단은 혼합 전 고체 형태인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  24. 제15항에 있어서, 상기 분석물은 개 심장사상충, 고양이 백혈병 바이러스, 개 파보바이러스, C-반응성 단백질, 지알디아 람블리아, 에를리키아 항원 또는 항체, 보렐리아 항원 또는 항체 및 심장 마커 항원인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  25. 제15항에 있어서, 상기 복합체를 제거하는 단계는 원심력을 사용하는 것을 포함하는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  26. 제15항에 있어서, 상기 제1 입자의 집단 및 상기 제2 입자의 집단은 샘플과 혼합 전 분리되는 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  27. 제15항에 있어서, 상기 제2 입자의 평균 직경 대 상기 제1 입자의 평균 직경의 비는 약 5:1 내지 약 50:1인 것인 샘플 내 분석물의 검출방법.
  28. 제1 입자의 집단 및 제2 입자의 집단을 포함하되, 상기 제1 입자와 제2 입자는 다르고, 상기 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 제2 입자의 평균 직경 대 상기 제1 입자의 평균 직경의 비는 약 5:1 내지 약 50:1인 것인 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제1 입자의 집단과 상기 제2 입자의 집단은 혼합되지 않는 것인 키트.
  30. 제28항에 있어서, 상기 제1 입자의 집단 및 상기 제2 입자의 집단은 고체 형태인 것인 키트.
  31. 제28항에 있어서, 상기 제1 입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 임의의 앞서 언급한 금속의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이며, 상기 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카를 포함하는 것인 키트.
  32. 제28항에 있어서, 상기 제1 입자는 (i) 금, 은, 백금 또는 구리 및 (ii) 분석물을 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이고, 상기 제2 입자는 (i) 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카 및 (ii) 상기 분석물의 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 포함하는 것인 키트.
  33. 제28항에 있어서, 상기 제1 입자는 (i) 금, 은, 백금 또는 구리 및 (ii) 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이고, 상기 제2 입자는 (i) 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카 및 (ii) 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 에피토프는 비중첩인 것인 키트.
  34. 분석물, 제1 입자의 집단, 제2 입자의 집단, 및 제1 입자, 제2 입자 및 분석물을 포함하는 다입자 복합체의 집단을 포함하되, 상기 제2 입자의 평균 직경 대 상기 제1 입자의 평균 직경의 비는 약 5:1 내지 약 50:1인 것인 혼합물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1입자는 금, 은, 백금, 구리 또는 임의의 앞서 언급한 금속의 복합체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이며, 상기 제2 입자는 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카를 포함하는 것인 혼합물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 제1 입자는 (i) 금, 은, 백금 또는 구리 및 (ii) 분석물을 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이고, 상기 제2 입자는 (i) 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카 및 (ii) 상기 분석물의 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 포함하는 것인 혼합물.
  37. 제34항에 있어서, 상기 제1 입자는 (i) 금, 은, 백금 또는 구리 및 (ii) 분석물 상의 제1 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 포함하는 콜로이드 나노입자, 나노튜브, 공동 나노구 또는 코어 셸 구조이고, 상기 제2 입자는 (i) 라텍스, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 또는 실리카 및 (ii) 동일 분석물 상의 제2 에피토프를 인식할 수 있는 항체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 에피토프는 비중첩인 것인 혼합물.
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